Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Курчій Богдан Олексійович

УДК 581.1+577.1

Біологічна роль абсцизової кислоти і етилену та їхній синтез

в рослинах за дії стресів

03.00.04 - біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики

Національної академії наук України

Науковий консультант: доктор біологічних наук,

Яворська Вікторія Казимирівна

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

завідувач відділом фізіології росту і розвитку рослин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

Мусатенко Людмила Іванівна

Інститут ботаніки імені М.Г. Холодного НАН України,

завідувач відділом фітогормонології

доктор біологічних наук,

Кравець Володимир Степанович,

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

завідувач відділом стійкості рослин

доктор біологічних наук,

Терек Ольга Іштванівна,

Львівський національний університет імені Івана

Франка,

завідувач кафедри фізіології та екології рослин

Провідна організація: Чернівецький національний університет

імені Ю. Федьковича

Захист відбудеться 17 червня 2002 р. о 12 год.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 при Київському

національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою:

вул. Академіка Глушкова 2, корп. 12, біологічний факультет, конференцзала

Поштова адреса: 01033, Київ, вул. Володимирська 64, біологічний факультет, спецрада Д 26.001.24

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розіслано 14 травня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

О.В. Брайон

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Природні регулятори росту рослин (фітогормони) є медіаторами ендогенної програми росту і розвитку, вони також інтегрують екзогенний сигнал у фізіолого-біохімічні процеси рослин. Проте складні перехресні сигнальні шляхи між рістстимулюючою і рістінгібуючою дією фітогормонів ускладнюють розуміння первинних механізмів дії як ендогенних регуляторів росту, так і ксенобіотиків. Експериментальні дані свідчать [Косаківська, 1997; Мусатенко и др., 1999; Bleecker, 1999; Bonetta & McCourt, 1998], що механізми синтезу, дії і метаболізації регуляторів росту тісно між собою пов'язані, а втрата контролю, наприклад за дії стресорів, над протіканням реакцій, навіть на одній із цих стадій, може негативно відбитися на формуванні біомаси рослин [Таран, 1999]. Дія різноманітних хімічних і фізичних факторів супроводжується зміною фізіологічного стану рослин, вмістом ендогенних регуляторів росту, зокрема таких фітогормонів як етилену [Abeles et al., 1992] і абсцизової кислоти (АБК) [Косаківська, 1997; Leung & Giraudat, 1998], різким збільшенням оксидантів [Sies, 1984], зменшенням концентрації АТФ [Rawyler et al., 1999], а також порушенням балансу між оксидантами і антиоксидантами [Girotti, 1990]. Хоча реакції синтезу етилену в основних рисах вивчені [Abeles et al., 1992], фактори, які активують значне його утворення за дії різноманітних стресових чинників досліджені фрагментарно. АБК ідентифікована у вищих рослинах, водоростях і грибах [Zeevaart & Creelman, 1988] як невід'ємний компонент гормональної системи. Проте значне збільшення її синтезу і роль у рослинах за стресових станів недостатньо з'ясована і дискутується. Знання молекулярних механізмів синтезу і ролі цих біорегуляторів за дії фізичних і хімічних факторів, з'ясування сигнальних ієрархій і даних про метаболічні зміни, виражені у стрес-відповідях, необхідні як для контролю за стресовими процесами з метою зменшення їх негативної дії на рослини, так і для оптимізації селекційного процесу при відборі стрес-стійких видів. Тому необхідним було з'ясувати механізми активації утворення АБК і етилену, а також біологічну роль цих регуляторів росту рослин за дії різних стресорів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно наукових планів відділу фізіології росту і розвитку рослин Інституту фізіології рослин і генетики НАН України:

- Вивчити роль біологічно активних речовин (БАР) в регуляції окремих етапів онтогенезу рослин і розробити способи їх використання для підвищення врожайності с/г культур (1.01.92-31.12.96 рр.). Шифр проблеми 2.28.5, Шифр теми 2.3.6/238. (Виконавець розділу).

- Створення регуляторів росту та дослідження фізіологічних основ їх застосування для підвищення продуктивності рослин (1.01.97-31.12.2001 рр.). Шифр проблеми 2.28.5, Номер держреєстрації 0199V00386. (Виконавець розділу).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було з'ясування механізмів активації синтезу етилену і АБК, а також біологічної ролі цих сполук за дії стресових чинників. Для чого необхідно було реалізувати такі задачі:

- вивчити вміст АБК, її синтез та механізми дії,

- вивчити синтез етилену тканинами різних рослин, динаміку акумуляції поза тканинами та механізми його дії,

- дослідити можливий зв'язок між вмістом фосфоліпідів, жирних кислот і продуктів пероксидного окиснення ліпідів мембран (малонового діальдегіду і гідропероксидів) таактивацією синтезу АБК і етилену.

Об'єкт дослідження: механізми дії і метаболізм природних регуляторів росту рослин етилену та АБК за впливу фізичних і хімічних факторів.

Предмет дослідження: стрес-маркери етилен і АБК, фосфоліпіди, жирні кислоти, 1-аміноциклопропан-1-карбонова кислота (АЦК).

Методи досліджень: газова хроматографія етилену, газорідинна і тонкошарова хроматографії АБК і жирних кислот, спектрофотометрія пігментів і малонового діальдегіду.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що:

Абсцизова кислота, зменшуючи оксидантну дію стресових чинників, функціонує у рослинах як антиоксидант.

Активація синтезу етилену за дії хімічних чинників і обезводнення може відбуватися неферментативно при розкладі різних речовин клітини, в тому числі і компонентів ліпідів мембран, таких як похідні холіну.

