Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

Кругликов Ілля Андрійович

УДК 612.822

Зміни кальцієвoї сигналізації у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів при діабетичній нейропатії

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник

Доктор біологічних наук, проф., академік НАНУ

Костюк Платон Григорович

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАНУ, директор

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, проф. кафедри біофізики Національного університету ім. Т. Г. Шевченка, В.Л. Зима

Доктор біологічних наук, завідуюча відділу нейрохімії Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, М.К. Малишева

Доктор біологічних наук, вчений секретар спеціалізованої вченої ради Інституту Ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка МАН України, Л.М. Калінська

Провідна установа

Інститут Біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м. Київ

Захист відбудеться 05.04.2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту фізіології ім. О. О. Богомольця, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 4 березня 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої доктор біологічних наук

вченої ради З. О. Сорокіна-Маріна

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Дефекти периферичної нервової системи широко розповсюджені у людей хворих на цукровий діабет, принаймні у 50 відсотків діабетичних пацієнтів з терміном плину захворювання більш ніж 25 років виявляють одну iз форм нейропатії. Сьогодні наріжним каменем лікування таких хворих є підтримaння нормального рівня цукру в плазмі крові, шляхом введення їм інсуліну, що втім є лікуванням наслідків а не причин.

З?ясування причин та засобів лікування нейрологічних ускладнень при цукровому діабеті, є однією з найважливіших проблем як експериментальних досліджень, так і клінічної практики, зважаючи на важкість таких ускладнень та значний відсотoк інвалідизації пацієнтів. Дійсно, механізми розвитку дистальної діабетичної нейропатії, зокрема прояву больових синдромів таких як гіперальгезія й аллодінія, або ж навпаки, втрати больової чутливості, на сьогодні не сповна зрозумілі та вивчені недостатньо. Зокрема дані про зміни внутрішньоклітинного метаболізму і, особливо, кальцієвого гомеостазу у вторинних сенсорних нейронах, практично відсутні. Однак перелічені механізми можуть відігравати чи не найважливішу роль у змінах синаптичної передачі ноціцептивних стимулів, які спостерігаються при діабетичних нейропатіях у сенсорних нейронах (Levy J. et al. 1994).

Крім того, залишається нез`ясованим, порушення якого з численних механізмів, залучених до регулювання Ca2+ гомеостазу в клітинax, має первинне значення. Показано, що порушення гомеостазу Ca2+ у клітинах відіграють істотну роль в розвитку функціональних порушень секреції та дії інсуліну при діабеті (Levy J. et al. 1999). Вони також, можуть відігравати важливу роль у судинних ускладненнях, що супроводжують діабет, таких як артеріальна гіпертензія, атеросклероз і мікроангіопатія (Levy J. et al. 1999). Крім того, зміни кальцієвoї сигналізації у первинних сенсорних нейронах за умов стрептозотоцин – індукованого діабету супроводжуються зменшенням кальцій-акумулюючої функції мітохондрій, параметрiв викликаного деполяризацією кальцієвого сигналу та швидкості проведення больового імпульсу (Kostyuk E. et al. 1995, 1996, 1999). Враховуючи сказане, не викликає сумнівів високе теоретичне і практичне значення вивчення механізмів розвитку та корекції порушень кальцієвої сигналізації при діабетичних нейропатіях у нейронах дорзального рогу спинного мозку, як однієї з ланок у ланцюгу проведення больової інформації.

Мета дослідження. Виявити наявність сенсорних полінейропатій та зміни Ca2+ сигналізації у вторинних сенсорних нейронах дорзального рога спинного мозку у щурів зі стрептозотоцин - індукованим діабетом.

Задачі дослідження.

1. Виявити зміни больової чутливості та поведінкових реакцій у щурів зі стрептозотоцин – індукованим діабетом, використовуючи метод "формалінового тесту".

2. Виявити зміни температурної больової і не больової чутливості в щурів зі стрептозотоцин – індукованим діабетом, використовуючи метод "гарячої поверхні".

3. Порівняти характеристики [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в нейронах дорзального рога спинного мозку в контрольних та діабетичних тварин.

4. Встановити внесок різних типів потенціал – керованих Ca2+ каналів у генерацію, викликаних деполяризацією, [Ca2+]i транзиєнтів та його зміни за умов стрептозотоцин – індукованого діабету.

5. Встановити роль мітохондрій в генерації [Ca2+]i транзиєнтів та її зміни за умов стрептозотоцин – індукованого діабету.

6. Виявити зміни в роботі ріанодин та InsР3 – чутливих Ca2+ акумулючих депо ендоплазматичного ретикулума за умов стрептозотоцин – індукованого діабету.

7. Провести аналіз кінетичних характеристик процесу виведення кальцію із цитоплазми, з метою з'ясувати, функціонування яких Ca2+ -екстругуючих систем зазнає змін за умов експериментального діабету.

Наукова новизна роботи. Незважаючи на велику кількість наукових праць та підвищену увагу до вивчення діабетичних нейропатій, поведінкові реакції та реакції на гострий біль, зокрема як при формаліновому тесті, у діабетичних тварин вивчені недостатньо. Даній роботі присвячена комплексному опис поведінкових та больових реакцій у щурів за умов стрептозотоцин – індукованого діабету.

