НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КОЖУХ ІРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК : 615.322:615.281:582.717:577.15./.17

Фармакогностичне дослідження рослин роду бадан

15.00.02- фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармакогнозії Національного фармацевтичного університету, Міністерство охорони здоров'я України.

Науковий керівник: кандидат фармацевтичних наук, доцент

ПОПОВА НАТАЛІЯ ВўЯЧЕСЛАВОВНА

Національний фармацевтичний університет, доцент кафедри фармакогнозії

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук , професор

СЕРБІН АНАТОЛІЙ ГАВРИЛОВИЧ,

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри медичної ботаніки;

доктор фармацевтичних наук, професор

ДОЛЯ ВІКТОР СЕМЕНОВИЧ

Запорізький державний медичний університет, завідувач кафедри фармакогнозії

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, кафедра фармацевтичної хімії та фармакогнозії

Захист відбудеться “24” січня 2003 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “20” грудня 2002 року.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради Малоштан Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Створення нових лікарських рослинних препаратів і удосконалення технології виробництва фітопрепаратів є найважливішим напрямком медичної промисловості.

Для одержання фітохімічних засобів на території країн СНД використовується близько 240 видів лікарської рослинної сировини. Найбільший інтерес представляють джерела фенольних сполук. Однією з рослин, для якої характерний високий вміст фенольних сполук, є бадан товстолистий (Bergenia crassifolia (L.) Fritsch), родини ломикаменеві (Saxifragaceae). Кореневище бадану є офіційним і використовується в медицині як в'яжучий, кровоспинний і протизапальний засіб. При заготівлі сировини у бадана майже цілком видаляються пагони і заготівля кореневищ в промислових масштабах спричиняє знищення його заростей.

Листки бадану залишаються невикористаними для медичної промисловості, хоча за попередніми даними містять значну кількість різних класів фенольних сполук, таких як дубильні речовини і прості феноли. У зв'язку з цим листки бадану товстолистого - перспективна сировина для медичної промисловості. Рід бадан нараховує близько 11 видів, однак хімічний склад, біологічна дія і морфолого-анатомічна будова представників цього роду мало вивчені. У систематиці роду бадан є розходження що до кількості видів даного роду – відповідно до одного джерела рід нараховує 4 види, згідно з іншим – 12 видів.

Таким чином, дослідження, спрямовані на вивчення біологічно активних речовин листків бадану, розробка методів виділення речовин і контролю якості сировини, хематоксономічні дослідження роду бадан і створення на основі листків бадану засобу з противірусною дією є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету (НФаУ) (номер державної реєстрації №0198U007008) і проблемної комісії “Фармація” МОЗ України.

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження є вивчення різних груп біологічно активних речовин (БАР) і розробка технології засобу з противірусною активністю з нової лікарської сировини – листків бадану товстолистого.

Для досягнення цієї мети ставили наступні задачі:

· вивчення БАР листків різних видів роду бадан;

· розробка методів виділення й аналізу різних груп біологічно активних речовин;

· встановлення структури виділених сполук;

· розробка методів кількісного аналізу біологічно активних сполук;

· проведення морфолого-анатомічних досліджень листків таксонів роду бадан;

· хемосистематичне вивчення таксонів роду бадан;

· розробка оптимальної технології отримання препарату з противірусною активністю з листків бадану товстолистого;

· визначення біологічної активності екстрактів отриманих з листків бадану.

Об'єктом дослідження стали листки різних видів роду бадан і групи БАР – амінокислоти, мікроелементи, лектини, ліпофільні речовини і фенольні сполуки, що обумовлюють фармакологічну активність листків таксонів роду бадан.

Предметом дослідження стали аналіз, виділення і встановлення структури галоїльних похідних, флавоноїдів, оксикоричних кислот, фенологлікозидів, ліпофільних речовин, мікроелементів, амінокислот, лектинів; розробка технології одержання лікарських засобів з листків бадану; проведення хемосистематичного і морфолого-анатомічного дослідження рослин роду бадан.

Методи дослідження. БАР вивчали фармакопейними методами аналізу, а також використовуючи тонкошарову і паперову хроматографію, високоефективну рідинну (ВЕРХ) і газорідинну (ГРХ) хроматографії з застосуванням приладів “Міліхром А-01”, “Міліхром-02”, “Альфа плюс” і “Хром-5”. Для виділення БАР з рослинної сировини використовували колонкову хроматографію на поліаміді, а також препаративну хроматографію на папері. Хімічну будову виділених речовин встановлювали методами УФ- і ІЧ-спектрального аналізу за допомогою спектрофотометрів типу СФ-26 та СФ-46, UR-10, Carl Zeiss, Jena, DDR. Тривимірні спектри флюоресценції ліпофільних сполук записували на спектрофлюориметрі Hitachi F4010. Температуру плавлення фенольних сполук визначали на блоці Кофлера- Franz Kustner nqch K:G:Dresden; N.K. 70/3314k. Для анатомічного дослідження листків представників роду бадан використовували мікроскопи МБР-1 і МБР-2, препарати фотографували апаратом ФЕД-5 на плівку “Мікрон-22”. Експериментальні дослідження листків представників роду бадан основані на методі нумеричної таксономії та хемотаксономії. Фармакологічні дослідження проводили in vivo та in vitro.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше проведене комплексне фітохімічне дослідження 8 видів роду бадан. Встановлено наявність у них 16 амінокислот, вуглеводів, лектинів, ліпофільних речовин (хлорофілів, каротиноїдів, токоферолів, жирних кислот), карбонових кислот, мікроелементів, фенольних сполук (флавоноїдів, оксикоричних кислот, фенологлікозидів, галоїльних похідних). Новими для бадану виявилися лектини. З листків бадану в індивідуальному стані виділено 20 речовин: 4 аглікони флавоноїдів, 4 моноглікозиди флавоноїдів, 2 біозиди флавоноїдів, 3 оксикоричні кислоти, 4 галоїльні похідні, 2 С-глікозиди і 1 фенологлікозид. Такі фенольні сполуки як 3-О-рутинозид кемпферолу, 2,3-дигалоїл-D-глюкоза і 2,3,6-тригалоїл-D-глюкоза, 7-О-b-D-глюкопіранозид лютеоліну, 7-О-b-D-глюкопіранозид апігеніну, 5-О-b-D-глюкопіранозид кверцетину, 5-О-b-D-глюкопіранозид кемпферолу раніше не описані в бадані товстолистому, а С-глюкопіранозид метоксигалової кислоти є новою природною сполукою.

