НАЦІОНАЛЬНА ФАРМАЦЕВТИЧНА АКАДЕМІЯ УКРАЇНИ

КОВАЛЬОВА Алла Михайлівна

УДК 615.322:581.192 +582

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ РОСЛИН РОДИН

FABACEAE, APIACEAE, CONVALLARIACEAE, ASTERACEAE

ТА ПЕРСПЕКТИВИ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ В МЕДИЦИНІ

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фармацевтичних наук

Харків – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармакогнозії Національної фармацевтичної академії України (м .Харків), Міністерство охорони здоров'я України.

Науковий консультант: доктор фармацевтичних наук , професор

КОВАЛЬОВ ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ

Національна фармацевтична академія України, завідувач кафедри фармакогнозії

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук , професор

СЕРБІН АНАТОЛІЙ ГАВРИЛОВИЧ

Національна фармацевтична академія України, завідувач кафедри медичної ботаніки

доктор фармацевтичних наук, професор

ДОЛЯ ВІКТОР СЕМЕНОВИЧ

Запорізький державний медичний університет,

завідувач кафедри фармакогнозії

доктор фармацевтичних наук, професор

ГРИЦЕНКО ОЛЕНА МИКОЛАЇВНА

Київська медична академія післядипломної освіти

Ім. П.Л.Шупика, завідувач кафедри фармацевтичної

хімії і фармакогнозії

Провідна установа: Державний науковий центр лікарських засобів,

лабораторія пошуку рослинних препаратів і біотехнології, м. Харків

Захист відбудеться “22“ жовтня 2002 року о 10.00 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01. при Національної

фармацевтичної академії України за адресою: 61002, м. Харків,

вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національної фармацевтичної академії України (61168, м. Харків, вул.. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “ 20 “ вересня 2002 року.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради

доктор фармацевтичних наук, професор Л.М.Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Тема пошуку біологічно активних речовин (БАР) рослинного походження і створення на їх основі лікарських препаратів залишається актуальною для фармацевтичної науки.

Сучасним підходом до вирішення даної проблеми є дослідження представників вітчизняної флори, які здавна застосовуються в народній медицині і можуть стати джерелом лікарських препаратів. Такими конкурентоспроможними офіцінальним рослинам є представники родин Fabaceae, Asteraceae, Apiaceae, Convallariaceae та ін. На особливу увагу заслуговують сільськогосподарські культури, які мають достатню сировинну базу і практично нешкідливі для організму людини. Даним вимогам відповідають культури гороху, віки, деяких видів роду астрагалу, які можуть служити основою виробництва лікарських препаратів.

Розробка сучасних і доступних методів цілеспрямованого пошуку рослинних БАР набула гострої злободенності. Одним з таких методів є хемотаксономічний аналіз. Припущення апріорі, що морфологічна спорідненість таксонів визначає схожість їх хімічного складу, потребує доказів на основі конкретних наукових досліджень. В той же час різні за морфологічною будовою рослини можуть мати подібний хімічний склад. Саме хемотаксономічне дослідження виявляє корелятивні взаємозв'язки між морфологічними і хімічними ознаками, які можуть бути використані як з метою вдосконалення класифікації рослин, так і з метою пошуку перспективних рослин для одержання певних біологічно активних речовин. Значення хімічних ознак у систематиці рослин виросло настільки, що все частіше на зміну морфолого-географічному методу в таксономії і філогенетиці приходить фенетико-географічний, причому під поняттям фенетики розуміють сукупність морфологічних і хімічних ознак.

Кількісний хемотаксономічний аналіз сполук вторинного синтезу – флавоноїдів, глікозидів, кумаринів, тритерпенових сполук дозволяє скласти більш повний опис фенотипів, що створює передумови для вирішення питань класичної систематики, філогенетики рослин, а також забезпечує умови для прогнозування і виявлення перспективних видів – джерел біологічно активних речовин.

Розробка нових лікарських форм кардіотонічних глікозидів, є актуальним завданням для лікування серцевих хвороб. Препарати – похідні строфантидину, в медичній практиці застосовуються у вигляді парентеральних форм. В офіційній медицині існувала думка, що серцеві глікозиди, які містять в положенні С-10 молекули альдегідну або спиртову групу, в організмі людини розкладаються на фрагменти, що не виказують або мають незначну специфічну кардіотонічну дію, яка триває короткий проміжок часу. Проте, на сьогодні науково доведено, що серцеві глікозиди з альдегідною або спиртовою групою у С-10, утворюють продукти метаболізму не окислені, а відновлені, тобто в організмі не утворюються біологічно неактивні карденолід (буфадієнолід)-карбонові кислоти. Тому виникла проблема розробки препаратів кардіостероїдів, похідних строфантидину, у вигляді пероральної форми – таблеток і доказу їх ефективності.

Тенденції сучасної науки щодо створення препаратів, які виявляють вибіркову дію на рецептор або фермент, дають можливість створювати лікарські засоби так званого нового покоління. На сьогоднішній день актуальним питанням залишилось встановлення впливу природних речовин, а також деяких існуючих препаратів на активність ферменту ліпази з метою виявлення інгібіторів ліпази і механізму біологічної дії лікарських препаратів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності до плану науково-дослідних робіт Національної фармацевтичної академії України (шифр теми ВН 10.06.0037.91; номер державної реєстрації 0198У007008).

Мета та завдання дослідження. Мета нашої роботи – виявлення перспективних видів рослин родин Fabaceae, Apiaceae, Asteraceae, Convallariaceae для одержання БАР, виділення, ідентифікація, встановлення фізико-хімічних та біологічних властивостей сполук; створення на їх основі лікарських препаратів і нових лікарських форм; визначення перспектив застосування в медицині.

Для досягнення поставленої мети виконувались наступні завдання:

·

·

·

·

· розгляд теоретичних питань з систематики роду Astragalus L. і внесення пропозицій з дискусійних питань;

· виділення та ідентифікація БАР з представників родів Pisum L., Vicia L., Astragalus L., Heracleum L., Angelica L., Соnvallaria L.;

· вивчення фармакологічних властивостей сумарних комплексів БАР та інших біологічних властивостей досліджуваних сполук і субстанцій in vitro; розробка технології одержання лікарських засобів;

· створення аналітичної нормативної документації (АНД) на розроблені препарати.