Як нам відомо, на сьогодні відсутні робoти, присвячені дослідженню, на клітинному рівні, змін Ca2+ сигналізації в нейронах дорзального рoгу спинного мозку щурів за умов цукрового діабету, зокрема функціонування ріанодин, InsP3- чутливих внутрішньоклітинних кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій. Таким чином, у даній роботі вперше проведенo комплексний аналіз змін функціонування Ca2+-транспортних та Ca2+-регуляторних систем за умов експериментального діабету. Також вперше булo виявлено зміни внеску різних типів потенціал-керованих Ca2+ каналів у генерацію, викликаних деполяризацією [Ca2+]i транзиєнтів у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів за умов стрептозотоцин-індукованого діабету.

Теоретичне і практичне значення роботи. Результати одержаних досліджень мають, як теоретичне так і практичне значення. Краще розуміння механізмів порушення Ca2+ гомеостазу в вторинних сенсорних нейронах за умов викликаного діабету, значно розширює розуміння перебігу та патогенезу діабетичних нейропатій.

Істотне практичне значення мають дані про те, які саме механізми підтримання внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу зазнають змін за умов діабетичної нейропатії. Цілком ймовірно, що речовини, які нормалізують функціонування внутрішньоклітинних кальцієвих насосів, чи блокатори кальцієвих каналів, внесок яких у генерацію, викликаних деполяризацією, [Ca2+]i транзиєнтів збільшується за умов діабету, можна буде використовувати при лікуванні сенсорних нейропатій у людини.

Особистий внесок здобувача. Дослідження змін кінетичних характеристик, викликаних деполяризацією, Ca2+ транзієнтів а також внеску потенціал-керованих кальцієвих каналів за умов стрептозотоцин-індукованого діабету, проводилися автором особисто. Експерименти по визначенню змін функціонування внутрішньоклітинних кальцієвих депо за умов стрептозотоцин-індукованого діабету та дослідження змін терморецепції у щурів з експериментальним діабетом проводилися спільно з аспірантом Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця – Шутовим Л.П. Експерименти по визначенню змін больових реакцій щурів при формаліновому тесті проводилися спільно зі старшим науковим співробітником Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця – к.б.н. Сушко Б.С. Опрацювання, статистичний аналіз та узагальнення усіх результатів проводилися автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались на наступних наукових конференціях: 29й щорічній конференції Спілки Нейронаук, Майамі, США, 1999; 44й щорічній конференції Біофізичного Товариства, Новий Орлеан, США, 2000; спільному “Богомолець-Ненскі” Симпозіумі, Сулєєв, Польща, 2001; 34м міжнародному Конгресі фізіологічних наук, Крайстчерч, Нова Зеландія, 2001, 31й щорічній конференції Спілки Нейронаук, Сан-Франциско, США, 2001; Розширеному семінарі по нейронаукам, Прага, Чехія, 2001; Також результати роботи були представлені на семінарах Сектору молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (1999-2001 роки). За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті та 8 тез.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел, який включає 224 найменування. Дисертаційна робота викладена на 130 сторінках (не включаючи списку використаних джерел) та ілюстрована 29 рисунками.

МЕТОДИКА ДОслIджень

Метод "формаліновий тест". Даний метод використовується для дослідження поведінкових реакцій тварин при гострому болі. Ноцицептивний стимул викликали підшкірним введенням 20 мкл 5% розчину формаліну в задню лапу контрольних та діабетичних тварин. Протягом наступних півтори години поведінкові реакції кожної тварини (переміщення, споживання їжі та води, лизання та посмикування ушкодженої кінцівки) реєстрували з використанням комп'ютера.

Метод "гаряча поверхня". Даний метод дозволяє вивчати больові реакції щурів на термічний стимул, а також визначати поріг больової температурної чутливості. Для створення ноцицептивного стимулу експериментальну тварину поміщали на поверхню розігріту до температури, яка здатна викликати розвиток больової реакції. Після того, як експериментальні тварини були поміщені на поверхню з заданою температурою, починався відлік часу до появи характерної больової реакції – лизання задніх кінцівок.

Одержання зрізів спинного мозку Тонкі зрізи спинного мозку готували за методом Рандіч та співавторів (Randic M. et al. 1993). Експерименти проводили на щурах лінії Wistar віком 6-7 тижнів. Під глибокою ефірною анестезією, проводили операцію розкриття оболонок спинного мозку, та видаляли люмбо-сакральну ділянку спинного мозку (сегменти L4 –S1). Безпосередньо після видалення, спинний мозок поміщали в охолоджений до 4° С інкубаційний розчин, який постійно оксигенували сумішшю 5% CO2 + 95% O2. Після очищення, спинний мозок прикріплювали до предметного столика вібротома (Campden Instruments LTD, Англія) де виготовляли його тонкі (300 мкМ) зрізи.

Фарбування клітин флуоресцентним барвником. Для кількісного визначення концентрації кальцію в нейронах дорзального рога спинного мозку використовували мембранно-проникну форма барвника фура-2 (фура- 2/АМ). Для введення кальцій  чутливого зонда в клітини, тонкі зрізи спинного мозку поміщали в базовий розчин, який містив естерифіковану незаряджену форму барвника в концентрації 5 мкмоль/л, розчинену в диметилсульфоксиді з додаванням детергенту Плуронік F-127 (0.02%). Зріли фарбували протягом 50 хвилин при температурі 35о С та постійному оксигенуванні атмосфери, що оточує розчин зі зрізами, сумішшю 5% CO2 + 95% O2. Після фарбування зрізи переносили в базовий розчин, в якому їх додатково витримували протягом 40 хв. для повної деестерифікації зонда фура-2/АМ.

