КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

КАПУСТЯН АНДРІЙ ВАСИЛЬОВИЧ

УДК 581.522.4: 577.150.36

ІЗОФЕРМЕНТНИЙ СКЛАД ПЕРОКСИДАЗИ

ОЗИМИХ ЗЕРНОВИХ ЗА УМОВ

НИЗЬКОТЕМПЕРАТУРНОГО СТРЕСУ

03.00.12. – фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедри фізіології та

екології рослин біологічного факультету Київського

національного університету імені Тараса Шевченка,

та в секторі фізіології та біохімії інтродукованих рослин

Ботанічного саду ім. акад. О. В. Фоміна Київського

національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник – доктор біологічних наук,

член-кореспондент УААН,

Професор Мусієнко Микола Миколайович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри фізіології та екології рослин

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Кравець Володимир

Степанович, Інститут фізіології

рослин та генетики НАН України, м. Київ

завідуючий відділом фізіології стійкості

кандидат біологічних наук Кожукало Валентина Євгенівна,

Національний Аграрний Університет, м. Київ.

старший викладач кафедри фізіології рослин,

вірусології та біотехнології

Провідна установа: Інститут ботаніки

ім. М. Г. Холодного НАН України

Захист відбудеться 17 червня 2002 р. о 14 год.

На засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24

в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

за адресою: 03127, м. Київ, проспект Глушкова 2, корпус 12

(біологічний факультет), ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64,

Спецрада Д. 26.001.24, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка: 01033, Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 15 травня 2002 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Життєздатність рослинного організму в значній мірі залежить від факторів зовнішнього середовища. Температура – один із найважливіших для рослин лімітуючий фактор навколишнього середовища. Низькі температури несприятливо впливають на ріст та розвиток рослин (Поліщук, 1962, Проценко, 1964; Туманов,1979; Kuroda, 1991; Willekens, 1995; Кравець, 1998). В умовах Лісостепу спостерігається вимерзання озимих зернових (до 30% посівів), викликаючи суттєві втрати врожаю. Тому зрозуміла увага, яка приділяється в Україні вивченню дії низьких температур на озимі зернові та фізіології їх зимостійкості.

Розробка фізіологічних методів підвищення стійкості рослин до низьких температур можлива лише на основі глибокого вивчення внутрішньої природи механізмів зимостійкості, що формуються в процесі адаптації до екстремальних факторів зовнішнього середовища (Андрєєва, 1988; Войников 1989; Guy, 1990; Стаценко, 1994; Houde, 1995).

Життєздатність будь-якого організму базується на ферментативних процесах, і особлива роль належить ферментним системам рослин у стійкості до низькотемпературного фактора (Петрова, 1985; Сарсенбаев, 1986; Савич, 1988; Perras, 1989; Schцner, 1990; Вовчук, 1991; Колупаев, 1993; Кучеренко, 1998). За дії низьких температур відбувається перебудова ферментативного апарату, націленого на можливість пристосування організму до існування в несприятливих умовах (Александров, 1984; Olien, 1985; Лютова, 1995).

Якісно нові можливості відкриває в цьому напрямку застосування молекулярно-генетичних маркерів. Дослідження механізмів зимостійкості з використання маркерних систем ізоферментного складу пероксидази дає можливість удосконалювати селекційний процес та давати оцінку зимостійкості селекційного матеріалу. Залежність між рівнем зимостійкості та трансформацією ізоферментного складу пероксидази потребує досконалого вивчення, і може виступати важливою ланкою у розширенні уявлень про формування адаптивних реакцій рослин до умов низькотемпературного стресу.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було з`ясування ролі активності, ізоферментного складу, рівня експресії генів пероксидази в механізмах формування стійкості озимих зернових до низькотемпературного стресу.

Для досягнення поставленої мети до завдань роботи входило:

1. Розробити якісний та швидкий фізіологічний метод прогнозування зимостійкості озимих зернових, що знаходяться на сортовипробуванні, за показниками сумарної активності пероксидази.

2. На основі розробленого експрес методу відібрати контрастні сорти та лінії озимих зернових для дослідження ізоферментного складу пероксидази.

3. Дослідити зміни ізоферментного складу пероксидази у різних за зимостійкістю сортів та ліній озимих зернових за оптимальних умов та за умов низькотемпературного стресу.

4. Підібрати олігонуклеотидні затравки до чотирьох генів пероксидази у озимих сортів і ліній та оптимізувати умови полімеразної ланцюгової реакції.

5. Дослідити експресію генів пероксидази за рахунок реакції зворотної транскрипції з використанням полімеразної ланцюгової реакції для з`ясування механізмів формування зимостійкості у досліджуваних сортів та ліній озимих зернових.