Похідні холіну ацетилхолін.HCl, холін.HCl і синтетичний ретардант росту рослин хлорхолінхлорид (ССС, ХХХ) розкладаються in vitro у лужному середовищі з утворенням етилену.

Етилен діє аналогічно діквату, активуючи процеси пероксидного окиснення ліпідів клітин рослин.

Теоретична та практична значимість роботи. Сформульована концепція ролі АБК як природного антиоксиданта і запропоновано молекулярні механізми її біологічної дії. Збільшення ендогенної концентрації АБК за дії хімічних і фізичних чинників являється однією з реакцій захисних антиоксидантних систем у відповідь на збільшення у клітинах концентрації окиснювачів. Базуючись на експериментальних даних ініціації пероксидного окиснення ліпідів клітин, запропоновано вільнорадикальний механізм дії етилену. Обробкою рослин антиоксидантами можна досягти зменшення деструктивного впливу хімічних і фізичних стресів. Отримані експериментальні дані і узагальнення можуть бути використані при створенні нових синтетичних біорегуляторів, а також в курсах лекцій з біохімії та фізіології рослин у ВУЗах.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснено інформаційний пошук та оцінку літературних даних, розроблено робочі гіпотези та обґрунтована методологія постановки експериментів, здійснено експериментальні дослідження, проведено інтерпретацію і узагальнення отриманих результатів, самостійно або у співавторстві написано статті.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати за матеріалами дисертації були представлені на: · 7-й конференции молодых ученых-биологов, Март 1987, Рига; · II Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений, 25-27 мая 1988 года, Киев; · Научной конференции "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов", Уфа, 1989; · Ethylene: physiology, biochemistry and practical application. An International Conference to mark the 90th anniversary on the discovery of ethylene as plant growth regulators by DN Nelubov (1886-1926), 16-21 July 1992, Moscow - Puschino - St. Peterburg; · From Molecular Mechanism to the Plant: An Integrated Approach. 10th FESPP Congress, Florens, Italy, 9-13 September 1996; · Miami Nature Winter Symposium "Advances in Gene Technology: Biomolecular Design, Form and Function", 1-5 February 1997; · International regional seminar "Environment Protection: Modern Studies in Ecology and Microbiology", 13-16 May 1997, Uzhorod (Ukraine); · XVIII Congress of SPPS. The Scandinavian Society for Plant Physiology, Uppsala, Sweden, 12-17 June 1997; · Proc. of the International Conference on Рlant Ontogenesis in Natural and Transformed Environments, 1-4 July 1998, Lviv, Ukraine; · II International Symposium on Plant Biotechnology, 4-8 October 1998, Kyiv (Ukraine); · Seventeenth Annual Symposium "Current Topics in Plant Biochemistry, Physiology and Molecular Biology. Plant Hormones: Signaling and Gene Expression", 14-17 April 1999, University of Missouri; · International Symposium "Signalling Systems of Plant Cells", Moscow, Russia, 5-7 June 2001; · Annual Meeting "Botany 2001: Plants and People", August 12-16, 2001, Albuquerque, New Mexico · International Symposium "Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems (ISPAS)", 9-14 September 2001, Kyiv, Ukraine.

Публікації. Матеріали дисертації викладені у 47 основних і допоміжних публікаціях у фахових виданнях та 2 патентах України.

Об'єм і структура дисертації. Дисертація викладена на 345 сторінках (формат А4, комп'ютерна верстка). Структура дисертації: вступ, 3 глави, висновки, список використаної літератури 683 джерел, таблиць – 25, рисунків – 53.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єкти досліджень. Об'єктами досліджень були рослини: озимого жита (Secale cereale L., сортів Поліське тетра і Богуславка), озимої пшениці (Triticum aestivum L., сортів Миронівська 808 і Киянка), томатів (Licopersicon esculentum, сортів Київський, ранній строк дозрівання, і Донецький, пізній строк дозрівання), квасолі (Phaseolus vulgaris L., сорт Лопата), хвоя ялини європейської (Picea abies [L.] Kersten) і ялини срібної (Picea pungens Engelm.), а також тканини плодів яблунь (Pyrus malus L., сорт Кальвіль сніговий).

Препарати, використані в роботі. В роботі використовували препарати кампозан М (етефон) фірми Біттерфельд, дігідрел виробництва Волгоградського заводу хімпрепаратів, хлористий холін, ацетилхолін (HCl і HJ солі) виробництва російського заводу "Мосмедпрепараты", 2-хлоретилтриметиламмоній хлорид (ССС) виробництва російських заводів, АБК (Abscisin II), гіберелін, ІОК, 2,4-Д, Tris.HCl і Tris фірми "Serva", дикват - фірми "Renal", тордон - фірми "DowElanco (USA)" (рис.1). Пластинки для тонкошарової хроматографії фірми "Сhemapol".

Рис. . Структурні формули препаратів етефону, етилену, піклораму, (+),S-АБК, зеатину, діквату, IОК, гліфосату і ГК3, використаних в роботі.