Флуоресцентна кальційметрія. Флуоресцентний сигнал реєстрували на довжинах хвиль 360 та 390 нм. Реєструючи відносну зміну інтенсивності флуоресценції при збудженні двома довжинами хвиль, можна розрахувати [Ca2+]i у клітинах за формулою, яка була запропонована Грінкевичем і співавторами в 1985 р. (Grynkiewicz G. et al. 1985):

[Ca2+]i = Kd · b · (R - Rmin)/(Rmax - R)

Значення констант, що входять у рівняння одержані внаслідок калібрування склали: Rmin= 0.9; Rmax= 19 і b= 26. Параметр Кd, взятий з роботи Грінкевича [145], становив 224 нмоль/л.

Експериментальна установка для двохвильового вимірювання концентрації цитозольного кальцію. Основними елементами установки є: джерело світла, система зміни фільтрів, мікроскоп, фотоелектронний помножувач (ФЕП), модуль попередньої обробки сигналу та комп'ютер. Як джерело збуджуючого світла використовували ртутну лампа потужністю 50 ват. Періодична зміна фільтрів для збудження флуоресценції здійснювалась за допомогою обертання колеса з двома інтерференційними фільтрами з максимумами пропускання 360 і 390 нм. Частота обертання колеса складала 5 Гц. Керування системою зміни фільтрів здійснювалося за допомогою модуля попередньої обробки фірми Luigs und Neumann, Німеччина.

Оптична частина установки була змонтована на базі мікроскопа Axioskop, Zeiss, Німеччина. Розділення потоків збуджуючого світла та флуоресценції здійснювалось за допомогою дихроїчного дзеркала. Світло, що пройшло через фільтр у шляху збудження флуоресценції, відхилялось дихроїчним дзеркалом та фокусувалось на об'єкті за допомогою високоапертурного іммерсійного об'єктива (60х, цифрова апертура 0.9). Відбитий флуоресцентний сигнал, пропускався дихроїчним дзеркалом, і після проходження через інтерференційний фільтр, з максимумом пропускання 510 нм, подавався на ФЕП.

За допомогою модуля попередньої обробки компенсували автофлуоресценцію та підсилювати сигнал, який після цього оцифровувався та зберігався на комп'ютері за допомогою цифрового інтерфейсу TIDA (Гейдельберг, Німеччина).

Розчини і реактиви. Фізіологічний розчин, який використовували для виділення спинного мозку (інкубаційний) містив (у мМ): NaCl - 125; KCl - 5; CaCl2 - 2.5; MgSO4 - 1.5; NaHCO3 - 25; KH2PO4 - 1.6; глюкоза – 10, рН – 7.4, при постійному оксигенуванні сумішшю 5% CO2 + 95%2. Температуру розчину підтримували на рівні 4°С протягом усього процесу виділення та виготовлення зрізів. Базовий фізіологічний розчин, який використовували під час експериментів, а також при фарбуванні зрізів зондом фура-2/АМ містив (у мМ): NaCl - 128; KCl - 2; CaCl2 - 2.5; MgSO4 - 1.5; NaHCO3 - 25; KH2PO4 - 1.6; глюкоза – 10, рН – 7.4, при постійному оксигенуванні сумішшю 5% CO2 + 95% O2 , температура розчину підтримувалася на рівні 32°С. Безкальцієвий фізіологічний розчин одержували з базового розчину шляхом еквімолярної заміни CaCl2 на MgCl2 та додаванням хелатора Ca2+ – EGTA (5 мМ). В усіх експериментах із зрізами спинного мозку, до базового розчину додавали блокатор потенціал–керованих Na+ каналів – тетродотоксин у концентрації 1 мкМ. Розчин Тироде, який використовували при аплікації агоністів та антагоністів, а також для одержання гіперкалієвого розчину, містив (у мМ): NaCl - 140; KCl - 4; CaCl2 - 2; MgCl2 - 2; HEPES/NaOH - 5; глюкоза - 10; p - 7.4. Для одержання гіперкалієвого розчину 50 мМ Na+ у розчині Тироде ізоосмотично заміщали на 50 мМ K+. Фура-2/АМ була одержана від компанії Molecular Probes, (Eugene, OR, США); тетродотоксин та тапсигаргін від компанії Alomone Labs Ltd. (Єрусалим, Ізраїль); AIDA, CNQX, D-AP5 і PPADS від компанії Tocris-Cookson Ltd. (Брістоль, Великобританія); всі інші солі та реагенти від компанії Sigma-Aldrich Chemie Gmb. (Deisenhofen, Німеччина).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕНЬ

Вимірювання змін больової чутливості. Формаліновий тест. Ноцицептивний стимул створювали підшкірним введенням 20 мкл 5% розчину формаліну в задню кінцівку тварини. Як основні больові реакцій було вибрано реакцію посмикування травмованої кінцівки та її лизання. Після введення формаліну, як у хворих, так і в контрольних щурів розвивалася реакція самочинного посмикування лапки, в яку був введений формалін. При цьому характер розвитку даної реакції достовірно відрізнявся у контрольних щурів та у щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом. У діабетичних тварин спостерігався яскраво виражений двофазний характер відповіді, яка складалася з першої "гострої" фази, тривалістю близько 10 хв., та другої "тонічної" фази перебіг якої, відбувався без яскраво виражених максимумів та припинявся до 85-90 хв. У контрольних тварин спостерігалася практично повна відсутність першої фази, а друга "тонічна" фаза, навпаки, була більш вираженою з одним максимумом на 40-45 хв. (Рис. 1А). Експеримент проведений на 7 контрольних та 5 діабетичних тваринах. Друга больова реакція - лизання вколотої кінцівки, також характерна при виникненні больового рефлексу. Характер розвитку даної реакції був достовірно відрізнявся у контрольних та діабетичних тварин. Лизання лапки в діабетичних щурів теж мало яскраво виражений двофазний характер: перша "гостра" фаза тривалістю 10-15 хв. та друга "тонічна" фаза під час якої було зареєстровано появу локальних максимумів на 25-й, 60-й і 85-й хв. Експеримент проведений на 10 контрольних та 5 діабетичних щурах (Рис. 1Б).