Уперше був проведений аналіз різних ліпофільних речовин з екстрактів із зелених, чорних і свіжих листків бадану товстолистого, порівняльний амінокислотний і мікроелементний аналіз декількох зразків роду бадан та екстрактів з них.

Уперше проведене кількісне визначення фенольних сполук методом ВЕРХ у листках 8 видів бадану. Розроблено методику кількісного аналізу фенольних сполук листків бадану методом ВЕРХ на приладах “Міліхром-01” і “Міліхром –02”.

При проведенні анатомічних досліджень листків рослин роду бадан були встановлені нові, раніше не описані діагностичні ознаки.

Уперше проведене хемосистематичне дослідження 8 таксонів роду бадан. Вивчені види були згруповані за біохімічними груповими і парними ознаками у дві групи.

Розроблена технологія одержання нового препарату з листків бадану товстолистого і досліджена його фармакологічна активність. Вперше встановлено, що екстракт бадану має противірусну активність.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблена технологія одержання екстракту з листків бадану товстолистого з противірусною дією. Розроблені проекти АНД на “Листки бадану товстолистого” і “Сухий екстракт листків бадану товстолистого”. Результати досліджень впроваджені в навчальний процес кафедр ботаніки і фармакогнозії НФаУ, Київського медичного університету ім. О.О.Богомольця, Тернопільської медичної академії ім. І.Я.Горбачовського, Ташкентського фармацевтичного інституту, в науково-дослідну роботу ІМІ ім. І.І. Мечникова та апробовані на дослідному заводі ДНЦЛЗ та в лабораторії хімії і технології фенольних препаратів ДНЦЛЗ. Хемотаксономічне дослідження 8 таксонів роду бадан дозволило згрупувати вивчені види за біохімічними груповими і парними ознаками у дві групи.

Особистий внесок здобувача: У наукових працях опублікованих зі співавторами Поповою Н.В., Картмазовою Л.С., Сірою Л.М., Мартиновим А.В., Смелянською М.В., Литвиненко В.І., Комір З.В., Кисличенко В.С., Волькович О.А., Ткаченко О.Ю., Оккерт І.Л., Гольдбергом Е.Д., Дигаєм А.М. і особисто автором:

· проведений аналіз літературних даних ботанічної характеристики, поширення, хімічного складу і використання рослин роду бадан;

· встановлені основні групи БАР, проведений їх кількісний аналіз;

· виділено й ідентифіковано 20 речовин фенольної природи з листків бадану;

· розроблена і обґрунтована технологія одержання сухого екстракту листків бадану товстолистого;

· вивчена морфолого-анатомічна будова листків представників роду бадан;

· проведений хемосистематичний аналіз 8 таксонів роду бадан;

· розроблені проекти АНД на листки бадану товстолистого, на сухий екстракт листків бадану товстолистого.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були викладені й обговорені на IV Міжнародній конференції з медичної ботаніки (Ялта, 1997), науково-практичній конференції, присвяченій 75-річчю з дня народження проф. Сала Д.П. “Теорія і практика створення лікарських препаратів” (Харків, 1998), на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Вчені України – вітчизняній фармації” (Харків, 2000), на науково-практичній конференції ”Сучасні проблеми фармацевтичної науки і практики” (Харків, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 наукових праць, у тому числі 7 статей і 5 тез.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, шести розділів, списку літературних джерел і додатка (2 проекти АНД). Загальний обсяг дисертації складає 170 сторінок. Робота ілюстрована 57 рисунками, 30 таблицями, 1 схемою. Список використаних літературних джерел складає 158 найменувань, з них 60 - іноземні.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Коротка ботанічна характеристика, ареал, культура, хімічний склад і застосування рослин роду бадан

У медичній практиці застосовується кореневище бадану товстолистого. Як джерело лікарської сировини може бути використана надземна частина бадану товстолистого (зелені, червоні та чорні листки), тому що його листки практично не поступаються кореневищам за вмістом в них поліфенолів. Використання листків бадану допоможе зберегти і відновити природні зарості бадану і значно розширити спектр застосування даної рослини. На відміну від бадану товстолистого, хімічний склад і морфолого-анатомічна будова інших таксонів роду бадан і їхня перспективність як нового виду лікарської сировини мало вивчені.

Проведений аналіз літературних даних свідчить, що в систематиці роду Bergenia спостерігається розходження: згідно з С.К.Черепановим рід нараховує 4 види, а згідно з Н.А. Єповою - 12 видів.