6. На основі результатів проведених досліджень розробити рекомендації за фізіологічними та біохімічними параметрами, що визначають ступінь зимостійкості озимих зернових, для відбору батьківських пар у селекційний процес, а також для ранньої діагностики сортового матеріалу.

Об`єкт дослідження - зимостійкість озимих зернових

Предмет дослідження – молекулярно генетичні маркери пероксидази за умов низькотемпературного стресу.

Методи дослідження – системний підхід у дослідженні реакції рослин на дію низьких температур, біохімічне визначення зміни активності пероксидази, електрофоретичний розподіл ізопероксидаз, дослідження регуляції генів пероксидаз з використанням RT-PCR.

Наукова новизна одержаних результатів. В лабораторних умовах була створена оригінальна модель експериментального загартування озимих зернових для попереднього їх скринінгу за ознакою зимостійкості.

Виявлена направлена зміна активності та ізоферментного складу пероксидази у озимих зернових, що мають різну зимостійкість, за умов низькотемпературного стресу.

З`ясовано особливості активності та ізоферментного складу пероксидази в клітинах зимостійких сортів за умов низькотемпературного стресу. Встановлено, що у зимостійких сортів жита Київське 9, пшениць Миронівська 808, Мирлебен зростає інтенсивність вже існуючих зон з ВЕР 0,14; 0,20 та з`являються нові компоненти з ВЕР 0,23; 0,69.

Вперше розроблена система диференційної напівкількісної детекції специфічних мРНК генів рох3 та рох4 у Tritiсum aestivum за умов низькотемпературного стресу, що рекомендовано як функціональний маркер зимостійкості рослин.

Вперше досліджено регуляцію генів пероксидази за умов низькотемпературного стресу з використанням методики RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) .

Досліджено та визначено рівень експресії генів пероксидази за рівнем мРНК у різних за зимостійкістю озимих зернових за умов низькотемпературного стресу.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено експрес метод прогнозування зимостійкості озимих зернових за показниками активності пероксидази при оптимальних, загартувальних режимах вирощування, що захищений авторським свідоцтвом “Спосіб прогнозування зимостійкості озимих зернових” № 32911А від 15.02.01. р.

За сумарною активністю пероксидази, розроблено точну та просту у використанні методику прогнозування зимостійкості озимих зернових для прискореного відбору пар в селекційний процес.

Здійснено скринінг зимостійкості понад 70 сортів, ліній та гібридів озимих зернових, що знаходяться на сортовипробуванні. Рекомендовано до впровадження у виробництво понад 24 лінії та гібриди за ознакою зимостійкості.

Для дослідження рівня експресії генів пероксидази за кількістю мРНК у різних за зимостійкістю озимих зернових при низькотемпературному стресі оптимізовано умови полімеразної ланцюгової реакції.

На основі системного аналізу адаптаційних реакцій за умов низькотемпературного стресу рекомендовані нові надійні маркери для прогнозування зимостійкості озимих зернових як при попередньому лабораторному скринінгу селекційних форм, так і в умовах польового сортовипробування.

Особистий внесок здобувача. Дисертант опрацював чисельну літературу, самостійно оволодів відомими та розробив нові методики досліджень, брав участь у плануванні експериментів, підготовці матеріалу до друку. Експериментальні дані, висновки та рекомендації отримані здобувачем самостійно.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною наукової теми, кафедри фізіології та екології рослин Київського університету імені Тараса Шевченка № 97/090 “Екзогенна індукція адаптивних реакцій для стабілізації продуктивності зернових культур в несприятливих екологічних умовах” № державної реєстрації 0197U003136; проекту Фонду фундаментальних досліджень України ”Шляхи реалізації адаптивного потенціалу стійкості зернових культур в стресових умовах”, № державної реєстрації 0195U004230).

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на: Х з`їзді Українського ботанічного товариства (Київ-Полтава, 1997р.); конференція професорсько-викладацького складу Київського університету ім. Тараса Шевченка (Київ, 2001р.); міжнародна конференція “Роль ботанічних садів у збереженні рослинного різноманіття” (Київ, 1999); міжнародна конференція молодих вчених “Теоретичні основи інтродукції рослин і зеленого будівництва” (Київ, 2000 р.)

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладено в 8 наукових працях, зокрема, авторським свідоцтвом “Спосіб прогнозування зимостійкості озимих зернових” № 32911А від 15.02.01. р.