Рисунок 1. Графік перебігу двох больових реакцій. А) Реакція посмикування вколотої кінцівки. Б) Реакція лизання вколотої кінцівки. Графік побудований за усередненими по всім тваринам значенням, одержаним для кожної тварини в кожній точці. Зірочками позначені точки, які відрізняються достовірно, (р<0.05).

Метод "гаряча поверхня". Дана методика дозволяє оцінити два параметри змін больових поведінкових реакцій щурів. Перший - поріг чутливості до дії больового стимулу, другий - час реакції у відповідь на больовий стимул. Для створення ноцицептивного стимулу експериментальних тварин поміщали на поверхню розігріту до температури здатної викликати больову реакцію. Проявом больової реакції вважали лизання кінцівок, дотичних до нагрітої поверхні. У випадку, коли такої реакції не виникало протягом 10 хв., ми вважали, що дана температура є підпороговою. Було встановлено, що поріг больової чутливості для контрольних та діабетичних щурів не відрізнявся та складав 42°С. При підвищенні температури поверхні від 43 до 47°С не спостерігалося достовірних відмінностей у швидкості больової реакції у тварин, однак уже при 48°С, ці розбіжності досягали достовірності. Так у щурів, яких поміщали на гарячу поверхню з температурою 48°C, час появи больової реакції достовірно відрізнявся та складав 10 ± 0.8 с (n = 5) і 22 ± 1.5 с (n = 5), р < 0.001 (Рис. 2).

Рисунок 2. Час появи больової реакції при температурі гарячої поверхні 48°С.

Зміни кальцієвої сигналізації в ноцицептивних нейронах за умов стрептозотоцин-індукованого діабету. Характер змін кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією. В ході досліджень [Ca2+]i у вторинних ноцицептивних нейронах, розташованих в ділянках ламіни I та substantia gelatinosa дорзального рога спинного мозку, не було виявлено істотної відмінності рівня базального кальцію в контрольних та діабетичних тварин. Деполяризацію клітин викликали аплікацією гіперкалієвого розчину з концентрацією іонів К+ - 50 мМ. Істотної різниці значень пікових амплітуд та часу наростання кальцієвих транзиєнтів, викликаних деполяризацією, у контрольних та діабетичних тварин виявлено не було. Основна відмінність в характеристиці деполяризаційних [Ca2+]i транзиєнтів у нейронах дорзального рога спинного мозку була виявлена при дослідженні кінетики їх спаду. Рівень залишкового [Ca2+]i, який реєстрували на 90-й с. після початку деполяризації, був достовірно вищим у діабетичних тварин та складав (у відсотках від піка викликаного деполяризацією Ca2+ транзиєнта) 14.1 ± 1.2% (n = 25) порівняно з 2.8 ± 0.5% (n = 25) у контрольних тварин(р<0.001, Рис. 3).

Рисунок 3. [Ca2+]i транзиєнти, викликані 20 с аплікацією позаклітинного розчину з підвищеним (50 мМ) змістом іонів К+ А) у контрольних умовах і Б) за умов експериментально-викликаного діабету.

Зміни внеску різних типів Са2+ каналів плазматичної мембрани в генерацію [Ca2+]i транзиентов за умов стрептозотоцин-індукованого діабету. Ефект ніфедіпіну. Амплітуда, викликаних деполяризацією [Ca2+]i транзиєнтів, яка не відрізнялась у контрольних та діабетичних тварин, під час дії 50 мкМ ніфедіпіну (блокатора L-типу Ca2+ каналів) зменшувалась на 31 ± 5% (n = 18) та на 65 ± 3% (n = 13) у нейронах контрольних та діабетичних щурів відповідно. Різниця між ефектами ніфедіпіну була достовірною (p<0.001, Рис.4).

Ефект w-конотоксину. Для визначення змін внеску потенціал керованих кальцієвих каналів у генерацію, викликаних деполяризацією [Ca2+]i транзиєнтів, ми використовували специфічний блокатор N-типу високопорогових Ca2+ каналів - w-конотоксин GVIA. Дія 1 мкМ w-конотоксину викликала зменшення амплітуди [Ca2+]i транзиентів, викликаних деполяризацією мембрани клітин на 23 ± 4% (n=8) у нейронах контрольних тварин, у той час як у нейронах щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом зменшення було достовірно більшим - 40 ± 3% (n=11). Різниця між ефектами w-конотоксину була достовірною (p<0.01, Рис.4).

Сумісна дія нифедипину та w-конотоксину. Для перевірки, чи відрізняються мішені дії цих блокаторов, ми використовували сумісне додавання нифедипину та w-конотоксину. Сумісна дія 1 мкМ w-конотоксину та 50 мкМ ніфедіпіну супроводжувалась зменшенням амплітуди [Ca2+]i транзиентів, викликаних деполяризацією мембрани клітин, на 52 ± 5% (n=8) у нейронах контрольних тварин, у той час як у нейронах щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом дане зменшення складало 78 ± 8% (n=8). Різниця між ефектами w-конотоксину була достовірною (p<0.01, Рис.4).