Об'єкти дослідження: рослини родів Астрагал, Гороху, Віки, Борщівника, Морківника, Дягелю, Дудника, Конвалії, Горицвіту, які ростуть і культивуються в Україні, а також виділені з них біологічно активні речовини – кумарини, фурокумарини, флавоноїди, тритерпени: циклоартани, кардіостероїди та комплекси БАР.

Предмет дослідження: визначення фенетико-(хемоморфолого)-еколого-таксономічної характеристики роду Astragalus L. для виявлення перспективних для медицини видів; вивчення біологічної активності речовин, виділених з окремих видів родин Fabaceae, Apiaceae, Convallariaceae та Asteraceae, для одержання фармацевтичних препаратів; розробка технологічних схем виробництва, показників якості та фармакологічних властивостей нового гепатопротекторного препарату піфламін з трави Pisum sativum L. та нової лікарської форми кардіотонічного препарату корглікон.

Методи дослідження: кількісне таксономічне дослідження великого континууму роду Astragalus L. проводили з використанням в якості маркерів флавоноїдів, циклоартанів, морфологічних ознак и екотопів рослин. Таблиці побудовані за допомогою програмного забезпеченням Microsoft Excel. Якісний склад БАР вивчали методами паперової (ПХ) та тонкошарової хроматографії (ТШХ) в різних системах органічних розчинників. Структура досліджених сполук встановлена з використанням інструментальних методів аналізу – УФ-, ІЧ-, ПМР-, мас-спектрометрії, дисперсії оптичного обертання, методів хроматографічного аналізу, порівняння фізико-хімічних властивостей виділених речовин і вірогідних зразків. Виявлення і визначення ліпазотропної активності БАР проводили крапельним методом в мономолекулярному шарі триолеїну.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено методику таксономічного дослідження великого масиву континууму таксонів на основі сучасних програмних технологій. Вперше проведено фенетико-(хемо-морфолого)-еколого-таксономічне дослідження 67 видів роду Astragalus L., з них 22 види флори України. В якості фенетико-екологічних маркерів використано 468 ознак, з них 60 хімічних; проаналізовано 31356 позитивних і негативних станів ознак.

Проведено хеморесурсознавче дослідження 22 видів роду Astragalus L. з використанням у якості маркерів 60 циклоартанових сполук, проаналізовано 1320станів ознак. Знайдено корелятивні зв'язки між функціональними морфологічними ознаками, хімічним складом і екотопами таксонів, що дає змогу цілеспрямованого пошуку БАР у великому масиві континуумі видів. За результатами дослідження визначено перспективні види астрагалів флори СНД і України для подальших наукових досліджень і практичних розробок.

З досліджених рослин виділено та ідентифіковано 65 речовин, з яких 50 фенольні сполуки: 1 простий фенол, 5 гідроксикоричні кислоти, 3 гідроксикумарини, 4 фурокумарини, 37 флавоноїдів; 11 терпеноїдів: 5 циклоартанів, 2 сесквітерпенові лактони, 4 кардіостероїди; 4 азотовмісні сполуки. Встановлено структуру нового флавонолового глікозиду: кверцетин-3-софорозидо-п-кумарату.

Вперше виявлено і визначено інгібуючу ліпазотропну активність природних і синтезованих груп БАР, а також лікарських препаратів, що дає можливість виявити деталі механізму біологічної дії, а також розширити область призначення існуючих препаратів. Запропоновано модифіковану методику визначення ліпазотропної активності БАР.

Вперше виявлено добову ритмічну (циркадіанну) ферментативну діяльність ліпази in vitro і встановлено час найбільшої її активності (акрофазу), що дає підставу для цілеспрямованої терапії деяких захворювань.

Розроблено технологію субстанції “Піфламін”. На спосіб одержання комплексу БАР гепатопротекторної дії, який містить “Піфламін”, отримано позитивне рішення на видачу патенту на винахід 88063104 (МКИ А 61К 38/43, А 61К 9/20). Розроблено технологію таблеток “Корглікону” покритих оболонкою, на спосіб одержання якого видано позитивне рішення на видачу патенту на винахід 2000127177 (МКИ А61К9/20, А61К35/78, А61Р9/04).

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано методику цілеспрямованого хеморесурсознавчого пошуку БАР в роді Astragalus L.

Розроблено і апробовано в умовах дослідного заводу ДНЦЛЗ технологію одержання оригінального фітопрепарату “Піфламін” гепатопротекторної дії.

Розроблено технологію одержання нової лікарської форми – Корглікон таблетки 0,0006 г покриті оболонкою (ТПР 64У-0048-1235-99-2000).

Розроблено АНД на субстанцію (ТФС 42У-6/281-1670-00) і таблетки “Піфламін” (ТФС 42У-6/281-1671-00). Розроблено і затверджено АНД на “Корглікон” таблетки (ФС 42У-6/281-805-00). Доведено біологічну ефективність препарату “Піфламін” і таблеток “Корглікону“.

Результати досліджень, що отримані при виконанні дисертаційної роботи, впроваджені в учбовий процес і використовуються в наукових дослідженнях Запорізького медичного університету, Львівського медичного інституту, Ташкентського фармацевтичного інституту та ін.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною науковою працею. Автору належить вирішальна роль у визначенні мети дослідження, плануванні, шляхів реалізації, використанні та обробці експерименту, систематичної інтерпретації і узагальненні результатів, формулюванні основних положень і висновків, які захищаються. В наукових працях, опублікованих зі співавторами, особисто автором:

розроблено методику таксономічного дослідження великого масиву континууму таксонів на основі сучасних програмних технологій; розроблено методику хеморесурсознавчого аналізу флавоноїдів і циклоартанів; проведено хемо-морфолого (фенетико)-екологотаксономічне і хеморесурсознавче дослідження видів роду Astragalus L. флори СНД і України з урахуванням 32676 станів морфологічних, хімічних і екологічних ознак; внесено пропозиції до деяких положень систематики роду; визначено перспективні види флори СНД і українських астрагалів для подальших наукових досліджень; знайдено корелятивні зв'язки між екотопами астрагалів, функціональними морфологічними ознаками і хімічним складом; з рослин родин бобові, селерові, айстрові, конвалієві виділено і встановлено структури простих фенолів, гідроксикоричних кислот, гідроксикумаринів, флавоноїдів, фурокумаринів, фурохромонів, циклоартанів, сесквітерпенових лактонів, кардіостероїдів; виявлено і визначено інгібуючу ліпазотропну активність виділених речовин, а також амінопохідних антраценів, амінопохідних сесквітерпенових лактонів, розроблених та існуючих лікарських препаратів; запропоновано модифіковану методику визначення ліпазотропної активності БАР in vitro; виявлено добову ритмічну (циркадіанну) ферментативну діяльність ліпази in vitro і встановлено акрофазу її активності; розроблено препарати – сухий екстракт і таблетки “Піфламін” гепатопротекторної дії; розроблено і впроваджено у промислове виробництво технологію таблеток “Піфламін”; розроблено і затверджено АНД на таблетки “Піфламін” і на таблетки “Корглікон”.

Апробація результатів дисертації.

Основні положення дисертації обговорено на І Конгресі світової фармації українських фармацевтичних товариств (Львів, 1994), на науково-практичній конференції, присвяченій 75-річчю Української фармацевтичної академії (Харків, 1996), на науково-практичній конференції, присвяченій 25-річчю фармацевтичного факультету Курського медичного інституту (Курськ,1991), на республіканських науково-практичних конференціях (Харків, 1991, 1992, 1993, 1994, 1998-2000; П'ятигірськ, 1993), на IY, Y, YI Російських національних конгресах “Человек и лекарство” (Москва 1997, 1998, 1999), на міжнародній конференції “Теорія і практика створення ліків” (Харків, 1998), на науково-практичному семінарі Координаційної Ради відділу хімії НАН України (Гурзуф, 2000).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 47 робіт, у тому числі 28 статей у наукових журналах, 2 патенти, 16 тез.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на ___сторінках і складається зі вступу, 5 розділів, загального висновку та списку використаної літератури, який включає 350 джерел. Робота ілюстрована ___ рисунками, ___ таблицями та ___ схемами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об'єктами фармакогностичного дослідження були 80 видів і одна різновидність астрагалів, 2 види гороху, 2 види віки, борщівник сибірський, морківник лучний, сідач конопляний, дудник лісовий, оман високий і британський, конвалія звичайна і кавказька, які ростуть і культивуються в Україні; а також строфант витончений, олеандр звичайний, горицвіт волзький. В якості сировини вивчалися вегетативні (листя, стебла, корні) і генеративні (квітки, плоди) органи рослин.

Фенетико-екологотаксономічне дослідження роду Аstragalus L.

Таксономічне вивчення рослин роду Astragalus L. є недостатнім, що зумовлює неоднозначне трактування систематичного положення деяких видів і викликає протиріччя з деякими положеннями Флори України, в тому числі – Криму, а також Флори Кавказу та інших регіонів СНД. З метою поглибленого дослідження роду Astragalus L. і для системного пошуку БАР серед його видів проведено фенетико-еколого-таксономічне дослідження роду.

Розроблено методику визначення таксономічних коефіцієнтів для великого масиву континууму за допомогою сучасного програмного забезпечення. При розрахунках в Microsoft Excel використовувалась процедура привласнення імені діапазонам і функція обробки масивів СУМПРОИЗВ – сума попарного добутку двох лінійних масивів, якими є одиничні вектори наявності ознаки для кожного з таксонів. Результатом цієї функції є кількість збігу станів ознак. Критерієм перевірки правильності розрахунків є значення коефіцієнтів по діагоналі таблиці, яке дорівнює 100%, що означає повну подібність самого до себе.

Для того, щоб розділити континуум досліджуваних таксонів на групи, було визначено відносну різницю між сусідніми таксонами в ієрархічному ряді. Ті види, відносна різниця яких вище середнього значення, є пограничні в окремій групі таксонів. В математичному вигляді методику можна представити наступним чином:

f = Ю max,

де значення коефіцієнта парної схожості матриці А;

i - індекс рядка, j – індекс стовпчика, m – число таксонів (65)

допоміжна величина матриці В, де

Матриця В вводиться для виключення елементів, які виражають коефіцієнти парної спорідненості між однойменними таксонами.

Найбільш значні зв'язки мають таксони І основної або групи. Для ранжирування таксонів І групи максималізуємо функціонал матриці (С):

f =Ю max,

де значення коефіцієнта парної спорідненості матриці С;

;

1, якщо max зв'язок здійснено; 0, в протилежному випадку.

задовольняє ще двом умовам:

На основі розрахованих таксономічних відстаней з використанням в якості маркерів морфологічних, хімічних і фенетико-екологічних ознак були побудовані дендрограми роду, які наглядно демонструють, що рід Astragalus L. розділяється на дві гілки, кожна з яких в свою чергу ділиться на 5 і більше груп, в основі яких знаходяться більш еволюційно стародавні види. Кожній групі притаманний певний набір ознак. Дендрограма роду на основі фенетико-екологічної таксономії представлена на рис.1.

Переважну більшість С31-заміщених флавоноїдів виявлено в підродах VII і II. У підродах І і ІІ виявлено метильовані флавоноїди по трьом положенням С-7, С-31 і С-41. Причому підрід І.Phaca L. продукує сполуки метильовані по С-3 положенню також, що підкреслює еволюційний розвиток і пластичність його таксонів. Метоксильовані гідроксифлавоноїди підвищують коефіцієнт своєрідності таксонів Astragalus L.

На нашу думку, наявність апігенину, космосиїну, лейкоціанідинів і ціанідинів у 741.A.transcaspicus Frein., 749.A.ammodendron Bunge і 750.A.hyrcanus Pall у поєднанні з астрагаліном, популніном і нікотифлорином, а також життєві форми і умови існування ставлять середньоазіатсько-кавказьку секцію 94. Ammodendron Bunge, до складу якої ці види входять, у відокремлене положення. Подальше вивчення хімічного складу цієї секції може дати підставу для виділення секції в окремий підрід, або навіть рід. В результаті дослідження доведено перехідне положення спірного виду 416. А.sulcatus L. у системі роду.