Аналіз речовин первинного синтезу рослин роду бадан

Об'єктами наших досліджень були листки і різні екстракти з рослин роду бадан: бадан товстолистий (Bergenia crassifolia (L.) Fritsch), бадан серцелистий (Bergenia соrdіfоlіа Fritsch), бадан війчастий (Bergenia ciliata (Royl) A. Br.), бадан Стречі (Bergenia stracheyi (Hook.) а. Thoms.) Engl.), бадан Горбунова (Bergenia gorbunovii B. Fedtsch), бадан Делаво (Веrgеnіа delavayi x media Engl), бадан тихоокеанський (Bergenia pacifica Kom.), бадан гімалайський (Bergenia hymalaica Boriss. чи Bergenia hissarica Boriss.sp. nova), що були заготовлені у ботанічному саду ХНУ, на фармакопейній ділянці НФаУ і ДНЦЛЗ, у Ботанічному саду Ботанічного інституту РАН ім. В.Л.Комарова (Санкт-Петербург) та на фармакопейній ділянці Медичного університету м. Ярославль.

За допомогою якісних реакцій і хроматографії на папері, у тонкому шарі сорбенту, ГРХ і ВЕРХ у листках рослин роду бадан встановлена наявність карбонових кислот і амінокислот, вуглеводів, каротиноїдів, хлорофілів, токоферолів, жирних кислот, мікроелементів і лектинів.

Методом хроматографії на папері і ВЕРХ було ідентифіковано 16 амінокислот, встановлений їх якісний і кількісний склад. Домінуючими кислотами для бадану є аспарагінова (0,57-2,26%) і глютамінова (0,45-1,44%) кислоти. Кількісний вміст білку в сировині бадану товстолистого склав біля 8 %, у водному екстракті біля 62 %. Вміст азотовмісних сполук у спиртовому екстракті листків бадану товстолистого склав біля 32 %, у шроті -14 %.

При вивченні білково-вуглеводного комплексу, вихід якого склав 12%, у листках бадану товстолистого були ідентифіковані наступні цукри: глюкоза, рамноза, арабіноза, фруктоза; а в гідролізаті: арабіноза, галактоза, глюкоза, фруктоза, апіоза, уронова і глюкуронова кислоти.

Хроматографічний аналіз на папері дозволив ідентифікувати наступні органічні кислоти: щавлеву, янтарну, яблучну, винну і лимонну. Кількісний вміст карбонових кислот у чорних та зелених листках визначали як титрометричним (2,24% і 3,14%), так і іонообмінним (11,30% і 12,50%) методами.

Виділено суму ліпофільних речовин із сухих зелених, чорних і свіжих листків бадану товстолистого. Проведено ідентифікацію ліпофільних речовин хроматографічними методами (ТШХ і ГРХ), встановлено склад хлороформного екстракту.

Тривимірні спектри флюоресценції ліпофільних екстрактів з листків бадану інформують про якісний і кількісний склад хлорофілів і каротиноїдів (рис.1). Вміст хлорофілу в екстрактах із зелених і чорних листків склав 206,00 і 10,20 мг/г, суми каротиноїдів в екстракті свіжих листків склав 0,88 мг/г. Вміст токоферолів в досліджуваних екстрактах склав 0,55 і 0,21 мг/г,

Методом ГРХ встановлений кількісний вміст 11 жирних кислот у ліпофільному екстракті з зелених листків. Домінуючими є пальмітинова, олеїнова і лінолева кислоти. Сума жирних кислот склала 24% від усієї ліпофільної фракції. Встановлені числові показники ліпофільного екстракту.

У сировині бадану вперше були ідентифіковані лектини. Титр лектинів листків бадану товстолистого склав 1:1024, а титр лектинів з кореневищ - 1:32.

Атомно-емісійним методом, у золі різних видів та екстрактів бадану встановлена наявність 22 мікроелементів. Слід відмітити високий вміст таких елементів як мідь (до 35 мг/кг), марганець (до 78 мг/кг) і залізо (до 1200 мг/кг).

Де emission – л, нм, довжина хвилі випромінювання,

excitation – л, нм, довжина хвилі збудження.

Рис. 1. Тривимірний спектр флюоресценції ліпофільного екстракту з зелених листків бадану

Аналіз речовин вторинного синтезу рослин роду бадан

За допомогою якісних реакцій і хроматографії на папері, у тонкому шарі сорбенту і ВЕРХ в екстрактах з листків рослин роду бадан встановлено наявність флавоноїдів, галоїльних похідних, оксикоричних кислот, фенологлікозидів, що дозволило провести визначення кількісного вмісту дубильних речовин, арбутину, флавоноїдів. Результати наведені в таблиці 1. Для виділення фенольних речовин і поділу їх на індивідуальні сполуки використовували методи колонкової хроматографії на поліаміді, препаративної хроматографії на папері і силікагелі, ВЕРХ-метод. Структуру виділених сполук встановлювали за допомогою спектральних, фізичних і хімічних методів аналізу в порівнянні з достовірними зразками. З листків бадану було виділено і встановлено структуру 20 індивідуальних сполук. Фізико-хімічні властивості виділених сполук наведені в таблиці 2.

Флавоноїди. Речовини 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 і 17 на підставі якісних реакцій, хроматографічної рухливості та фізико-хімічних характеристик можна віднести до флавоноїдів. За даними якісних реакцій, хроматографічного аналізу, УФ- і ІЧ-спектоскопії, по продуктах гідролізу, фізико-хімічним властивостям і в порівнянні з достовірними зразками речовини 8, 9, 10, 11 віднесені до агліконів флавоноїдної природи, речовини 12, 13, 14, 15 до моноглікозидів, а 16 і 17 до біозидів флавоноїдної природи. На підставі фізичних і хімічних методів аналізу й у порівнянні з достовірними зразками ідентифікували речовину 8 як лютеолін чи 5,7,3ў4ў-тетрагідроксифлавон, речовину 9 як апігенін чи 5,7,4ў-тригідроксифлавон, речовину 10 як кверцетин чи 3,5,7,3ў4ў-пентагідроксифлавон, речовину 11 як кемпферол чи 3,5,7,3ў-тетрагідроксифлавон, речовину 12 як цинарозид чи 7-О-b-D-глюкопіранозид лютеоліну, речовину 13 як космосіїн чи 7-О-b-D-глюкопіранозид апігеніну, речовину 14 як 5-О-b-D-глюкопіранозид кверцетину, 15 як 5-О-b-D-глюкопіранозид кемпферолу, речовину 16 ідентифікували як рутин чи 3-О-b-D- рутинозид кверцетину, а речовину 17 як нікотифлорин чи 3-О-b-D-рутинозид кемпферолу.