Визначення етилену. Етилен визначали на газовому хроматографі "Chromatograph-504" (Польща) і "Selmihrom" (Суми). При визначенні на "Chromatograph-504" використовували скляну колонку довжиною 1 м заповнену Поропаком-Т, температура колонки - 70°С, температура детектора - 100°С, температура випаровувача - 150°С. Витрати водню - 40 мл/хв, азоту - 40 мл/хв і повітря -300 мл/хв [Курчий, 1991]. При визначенні на хроматографі "Selmihrom" з полум'яно іонізаційним детектором та комп'ютерним управлінням використовували стальну колонку довжиною 2 м, діаметром 3,2 мм заповнену Поропаком-Q (Poropack-Q, 80-100 mesh). Температура термостата 70°C, потоки N2, H2 і O2 (повітря) були 33, 33 і 350 мл/хв відповідно [Kurchii, Kurchii, 2000]. Ідентифікація етилену здійснювалася порівнянням з часом утримання стандарту.

Визначення АБК. Вміст АБК визначали: 1) газохроматографічним методом на хроматографі "Цвет-106" з детектором електронного захоплення в модифікації Гогебашвілі і Булах [1983]. Температура детектора і випарювача - 230°С, колонки - 210°С. Швидкість газу-носія азоту 40 мл/хв. Використовували скляну колонку довжиною 2 м, діаметром – 3 мм наповнену Chromaton-N-super і просочену 3% OV-225; 2) методом хроматографії високого тиску та 3) методом тонкошарової хроматографії в модифікації Савинського із співавт. [Савинский и др., 1991].

Визначення ліпідів і жирних кислот. Ліпіди із мембран клітин виділяли як описано в [Leonard, Van der Woude, 1976; De la Roche, 1972]. Хроматографію ліпідів здійснювали згідно методик [Ахрем,1965; Новицкая, Руцкая, 1976]. Жирні кислоти визначали методом газорідинної хроматографії [Синяк и др., 1976]. Препарати плазматичних мембран отримували із мікросомальної фракції розділенням її в градієнті густини сахарози [Leonard,Van der Woude, 1976]. Метилові ефіри жирних кислот готували згідно [Синяк и др.1976] і ідентифікували в газорідинному хроматографі "Цвет-100" з полум'яно-іонізаційним детектором.

Визначення пігментів. Хлорофіли визначали як описано в Мачаклан і Залік [Machachlan, Zalik, 1963]. Екстракцію проводили в 80%-ному ацетоні (спирті), екстракти просвітлювали центрифугуванням при 2500 об/хв і визначали на спектрофотометрі СФ-20 при довжині хвиль 645 і 663 нм.

Визначення АЦК. АЦК визначали згідно процедури, описаної Крістман і Френзель [Christmann, Frenzel, 1997]. Зірвані листки (2 г) заморожували в рідкому азоті і розтирали в 35 мл розчину метанол:0,04 фосфатного буферу рН 7,0 (3:1 об'єм/об'єм). Після фільтрації на целюлозному фільтрі метанол випаровували при 35°С під вакуумом. Водний залишок доводили дистильованою водою до 10 мл і центрифугували при 2000 g протягом 15 хв. 0,5 мл супернатанту використали для аналізу АЦК згідно методу Лізади [Lizada, Yang, 1979]. АЦК поміщали в флакони об'ємом 5 мл і розкладали за допомогою NaClO. Водний залишок після центрифугування використали також для визначення малоніл АЦК (МАЦК). Супернатант після центрифугування із АЦК гідролізували в 6 M HCl при 100°C протягом 3 год. Отриманий розчин нейтралізували насиченим розчином NaOH, доводили до загального об'єму 2 мл і центрифугували до просвітлення. AЦК визначали до і після гідролізу в HCl [Gallardo et al., 1991]. Різниця у вмісті АЦК до і після HCl-гідролізу визначена як MAЦК в екстракті.

Визначення гідропероксидів ліпідів. До наважки ліпідів 2 мг добавляли 12,5 мл суміші хлороформ/оцтова кислота (1:1), продували азотом, закривали на 5 хв, добавляли 1 мл 50%-ного розчину йодистого калію і витримували 10 хв в холодильнику. Після цього добавляли 20 мл дистильованої води і 1 мл 1%-ного розчину крохмалю, перемішували і титрували 0,001 н розчином тіосульфату натрію. Вміст гідропероксидів виражали в йодних процентах (J%), [Aрутюнян и др., 1979].

Визначення малонового діальдегіду (МДА). Для визначення МДА 1 г тканин гомогенізували в 10 мл 20%-ої трихлороцтової кислоти + 1 мМ ЕDТА і центрифугували при 3500 g протягом 10 хв. До 3 мл гомогенату добавляли 1 мл 0,67% тіобарбітурової кислоти і кип'ятили при 100°С протягом години в запаяних ампулах. Спектрометрію гомогенатів проводили на СФ-20 при 532 нм.

Дані експериментів обробляли статистично з використанням загальноприйнятих методик [Доспехов, 1985].

Біологічна функція АБСЦИЗОВОЇ КИСЛОТИ та її синтез за дії стресових чинників

Залежність між вмістом АБК у функціонально різних клітин рослин і їх фізіологічним станом. Отримані нами дані при вивченні впливу ретарданту кампозану (етефон, продуцент етилену in vivo, рис.1) на підвищення стійкості озимого жита до вилягання, свідчили про суттєве збільшення концентрації АБК у рослинах за дії етилену [Калинин, Курчий, 1986]. Проте ці дані не давали відповіді на питання про механізми збільшення кількості АБК при одночасному зменшенні інших природних регуляторів (ІОК, ГК3 і зеатину). Оскільки досліди були проведені тільки на одній стадії розвитку, ми продовжили наші дослідження по визначенню вмісту АБК на інших стадіях онтогенезу рослин озимого жита. Виявлено (табл. 1) [Курчій, 2000], що найбільша концентрація АБК була у меристематичних і хлорофілоносних тканинах. У меристемах етіольованих паростків (перший листок) АБК було в 5,4 раза більше, ніж у цілих (разом із коренями) паростках. Паростки, оброблені етефоном і дікватом містили в 1,4 і 1,2 рази відповідно більше цієї кислоти у порівнянні з необробленими. У зернівках у фазі молочної стиглості АБК було в 1,7 раза більше, ніж у фазу воскової стиглості. Таким чином, максимальний вміст АБК був характерний для меристематичних тканин і хлорофілоносних листків озимого жита на стадії молочної стиглості, тобто у тканинах з інтенсивними процесами росту або метаболізму .