Об’єм роботи. Дисертація містить 150 сторінок друкованого тексту і складається зі вступу, 3 розділів, заключної частини, висновків, списку літератури. Робота ілюстрована 26 рисунками, 8 таблицями. Список використаних джерел включає 279 найменувань, у тому числі 135 праць іноземних авторів.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для порівняльної характеристики зимостійкості озимої пшениці, дослідження ізоферментного складу пероксидази та дослідження рівня експресії генів пероксидази були використані різні види, сорти, гібриди та лінії зернових вітчизняної та іноземної селекції, представлені Інститутом Землеробства УААН, та Одеським селекційно-генетичним Інститутом УААН. А саме:

cорти пшениці – Кінельська 9, Миронівська 808, Поліська 90, Поліська 90-

167, Поліська 90-209, Миронівська остиста, Миронівська 29, Миронівська 33, Миронівська 61, Кримська 10, Мирлебен, Soinson French, MV-24, Поліська 1, ІФ 124-94, Тіра;

лінії пшениці – № 1247-94, № 1009-95, № 1130-95, № 11004-96, № 11014-96, № 11041-96, № 11045-96, № 11061-96, № 11071-96, № 11154-96, № 11166-96, № 11225-96, № 11252-96, № 11253-96, № 7045 – 97, № 7020 – 97, № 7044 – 97, № 1788 – 97, № 1087 – 97, № 1088 – 97, № 1098 – 97, № 1114–97, № 1233 – 97, № 1584 – 97, № 1590 – 97, ПС 154 – 97, ПС 160-97, ПС 178 – 97, ПС 184 – 97, ПС 190 – 97, ПС 102 – 97, ПС 103 – 97, ПС 126– 97, ПС 127 – 97, ПС 136 – 97, ПС 144 – 97, ПС 155 – 97;

тритикале – Поліська 1, амфідиплоїди 55/96, 56/96, 58/96, 59/96, 3/5, ДR 9-95, ДР 265, ДР 358, ДР 371, ПТ 384, ПТ 387, ПТ 484, ПТ 488, СР –14, СР – 15, СР - 16, СР – 23, СР – 27.

жито – Київське 9;

ячмінь – Основа, Росава, Манас, Фермер, Одеський 165.

Досліди проводили в лабораторних та польових умовах: лабораторні – на базі кафедри фізіології та екології рослин Київського національного університету імені Тараса Шевченка, в секторі фізіології та біохімії інтродукованих рослин Ботанічного саду ім. акад. О.В. Фоміна, в Інституті клінічної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН; польові досліди здійснювали протягом 2-х вегетаційних періодів 1996/1997 та 1997/1998 базі відділу селекції зернових культур Українського науково-дослідного інституту землеробства УААН (с.м.т. Чабани, Київської області).

Лабораторні досліди проводили на 4-12 денних проростках, які вирощували в ростильниках при 22-230С, інтенсивність освітлення 5000 лк, відносна вологість повітря 65-70%, світловий період 16 год. Низькотемпературний стрес створювали за схемою:

1. Контроль – рослини весь час росли за оптимальних умов (22-230С).

2. Загартування – 4 денні рослини впродовж наступних п`яти діб удень росли за оптимальних умов (22-230 С, 10 год.), вночі – за температури (1-20С, 14 год.).

3. Стрес – 10 денні рослини після загартування витримували 2 доби за оптимальних умов (22-230С), а далі їх піддавали низькотемпературному стресу при -1-20 С протягом 48 год.

Сумарну активність пероксидази, визначали за методом Бояркіна (Бояркин, Бояркина, 1961). Електрофорез проводили в апараті “Хійу Калур”. Ізопероксидази виявляли після електрофоретичного розподілу білків в 7,5% поліакриламідному гелі, рН 8,3 (Сафонов, Сафонова, 1969; Гааль и др., 1982). Денситографічний аналіз здійснювали зв допомогою програми “TotalLab v 1.10”

Експресію генів пероксидази рох 1, рox 2, рox 3, рox 4 досліджувала за рахунок ампліфікації продуктів, отриманих на мРНК матриці за допомогою реакції зворотної транскрипції RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) з використанням праймерів, що вироджені в деяких позиціях, щоб їхні послідовності задовольняли умовам компліментарності усіх чотирьох генів пероксидази: рох1 1). 5‘-ссttcgcgacatctctcagggcca-3‘, 2). 5‘-ctggtccgagtgcaggagccctt-3‘, рox2 1). 5‘-ссttcgcgacgtctctcaaggcca-3‘, 2). 5‘-ctggtccgagtgcaggagccttt-3‘, рox3 1). 5‘-ссttcgccacatctctcagggcca-3‘, 2). 5‘-ctggtccgagtgcaggagccctt-3‘, рox4 1). 5‘-ссttcgcaacatctctcagggcca-3‘, 2). 5‘-ctggtcggagtgcaggagccctt-3‘.