Таблиця 1

Кількісний вміст фенольних сполук у листках різних видів бадану

Метод кількісного визначення Види

Bergenia crassifolia Bergenia crassifolia* Bergenia stracheyi Bergenia delavayi x mediа

Дубильні речовини, %

ДФ-ХІ 23,52 44,30 22,90 25,90

Комплексонометрич- ний метод 19,23 23,08 17,80 22,80

Арбутин, %

ДФ-ХІ 6,43 7,09 6,69 8,90

Метод Браїловської-Лук'янчикової 7,48 7,00 5,08 9,56

Спектрофотометри-ний метод 7,70 6,70 5,70 9,83

Суми флавоноїдів, %

Спектрофотометри- чний метод у перерахунку на рутин 0,13 0,13 0,10 0,14

*заготовлено у м. Ярославлі

Оксикоричні кислоти. Речовини 18, 19 і 20 на підставі якісних реакцій, хроматографічної характеристики, за даними УФ та ІЧ-спектрального аналізу були віднесені до оксикоричних кислот (таблиця 2). Продукти лужного гідролізу досліджуваних речовин ідентифікували: з протокатеховою кислотою (речовина 18), з кофейною і хінною кислотою (речовина 19). Хімічні перетворення, УФ-спектральний аналіз спиртових розчинів речовин 18 і 19 з іонізуючими добавками дали можливість встановити, що досліджувані речовини є 18 - кофейна кислота чи 3-(3,4-дигідроксифеніл)-2-пропіонова кислота, речовина 19 - хлорогенова кислота чи (3-О-кофеїлхінна кислота), речовина 20 - неохлорогенова кислота чи 5-О-кофеїлхінна кислота.

Галоїльні сполуки. За допомогою якісних реакцій, хімічних перетворень, хроматографічного аналізу, реакцій метилювання й етилювання, ацетилювання, фізико-хімічних характеристик, сполуки 3, 5, 6 і 7 були віднесені до похідних галової кислоти. На підставі проведених фізико-хімічних досліджень і в порівнянні з достовірними зразками ідентифікували речовину 3 як галову кислоту чи 3,4,5-триоксибензойну кислоту, а речовину 7 як елагову кислоту чи дилактон гексаоксидифенової кислоти, речовину 5 можна віднести до 2,3-дигалоїл-D-глюкози, а речовина 6 – до 2,3,6-тригалоїл-D-глюкози.

С-глікозиди. Сполуку 2 на підставі якісних реакцій, хроматографічної рухливості, фізико-хімічних характеристик, УФ- та ІЧ-спектрального аналізу ідентифікували як бергенін чи С-глюкопіранозил–4-О-метоксигалової кислоти. Речовину 4 було отримано у виді кремового аморфного порошку, і вона відрізнялася від речовини 2 хроматографічною рухливістю. Кислотні властивості речовини 4 були виявлені за реакцією з метиленовим червоним, бромкрезоловим зеленим та ін. УФ-спектри бергеніну і сполуки 4 ідентичні. ІЧ-спектральний аналіз виявив наявність вільної карбоксильної групи у речовини 4 по смузі поглинання при 1710см–1. Припускаючи, що речовина 4 є бергеновою кислотою, було проведено зустрічне хімічне перетворення (рис.2).

бергенін аніон бергенової кислоти Бергенова кислота

Рис.2. Схема хімічного перетворення бергеніну

Наважку бергеніну розчиняли в 10% розчині натрію гідроксиду, отриманий розчин нейтралізували розчином хлористоводневої кислоти до слабокислого середовища, отриманий продукт кристалізували і вивчали його фізико-хімічні властивості. Хроматографічні характеристики отриманого синтетичного похідного (рис.2) і речовини 4, також як і УФ- і ІЧ-спектри були ідентичні. ВЕРХ аналіз дозволив встановити однаковий час утримання одержаного синтетичного продукту і речовини 4. Таким чином, речовину 4 можна охарактеризувати як бергенову кислоту або С-глюкопіранозид метоксигалової кислоти, яка є новою природною сполукою, раніше не описаною у літературі.