Ефект іонів нікелю. Іони нікелю використовувалися як блокатор низькопорогових Ca2+ каналів Т типу. Іони нікелю викликали недостовірне зменшення амплітуди [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних деполяризацією як у контрольних так і у діабетичних тварин. Гістограма, яка відображає дію блокаторів різних типів кальцієвих каналів та зміни їх дії за умов експериментально-викликаного діабету, представлена на рисунку 4.

Рисунок 4. Гістограма зменшення [Ca2+]i транзієнтів, викликаних деполяризацією, блокаторами потенціал - керованих Ca2+ каналів.

Зміни функціонування мітохондрій. Для дослідження ролі мітохондрій у кальцієвій сигналізації ми використовували роз'єднувач протонного градієнта на внутрішній мембрані мітохондрій, що призводить до припинення захоплення [Ca2+]i мітохондріями - карбоніл-цианід-м-хлорофеніл гідрозон (СССР), у концентрації 10 мкМ. Амплітуда, викликаних деполяризацією [Ca2+]i транзиєнтів у нейронах дорзального рога спинного мозку при додаванні СССР у концентрації 10 мкМ складала 1249 ± 69 нМ (n = 22) у контрольних тварин та 827 ± 45 нМ (n = 22) за умов експериментального діабету. Різниця між амплітудами [Ca2+]i транзиєнтів була статистично достовірною (p .001, Рис. 5А).

Рисунок 5. А) [Ca2+]i транзиєнти, викликані 10 с аплікацією гіперкалієвого розчину в присутності блокатора уніпортера мітохондрій - СССР 10 мкМ. Б) [Ca2+]i транзиєнти, викликані 10 с аплікацією 200 мкМ АТФ у безкальцієвому розчині та після інкубації зрізу протягом 2х хвилин у безкальцієвому розчині з блокаторами метабо- та іонотропних глутаматних рецепторів (AIDA 100мкМ, CNQX 10мкМ, D-APV 30мкМ).

Зміни у функціонуванні кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму. Ріанодин-чутливе депо Ca2+. Для вивчення роботи ріанодин-чутливого депо, ми використовували кофеїн, що знижує поріг активації ріанодинового рецептора кальцієм до рівня, якого достатньо щоб базальний [Ca2+]i викликав його активацію та наступне вивільнення Ca2+ з депо. Амплітуда [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних аплікацією 30 мМ кофеїну, була достовірно меншою в нейронах діабетичних тварин - 41 ± 8 нМ (n = 13), ніж у контрольних нейронах - 268 ± 18 нМ (n = 17). Різниця в між амплітудами була статистично достовірною (р < 0.001, Рис.6).

Ins3 - чутливе депо Ca2+. Сучасні дослідження показали що, як для глутамата, так і для АТФ існують відповідні метаботропні рецептори, активація яких призводить до вивільнення Ca2+ з депо ЕР через інозитолтрифосфатний шлях. Додавання 200 мкМ АТФ до безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину призводило до транзиєнтного збільшення [Ca2+]i у 59% нейронів, які були чутливими до дії АТФ у фізіологічному розчині (45 нейронів із 76). Одначе, з огляду на те, що експерименти проводили на тонких зрізах спинного мозку, ефект АТФ може бути замаскований вивільнення глутамата з, оточуючих нейрони, гліальних клітин (Idestrup1998, Salter1995). З метою виключити можливий вплив глутамата, ми використовували позаклітинний розчин, який містив блокатори різноманітних глутаматних рецепторів (100 мкМ AIDA - блокатор метаботропних глутаматних рецепторів mGlu1, mGlu5; 30 мкМ D-AP5 - блокатор іонотропних глутаматних рецепторів NMDA типу та 10 мкМ CNQX - блокатор інотропних глутаматних рецепторів AMPA типу). Додавання 200 мкМ АТФ у бескальциєвий розчин, який містив AIDA, CNQX і D-APV, супроводжувалось транзиєнтним збільшенням [Ca2+]i в нейронах дорзального рога спинного мозку. Причому, це збільшення не відрізнялося достовірно від збільшення, що спостерігається, без додавання вищевказаних речовин у безкальцієвий позаклітинний розчин (n = 8, Рис. 5Б). Таким чином, одержані нами результати свідчать про можливість використання аплікації АТФ, як адекватного функціонального тесту