Олігонуклеотидні затравки були синтезовані за допомогою фосфораметидного методу на синтезаторі “Applaid biosistem” та очищені за допомогою гель-електрофорезу в 20% акриламіді та знесолені за допомогою гельфільтрації з використанням Toyеperl HW-40.

Реакцію зворотної транскрипції проводили протягом 1 години при 370С з використанням зворотного праймеру 5‘-ctggtc(c/g)gagtgcaggagccc(c/t)tt-3‘. Отриману кДНК ампліфікували в ампліфікаторі “Perkin Еlmer 2400” протягом 35 циклів: денатурація 940С 20 сек., асоціація праймерів 670С 20 сек., синтез 720С 10 сек (). Отримані продукти детектували в 10% акриламідному гелі за допомогою горизонтального електрофорезу в трісборатному буфері. Гель після електрофорезу фарбували бромистим етидієм (1мкг/мл). Фрагменти спостерігали за допомогою ультрафіолетового транслюмінатора (Маниатис, 1985).

Біологічна повторність дослідів 3-4-х кратна, аналітична – 9-ти кратна. Результати оброблені статистично з використанням загальноприйнятих методик (Доспехов, 1985).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Прогнозування зимостійкості озимих зернових за показниками активності пероксидази. Як відомо при дії низькотемпературного стресу у рослини відбуваються процеси адаптації, що полягають у зниженні термостабільності функцій та зростанні числа функціональних одиниць (Александров, 1984). Тобто відбувається зростання інтенсивності дихання для створення високого енергетичного потенціалу, що спричиняє утворення в ЕТЛ супероксидних радикалів, дія яких призводить до “окислювального стресу” у клітині. У відповідь не це у зимостійких сортів зростання сумарної активності пероксидази зумовлене змінами властивостей ферменту, викликаного адаптивними змінами генотипової та модифікаційної природи.

На основі виявленої закономірності чітко проявляється маркерна функція пероксидази у процесах формування зимостійкості, яка була взята за основу розробленого та запатентованого методу прогнозування зимостійкості озимих зернових.

Щоб здійснити попередній скринінг генотипів озимих зернових, що знаходяться на сортовипробуванні, ми застосували розроблений та запатентований нами спосіб прогнозування зимостійкості рослин за показниками активності пероксидази за різних температурних режимів. Нами було дано оцінку зимостійкості 70 сортам, гібридам, лініям озимих злаків (жито, пшениця, тритикале). Паралельно були проведені польові досліди. Одержані дані співпадають зі станом перезимівлі у вегетацію 1996/1997 та 1997/1998 років (рис. 1).

Рис. 1. Порівняльні показники зимостійкості озимих зернових за даними

пероксидазного аналізу та наслідками перезимівлі в природних

умовах (1996/1997)

1. жито Київське 9; 2. пшениці Миронівська 808; 3. Мирлебен; 4. Миронівська 61; 5. Кінельська 9; 6. лінія № 11004-96; 7. лінія № 11014-96; 8 лінія № 11071–96; 9. лінія № 1130–95; 10. ПС 144-97; 11. Миронівська 33; 12. Миронівська 29; тритикале 13. Поліська 1; 14. амфідиплоїд 55/96; 15. ПТ-384; 16. ПТ-488; 17. ПС 154-97; 18. ПС 178-97; 19. ПС 102-97; 10. ПС 103-97

Рослини, що вимерзли в цей період мали відношення активності пероксидази при оптимальній температурі (21-230С) (Аопт.) до активності при стресі (Ахол) менше одиниці, що корелює (??0,9208) з низькою ферментативною активністю пероксидази. Рослини з задовільною зимостійкістю мали співвідношення пероксидази за різних температурних режимів Ахол/Аопт більше одиниці, тобто їх пероксидазна система здатна протистояти низькотемпературному стресу.

Зима 1997/1998 років теж характеризувалась екстремальними умовами перезимівлі: відносно тепла осінь (середня за місяць в листопаді 2,50С при нормі 0,80 С), велика сума опадів в зимові місяці (грудень 205 % від норми, січень – 111%, лютий – 106 %), та коливання температур від низьких позитивних (в других декадах грудня 2–4оС, січня 3–50С) до екстремальних (кінець грудня, третя декада січня –100С). Озимі зернові не пройшли процеси яровизації, що відбуваються при низьких температурах (-1, +20С…+60С). В свою чергу відносно велика сума опадів в зимові місяці та коливання температур сприяли випріванню та вимоканню озимих зернових. Тому не дивно, що зразки, відібрані після несприятливої зими 1996/1997 рр. з екстремальними умовами при застосуванні пероксидазного аналізу показали задовільну зимостійкість (Рис.2).