Таблиця 2

Фізико-хімічні властивості фенольних сполук, виділених з листків бадану

№ Назва речовини t° топл.є С l max, нм Величина Rf

Фенологлікозиди

1. Арбутин 195-196 220,286 0,39-А; 0,73-Б; 0,25-Д

Галоїльні похідні

2. Бергенін 235 275,220 0,43-А; 0,58-Б;0,50-Г;0,45-Д

3. Галова кислота 225-230 272 0,60-А; 0,48-Б

4. Бергенова кислота Аморф. 275, 220 0,86-А; 0,12-Б; 0,20-Б; 0,23-Г

5. Дигалоїлглюкоза Аморф. 0,52-Б

6. Тригалоїл глюкоза 182-183 0,59-Б

7. Елагова кислота 358-360 366, 255 0,07-В

Флавоноїдні аглікони

8. Лютеолін 329-330 350,265,255 0,84 –В; 0,05-А; 0,82-Б

9. Апігенін 257-258 335, 270 0,90 –В; 0,07-А

10. Кверцетин 311-313 375,270,255 0,77 –В; 0,07-А

11. Кемпферол 275-277 370,265 0,85 –В; 0,05 - А

Флавоноїдні глікозиди

12. Цинарозид 257-258 350,265,255 0,22-А; 0,49-Б

13. Космосіїн 226-228 335, 270 0,26-А

14 3-О-b- D-глюкопіранозид кверцетину Аморф. 360, 257 0,57-А

15. 3-О-b-D-глюкопіранозид кемпферолу Аморф. 345, 265 0,43-А

16. Рутин 189-190 360, 257 0,61-В; 0,51-А; 0,50-Б

17. Нікотифлорин 224-225 345, 265 0,43-В; 0,54-А

Оксикоричні кислоти

18. Кофейна кислота 193-194 325, 245 0,82-А; 0,38-Б

19. Хлорогенова кислота 203-205 325, 240 0,63-В; 0,55 -А

20. Неохлорогенова кислота Аморф. 325, 300 0,67-В; 0,75-А

Системи для хроматографування

А - 15% оцтова кислота; Б - БОВ (4:1:2); В - БОВ (4:1:5);

Г - етилацетат - оцтова кислота - вода (3:1:3);

Д – метанол - хлороформ (8:2)

Фенологлікозиди. Метод хроматографії на папері, ТШХ і ВЕРХ, якісні реакції і фізико-хімічні властивості показали, що сполука 1 є арбутином чи 0-b-D-глюкозидом гідрохінону.

За допомогою ВЕРХ аналізу визначили кількісний вміст деяких фенольних сполук, результати наведені в таблиці 3.

Таблиця 3

Кількісний вміст фенольних сполук в екстрактах листків різних видів роду бадан

Вид Вміст фенольних сполук, %

Арбутин Бергенін Бергенова кислота Рутин Галова кислота Елагова кислота

B. ciliata 6,29 5,96 - 0,99 0,65 2,80

B. pacifica 8,86 8,52 23,66 0,97 1,29 17,87

B. stracheyi 6,76 6,09 11,52 1,03 1,80 8,00

B. crassifolia 9,18 6,14 19,90 1,01 2,15 3,98

B. delavayi x m 12,03 1,44 24,32 1,00 1,91 10,06

B. gorbunovii 0,79 18,48 2,19 1,00 9,48 2.21

B. hymalaica 9,51 11,25 2,63 1,01 5,80 7,84

B. cordifolia 9,23 12,44 2,94 0,98 2,31 2,47

Морфолого-анатомічний аналіз та інтродукційна оцінка рослин роду бадан

Уперше проведене порівняльне морфолого-анатомічне дослідження листків 6 видів роду Bergenia: B. crassifolia (L.) Fritsch, B. соrdіfоlіа Fritsch, B. ciliata (Haw.), B. stracheyi (Hook. Fil. St Thoms.) Engl., B. delavayi x media Engl., B. pacifica Kom. Встановлені їх загальні і відмінні морфолого-анатомічні особливості.

Для листків у цілому характерні: товстостінна з чітковидними зовнішніми оболонками епідерма; клітини ідіобласти з великими друзами і брунатним вмістом; куткова коленхіма, яка оточує 1-2 шарами черешок та доповнює краї листкової пластинки, піхви і борозенок; дрібні колатеральні провідні пучки часто оточені 1-2 шарами клітин з коричневим вмістом.

У черешків є велика кількість дрібних колатеральних провідних пучків. Для черешків характерна епідерма з чітковидними зовнішніми оболонками, основну масу черешка складає товстостінна, воздухоносна паренхіма, яка містить навесні і влітку прості крохмальні зерна, що змінюються восени і брунатний вміст; ланцюжки друз у коленхімі і зовнішніх шарах пов'язаною з нею паренхіми.

Для листкової пластинки характерно багатогранна з чітковидними оболонками епідерма з продихами анізоцитного типу і заглибленими залозками; тришаровий стовпчастий і багатошаровий губчатий мезофіл, що містить клітини ідіобласти та друзи; гідатоди по зубчиках краю листка; наявність багатопучкових центроксилемних і однопучкових бічних жилок.

При морфолого-анатомічному порівнянні вивчених видів листків установлено: у шести з вивчених видів листків істотних відмінностей не виявлено. Найбільш відрізняється за морфолого-анатомічною будовою від інших видів бадан Горбунова, який має трохи потовщені (у порівнянні з іншими видами) зовнішні чітковидні оболонки верхньої і нижньої епідерми, чотиришарову стовпчасту паренхіму; наявність емергенців, які нагадують шипики і колючки.

За ознаками, що показують стан, а також мають значення для практичного застосування, рослини роду бадан є дуже перспективними для введення в культуру на північному сході України.

Хемосистематичний аналіз таксонів роду бадан

Виділені фенольні сполуки використовували як хімічні ознаки для хемосистематичного дослідження 8 таксонів роду бадан. Ознаки подібності і розходження, біохімічну дистанцію розраховували за допомогою результатів кількісного аналізу методом ВЕРХ. Данні про процентний вміст компонентів використовували для визначення біохімічної дистанції між видами за методом Рунемарка (таблиця 4). Для статистичного аналізу роду бадан була використана програма Statistica 5.0.

Зіставлення кластерних дендрограм по парній і груповій подібності (рис.3) і полігональних графів (рис.4), отриманих за біохімічними дистанціями, дозволило з'єднати таксони з яскравими біохімічними відмінностями й упевнитися в подібності близьких таксонів.