В результаті фенетико-екологічного таксономічного дослідження роду Astragalus L. виявлено групу таксонів, яка лежить в основі еволюційного розвитку роду, і є більш еволюційно посуненою. Група виявляє найбільші коефіцієнти спорідненості до решти таксонів роду (рис.2). Середній показник спорідненості між таксонами в групі спостерігається на рівні 71,5%. Найбільший коефіцієнт спорідненості має таксон 452.A.bungeanus Boiss. Група характеризується великим коефіцієнтом інформативності і середнім рівнем оригінальності ознак. Типовими для групи, а отже і для роду є кемпферол, кверцетин, ізорамнетин і їх глікозиди: астрагалін, трифолін, гіперозид, ізокверцитрин, рутин, ізорамнетин-3-глюкозид і нарцисин.

Дані сполуки визначають хімічний профіль роду. Специфічними ознаками є апігенін, космосиїн, цинарозид і дактилин. Нами було встановлено кореляційні зв'язки флавоноїдів насамперед з екотопом, а не з морфологічною будовою таксону. Визначену кореляцію між морфолого-екологічними та флавоноїдними ознаками використано для систематичного і цілеспрямованого пошуку конкретних БАР в роді Astragalus L.

Порівнюючи хімічні показники парної спорідненості та морфологічні ознаки хемотаксонів групи Bungeі: 452.A.bungeanus Boriss., 450.A.circassicus Grossh., 451.A.sevangensis Grossh. (ряд Onobrychoides Boriss.), 455.A.goknschaicus Grossh., 456.A.captiosus Boriss. (Fumosi Boriss.), які відрізняються між собою величиною бобів: у першого боби довші за чашечку, а в другому – менші, рівні або незначно довші, нами зроблено висновок про необхідність об'єднання рядів Onobrychoides Boriss. і Fumosi Boriss. в один ряд.

Дане дослідження ілюструє процес видоутворення у 452.A.bungeanus Boriss. в малих популяціях. Морфологічні і хімічні таксономічні відстані між таксонами роду великі, в середньому на рівні 17-23% (рис.3). Низьку спорідненість між таксонами можна пояснити високим показником ендемічності, дискретністю ареалів видів.

Ресурсознавче дослідження роду Astragalus L. з використанням

фенетико-екологічних ознак

Використовуючи елімінуючий відбір морфологічних, екологічних і хімічних ознак, виявлено кореляцію хімічного складу таксонів з екологічними умовами, життєвою формою існування і деякими морфологічними ознаками.

Рід Astragalus L. виробляє ряд флавоноїдних сполук, які представляють практичний інтерес для медицини. На основі таксономічного дослідження роду Астрагал розроблено методику цілеспрямованого ресурсознавчого пошуку таких цінних фармакологічних речовин, як робінін, нарцисин, ізорамнетин-3-глюкозид, рутин.

Робінін було виявлено в 14 видах роду, найбільше він розповсюджений серед видів підроду YII. Cercidothrix Bunge. Відмічено кореляцію робініну з життєвою формою рослин, скороченістю стебел або їх відсутністю.

Таким чином, пошук джерел робініну доцільно проводити серед рослин підроду Cercidothrix Bunge, а саме тих, які існують в аридних умовах і мають скорочений вегетаційний цикл розвитку. Чіткий зв'язок робініну у астрагалах з екологічними умовами існування, а вже потім з морфологічними ознаками астрагалів свідчить про адаптивне значення даного флавоноїду, який сприяє процесу пристосування до мінливих умов середовища і розширенню ареалів рослин. Наший висновок відповідає одному з положень хемосистематики про кореляційні зв'язки флавоноїдного складу рослин, в першу чергу, з екологічними умовами існування.

Відмічено кореляцію робініну з трифоліном і ізорамнетином. Астрагали, які продукують робінін, одночасно можуть синтезувати кемпферол, астрагалін, трифолін, рутин (рис.4), а також в меншій мірі гіперозид, нікотифлорин і популнін.

Хеморесурсознавче дослідження флавоноїдів було проведено серед 22 видів астрагалів флори України. Для більшості українських таксонів характерні аридні умови існування. Таксони A.cicer, A.ponticus, A.asper, A.sulcatus, A.testiculatus і A.dolichophyllus поширилися в зону різнотравного степу, березняків, рідких лісів. Завдяки різноманітному флавоноїдному складу вони більш адаптовані до зміни середовища, мають поширений ареал і посунені в еволюційному розвитку.

Астрагали української групи виробляють понад 32 флавоноїдних сполук. Характерними ознаками є рутин (підроди Hypoglottis Bunge і Cercidothrix Bunge), кемпферол, астрагалін і кверцетин. Робінін виділено з 4 таксонів, які належать до підродів Caprinus Bunge, Hypoglottis Bunge i Cercidothrix Bunge. Найбільшу інформативну вагу (JPi) в українських таксонах мають космосиїн, апіїн, цинарозид, афзелін, кемпферол-3-софорозид, нікотифлорин, кемпферол-3,7-диглюкопіранозид, кемпферол-7-рамнозид, кемпферол-3-рутинозил-7-рамнозид і кверцитрин. Астрагали флори Україні можуть бути цінним джерелом БАР.

Хеморесурсознавче дослідження в роді Astragalus L. на основі циклоартанів

Проведено хеморесурсознавче вивчення 22 видів роду Astragalus з використанням в якості маркерів 58 циклоартанів. В основі структури циклоартанів знаходиться 9,19-цикло-3b,5a-ланостанол. Основна стереоспецифічна різниця похідних циклоартану і стероїдів полягає у цис-сполученні кілець В/С, яке зумовлене наявністю 9,19 - тричленного циклу.

Передумовою до хеморесурсознавчого дослідження роду Astragalus L. з використанням в якості хімічних ознак циклоартанів можна вважати високу біологічну активність деяких з них, що виявляють кардіотонічну, імуностимулюючу, протипухлинну, протизапальну та інші види дії. Циклосиверсиозиди F і D, які знайдено у дев'яти видах астрагалів, мають антивірусну, цитостатичну і гіпотензивну активність. Серед астрагалів найбільш розповсюджені циклосиверсигенін та його глікозиди. Різноманітними за циклоартановим складом є підроди І.Phaca (L.) Вunge, ІІ.Caprinus Вunge i YI.Calicophysa Вunge (рис.5).