Рис. 1. Порівняльні показники зимостійкості озимих зернових за даними

пероксидазного аналізу та наслідками перезимівлі в природних

умовах (1997/1998)

1. пшениці Миронівська остиста; 2. Кримська 10; 3. Поліська 90; 4. Поліська 90-167; 5. Поліська 90-209; 6. Тіра 6112-96; 7. лінія № 11041-96; 8. лінія № 11045; 9. лінія № 11061-96; 10. лінія № 11166-96; 11 лінія № 11225-96; 12 лінія № 11253-96; 13. тритикале: амфідиплоїди 56/96; 14. – 58/96; 15 – 59/96; 16 – 3/5; 17. ДR 265; 18. ДR 358; 9. ДR 371; 20. ПТ-387

За результатами попереднього скринінгу були відібрані 25 батьківських пар в селекційний процес за ознакою зимостійкості: а саме лінії пшениці № 11041-96, № 11045, № 11061-96, № 11166-96, № 7020-97, № 7044-97, № 1788-97, № 1087-97, № 1114-97, № 1585-97; тритикале – 58/96, 59/96, 3/5, ДR. 265, ДR 358, ДR 371, CP 14, CR 15, CR 16, CR 27, ПС 160-97, ПС 127-97, ПС 136-97, ПС 155-97.

Значна кількість ферментів у відповідь на зниження температури збільшують свою спорідненість до субстрату, тобто знижують константу Міхаеліса (Кm) і тим самим стримують або прискорюють швидкість метаболічних процесів. Тобто пероксидаза міняє свою спорідненість до субстрату із-за впливу температури на її конформацію. Оскільки зимостійкість генетично детермінована ознака, то постає питання за рахунок яких механізмів адаптації зростає сумарна активність пероксидази у зимостійких генотипів озимих зернових.

Виявлення співвідношення активності пероксидази за умов низькотемпературного стресу Ахол до активності пероксидази при оптимальній Аопт є штучний показник для оцінки генотипу, і щоб з'ясувати чим він зумовлений, перед нами постало питання які перебудови ферментативного апарату відбуваються при низькотемпературному стресі, а також досі поки повністю не з`ясована роль ізоферментів пероксидази до змін температури в межах толерантної зони.

Авторські права захищені патентом А 01 Н 1 /04 № 98073930 від 15. 02. 2001 р. “Спосіб прогнозування зимостійкості озимих зернових”.

Дослідження ізоферментного складу озимих зернових. Для з`ясування адаптаційних змін модифікаційної природи та дослідження ізоферментного складу пероксидази був використаний електрофоретичний розподіл в ПААГ. За допомогою розробленого нами способу були відібрані контрастні сорти та лінії озимих зернових, а саме зимостійке жито Київське 9 Ахол/Аопт 2, зимостійкі пшениця Миронівська 808 та Мирлебен Ахол/Аопт 1,8 і незимостійкі лініі № 11014-96 та № 11004-96 Ахол/Аопт 0.82

Аналіз електрофоретичних спектрів пероксидаз озимого жита Київське 9 до і після загартування показує наявність якісних змін, які проявляються у зростанні інтенсивності зон з ВЕР 0.11 та 0.14 (рис 3-ІІ. піки № 2,3), а також зменшенні інтенсивності зони з ВЕР 0.20 (пік № 4). Тобто, за умов загартування, зростання інтенсивності зон з ВЕР 0.11 та 0.14 свідчить про зміну спрямованості метаболічних процесів під час підготовки рослин до перенесення низьких температур в зимовий період.

Рис. 3. Денситограми ізоферментів пероксидази жита Київське 9.

І – контроль, ІІ – загартування, ІІІ – стрес.

Значні зміни кількості окремих компонентів і в цілому всього ізопероксидазного спектру спостерігаємо у варіанті стрес. Аналізуючи фореграми та їхні денситограми, спостерігаємо значне зростання кількості пероксидаз в повільнорухливій фракції (рис.3-ІІІ). За умов низькотемпературного стресу в порівнянні із загартуванням значно підвищується інтенсивність зони з ВЕР 0,14; 0.20 (піки № 2,3), а також з`являється мінорний компонент з ВЕР 0,23 (пік № 5). Малоймовірно, що це з`являється новий ізофермент, очевидно, в теплових варіантах активність цієї зони низька. Можна припустити, що відмічені нами збільшення інтенсивності окремих ізоферментів пероксидази та тривале збереження інтенсивності на цьому рівні пов`язане із загартуванням рослин.

При загартуванні за температури –1-2 0С протягом 4-х діб у проростків озимих сортів та ліній пшениці активність деяких ізопероксидаз підвищується. У зимостійкої пшениці Миронівська 808 (рис. 4. - ІІ). Спостерігається зростання

Рис. 4. Денситограми ізоферментів пероксидази пшениці Миронівська 808.

І – контроль, ІІ – загартування, ІІІ – стрес.