Отримані нами дані не підтверджували роль АБК як інгібітора росту рослин [Addicott, 1983; Кефели, 1977; Петелина, 1981], оскільки, наприклад у зрілих зернівках її мало бути більше, ніж на стадії інтенсивного росту. В 1982 р. Chen T. (США) для явища збільшення концентрації АБК в томатах за дії температурного стресу запропонував термін для АБК – "стресовий гормон". В кінці 80-х і протягом 90-х років опубліковані статті [див. огляди Leung and Girodat, 1998; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000], в яких уже відмічалася позитивна роль АБК за дії фізичних і хімічних чинників.

Дія продуцентів етилену на рослини озимого жита супроводжувалася зменшенням вмісту ІОК, зеатину, ГК3 і збільшенням АБК [Калинин, Курчий, 1986]. Оскільки існує тісна кореляція між вмістом гомонів "стимулюючої" (ІОК, зеатину, ГК3) і гальмівної (АБК, феноли) дій, потрібно було з'ясувати, як буде змінюватися концентрація АБК за дії ІОК, зеатину і ГК у рістгальмівних концентраціях. Для порівняння також використовували синтетичні препарати ауксиноподібної дії піклораму, 2,4-Д, а також гербіциду діквату. Для дослідів нами були відібрані препарати, молекулярні механізми дії яких добре вивчено, наприклад, дікват відомий як ініціатор пероксидного окиснення ліпідів [Jones, Мale, 2000].

Таблиця 1 Вміст АБК у різних тканинах та фазах озимого жита

Варіанти ABК нг / г . сухої речовини

Зернівки (молочна стадія) 321,33±34,33

Зернівки (воскова стадія) 183,17±23,11

Зернівки (повна зрілість) 3,36±0,15

Листки з рослин на стадії молочної стиглості (польовий дослід) 482,77±35,34

Етіольовані паростки (контроль) 93,45±2,22

Етіольовані паростки (дікват 2,7.10-3 М)* 118,76±3,34

Етіольовані паростки (етефон 3,4.10-3 М)* 131,24±3,78

Меристеми етіольованих паростків (надземна частина) 504,34±32,54

*АБК у етіольованих 96-годинних паростках (пагони разом із коренями) визначали через 24 години після обробки їх дікватом і етефоном на 72-й годині проростання.

Отримані дані засвідчили зменшення маси сухої речовини після обробки рослин досліджуваними препаратами (рис.2А) [Курчий, 1992]. Через 24 год у всіх варіантів відмічено збільшення ендогенного вмісту вільної (рис.2Б) і зв'язаної форм (рис.2В) АБК. Загальна кількість АБК збільшувалася протягом 24 год після обробки, а через 48 год знижувалася, залишаючись дещо більшою, ніж у контролі. У паростків, оброблених розчинами АБК, спостерігалося збільшення її рівня в початковий період. Таким чином, у відповідь на дію різних регуляторів росту ендогенний вміст АБК спочатку збільшувався, а потім різко знижувався. В цей же час синтетичні процеси (вміст сухої речовини) у паростках значно гальмувалися. Якби вміст АБК збільшувався постійно, можна було би вважати її якоюсь мірою відповідальною за гальмування росту паростків. Проте зменшення вмісту АБК через 48 год не привело до відновлення росту паростків, які через 72 год усихали. На підставі цих даних дійшли висновку, що АБК не була першопричиною гальмування росту паростків озимого жита.

Для подальшого з'ясування ролі АБК у цьому явища, нами досліджено вплив екзогенної АБК на ріст паростків озимого жита одночасно з іншими регуляторами росту. Ми виходили з того, що коли АБК має відношення до гальмування росту паростків, вона може посилювати гальмівну дію інших біологічно активних речовин (БАР).

Витримування паростків озимого жита у розчині АБК за 1 год, одночасно або через 2 год після обробки їх розчинами діквату, 2,4-Д і ІОК не змінювала рістгальмівної дії цих БАР. Витримування коренів паростків озимого жита у розчині АБК (10-5 М) протягом 24 год, або у розчині АБК 10-3 М протягом однієї години за 2-4 год до обробки розчинами діквату, 2,4-Д і ІОК приводило до ослаблення дії останніх. Хоча екзогенна АБК не знімала повністю рістгальмівну дію діквату, 2,4-Д і ІОК, вона значно її послаблювала. Отже, АБК ослаблювала дію діквату, 2,4-Д і ІОК, але не впливала на біохімічні процеси, які вже були ініційовані цими регуляторами.

Рис. 2. Маса сухої речовини (А) паростків озимого жита і вміст у них вільної (Б) і зв'язаної (В) АБК після обробки: 1 - Н2О, 2 - 2,4-Д (10-2 М), 3 - ХЕФК (10-2 М), 4 - піклорамом (10-2 М) і 5 - дікватом (10-5 М).