Хеморесурсознавчими дослідженнями виявлено кореляцію між життєвою формою існування, морфологічними особливостями та циклоартановим складом. Більшість ацетильованих циклоартанів міститься у A.sieversianus Pall. та A.penduliflorum Lam., які мають добре розвинуті високі стебла.

Наявність циклогалегігеніну у A.galegiformis L. (підрід І. Phaca) і A.falcatus Lam. (підрід YII. Cercidothrix), далекими за систематичним положенням, корелює з життєвою формою (багаторічні трави з розвинутими стеблами) і подібними умовами існування (субальпійські луки, широколистяні ліси).

У 12 українських видах астрагалів хроматографічно виявлено циклоартани. З A.galegiformis L., A.dasyanthus Pall. і вперше з A.cicer L. виділено циклоартани, які ідентифіковано порівнянням фізико-хімічних властивостей з автентичними зразками циклогалегігеніну, циклогалегінозиду А і циклогалегінозиду В, а також два циклоартани, структуру яких не встановлено, для них визначено деякі фізико-хімічні властивості.

Перспективними видами є A.basineri, A.sieversianus, A.penduliflorum Lam., A.glycyphyllus L. i A.quisqualis Bunge підроду ІІ.Caprinus, які містять в собі глікозиди циклосиверсигеніну, дазиантогеніну, квісвагеніну та циклоорбікогеніну, а також A.falcatus Lam, A.amarus Pall. i A.adsurgens Bunge підроду VII.Cercidothrix. З трагакантових астрагалів заслуговують на увагу A.microcephalus Wild. i A.tragacantha Habl. (A.arnacantha M.B.).

Виділення та встановлення структури біологічно активних речовин

Попередніми якісними реакціями встановлено наявність в досліджуваних об'єктах простих фенолів, гідроксикоричних кислот, гідроксикумаринів, флавоноїдів, фурокумаринів, кардіотонічних глікозидів, азотовмісних сполук та ін.

Виділення суми поліфенолів з рослинної сировини проводили спирто-водними сумішами і наступним рідинним фракціюванням, використовуючи розчинники з поступовою зміною полярності: від малополярних до високополярних і води. З хлороформної фракції вилучено кумарини, циклоартани, з етилацетатної – монозиди, гідроксикоричні кислоти, з етилацетатно-спиртової (9:1) біозиди і диглікозиди, кардіотонічні глікозиди, з ізопропанольної – ізофлавоноїди, з бутанольної – біозиди і ацильовані біозиди, з водної – триглікозиди і ацильовані триглікозиди флавоноїдів і азотовмісні сполуки.

З представників родини Fabaceae вивчалися роди астрагалу, гороху, віки. У 22 видах роду астрагал досліджено якісний і кількісний склад флавоноїдів, циклоартанів, азотовмісних сполук, а також морфологічні ознаки для послідуючого таксономічного аналізу роду.

Вперше вивчено флавоноїдний склад 10 видів і 1 різновидності Astragalus L., розповсюджених у дикоростучому стані на Україні. Фенольні сполуки вивчались у представників родів горох і горошок (віка): P.sativum L., P.arvense L., V.cracca L., V.sativa L. Фурокумарини і фурохромони виділено з представників родини Apiaceae: Angelica palustris Hoffm. (Ostericum palustre Bess.), Angelica archangelica L., Heracleum sibiricum L., Silaum alpestre (L.) Thell. і Pimpinella titanophilla Woronow.

Сесквітерпенові лактони виділено з представників родини Asteraceae L.: Eupatorium cannabinum L., Inula helenium L. і Inula britanica L. Кардіотонічні глікозиди виділено з Convallaria majalis, Convallaria caucasica, Strophanthus gratus (Walr. et Hool) Franch., Adonis volgensis L., Nerium oleander L.

Азотовмісні сполуки виділено з видів роду Astragalus L., Pisum L. Виділені БАР були дослідженні на ліпазотропну активність. Деякі фізико-хімічні властивості речовин і джерела їх одержання представлені в таблиці 1.

Прості феноли

Арбутин (1). Речовину на основі якісних реакцій з діазотованою сульфаніловою кислотою, о-фталевим альдегідом віднесено до фенолів. Кількісний кислотний гідроліз приводить до появи аглікону загальної формули С6Н6О2 і цукрового залишку у співвідношенні 1:2,5, що вказує на монозидну природу речовини. Проба змішування аглікону зі зразком гідрохінону не дає депресії температури плавлення. Вуглеводний компонент на основі порівняння величин Rf з D-глюкозою і їх озазонами ідентифіковано з D-глюкозою. Речовину 1 ідентифіковано як – гідрохінон-О-b-D –глюкопіранозид (арбутин).

Гідроксикоричні кислоти (речовини 2, 3, 4, 5, 6). Речовини дають позитивну реакцію з хлоридом заліза (ІІІ), сульфаніловою діазотованою кислотою, що виявляє їхню фенольну природу. На підставі хроматографії на папері, якісних реакцій, УФ-спектрів, порівнянням з вірогідними зразками визначили, що речовини є: 2 – 4-гідроксикоричною (п-кумаровою); 3 – 3,4-діоксикоричною (кавовою); 4 – 3-метокси-4-оксикоричною (феруловою); 5 – 5-О-кофеїл-D-хінною кислотою (хлорогеновою) і 6 – 3-О-кофеїл-D-хінною (неохлорогеновою) кислотами.

Гідроксикумарини (речовини 7, 8, 9). На підставі якісних реакцій, флуоресценції в УФ-світлі, вивчення продуктів деструкції йодистоводневою кислотою, даних УФ-, ІЧ-спектрів дані речовини були ідентифіковані як умбеліферон (7-гідроксикумарин), скополетин (6-метокси-7-гідроксикумарин) і ескулетин (6,7-дигідроксикумарин).

Фурокумарини (речовини 10,11,12,13). На підставі вивчення фізико-хімічних властивостей речовини віднесені до фурокумаринів.