На підставі отриманих даних досліджені таксони роду бадан можна розділити на дві групи: перша група – B. crassifolia, B. stracheyi, B. delavayi x media, B. pacifica. Найбільш віддаленим таксоном цієї групи є B. pacifica. Друга група – B. ciliata, B. hymalaica, B. cordifolia, B. gorbunovii. Встановлено, що B. gorbunovii є найбільш віддаленим від таксонів з представників другої групи. B. pacifica є найбільше віддаленим таксоном з усіх досліджених представників роду Bergenia.

Таблиця 4

Біохімічна дистанція між таксонами роду бадан

Таксон B. ciliata B. pacifica B. stracheyi B. crassifolia B. delavayi x media B. gorbunovii B. hymalaica B. cordifolia

B. ciliata 0.00 119.33 70.71 93.90 103.05 106.29 78.47 86.93

B. pacifica 119.33 0.00 80.41 70.50 67.50 132.19 104.40 120.97

B. stracheyi 70.71 80.41 0.00 49.25 59.35 108.92 74.48 75.61

B. crassifolia 93.90 70.50 49.25 0.00 55.90 114.09 85.56 88.50

B. delavayi x media 103.05 67.50 59.35 55.90 0.00 123.75 88.63 96.99

B. gorbunovii 106.29 132.19 108.92 114.09 123.75 0.00 65.18 68.84

B. hymalaica 78.47 104.40 74.48 85.56 88.63 65.18 0.00 55.49

B. cordifolia 86.93 120.97 75.61 88.50 96.99 68.84 55.49 0.00

Рис.3. Кластерна дендрограма за груповою подібністю

Рис.4. Полігональний граф біохімічної спорідненості B.hymalaica до інших видів бадану

Дослідження противірусних і протипухлинних властивостей листків бадану товстолистого

При дослідженні фармакологічної активності екстрактів з листків бадану товстолистого для зараження тварин використовували вірус везикулярного стоматиту (ВВС), штам Індіана, клітини асцитного раку Ерліху. У дослідженнях противірусної дії лектинів і екстрактів використовували: культуру клітин печінки мавпи (VERO), штам Л-2 віруси герпесу 1 типу (ВПГ1).

Проведені дослідження свідчать, що лектини бадану й екстракти, що містять лектини мають противірусну активність стосовно вірусу везикулярного стоматиту, Екстракти з бадану товстолистого мали противірусну активність у дозах 0,54 мг/мл проти ВВС. Також було проведене порівняння характеристик досліджуваних екстрактів: максимально стерпної дози (МСД) та антівирусної дії з відомим препаратом – бонафтоном. Результати представлені в таблиці 5.

Таблиця 5

Порівняльні характеристики екстракту листків бадану товстолистого і препарату порівняння – бонафтону

Препарати МСД (мг/мл) Антивірусна дія стосовно до ВВС у дозі (мг/мл)

Досліджуваний препарат 15,00 ± 1,00 0,54 ± 0,04

Бонафтон 0,105 ± 0,05 0,095 ± 0,005

Встановлено, що противірусна активність екстракту з листків бадану залежить від технології його одержання і наявності в ньому лектинів.

Рис.5. Противірусна дія лектинів бадану з екстракту ВВ і вільного від білків і полісахаридів фракції ВЕ

Використання спирту для осадження лектинів чи високої температури спричиняє денатурацію білка і втрату противірусної дії екстракту (екстракт ВЕ). Лектини бадану й екстракти бадану (екстракт ВВ), не оброблені спиртом чи температурою (до 400 С) можуть бути використані для розробки нового препарату з протигерпетичними властивостями. Ефективна концентрація суми очищених лектинів бадану, що гальмує цитопатичну дію вірусів герпесу складає 1,5 мкг/мл, тоді як вільний від лектинів екстракт не має противірусної активності (рис.5).

Екстракти з листків бадану товстолистого незначно гальмують ріст маси тіла хворих мишей з асцитною аденокарциномою Ерліху, що свідчить про протипухлинну активність екстракту бадану товстолистого.

ВИСНОВКИ

1. Уперше проведене комплексне вивчення листків 8 таксонів роду бадан (Bergenia). Встановлено наявність різних груп біологічно активних речовин: амінокислот, вуглеводів, лектинів, мікроелементів, фенольних сполук, (флавоноїдів, галоїльних похідних, фенологлікозидів, оксикоричних кислот), ліпофільних речовин (хлорофілів, каротиноїдів, токоферолів, жирних кислот).

2. За допомогою препаративної хроматографії на папері, ТШХ, методів колонкової хроматографії на поліаміді, ВЕРХ, з листків бадану товстолистого й інших видів у індивідуальному стані виділено й встановлено структуру 20 речовин, таких як 6 флавоноїдних глікозидів: цинарозид, космосіїн, рутин, 3-О-b-D-глюкопіранозид кемпферолу, 3-О-b-D-глюкопіранозид кверцетину, нікотифлорин; флавоноїдні аглікони: лютеолін, апігенін, кверцетин, кемпферол; 3 оксикоричні кислоти: кофейна, хлорогенова та неохлорогенова кислота, фенологлікозид: арбутин, 6 галоїльних похідних: елагова кислота, галова кислота, дигалоїл – D-глюкоза, тригалоїл-D-глюкоза; С-глікозиди: бергенін, С-глюкопіранозид-метоксигалової кислоти (бергенова кислота).

3. Уперше з листків бадану виділена нова природна сполука, названа нами бергенова кислота або С-глюкопіранозид-метоксигалової кислоти, структура якої встановлена за допомогою хімічних перетворень і спектрофотометричних методів.