Для того, щоб з'ясувати, чи отримані нами дані про вміст АБК за дії стресів є видоспецифічною реакцією, ми вивчили дію ряду природних і синтетичних БАР на ендогенний вміст цього регулятора у листках квасолі (Phaseolus vulgaris L., сорт Лопата). Вміст АБК у листках квасолі під впливом обробки різними регуляторами також значно збільшувався (табл.2) [Курчій, Яворська, Григорюк, 2001]. Максимальна концентрація АБК у варіантах із етефоном і тордоном зафіксована через 48 год, а в подальшому знижувалася. У варіантах із ГК3, зеатином, дікватом, ССС і 2,4-Д максимальна концентрація АБК виявлена через 48 год. Через 72 год у всіх варіантах вміст АБК зменшувався. Зменшення вмісту АБК співпадало зі значним побурінням і зав'яданням листків. Концентрація АБК у рослин, оброблених водою, використаною для розчинення досліджуваних речовин, зазнавала незначних змін протягом експерименту.

Фізичні фактори, наприклад зневоднення, також спричиняли збільшення ендогенного вмісту АБК. Так, при зневодненні (припинення поливу) рослин томатів, вміст АБК у листках збільшувався (рис.3) [Григорюк, Нижник, Курчій, 2001]. Це свідчать, що не тільки різні тканини, але і різні види рослин як за нормальних умов, так і під впливом стресорів відрізняються за ендогенним вмістом АБК.

Окиснювальний метаболізм каротинів: синтез абсцизової кислоти. Приведені вище дані свідчать, що під впливом рістгальмівних концентрацій різних БАР вміст АБК значно збільшувався. В зв'язку з цим необхідно було з'ясувати механізми активації синтезу АБК за умов гальмування ростових процесів. Синтез АБК по мевалоновому шляху потребує значних енергетичних затрат. Проте за дії стресорів процеси накопичення, наприклад АТФ гальмуються [Cooke, 1990], що підтверджується також гальмуванням накопичення сухої речовини. В той же час це можливо, якщо АБК утворювалася при розкладі раніше синтезованих речовин, зокрема каротинів.

Таблиця 2 Вплив різних регуляторів росту на вміст АБК у листках квасолі

Варіанти досліду AБК, нг/г . сухої речовини

Час після обробки препаратами, год

24 48 72

Контроль (H2O) 220,8±34,6 224,5±32,4 221,7±37,1

ГК3 (10-2 M) 563,2±32,2 582,7±27,6 288,5±12,8

Зеатин (10-2 M) 594,4±29,8 611,9±25,2 312,4±15,2

Дікват (10-2 M) 596,3±35,5 623,4±29,4 276,6±13,6

ССС (10-2 M) 622,4±28,7 654,7±37,8 227,7±10,9

2,4-Д (10-3 M) 643,2±36,6 689,9±35,5 187,8±11,4

ІОК (10-2 M) 687,1±34,6 732,2±36,8 202,5±12,9

Етефон (10-3 M) 787,5±33,4 742,1±37,1 134,5±12,7

Тордон (10-4 M) 812,3±38,9 714,4±44,6 93,8±11,8

Для перевірки цієї ідеї ми визначили вміст каротинів та АБК в зелених листках 20-денних паростків озимого жита, оброблених дікватом або етефоном. Збільшення ендогенного вмісту АБК спостерігалося уже через 24 год (рис. 4) [Курчій, 2000]. Максимальна концентрація АБК визначена через 48 год, після чого вона знизилася, але залишалася більшою, ніж на початку досліду, і в порівнянні з контрольними рослинами. Отже, в умовах стресу швидке збільшення вмісту АБК могло відбуватися за рахунок розкладу раніше синтезованих попередників.

Оскільки функцією каротинів є нейтралізація вільних радикалів [Rau, 1988; Vershinin, 1999], то при взаємодії їх з вільними радикалами (в наших дослідах це могли бути молекули діквату, активовані у вільнорадикальний стан в тканинах рослин) вони можуть розкладатися з утворенням різних сполук, в тому числі і АБК (рис. 5) [Курчій, 2000].

Базуючись на літературних і наших даних, в запропонованій нами схемі є два можливі шляхи початкового метаболізму b-каротину. Перший - починається із включення гідроксильної групи в кільце з утворенням лютеїну, зеаксантину і криптоксантину і другий, який починається із перетворень в ланцюгу і закінчується утворенням радикала з альдегідною групою. Як видно із нашої схеми, утворення "хвоста" АБК може відбуватися як по шляху І, так і ІІ. Не виключено також паралельне утворення АБК двома шляхами. Слід зазначити, що при окиснювальному метаболізмі b-каротину утворюються такі сполуки як ретиналь і ретинол (вітамін А – відомий як антиоксидант), які відрізняються від АБК тільки 5 атомами вуглецю в радикалі із ненасиченими зв'язками.

Рис. 4. Вплив діквату (10-3 М) на ендогенний вміст АБК (А, нг/г.сухої речовини; 1 - контроль, 2 – дікват, Н2О), b-каротину, хлорофілів і сухої речовини (Б, % до контролю, 1 і 2 - маса сухої речовини: 1 - контроль, 2 - дікват; 3 - b-каротин, 4 - хлорофіли), зеаксантину і віолаксантину (В, % до контролю, 1 - зеаксантин і 2 віолаксантин) в зелених листках 20-денних паростків озимого жита.