Примітка: * - речовини виділені з цих видів вперше

Порівнянням даних хроматографічного аналізу: величин Rf у різних системах розчинників, флуоресценції, максимумів поглинання в УФ-спектрах, характеристичних смуг в ІЧ-спектрах речовин з даними достовірних зразків речовини 10, 11,12 і 13 ідентифіковано як псорален (фуро-21,31:7,6-кумарин), ангеліцин (фуро-21,31:7,8-кумарин), імператорин (8-ізопентилгідроксипсорален) і ксантотоксол (5-гідрокси-8-метоксипсорален).

Встановлення структури флавоноїдів

Виділені речовини ідентифіковано на підставі вивчення їх фізико-хімічних властивостей за допомогою хімічних, фізичних і фізико-хімічних методів аналізу.

Аглікони флавонів

Сполуки (14, 16, 19): апігенін, лютеолин, діосметин – жовті гольчасті кристали. Речовини 14, 16, 19 дають позитивну реакцію за Бріантом, що дозволяє віднести їх до флавоноїдних агліконів. Інтенсивність максимумів поглинання речовин в УФ-спектрах майже рівна, що вказує на групу флавону. В ІЧ-спектрах цих речовин відмічаються смуги поглинання в області 3500-3200 см-1 (фенольні гідроксигрупи), 1665-1650 см-1 (карбонільна група ?-піронового кільця), 1615-1510 см-1 (скелетні коливання ароматичних кілець А і В). Для речовини 19 спостерігається максимум поглинання при частоті 2845 см-1 (метоксильна група). Наявність вільних гідроксигруп у флавонах з'ясовували за результатами аналізу прямої, диференційної УФ-спектроскопії, ІЧ- та ПМР-спектрів. У продуктах лужної деструкції виявлено флороглюцин та протокатехову кислоту. Змішана проба сполук (14, 16, 19) з вірогідними зразками апігеніну, лютеоліну і діосметину не давала депресії температури плавлення. Сполуки 14 ідентифіковано як 5,7,4' тригідроксифлавон (апігенін), 16 – як 5,7,3ў,4ў- тетрагідроксифлавон (лютеолін), 19 – як 5,7,3'-тригідрокси-4'-метоксифлавон (діосметин).

Аглікони флавонолів

Хризин (20) – речовину ідентифіковано на підставі порівняння фізико-хімічних властивостей з властивостями вірогідного зразку 3,7-дигідроксифлавону (хризину).

Кемпферол, кверцетин, ізорамнетин (21, 30 і 41). За даними хроматографії на папері та позитивної проби по Бріанту встановили, що сполуки 21, 30 і 41 є флавоноїдними агліконами. Результати аналізу УФ-спектрів показують, що дані сполуки відносяться до флавонолів; сполука 21 має вільні гідроксигрупи в положеннях С-3,5,7,4', сполука 30 – у С- 3,5,7,3',4'; сполука 41 – у С-3, С-5, С-7,4'. У ІЧ-спектрах речовин виявлено смуги поглинання карбонільної групи ?-пірону, ароматичного кільця, гідроксильних груп. У 41 виявлено смугу при 2895см-1 (-ОСН3 група). У продуктах лужної деструкції сполук сплавленням з кристалічним КОН було знайдено для сполуки 21 флороглюцин та п-гідроксибензойну кислоту, для 30 – флороглюцин і 3,4-диоксибензойну кислоту, для 41 – флороглюцин та ванілінову кислоту. Проба змішування сполуки 21 з вірогідним зразком кемпферолу, сполуки 30 зі зразком кверцетину, сполуки 41 зі зразком ізорамнетину не давали депресії температури плавлення. Сполуки 21 охарактеризовано як 3,5,7,4'-тетрагідроксифлавон (кемпферол); 30 – як 3,5,7,3',4'–пентагідроксифлавон (кверцетин); 41 – як 3,5,7,4ў-тетрагідрокси–3'–метоксифлавон (ізорамнетин).

С-глікозиди флавонів

Ізовітексин (Сапонаретин) (48). При хроматографуванні на папері речовина 48 виявляється у фільтрованому УФ-світлі у вигляді темної плями. Стійка до кислотного гідролізу 8-10% сірчаною кислотою і гідролізу за допомогою ферментів виноградного равлика. За молекулярною масою і результатом цианідинової реакції по Бріанту речовина 48 віднесена до глікозидів.

У ІЧ-спектрі виявляються ОН-групи, подвійні зв'язки ароматичної частини молекули. Методом УФ-спектроскопії з діагностичними реагентами виявлено вільні ОН-групи в 5,7 та С-4' флавоноїдного ядра. Розщеплення йодистоводневою кислотою у середовищі оцтового ангідриду і фенолу приводить до утворення апігеніну 14 і D-глюкози. За даними ПМР-спектру у агліконовій частині глікозиду відсутній протон при С-6, що вказує на його заміщенність.

Речовина 48 ідентична 5,7,4'-тригідрокси-6-(С-D-глюкопіранозидо)-флавону або ізовітексину (сапонаретину).

Ізооррієнтин (Гомоорієнтин) (49). Речовина більш полярна ніж сапонаретин 48. Виявляється на хроматограмі у вигляді темної плями, стійка до ферментів виноградного равлика і кислотного гідролізу 8-10% сірчаною кислотою.

За молекулярною масою і результатами цианідинової реакції по Бріанту речовину віднесено до глікозидів.

В ІЧ-спектрі виявляються ОН-групи, ароматичні зв'язки. В УФ-спектрі речовини встановлено гідроксильні групи при С- 5,7,3',4'-флавонового ядра. Для підтвердження С-глікозидної природи речовини 49 проведено розщеплення досліджуваного глікозиду йодистоводневою кислотою у середовищі оцтового ангідриду і рідкого фенолу. В продуктах реакції встановлено наявність лютеоліну і D-глюкози. На підставі даних ПМР-спектру виявлено, що у агліконі С-глікозиду відсутній протон при С-6, що вказує на його заміщенність.

За фізико-хімічними властивостями, продуктами перетворення, даними УФ-, ІЧ- і ПМР-спектрів речовина 49 ідентифікована як ізоорієнтин (гомоорієнтин) - 5,7,3', 4' - тетрагідрокси-6-С-D-глюкопіранозидофлавон.