інтенсивності зон з ВЕР 0,09; 0,14; 0,20; 0.25. Це можливо пояснити тим, що механізм адаптації шляхом зміни ізоферментного складу обмежений тим, що різноманітні форми ферменту не взаємозамінні із-за специфічності їх локалізації та функціонального різноманіття в метаболізмі клітини. За умов низькотемпературного стресу ми теж спостерігаємо зростання інтенсивності зон з ВЕР 0,09; 0,20; та 0,25. (рис.4.-ІІІ), піки № 3,5,6. Тобто стабільність ізоферментного складу пероксидази у зимостійкого сорту пшениці Миронівська 808 може розглядатися як непрямий покажчик конформаційної лабільності, яка здійснюватися за рахунок слабких взаємодій просторової структури ферменту.

У незимостійкх ліній в порівнянні з контролем за умов загартування на фореграмах ми не спостерігаємо появу нових мінорних компонентів. У лінії № 11004-96 в порівнянні з контролем за умов загартування на фореграмах ми не спостерігаємо появу нових мінорних компонентів (рис.5) спостерігається незначне зростання інтенсивності компонентів з ВЕР 0,14; 0,25; 0,59. Денситографічний аналіз дає підставу стверджувати, що накопичення пероксидази у незимостійкої лінії пшениці № 11004-96 (піки № 3-7) за умов низькотемпературного стресу не спостерігається.

Рис. 5. Денситограми ізоферментів пероксидази лінії пшениці № 11004-96

І – контроль, ІІ – загартування, ІІІ – стрес

На фореграмах за низькотемпературного стресу у незимостійкої ліній № 11004-96 в порівнянні з загартуванням ми не спостерігаємо появу нових компонентів та зростання активності вже існуючих.

У лінії № 11014-96 при загартуванні спостерігається незначне зростання інтенсивності компонентів з ВЕР 0,14; 0,25; 0,59 (рис. 6-ІІ піки № 3, 4, 5, 6).

Рис. 6. Денситограми ізоферментів пероксидази лінії пшениці № 11014-96

І – контроль, ІІ – загартування, ІІІ – стрес.

У незимостійкої лінії пшениці № 11004-96 за умова низькотемпературного стресу спостерігається деградація компонентів з ВЕР 0,14; 0,20; 0,59 (рис.6.-ІІ піки № 2, 3, 6) та зростання інтенсивності існуючих зон з ВЕР 0,32 (пік № 4)

Найбільш суттєві зміни в електрофоретичних спектрах спостерігались у зимостійкого сорту Мирлебен. За умов низьких температур на електрофореграмах ми спостерігали зростання інтенсивності існуючих зон з ВЕР 0,18; 0,23 (рис. 7-ІІ

піки № 5, 6) та появу мінорних компонентів в швидкорухливій фракції з ВЕР 0,68; 0,73. (піки № 7,8).

Рис. 7. Денситограми ізоферментів пероксидази пшениці Мирлебен.

І – контроль, ІІ – загартування, ІІІ – стрес

Експериментальні дані, отримані нами, у різноманітних за зимостійкістю озимих сортів та ліній пшениці дають можливість стверджувати, що зниження температури впливає на ізопероксидазні спектри: у зимостійких сортів зростання сумарної активності пероксидази обумовлене, зростанням активності вже існуючих ізопероксидаз та появою нових компонентів у зонах з ВЕР 0,32; 0,68 та 0,73. Ці зони, можливо, мають велике значення в низькотемпературній стійкості озимих сортів пшениці, очевидно їх накопичення пов`язане з підготовкою рослин до перенесення негативних температур в зимовий період. У незимостійких поява нових зон та зростання активності вже існуючих не відмічено.

Таким чином, за компонентним складом пероксидази у озимих сортів та ліній зернових (ячмінь, жито, пшениця, амфідиплоїди), за умов низькотемпературного стресу можна характеризувати зимостійкість досліджуваних сортів. На основі цих даних може бути розроблений метод прогнозування зимостійкості генотипів озимих зернових за зміною ферментативної активності лужних ізоформ пероксидаз з ВЕР 0,14; 0,20 та появою нової зони з ВЕР 0,23 у випадку жита.

Дослідження рівня експресії генів пероксидази за умов низькотемпературного стресу. Як відомо, зростання активності ферменту може бути обумовлене багатьма причинами. Одна з них - це та, що активність ферменту може зростати за рахунок його адаптаційних модифікацій, інша - за рахунок зростання кількості молекул, тобто зростання рівня експресії генів або генетичної адаптації.

Подальшою метою нашої роботи було з`ясування механізмів формування генетичної адаптації у зимостійких сортів Миронівська 808 та Мирлебен. Для цього нами було залучено сучасні технології кількісної детекції специфічних нуклеїнових кислот, зокрема мРНК, що кодують фермент пероксидазу.