InsР3-чутливого шляху вивільнення Ca2+ з депо ЕР. Амплітуда [Ca2+]i транзиєнтів викликаних дією 200 мкМ АТФ у фізіологічному розчині складала 237 ± 24 нМ (n = 30) у нейронах контрольних тварин та 226 ± 23 нМ (n = 17) у нейронах щурів із СТЗ-індукованим діабетом, різниця між амплітудами не була статистично достовірною (Рис. 6). При додаванні АТФ до безкальцієвого розчину спостерігалось достовірне зменшення амплітуди кальцієвих транзиєнтів від 156 ± 14 нМ (n = 45) за контрольних умов до 104 ± 6 нМ (n = 21) за умов експериментального діабету (Рис. 6). Зменшення амплітуди АТФ-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів у безкальцієвому розчині складало 34 ± 6 % (n = 17) у нейронах контрольних тварин порівняно з нейронами щурів з експериментальним діабетом (p<0.01). Аналогічні експерименти були проведені для вивчення дії глутамата на іонотропні та метаботропні рецептори в контрольні та за умов експериментально-викликаного діабету. Амплітуда [Ca2+]i транзиентів, викликаних дією 100 мкМ глутамата в фізіологічному розчині, складала 216 ± 19 нМ (n = 14) у нейронах контрольних тварин та 145 ± 20 нМ (n = 7) у нейронах діабетичних щурів (Рис. 6). Аплікація глутамата в безкальцієвому розчині супроводжувалась достовірним зменшенням амплітуди кальцієвих транзиєнтів від 176 ± 21 нМ (n = 13) за контрольних умов до 80 ± 15 нМ (n=9) за умов експериментально-викликаного діабету (Рис. 6). Амплітуда Ca2+ транзиєнтів, викликаних глутаматом у безкальціевому розчині зменшувалась на 54 ± 6 % (n = 17) у діабетичних тварин порівняно з контрольними (p<0.01).

Ефект іономіцину. Для дослідження ємності Ca2+ депо ЕР, ми використовували антибіотик іономіцин. Іономіцин у концентраціях менших чи рівних 1 мкМ призводить до вивільнення Ca2+ з обох типів депо ЕР за ріанодин та InsР3 незалежним механізмом (Albert P. 1986). Амплітуда [Ca2+]i транзиєнтів викликаних дією 1 мкМ іономіцину складала 188 ± 25 нМ, (n = 8) у нейронах контрольних тварин та 85 ± 13 нМ (n = 6) у нейронах тварин із СТЗ-індукованим діабетом. Різниця між амплітудами була статистично достовірною (р < 0.001, Рис. 6). Гістограма, яка відображає активацію різних шляхів вивільнення Ca2+ з ЕР та їх зміни за умов експериментального діабету, представлена на рисунку 6.

Рисунок 6. Гістограма змін амплітуди [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних аплікацією активаторів вивільненя Ca2+ з депо эндоплазматического ретикулума в контролі та діабеті. *-відповідає критерію достовірності р < 0.01, **- р < 0.001

Роль Ca2+-АТФази ендоплазматичного ретикулуму. При апроксимації спаду Ca2+ транзиентів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в присутності 10 мкМ СССР, з'ясувався яскраво виражений дво-експонентний характер його спаду (Рис. 7). Як у нейронах контрольних тварин, так і в нейронах тварин із СТЗ-індукованим діабетом, у спаді кальцієвого транзиентів були присутні "швидка" та "повільна" експоненти. Сталі часу спаду "швидких" експонент не відрізнялися достовірно та складали 6.3 ± 2.2 с. (n = 15) у нейронах контрольних тварин та 8.4 ± 3.1 с (n = 13) у нейронах щурів із СТЗ–індукованим діабетом. В той же час, сталі часу спаду "повільної" компоненти складали 92 ± 40 с (n = 15) у контрольних та 315 ± 75 с (n = 13) у нейронах щурів із СТЗ-індукованим діабетом відповідно (р < 0.01). При апроксимації спаду Ca2+ транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в присутності 10 мкМ СССР та 1 мкМ тапсигаргіну (специфічного блокатора Ca2+-АТФазы ЕР), з'ясувалося, що цей спад є моно-експоненціальним (Рис. 7). Сталі часу спаду експонент не відрізнялися (з точністю до похибки методу) та складали 75 ± 33 с (n = 6) у нейронах контрольних тварин та 81 ± 41 с (n = 6) у нейронах щурів із СТЗ–індукованим діабетом. Отже, при блокуванні Ca2+-АТФази ЕР зникає різниця у швидкості виведення кальцію з цитоплазми, між нейронами контрольних та діабетичних тварин, що свідчить про важливу роль Ca2+-АТФази ЕР у процесах, які лежіть в основі порушення Ca2+ гомеостазу за умов експериментального діабету.

Рисунок 7. Апроксимація спаду [Ca2+]i транзиєнту у контролі та за умов експериментально-викликаного діабету .На кожному графіку представлена суперпозиція спадів 5 транзиєнтів, побудованих у напівлогарифмічному масштабі та нормалізованих до 1.А) в присутності 10 мкМ СССР Б) в присутності 10 мкМ СССР та 1 мМ тапсигаргіну.