Регулювання окиснювальних процесів у тканинах рослин абсцизовою кислотою. Для того, щоб перевірити, чи АБК впливає на окисні процеси у клітинах рослин, ми дослідили дію відомого окиснювача діквату і етилену , а також відомого

Рис. 5. Гіпотетичний окисно-відновний механізм трансформації b-каротину та утворення АБК.

антиоксиданта аскорбінової кислоти на вміст ліпідів етіольованих паростків озимого жита, попередньо пророщених на середовищі із АБК і аскорбіновою кислотою (АК). Встановлено (табл. 3) [Курчій, 2001], що під впливом діквату і етилену вміст фосфатидилхоліну (ФХ) і фосфатидилінозитолу (ФІ) зменшувався. АБК послаблювала, але повністю не знімала, дію діквату і етилену на вміст цих ліпідів. Оскільки АК була менше ефективною у зменшенні рістгальмівної дії діквату, ніж АБК, ми не проводили подальших досліджень із цією кислотою.

Досліджено вплив АБК на відносний вміст жирних кислот сумарних ліпідів різних тканин етіольованих 72-годинних паростків озимого жита (табл. 4) [Курчій, 2001]. Найефективнішою була дія АБК в концентрації 1.10-7 М при внесенні в водне середовище вирощування етіольованих паростків і в 1.10-5 М для зелених паростків озимого жита. Більші концентрації АБК повністю не знімали рістінгібуючої дії діквату і етефону і, навіть, посилювала їх гальмівну дію. Одночасна обробка АБК з дікватом чи етефоном, як і обробка за 4, 6 і 12 год не зменшила рістінгібуючої дії цих регуляторів. Можливо, що для ефективної дії АБК як антиоксиданта потрібна її трансформація у інші форми, наприклад відновлення до 1',4'-діол АБК, яка як і антиоксидант гідрохінон має дві гідроксильні групи і відома як один із метаболітів АБК.

Нижче наведена схема, в якій дві ОН-групи при С1'- і С4'-атомах можуть бути активними, як антиокиснювачі, при віддачі двох атомів водню на нейтралізацію вільних радикалів (рис.6) [Курчій, 2000].

Таблиця 3 Вплив діквату і етефону на відносний вміст окремих класів фосфоліпідів (мкг, %) тканин етіольованих паростків озимого жита

Варіанти Ліпіди ФХ ФЕА ФГ ФІ ФК НІ

Контроль, Н2О 59,33±2,11 24,70±0,92 5,31±0,75 6,45±0,22 0,01±0,0 4,20±0,41

Дікват , 2,7.10-3 М 49,11±2,89 30,33±1,98 9,83±0,62 4,12±0,35 1,44±0,0 5,17±0,71

Етефон , 3,4.10-3 M 47,28±3,11 32,73±2,77 8,66±0,53 4,21±0,37 1,91±0,0 5,11±0,45

AБК, 2.10-7 М* + дікват, 2,7.10-3 М 54,31±2,78 26,44±1,87 7,22±0,76 5,72±0,42 1,51±0,0 4,86±0,39

AБК, 2.10-7 М** + етефон, 3,4.10-3 М 54,27±3,21 26,77±1,98 8,43±0,77 5,56±0,40 1,48±0,0 4,56±0,29

* пророщування в розчині AБК (1.10-7 М) протягом 24 год. до обробки дікватом

** пророщування в розчині AБК (1.10-7 М) протягом 24 год. до обробки етефоном

Розвиток ланцюгових реакцій пероксидного окиснення ліпідів за нормального (оптимального) функціонування клітини регулюється речовинами протилежної дії - антиокиснювачами, котрі нейтралізують активні вільні радикали. Аналіз структури різних метаболітів АБК свідчить, що власне антиоксидантом може бути 1',4'-дигідрооксі-АБК (структура В, рис.6) [Kurchii, 1977]. Остання, віддаючи два атоми водню на нейтралізацію вільних радикалів, переходить у вільнорадикальну структуру C. Вільнорадикальні структури АБК можуть утворювати різні кон'югати. Кон'юговані сполуки неактивні (в першу чергу як антиокисданти), або малоактивні, часто внаслідок зниження їх переміщення в тканинах (клітинах).

Таблиця 4 Вплив діквату і етефону на відносний вміст жирних кислот (мол, %) сумарних ліпідів етіольованих паростків озимого жита

Варіанти Жирні кислоти 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 НІ

Контроль 0,4±0,0 17,6±0,4 1,7±0,2 1,4±0,2 4,2±0,3 12,5±0,8 60,0±1,2 2,4±0,0

Дікват , 2,7.10-3 М 0,5±0,0 19,5±0,6 0,8±0,2 6,0±0,5 11,4±0,7 17,9±0,8 42,3±2,3 1,6±0,1

Етефон , 3,4.10-3 M 0,5±0,0 18,9±0,5 0,9±0,3 5,5±0,6 10,4±0,9 16,1±0,9 40,0±1,9 1,7±0,1

AБК (2.10-7 М)* 0,4±0,0 17,1±0,5 1,2±0,3 2,2±0,4 5,1±0,3 14,4±0,9 58,3± 2,1 2,1±0,1

AБК, 2.10-7 М* +дікват, 2,7.10-3 М 0,4±0,0 18,2±0,4 1,3±0,3 1,8±0,4 4,8±0,2 14,5±0,7 56,2±2,2 2,2±0,2

AБК, 2.10-7 М** +етефон, 3,4.10-3 М 0,4±0,0 18,5±0,5 1,5±0,2 1,9±0,4 4,9±0,3 13,8±0,8 54,2±1,9 2,1±0,2

* пророщування в розчині AБК (1.10-7 М) протягом 24 год. до обробки дікватом

** пророщування в розчині AБК (1.10-7 М) протягом 24 год. до обробки етефоном

Рис. 6. Окисно-відновний шлях метаболізму АБК.