В дослідженнях, що були проведені за останні роки показано, що адаптація рослин до дії низьких температур, яка супроводжувалася підвищенням зимостійкості, тісно пов`язана зі змінами в експресії генів (Guy, 1990; Thomashow, 1993; Ouellet, 1993). Найчастіше ці зміни під дією температур призводять до появ нових зразків мРНК і накопичення специфічних білків (Durham, 1991; Войников, 1991; Limin, 1995; Gana, 1997; Vazquez-Tello, 1998).

У наших дослідженнях також виявлено кореляцію між рівнем мРНК генів пероксидази та ступінню зимостійкості сортів та ліній пшениці. При проведенні нами полімеразної ланцюгової реакції для дослідження рівня експресії генів пероксидази у сортів та ліній пшениці за оптимальних умов та за умов низькотемпературного стресу було детектовано 2 продукти ампліфікації. Ці продукти реакції з молекулярною масою 146 та 152 п.н., спостерігаються у всіх сортів та ліній пшениці. Вони відповідають теоретично передбаченим фрагментам мРНК генів пероксидази рох3 та рох4, що свідчить про універсальний характер експресії цих генів у проростках озимих сортів та ліній пшениці.

При проведенні електрофорезу продуктів після 30 циклу ампліфікації на електрофореграмі у всіх варіантах за оптимальних умов (22-250С) та за умов низькотемпературного стресу (-1-20С) ми спостерігаємо напрацювання продуктів із молекулярною масою 145 та 151 п.н., але у зимостійких сортів кількість напрацьованого продукту у випадку стресу була більшою (рис.8 ).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Рис. 8. Електрофореграма продуктів RT-РCR з РНК матриці сортів пшениці за

оптимальних умов та при низькотемпературному стресі (30 цикл ампліфікації).

Умовні позначки: 1.10. Маркери мол. маси ?Х 174/НаеІІІ.2. Миронівська 808 за

оптимальних умов. 3. Миронівська 808 за умов низькотемпературного стресу.

4. Мирлебен за оптимальних умов. 5. Мирлебен за умов низькотемпературного

стресу. 6. Лінія № 11004-96 за оптимальних умов. 7. Лінія № 11004-96 за умов

низькотемпературного стресу. 8. Лінія № 11014-96 за оптимальних умов.

9. Лінія № 11014-96 за умов низькотемпературного стресу.

При порівнянні результатів отриманих нами з аналогічними інших авторів, ми приходимо до висновку, що більші рівні експресії генів за умов низькотемпературного стресу мають зимостійкі сорти. Так, при дослідженні рівня експресії гена tarc7 у тканинах злаків двох генотипів, що відрізняються за зимостійкістю [Кравець 30], були використані два мутанти озимої пшениці – Sdmut16029 з високим рівнем зимостійкості та Sdmut16169 – із низьким. Порівняння експресії гена tarc7 за низьких температур у двох вказаних генотипів виявило більш високий рівень у зимостійких форм. Найбільша відмінність в експресії дослідженого гена виявлена через 3 тижні росту рослин за температури 20С.

Таким чином, за результатами наших досліджень у зимостійких сортів Миронівська 808 та Мирлебен за умов низькотемпературного стресу сумарна активність пероксидази зростала за рахунок зростання рівня експресії генів рох3 та рох4, а у незимостійких ліній зростання рівня експресії генів за тих же умов ми не спостерігали. Отже, стійкість сортів озимих зернових до умов низькотемпературного стресу слід розглядати як генетично детерміновану ознаку.

Стійкість рослин до негативних факторів визначається складними регульованими генетичними системами. Зміни рівнів експресії генів рох3 та рох 4, визначені нами для деяких сортів та ліній пшениць, за дії низьких температур також займають певне місце серед механізмів адаптації, визначаючи фізіологічний стан рослин, впливаючи на метаболізм, стійкість, ріст та розвиток.

Розроблена нами система диференційної напівкількісної детекції специфічних мРНК генів рох3 та рох4 у Tritiсum aestivum за умов низькотемпературного стресу може бути застосована як функціональний маркер зимостійкості рослин.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що окремі типи спектру пероксидази за умов низькотемпературного стресу можуть бути фізіологічними маркерами, що беруть безпосередню участь в адаптації рослин до умов низькотемпературного стресу. У зимостійких озимих сортів жита Київське 9, пшениць Миронівська 808, Мирлебен за умов низькотемпературного стресу зростає інтенсивність вже існуючих зон із ВЕР 0,14; 0,20 та з`являються нові компоненти з ВЕР 0,23; 0,69.