Обговорення

Поведінкові тести, на сьогоднішній день, є єдиним джерелом інформації про больову чутливість тварин. В методах дослідження нейропатій широко використовується формаліновий тест, як модель гострого болю з наступною фазою тонічної або інфламаторної болі (Hunskaar S., 1987). Больовий ефект формаліну має двофазний характер, різні фази якого мають різну анальгетичну чутливість. Вважається, що перша фаза відповідає за прямий вплив на ноцицептивні нейрони, тоді як друга, зумовлена запальними процесами та біллю, викликаною запаленням та знімається дією антизапальних фармакологічних речовин (Hunskaar S., 1987). Під час СТЗ-індукованого діабету, ми спостерігали як посилення больової реакції на гострий біль, так і послаблення больової реакції на тонічний "інфламаторний" біль, що свідчить про те, що індукція цукрового діабету диференційовано змінює механізми, які відповідають за різні типи болю. Дослідження змін температурної чутливості за умов діабету, виявили відсутність у діабетичних тварин температурної аллодоніїї та наявність температурної гіпоалгезії. Ці результати узгоджуються з даними Фокса і співавторів (1999) стосовно температурної гіпоалгезії. Таким чином, стрептозотоцинова модель захворювання цукровим діабетом у щурів супроводжується значними змінами больових реакцій, патофізиологічні причини яких не з'ясовані остаточно, однак останнім часом усе більше уваги надається порушенням Ca2+ гомеостазу, які не лише супроводжують, а й цілком імовірно, є однієї з причин, що призводять до розвитку діабетичних нейропатій. Підвищений рівень [Ca2+]i у клітинах після деполяризації може призводити до збільшення нейрональної збудливості та збільшення вивільнення нейротрансміттерів (Stanley E., 1997). Експерименти, проведені нами по вивченню зміни внеску різних типів потенціал-керованих Ca2+ каналів у генерацію, викликаних деполяризацією [Са2+]i транзиєнтів, показали достовірне збільшення внеску L- і N- типу кальцієвих каналів за умов експериментального діабету. Активація L-типу Ca2+ каналів в нейронах дорзального рогу може мати специфічне значення для опосередкування повільних, Ca2+ потоків, що сумуються та сприяють поступовому й тривалому підвищенню збудливості (Baranauskas G., 1998). Результати, одержані нами та іншими авторами, можуть свідчити як про зміну щільності L- , N- типів Ca2+ каналів, так і про зміни фармакологічних та структурних характеристик, формуючих їх субодиниць. Нами виявлені також значні зміни, які відбуваються у внутрішньоклітинних структурах нейронів дорзального рога спинного мозку. Зокрема, спостерігалось значне зменшення вивільнення Ca2+ мітохондріями під час діабету, що, імовірно, пов'язано із зменшенням накопичення Ca2+ мітохондріями. При дослідженні роботи внутрішньоклітинних Ca2+ депо ендоплазматичного ретикулума, нами були виявлені значні зміни функціонування як ріанодинового так і інозитолтрифосфат–чутливого депо Ca2+. Причиною зменшення вивільнення Ca2+ з ріанодинового депо ЕР може бути, як зменшення закачування кальцію в депо Ca2+ -АТФазою ЕР, так і безпосереднє зменшення експресії ріанодинового рецептора за умов діабету, як це було показано на діабетичних кардіоміоцитах (Teshima Y. 2000). При дослідженні роботи InsР3-чутливого депо ЕР, нами показано достовірне зменшення вивільнення кальцію, як через глутаматергічний, так і пуринергічний шляхи. При проведенні цих досліджень була встановлена наявність у нейронах дорзального рога спинного мозку метаботропних пуринорецепторів, які, імовірно, розташовані на дистальних дендритах (Kruglikov I.A, 2001). Також встановлено перерозподіл внеску різних типів пуринорецепторов у генерацію [Ca2+]i транзиєнтів під час діабету, скерований на збільшення внеску іонотропних рецепторів. Усі вищенаведені результати свідчать про те, що вивільнення Ca2+ з депо ЕР, при дії як кофеїну, так і АТФ чи глутамата зменшується за умов експериментального діабету. Можливо, що порушується кожен із зазначених механізмів, або зменшується загальна кількість Ca2+ в обох депо ЕР. Непрямим підтвердженням останнього припущення, є зменшення вивільнення Ca2+ з депо ЕР при аплікації іономіцину, який, у використаних концентраціях, вивільняє Ca2+ з усього ретикулуму (Albert P. 1986). Для подальшого вивчення цього питання, ми використовували метод дослідження кінетичних характеристик спаду, викликаних деполяризацією кальцієвих транзиентів. Шляхом послідовного виключення механізмів, які відповідають за виведення кальцію з цитоплазми (Рис. 8), ми виявили достовірні порушення функціонування Ca2+-АТФази ЕР, що також може призводити до зменшення вмісту Ca2+ в ЕР. Висловлені припущення підтверджуються тим, що за умов діабету, спостерігається безпосереднє зниження рівня експресії Ca2+-АТФази ЕР уже через 3 тижні після початку захворювання (Teshima Y. 2000). Таким чином, одержані результати свідчать про виражені зміни функціонування внутрішньоклітинних Ca2+-транспортних та Ca2+-модулюючих структур у сенсорних нейронах щурів із стрептозотоцин–індукованим діабетом уже на ранніх етапах захворювання. Схема, на якій проілюстровані характер змін Ca2+ сигналізації наведена на рисунку 8.

Рисунок 8. Схема, яка демонструє механізми кальцієвого гомеостазу в нейронах та їх зміни під час стрептозотоцин-індукованого діабету. Стрілочки направлені вниз відображають пригнічення функції відповідної Ca2+ -транспортної чи Ca2+ -регуляторної системи за умов експериментального діабету, вверх – її посилення.

Висновки

1. В експериментах, проведених з використанням формалінового тесту, показані достовірні зміни больової чутливості у щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом. Динаміка змін больової реакції в діабетичних тварин, на відміну від контрольних, мала чітко виражений двофазний характер. Інтенсивність першої фази тривалістю 10-15 хв., яка фізіологічно відповідна початковому гострому болю, була достовірно вищою в діабетичних тварин. Інтенсивність другої "тонічної" фази, навпаки, була достовірно вищою в контролі з максимумом на 30 - 40 хв.

2. В експериментах, проведених з використанням методу "гарячої поверхні", встановлено, що температурний больовий поріг не відрізнявся для контрольних та діабетичних тварин та складав 42°С, що свідчить про відсутність у діабетичних тварин температурної аллодінії. Швидкість больової реакції при температурі 48°С, була достовірно меншою в діабетичних тварин, що свідчить про наявність у них температурної гіпоалгезії.