Таким чином, нейтралізуючи вільні радикали, АБК може попереджувати деструктивний вплив останніх, і тому її присутність в рослинах у високих концентраціях закономірна. Це є захисною реакцією рослин на збільшення рівня окиснювачів у клітинах. Водночас зменшення ендогенної концентрації АБК в тканинах, яке спостерігалось через 72 год можна пояснити як її руйнуванням в реакціях нейтралізації вільних радикалів, так і недостатнім синтезом de novo.

Біологічна роль етилену і механізми його синтезу у рослинах за дії стресових чинників

На початку 80-х років було встановлено, що для вираження біологічної дії етилену потрібні іони металів змінної валентності, зокрема іони Cu1+, а також асоційовані з мембранами гіпотетичні рецептори [Sisler, Yang, 1984; Smith, Hall1984]. Інтенсивні дослідження багатьох лабораторій протягом 20-ти останніх років принципових змін у механізми дії етилену не внесли: рецептори не ідентифіковані і залишаються гіпотетичними сполуками, роль міді не з'ясована. Ідентифіковані білки, які зв'язуються з міченим етиленом [Chang, 1999; Bleecker, 1999], котрі вважаються рецепторами. Проте, є деякі сумніви в тому, що виділені білки, які зв'язувалися з міченим етиленом і є рецепторами, а не наслідком метаболічних перетворень етилену: невідомо, коли відбувається зв'язування етилену з білками – до, чи після його дії на клітинні метаболіти.

При порівняльному дослідженні біологічної дії дейтерованого (С2D4) і протонованого (С2Н4) етилену на розтягнення зрізаних коренів гороху роботами Абелеса і Руса [Abeles, Ruth, 1972] і Бейера [Beyer, 1972] не було виявлено ізотопного ефекту цих речовин. Дослідники дійшли висновку, що біологічна дія етилену не пов'язана з розривом С-Н зв'язку. Оскільки різниці з міченим і неміченим етиленом не було виявлено в дослідах цих авторів, то це є свідченням відсутності звичайних іонних реакцій. Теоретично тут можливі два типи реакцій: відщеплення і приєднання. Оскільки енергія подвійного зв'язку більша, ніж одинарного, то при звичайних умовах (температури і тиску) окиснення етилену не відбувається [Fiser, Fiser, 1964]. В той же час олефіни досить легко можуть вступати в реакції приєднання вільних радикалів. Такі реакції відбуваються без енергії активації, або при дуже малій її величині [Ingold, 1969; Nonhebel, Walton, 1974], тобто енергія зв'язку не впливає на швидкість реакції. Якщо в середовищі різних молекул утворюються вільні радикали, то це призведе до утворення окиснених сполук. Із наявних біополімерів у клітині найбільш чутливими до окиснювачів є ліпіди (ненасичені жирні кислоти) [Pryor, 1976]. При пероксидному окисненні ліпідів (ПОЛ) в результаті їх фрагментації утворюється ряд високореакційних сполук, серед яких є пероксиди, альдегіди і діальдегіди [Pryor, 1976]. Тому в подальшому ми досліджували вплив етилену на активацію ПОЛ, стан окисненості яких визначали за вмістом МДА та гідропероксидних сполук.

Ініціація пероксидного окиснення ліпідів клітинних мембран – можливий молекулярний механізм дії етилену. Отримані дані (табл. 5) [Курчій, 2001] свідчать, що вміст MДA і гідропероксидних сполук у етіольованих паростках (72-годинні колеоптилі з коренями) озимого жита збільшувався під впливом як етефону, так і діквату.

Таблиця 5 Вміст MДA і гідропероксидів в етіольованих паростках озимого жита після обробки етефоном і дікватом

Варіанти MДA мікромоль/г білка години 6 12 24 Гідроперокиди, J% . 10-3 години 6 12 24

Контроль, Н2О 29,1±1.8 27,3±2,2 28,2±1,5 5 12 17

Етефон, 3,4.10-3 М 31,2±1,4 33,2±1,6 37,3±1,8 18 27 34

Дікват, 2,7.10-3 М 30,9±1,6 34,1±1,7 36,7±2,2 16 25 31

Таким чином, як дікват, так і етилен спричиняли збільшення вмісту МДА і гідропероксидів у тканинах паростків озимого жита, що може свідчити про подібність біологічної дії обох речовин.

Оскільки механізм дії етилену тісно пов'язаний із механізмом його утворення [Abeles et al., 1992], то логічно, що певну інформацію про первинні механізми дії етилену і його біологічну роль могли б дати дані про молекулярні механізми його утворення. Принциповим тут є питання, який етилен переважає в клітині: утворений ферментативним, чи не ферментативними (альтернативними) шляхами, тобто, чи утворення етилену генетично детермінований, чи побічний процес метаболізму (деструкції) біополімерів клітини.

Синтез етилену за дії хімічних і фізичних чинників. Найбільш дослідженим шляхом утворення етилену є ферментативний із метіоніну (рис.7). Проте субклітинні місця його синтезу залишаються невідомими [Kende, 1993]. Більшість етилену, що утворюється в цитоплазмі, транспортується в вакуолярні компартменти у вигляді кислоти [Saftner, Baker1987] або її малоніл кон'югата [Bouzayen et al.,1989; Saftner1994]. Проте, чи оцінювана кількість виділеного етилену залежить від збільшення синтезу, зменшення розкладу, чи посилення транспорту залишається також невідомим.