4. Уперше був вивчений білково-полісахаридний комплекс листків бадану товстолистого. Новими для листків виявилися такі сполуки як лектини, та встановлено їх титр у листках і кореневищах. У листках бадану були виявлені наступні вуглеводи до гідролізу: глюкоза, рамноза, арабіноза, фруктоза, а в гідролізаті: арабіноза, галактоза, глюкоза, фруктоза, апіоза, уронова і глюкуронова кислоти. Ідентифіковано 16 амінокислот, домінуючими амінокислотами є аспарагінова (до 2,26%) і глютамінова кислоти (до 1,44%). Вміст білка в сировині склав біля 8%, у водному екстракті - 62%, вміст азотовмісних сполук у спиртовому екстракті склав біля 32%, а в шроті - 14 %.

5. Сума ліпофільних речовин із зелених, чорних, свіжих листків бадану товстолистого склала 9,4%, 8,8% і 3% відповідно. Вміст хлорофілу в екстрактах склав 206,0 мг/г і 10,2 мг/г відповідно, а сума токоферолів в екстрактах із зелених і чорних листів склала 0,55 мг/г і 0,21 мг/г відповідно. Ідентифіковано 14 жирних кислот, сума кислот склала 24% від ліпофільного екстракту. Домінуючими жирними кислотами є: пальмітинова, олеїнова і лінолева.

6. Уперше був визначений мікроелементний склад золи 8 видів роду бадан. Була встановлена наявність 22 мікроелементів, з них у найбільшій кількості накопичуються: мідь (до 35 мг/кг), марганець (до 78 мг/кг) і залізо (до 1200мг/кг).

7. Уперше було проведене порівняльне анатомічне дослідження листків 8 таксонів роду бадан і були встановлені нові, раніше не описані анатомічні ознаки. При морфолого-анатомічному порівнянні вивчених видів листків встановлено: у шести з вивчених видів листків істотних розходжень не виявлено, тільки листи бадан у Горбунова відрізняються наявністю емергенців.

8. Уперше було проведене хемосистематичне дослідження 8 таксонів роду бадан. Вивчені види були зібрані в групи за біохімічними груповими і парними ознаками: 1) – B. сrassifolia, B. delavayi x media, B. pacifica; 2) – B.сiliata, B.hymalaica, B.cordifolia, B. gorbunovii. Перспективними для розширення сировинної бази і створення препаратів, крім B. crassifolia, виявилися: В. stracheyi, B. delavayi x media.

9. Уперше була визначена противірусна активність екстрактів листків бадану товстолистого. Отримані результати лягли в основу розробки проектів АНД “Листки бадану товстолистого” і “Сухий екстракт листків бадану товстолистого”.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ ВИКЛАДЕНО В ПУБЛІКАЦІЯХ

1. Картмазова Л.С., Сіра Л.М., Попова Н.В., Кожух І.О. Фармакогностичне дослідження бадану товстолистого // Фармацевтичний журнал. - 1998. - №1. - С. 90-94.

2. Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д., Литвиненко В.И., Попова Н.В., Оккерт И.Л., Кожух И.А. Растительные адаптогены. // Вестник проблем биологии и медицины. – 1998. - №3. – С.24-30.

3. Мартинов А.В., Смілянська М.В., Кожух І.О., Волькович О.О., Попова Н.В., Кисличенко В.С. Протипухлинна дія рослинних глікопротеїдів, що афінні до імуноглобулінів класу G. // Фармацевтичний журнал. – 2000. - №5. – С.78-81

4. Мартинов А.В., Смілянська М.В., Попова Н.В., Кисличенко В.С., Кожух І.О., Волькович О.О., Ткаченко О.Ю. Дослідження противірусної дії ряду рослинних протеогліканів та полісахаридів у вигляді терапевтичних систем С-2.// Фармацевтичний журнал. – 2001. - №4. – С.74-77.

5. Литвиненко В.І., Попова Н.В., Кожух І.О., Комір З.В., Вавилов С.В. Вивчення амінокислотного та елементного складу роду бадан. // Вісник фармації. – 2000 - №3 (23). – С.14-17.

6. Попова Н.В., Кожух І.О. Вивчення ліпофільного екстракту з листа бадану товстолистого // Вісник фармації. – 2001 - №3 (27). – С.36.

7. Литвиненко В.И., Мартынов А.В., Попова Н.В., Кожух И.А. Некоторые технологические и биофармацевтические особенности экстракции лектинов бадана. // Фармаком. – 2002.- №3. – С. 123-127.

8. Картмазова Л.С., Серая Л.М., Литвиненко В.И., Попова Н.В., Кожух И.А. Фармакогностическое изуение листьев бадана толстолистного./Тез. доп. IV міжнар.конференції з медичної ботаніки. – Київ,1997. – С.354-355.

9. Литвиненко В.И., Попова Н.В., Кожух И.А. Химическое изучение листьев бадана толстолистного./“Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений”: Материалы междунар. совещания посвященого памяти В.Г. Минаевой. – Новосибирск, 1998. – С.36-37.

10. Кожух И.А., Попова Н.В. Исследование и разработка тонизирующего препарата. / “Теорія і практика створення лікарських препаратів”: Матеріали міжнарод. конференціїї, присвячений 75-річчю з дня народження Сала Д.П. – Х., 1998. - С.152-155.

11. Попова Н.В., Литвиненко В.И., Кожух И.А. Качественный и количественный анализ листьев бадана толстолистного. / “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті”: Матеріали V національного з'їзду фармацевтів України. – Х., 1999. – С.321-322.

12. Попова Н.В., Кожух І.О., Комир З.В., Мартинов А.В. Перспективи використання рослин роду бадан. / Матеріали науково-практичної конференції „Вчені України - вітчизняній фармації”. – Харків, 2000. – С.157-158.

Кожух И. А. “Фармакогностическое изучение растений рода бадан”. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 – фармацевтическая химия и фармакогнозия Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2002.