2. Вперше було досліджено рівень експресії генів пероксидази за рівнем мРНК, у різних за зимостійкістю озимих зернових за умов низькотемпературного стресу. У сортів та ліній пшениці чітко спостерігаються продукти ампліфікації з молекулярною масою 146 та 152 п.н., що відповідають фрагментам мРНК генів пероксидази рох3 та рох4.

3. У зимостійких сортів за умов низькотемпературного стресу зростає сумарна активність пероксидази, яка у свою чергу пов`язана зі зростанням рівня експресії генів.

4. В лабораторних умовах були змодельовані та підібрані умови експериментального загартування для озимих зернових різних культур, що знаходяться на етапі конкурсного сортовипробування в Інституті Землеробства УААН (с.м.т. Чабани) .

5. Запропоновано метод визначення зимостійкості озимих зернових, що базується на встановленні співвідношення активності пероксидаз за оптимальних умов (Аопт), та за умов дії низьких температур (Ахол). Рослини тих сортів та ліній, в яких співвідношення Ахол/Аопт більше одиниці - зимостійкі, а сорти та лінії, що мають співвідношення Ахол/Аопт менше або рівне одиниці, неспроможні протистояти дії низьких температур, тому характеризуються низькою зимостійкістю.

6. Проведено попередній скринінг 70 сортів, гібридів та ліній озимих злаків (жито, пшениця, тритикале) на зимостійкість. Було виявлено 24 зимостійкі лінії та гібриди озимих зернових, що можуть бути відібрані в селекційний процес за ознакою зимостійкості. Зимостійкими виявились: пшениці – Миронівська 808, Мирлебен, Миронівська 33, Миронівська 29, Миронівська остиста, Кінельська 9, Поліська 90, лінії № 11041-96, № 11045, № 11061-96, № 11166-96, № 7020-97, № 7044-97, № 1788-97, № 1087-97, № 1114-97, № 1585-97; тритикале – 58/96, 59/96, 3/5, ДR 265, ДR 358, ДR 371, CP 14, CR 15, CR 16, CR 27, ПС 160-97, ПС 127-97, ПС 136-97, ПС 155-97.

7. Розроблена система диференційної напівкількісної детекції специфічних мРНК генів рох3 та рох4 у Tritiсum aestivum за умов низькотемпературного стресу може бути застосована як функціональний маркер зимостійкості рослин.

8. У пристосуванні рослин до низькотемпературного стресу адаптація може відбуватися за рахунок генотипічних механізмів (експресія генів, що включає в себе зміну первинної структури ферменту, а також посттрансляційні хімічні перебудови) та модифікаційних механізмів (конформаційні перебудови).

СПИСОК ОСНОВНИХ ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Кучеренко В.П., Капустян А.В., Шередеко Л.М. Прогнозування зимостійкості озимих зернових за показниками активності пероксидази // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Інтродукція та збереження рослинного різноманіття”. - 1999 - 2. - С. 72-73.

Капустян А.В., Кучеренко В.П., Мусієнко М.М. Вплив низькотемпературного стресу на активність пероксидази проростків пшениці // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Біологія”. - 1999. - 29. - С.43-45.

Капустян А.В., Кучеренко В.П. Зміна ізопероксидазного спектра проростків жита при низькотемпературному стресі // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Інтродукція та збереження рослинного різноманіття”. - 2000 - 3. - С.61-63.

Капустян А.В., Кучеренко В.П., Мусієнко М.М. Зміна ізопероксидазного складу сортів ячменю при низькотемпературному стресі // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Біологія”. - 2000. - 30. - С.83-85.

Капустян А.В. Фермент пероксидаза – універсальний маркер зимостійкості рослин // Інтродукція рослин. – 2000.- №1. – С. 152-154.

Кучеренко В.П., Капустян А.В. Пероксидаза – маркерний фермент низькотемпературного стресу стресі // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Інтродукція та збереження рослинного різноманіття”. - 2001 - 4. - С.65-69.

А.с. 98073930 А 01 Н ?. Кучеренко В.П., Капустян А.В., Шередеко Л.М. Мусієнко М.М. “Спосіб прогнозування зимостійкості озимих зернових”. № 32911А від 15.02.01. р.

Капустян А.В. Прогнозування адаптаційної здатності у Hordeum vulgare L. Матеріали з`їзду Х Українського ботанічного товариства // Київ-Полтава, - 1997. – С. 133.

АНОТАЦІЯ

Капустян А.В. Ізоферментний склад пероксидази озимих зернових за умов низькотемпературного стресу. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 – фізіологія рослин. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Ключові слова: Triticum аestsvum, низькотемпературний стрес, ізоферменти, зимостійкість, адаптація, пероксидаза, експресія генів.