В той же час збільшення виділення етилену під дією стресів [Abeles et al., 1992] вказує на можливість значного синтезу етилену не ферментативними шляхами. Літературні дані щодо механізмів синтезу етилену, узагальнені нами на рис.8 [Курчій, Яворська, 2001]. Гіпотетично етилен може утворюватися в різних реакціях: ферментативних, вільнорадикальних і в реакції розщеплення четвертинних амонієвих сполук за Гофманом. Таким чином, існує не менше 8 шляхів утворення етилену. При цьому одна частина (Y1) виділяється в навколишнє середовище із клітин, друга (Y2) – метаболізується або зв'язується з іншими біополімерами, а третя (Y3) - зберігається в компартментах клітини. Кількісні співвідношення між цими трьома частинами етилену невідомі.

Рис. 7. Механізм утворення етилену із метіоніну [McKeon et al., 1995].

Виходячи із того, що на виділення етилену різними тканинами впливає багато як фізичних, так і хімічних чинників, нами вивчено синтез етилену тканинами яблук (як модельний об'єкт тканини плодів яблук виділяли етилен у найбільших кількостях у порівнянні із іншими рослинами) із ключових його попередників АЦК і малоніл АЦК (МАЦК) під впливом різних БАР і за обезводнення.

Встановлено, що синтез етилену (рис.9) [Курчій, 2001] збільшувався під впливом діквату в концентрації 2,7. 10-3 М, тоді як в концентрації 2,7. 10-2 М - зменшувався. Під впливом діквату вміст АЦК зменшувався, а виділення етилену збільшувалося, досягаючи максимуму на 24 год експозиції (2,7. 10-3 М), тоді як під впливом АБК вміст обох сполук зменшувався. Аналогічні дані отримані нами і в дослідах з етіольованими паростками (72-годинні колеоптилі з коренями) озимого жита. Дікват в концентрації 2.10-3 M стимулював виділення етилену, тоді як концентрації 2.10-2 M інгібував цей процес. Таким чином, вміст МАЦК в клітинах знаходився в тісній кореляції із вмістом АЦК. Проте зв'язку між виділеним етиленом і вмістом МАЦК нами не встановлено. Можливо, що МАЦК може бути метаболітом випадкової кон'югації двох сполук.

Утворення етилену за дії хімічних стресорів досліджено у різних видів рослин: листках озимого жита (однодольні), томатів і квасолі (дводольні), вирощених в польових умовах. Утворення етилену під дією діквату та гербіцидів тордону і гліфосату наведено в табл. 6 [Курчій, Яворська, 2001]. Виявлено, що всі досліджені рослини виділяли етилен і етан. Найбільшу кількість етилену виділяли листки томатів сорту Київський, найменшу - листки жита. В наступні 24 год, тобто з 25 по 48 год, етилен утворювався в незначній кількості. Невелике збільшення утворення етилену відмічено через 72 год. експозиції, тобто в період з 49 по 72 год. Неподрібнені листки ранньостиглого сорту томатів Київський в перші 24 год виділяли в 1,6 разів більше етилену, ніж пізньостиглого сорту Донецький.

Рис. 8. Гіпотетичні шляхи утворення етилену. Сумарна кількість утвореного етилену Е=Х1 + Х2 + Х3

+ Х4 + Х5 + Х6 + Х7 + Х8 .

Рис.9. Вміст АЦК та синтез етилену в тканинах плодів яблук. А – АЦК (вільна і зв'язана), Б –МАЦК, В – етилен. 1 – контроль (Н2), 2 - дікват, 2,7. 10-3 М, 3 - дікват, 2,7. 10-2 М. Замірювання проводили через 24 і 48 годин після подрібнення тканин на куски та обробки їх дікватом на протязі 20 хвилин. Вміст АЦК перед дослідом: 20,4±0,03.

Виявлена закономірність утворення етилену і етану. Так, при утворенні великої кількості етилену, утворювалася незначна кількість етану і навпаки. Через 48 год експозиції (з 25 по 48 год) утворення етану в листках збільшилося, а етилену різко знизилося (в більшості варіантів виявлено його слідові кількості). При цьому у подрібнених листках етану утворювалося більше, ніж у неподрібнених. Через 72 год (з 49 по 72 год) утворення етилену знову збільшувалося, а етану різко зменшувалося. В подрібнених листках усіх варіантів етилену утворювалося менше, ніж у неподрібнених, проте етану більше. Так, у подрібнених листках озимого жита, квасолі і томатів в перші 24 год утворювалося відповідно 55%, 70%, 58% і 85% від такої кількості етилену, утвореного цілими листками і відповідно більше етану: 246%, 175%, 240% і 184,5%.

Після обробки рослин гербіцидами дікватом, тордоном і гліфосатом за 5 годин перед зрізанням листків для дослідів, стимулювалося різке утворення етилену в перші 24 год, етану в цей перід утворювалася незначна кількість. Найбільша кількість етилену утворювалася у листках, оброблених тордоном, менша - гліфосатом і найменша - дікватом. Наприклад, тордон в перші 24 год експозиції стимулював утворення етилену в листках озимого жита, квасолі і томатів відповідно в 3,7, 1,5, 4,8 і 7,9 разів більше. Кількість етану становила 8%, 26%, 38% і 24% відповідно від кількості. в період з 25 по 48 год у листках, оброблених гербіцидами. Етилен і етан синтезувалися у менших кількостях в