Глікозиди кемпферолу

Трифолін (22), астрагалін (23), популнін (24) і афзелін (25). Дані хроматографії на папері, УФ-спектрів – свідчать, що ці сполуки є флавонолами. Речовини 22, 23, 25 є 3-глікозидами, що підтверджується пробою Хьорхаммера та стійкістю до лужного гідролізу протягом 3 годин. Гідроліз речовини (24) 0,5% водним розчином лугу (25 хвилин) приводить до утворення аглікону і цукрового компоненту, що властиво для 7-моноглікозидів. Яскраво-жовте забарвлення плями речовини 24 на хроматограмі і величина Rf характерні для 7-глікозиду.

На підставі поведінки речовин в УФ-спектрі в присутності комплексоутворюючих та іонізуючих добавок доведено наявність вільних гідроксигруп у речовини 24 у положенні С-3 і С-5, у речовин 22, 23, 25 – у положенні С-5 і С-7. Кількісний гідроліз 5% сірчаною кислотою з виходом аглікону 63,2% свідчить про монозидну природу речовин 22, 23, 24, 25. Ці дані підтверджуються ІЧ-спектром і продуктами ферментного гідролізу. Аглікони сполук були ідентифіковані як 3, 5, 7, 4ў-тетраоксифлавон (кемпферол).

Дані хроматографії на папері нейтралізованих гідролізатів, температура плавлення отриманих озазонів і відсутність депресії температури плавлення змішаної проби з вірогідними зразками вказують на те, що цукровою частиною глікозидів 23, 24 є D-глюкоза, 22 – D-галактоза, 25 – L-рамноза.

Таким чином, сполуку 24 ідентифіковано як 3,5,4'-три-гідрокси-7-О-b-D-глюкопіранозид флавону (популнін), 23 – як 5,7,4ў-тригідрокси-3-О-b-D-глюкопіранозид флавону (астрагалін), 22 – як 5,7,4ў -три-гідрокси-3-О-b-D-галактопіранозид флавону (трифолін), 25 – як 5,7,41-тригідрокси-3-О-??-L-рамнопіранозид флавону (афзелін).

Нікотифлорин (26). Кемпферол-3-О-софорозид (27). Кемпферол-3,7-О-диглюкозид. Речовини 26, 27, 28 в незначній кількості виділено з надземної частини астрагалів. В результаті кислотного гідролізу 2% сірчаною кислотою речовини 26 утворюється кемпферол, D-глюкоза і L-рамноза; речовин 27 і 28 – D-глюкоза. Ферментний гідроліз речовини 26 рамнодіастазою приводить до утворення кемпферолу і рутинози, 27 – до софорози, 28 – до D-глюкози.

Аналіз і порівняння фізико-хімічних властивостей виділених глікозидів 26, 27, 28 та достовірних зразків кемпферол-3-О-b-D-рутинозиду, кемпферол-3-О-софорозиду та кемпферол-3,7-О-диглюкозиду довели їх ідентичність відповідно.

Робінін (29). Сполука 29 гідролізується 2%-им розчином сірчаної кислоти до аглікону кемпферолу 21 і цукрів D-глюкози і L-рамнози. Кількісний гідроліз дає 36% аглікону, що вказує на вміст у глікозиді трьох цукрових залишків. Відсутність зсуву максимуму смуги поглинання в УФ-спектрі глікозиду при додаванні ацетату натрію і хлориду алюмінію свідчить про заміщенність – ОН при С-3 і С-7. Для підтвердження отриманих даних проведено ферментний гідроліз рамнодіастазою, в результаті отримано кемпферол-7-О-??-L-рамнозид і хроматографією на папері виявлено робінобіозу. При лужному гідролізі в гідролізаті були виявлено кемпферол-3-О-робінобіозид і L-рамноза.

На підставі отриманих даних і даних УФ-,ІЧ-, ПМР-спектрів речовину 29 ідентифіковано як кемпферол-3-О-?-робінобіозидо-7-О-?-L-рамнопіранозид або робінін.

Глікозиди кверцетину.

Кверцитрин (31); ізокверцитрин (32) та гіперозид (33) – жовті голчасті кристали. В УФ-спектрах сполук (31, 32 і 33) є два характерних максимуми (362, 255 нм та “плече” 265 нм) для флавонолів, у боковому фенільному радикалі яких є вільне орто-гідроксиугрупування. УФ-спектри з діагностичними добавками вказують на наявність вільних гідроксигруп в положеннях 5,7,3ў,4ў. При кислотному гідролізі речовин виявлено аглікон (т. плавл. 312 - 314°С ) з виходом 63 - 64%, що характерно для моноглікозидів. Будову аглікону сполук (31, 32 і 33) встановлено аналогічно речовині 30. Суміш аглікону та кверцетину не дає депресії т. плавл., отже аглікон ототожнений як кверцетин. Гідролізати досліджено на вуглеводний компонент методом хроматографії на папері з вірогідними зразками L-рамнози, D-глюкози та D-галактози. У сполуці 31 ідентифіковано L-рамнозу, у 32 – D-глюкозу, у сполуці 33 – D-галактозу.

Сполуки 31 охарактеризовано як кверцетин-3-О-b-D-рамнопіранозид (кверцитрин); 32 – як 5,7,3ў,4ў-тетрагідрокси–3-О-b-D-глюкопіранозид флавон (ізокверцитрин); 33 – як 5,7,3ў,4ў-тетрагідрокси-3-О-b-D- галактопіранозид флавона (гіперозид).

Рутин (34). Біокверцетин (35). При кислотному гідролізі речовини 34 утворюється аглікон – кверцетин (30) та цукри D-глюкоза, L-рамноза; речовини 35 – кверцетин D-галактоза і L-рамноза. У фільтрованому УФ-світлі речовини 34 і 35 виявляються у вигляді темних плям, що свідчить про заміщенність гідроксилів при С-3. Дані ступінчастого гідролізу речовини 34 виявили L-рамнозу і ізокверцитрин (32), а речовини 35 – L-рамнозу і гіперозид (33). У результаті проведеного ферментного гідролізу речовини 34 отримано кверцетин і рутинозу, а 35 – кверцетин і робінобіозу (D-галактозил (6)-??-L-рамнозид).