3. При порівнянні [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в клітинах дорзального рога спинного мозку, не виявлено достовірної різниці між контрольними та діабетичними тваринами в базальному рівні [Ca2+]i, в амплітуді транзиєнтів, викликаних деполяризацією, а також у швидкості наростання Ca2+ сигналу. Одначе виявлені достовірні відмінності рівня залишкового Ca2+, який складав 2.8±0.5% та 14.1±1.2% від амплітуди транзиєнтів, викликаних деполяризацією для контрольних та діабетичних тварин відповідно.

4. Фармакологічне дослідження внеску потенціал-керованих Ca2+ каналів у генерацію Ca2+ транзиєнтів, викликаних деполяризацією, показало, що їх внесок відрізняється у контрольних та діабетичних тварин. Інгібування Ca2+ каналів L- та N- типу, відповідними специфічними блокаторами, зростає під час діабету, тоді як внесок каналів Т типу не змінюється.

5. Виявлено достовірні зміни Ca2+ акумулюючої функції мітохондрій, у діабетичних тварин порівняно з контрольними. Зменшення амплітуди, викликаних деполяризацією [Ca2+]i транзиєнтів при роз'єднанні протонного градієнта на мембрані мітохондрій складало 78%.

6. Показано достовірне зменшення вивільнення Ca2+ з ріанодин-чутливого депо ЕР, яке у діабетичних тварин складало 85 %. Останнє підтверджується зменшенням [Ca2+]i транзиентів у відповідь на аплікацію іономіцину, яке складало 54 %.

7. Виявлено достовірне пригнічення функціонування InsР3-чутливого депо ЕР в нейронах дорзального рога щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом. Зменшення амплітуди метаботропного АТФ-індукованого Ca2+ транзиєнта складало 34%, а метаботропного глутамат-індукованого – 54%.

8. При блокуванні Ca2+-АТФази ЕР за допомогою тапсигаргіна зникає різниця у швидкості виведення Ca2+ з цитоплазми, між нейронами контрольних та діабетичних щурів, що свідчить про важливу роль Ca2+-АТФази ЕР у процесах, які викликають порушення кальцієвого гомеостазу за умов експериментального діабету.

9. Виявлені порушення кальцієвої сигналізації у вторинних сенсорних нейронах дорзального рога спинного мозку, можна розглядати як один з механізмів змін передачі больових сигналів при цукровому діабеті, які призводять до розвитку діабетичної нейропатії.

За одержаними результатами було опубліковано такі праці:

1. N.V.Voitenko, E.P.Kostyuk, I.A.Kruglikov, N.V.Svichar, V.A.Shishkin (1999) Changes in calcium signalling of mammalian nociceptive neurons under diabetes. // Phyziol. Journ. (Kiev), 45 (4), 45-54.

2. N.V.Voitenko, I.A.Kruglikov, E.P.Kostyuk and P.G.Kostyuk (2000) Effect of streptozotocine-induced diabetes on activity of calcium channels in rat dorsal horn neurons // Neuroscience 95 (2), 519-524.

3. P.G. Kostyuk, A.S. Efimov, E.P. Kostjuk, N.V. Voitenko, I.A. Kruglikov (2000) Changes in intracellular turnover of calcium ions in nociceptive neurons in experimental diabetes and influence of blockers of potential-dependent calcium channels upon them // Ukrainian acad. of med. Sci. Journ 6 (4), 637-650.

4. Kruglikov, I.A., Shutov, L.P., Shishkin, V.O., Kostyuk, E.P., Potapenko, E.S., and Voitenko, N.V. (2001) Intracellular mechanisms of changes in the functioning of rat sensory neurones with streptozotocin-induced diabetes mellitus. // Phyziol Journ, (Kiev), 47 (5), 18-25.

Анотації:

Кругликов І.А. Зміни кальцієвoї сигналізації у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів при діабетичній нейропатії. – Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидату біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України. Київ-2002.

Дисертація присвячена дослідженню змін кальцієвoї сигналізації у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів при індукції діабетичної нейропатії. Результати дисертаційної роботи отримані за допомогою сукупності сучасних методів флуоресцентного вимірювання концентрації кальцію, та двох поведінкових тестів. Виявлено достовірні зміни больової поведінки діабетичних щурів, а саме доведена наявність у них термічної гіпоалгезії та збільшення больової чутливості при реакції на гострий біль під час формалінового тесту. Зареєстровані істотні зміни Ca2+ сигналізації під час експериментального діабету у вторинних сенсорних нейронах. Ці зміни стосуються сповільнення спаду, викликаних деполяризацією [Ca2+]i транзиєнтів, збільшення вкладу L- та N – типу Ca2+ каналів у їх генерацію, а також значне зменшення вивільнення Ca2+ з Ca2+-акумулюючих структур клітини (ріанодин та InsP3- чутливих депо ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій). Одержані результати свідчать про достовірні зміни Ca2+ гомеостазу у вторинних сенсорних нейронах щурів під час діабетичної нейропатії, які., цілком ймовірно, є однією з причин розвитку патології.

Ключові слова: діабет, нейропатії, Ca2+ канали, ріанодин, мітохондрії, ендоплазматичний ретикулум.

Кругликов И.А. Изменения кальциевой сигнализации в нейронах дорзального рога спинного мозга крыс при диабетической