Отже, речовини 34 ідентичні кверцетин-3-О-b-D-рутинозиду (рутину); 35 – кверцетин-3-О-робінобіозиду (кверцетин-3-О-b-D-галактопіранозил-О-??-L-рамно-зиду або біокверцетин).

Антозид (36). Речовина 36 виявляється на хроматограмах у вигляді темно-коричневої плями. Після проведення кислотного гідролізу 2% сірчаною кислотою на киплячій водяній бані протягом 30 хв флюоресценція речовини змінюється на жовту, що свідчить про заміщеність ОН-групи при С-3 у вихідній речовині. В гідролізаті виявлено кверцетин (30), D-глюкозу і L-рамнозу, що характерно і для рутину. Проте, відсутність вираженого зсуву у УФ-спектрі при додаванні натрію ацетату вказує на заміщене положення при С-7 кверцетину. Відсутність зсуву першої смуги при додаванні цирконія нітрату з кислотою лимонною вказує на заміщенність гідроксилу у С-3 положенні.

Таким чином, досліджувана речовина є диглікозидом, цукрові залишки якої приєднані при С-3 і С-7 положенням кверцетину. З метою з'ясування місця приєднання кожного цукру нами проведено ступінчастий лужний гідроліз глікозиду (36) 0,5% розчином КОН, в результаті отримано кверцетин-3-О-b-D-глюкопіранозид (32). Речовину 36 можна представити як кверцетин-3-О-b-D-глюкопіранозо-7-О-?-L-рамноніранозид (антозид).

Глікозиди ізорамнетину і рамнетину

Ізорамнетин– 3-O-b-D-глюкопіранозид (42). При кислотному гідролізі 2%-вою сірчаною кислотою розщеплюється на аглікон ізорамнетин (41) і D-глюкозу. Легко гідролізується ферментами виноградного равлика на ті ж компоненти. Методом УФ-спектроскопії з іонізуючими і комплексоутворюючими реагентами встановлено, що вільні ОН-групи знаходяться при С-5, С-7 і С-41 положеннях флавоноїдного ядра. При порівнянні УФ-спектрів аглікону (41) і досліджуваного глікозиду встановлено, що D-глюкоза приєднана до С-3 аглікону. Методом ферментного гідролізу b-гідролазою доведено b-глікозидний зв'язок глюкози з агліконом.

Досліджуваний глікозид 42 ідентифіковано як ізорамнетин-3-О-b-D-глюко-піранозид.

Нарцисин (43) при кислотному гідролізі 2%-вою сірчаною кислотою розщеплюється на аглікон ізорамнетин (41) близько 46%, D-глюкозу і L-рамнозу. Дані УФ-спектру свідчать про заміщенність гідроксилу у положенні С-3. Належність біози до рутинози доводили перйодатним окисленням і ферментним гідролізом.

Сполуку 43 ідентифіковано як ізорамнетин-3-O-b-D-рутинозид.

Ізорамнетин-3,7-ди-O-D-глюкопіранозид (44). Дактилін (45). Частка кожного аглікону, отриманого при кислотному гідролізі, складає близько 48% від ваги досліджуваних глікозидів. Хімічні перетворення даних речовин показано на схемі 1. Ступінчастий кислотний гідроліз приводить до утворення ізорамнетину і його монозидів: 3- і 7-глюкозидів (44) та 3- і 4'-глюкозидів (45). Ідентифікацію заміщеності положення С-7 і С-41 утруднено внаслідок спряженості цих положень. У продуктах лужного гідролізу речовини 44 отримано глікозид ідентичний ізорамнетину-3-глюкозиду, для речовини 45 продуктів гідролізу не виявлено. При вибірковому кислотному гідролізі речовини (45) отримано монозид, який ідентифіковано як ізорамнетин-4'-глюкозид.

В ІЧ-спектрах речовин відмічені смуги поглинання, властиві карбонілу ?-пірону (1660 см-1), гідроксильним (3520-3200 см-1) і метоксильній (2930 см-1) групам, ароматичному ядру (1615, 1575, 1520 см-1). Спектральні дослідження в області УФ-спектроскопії показали, що вуглеводні компоненти речовини 44 знаходяться у положеннях 3, 7, а речовини 45 – у 3, 4'. Визначення конфігурації глікозидних зв'язків проведено методом порівняння молекулярних обертань: обидві глюкози у глікозидах мають ?-конфігурацію глікозидних центрів.

Структуру досліджуваних речовин можна представити для речовин 44 як ізорамнетин-3,7-ди-О-b-D глюкопіранозид, для 45 як ізорамнетин-3,41-ди-О-b-D-глюкопіранозид (дактилін).

Рамнетин-3-О-b-D-галактопіранозид (47). Речовину виділено в незначній кількості. Будова речовини установлена на підставі даних УФ-спектрів, результатів кислотного і ферментного гідролізів. Аглікон речовини ідентичний вірогідному зразку рамнетина. При порівнянні УФ-спектрів аглікону і досліджуваного глікозиду встановлено, що D-глюкоза приєднана до С-3 аглікону. Методом ферментного гідролізу b-гідролазою доведено b-глікозидний зв'язок галактози з агліконом. Сполуку 47 ідентифіковано як 5,31,41-тригідрокси-7-метокси-3-O-b-D-галактопіранозид.

Схема 1. Хімічні перетворення дактилину і ізорамнетин-3,7-диглюкозиду

Ацильовані біозиди і триозиди кверцетину і кемпферолу;

триозиди кверцетину і кемпферолу

Кверцетин-3-О-b-софорозидо-п-кумарат (38). Речовина виділена з астрагалу і гороху посівного. Речовина 38 при кислотному та ферментному гідролізі з ферментним препаратом равлика утворює аглікон кверцетин, D-глюкозу і ароматичну кислоту, яка з діазотованою сульфаніловою кислотою дає червоне забарвлення. В ефірному витягу разом з кверцетином визначається також п-кумарова кислота. Ферментний гідроліз естеразами слимака і рамнодіастазою, а також мўякий лужний гідроліз приводить до появи речовин 37 та 2 – п-кумарової кислоти (схема 2).

Кількісний кислотний гідроліз речовини 38 приводить до виходу аглікону близько 38,5% по відношенню до глікозиду, що відповідає триглікозиду. Вичерпне метилювання речовини 38 йодистим метилом в сухому метанолі при