Впервые проведено фармакогностическое изучения листьев 8 видов растений рода бадан, семейства камнеломковые. Объектами исследований были экстракты из листьев и листья растений рода бадан: Bergenia crassifolia, Bergenia соrdіfоlіа, Bergenia ciliata, Bergenia stracheyi, Bergenia delavayi x media Engl., Bergenia pacifica, Bergenia hymalaica, Bergenia gorbunovii.

Установлено наличие различных групп биологически активных веществ: карбоновых кислот и аминокислот, углеводов, каротиноидов, хлорофиллов, токоферолов, жирных кислот, микроэлементов лектинов, флавоноидов, галлоильных производных, фенологликозидов, оксикоричных кислот.

Выделена и изучена сумма липофильных веществ из зеленых и черных листьев бадана толстолистного. Определено количественное содержание хлорофиллов, токоферолов и каротиноидов в экстрактах полученных из зеленых и черных листьев бадана. Идентифицировано 14 жирных кислот, сумма которых составила 24% от липофильного экстракта.

Микроэлементный состав 8 видов роду бадан был изучен впервые. Было установлено наличие 22 микроэлементов у различных органах растений рода бадан.

Впервые из бадана толстолистого были выделены лектины и установлен их титр в листьях - 1 : 1024 и в корневище - 1 : 32.

С помощью колоночной хроматографии на полиамиде, препаративной хроматографии из листьев бадана было выделено 20 индивидуальных соединений: четыре агликона флавоноидов, четыре моногликозида и два биозида флавоноидов, три оксикоричные кислоты, четыре галлоильных производных, 2 С-гликозида и один фенологликозид. На основании качественных реакций, хроматографической подвижности, физико-химических свойств, УФ и ИК-спектроскопии, продуктов химических превращений в сравнении с достоверными образцами, выделенные соединения были идентифицированы как: флавоноиды: лютеолин, апигенин, кверцетин, кемпферол, цинарозид, космоссиин, 3-О-b-D-глюкопиранозид кверцетина, 3-О-b-D-глюкопиранозид кемпферола, рутин, никотифлорин; оксикоричные кислоты: кофейная, хлорогеновая, неохлорогеновая кислоты; галлоильные производные: эллаговая кислота, галловая кислота, дигаллоил-D-глюкоза, тригаллоил-D-глюкоза; бергенин, бергеновая кислота (новое природное соединение); фенологликозид арбутин.

Впервые было проведено сравнительное анатомическое изучение листьев различных таксонов рода бадан и установлены новые, ранее не описанные анатомические признаки. При морфолого-анатомическом сравнительном анализе листьев различных видов установлено: у листьев изученных видов существенных различий не установлено, только листья бадана Горбунова отличаются наличием эмергенцев.

Впервые было проведено хемосистематическое исследование 8 таксонов рода Bergenia: B. crassifolia (L.) Fritsch., B. cordifolia Engl., B. pacifica Kom., B. stracheyi, B. hymalaica Boriss., B. delavayi x media, B. сiliata B. Fedtsch, B. gorbunovii B. Fedtsch. и изученные виды объединены по биохимическим, групповым и парным признакам в две группы.

Впервые была установлена противовирусная активность экстрактов из листьев бадана толстолистного по отношению к вирусу везикулярного стоматита. Установлена активная и максимально переносимая доза для экстракта.

Результаты работы внедрены в учебный и научно-исследовательский процесс кафедр фармакогнозии, медицинской ботаники НФаУ, кафедры фармакогнозии и ботаники Тернопольской медицинской академии им. И.Я.Горбачевского, секции фармакогнозии и ботаники кафедры фармации, Национального медицинского университета им. О.О. Богомольца, кафедры фармакогнозии Ташкентского фармацевтического института, апробированы в условиях ЦЗЛ ОЗ ГНЦЛС и в лаборатории химии и технологии фенольных препаратов ГНЦЛС, и использованы для разработки проектов АНД “Листья бадана толстолистного” и “Сухой экстракт листьев бадана толстолистого”.

Ключевые слова: Бадан толстолистный (Bergenia crassifolia), бадан сердцевидный (Bergenia cordifolia), бадан тихоокеанский (Bergenia pacifica), бадан стречи (Bergenia stracheyi), бадан гималайский (Bergenia hymalaica), гибрид бадана Делаво (Bergenia delavayi x media), бадан реснитчатый (Bergenia сiliata), бадан Горбунова (Bergenia gorbunovii), фармакогностическое изучение, флавоноиды, галлоильные производные оксикоричные кислоты, С-гликозиды, аминокислоты, жирные кислоты, хлорофиллы, каротиноиды, токоферолы, лектины, микроэлементы, хематоксономическое изучение, противовирусная активность.

Кожух І. О. “Фармакогностичне вивчення рослин роду бадан”. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за фахом 15.00.02 – фармацевтична хімія і фармакогнозія. Національний фармацевтичний університет, Харків, 2002.

Уперше проведене фармакогностичне дослідження листків 8 видів рослин роду бадан, родини ломикаменеві. Об'єктами досліджень були екстракти з листків і листки рослин роду бадан : Bergenia crassifolia, Bergenia соrdіfоlіа, Bergenia ciliata, Bergenia stracheyi, Bergenia delavayi x media, Bergenia pacifica, Bergenia hymalaica, Bergenia gorbunovii.

Установлено наявність та кількісний склад різних груп БАР: флавоноїдів, дубильних речовин, галоїльних похідних, фенологлікозидів, оксикоричних кислот, карбонових кислот і амінокислот, вуглеводів, каротиноїдів, хлорофілів, токоферолів, жирних кислот, мікроелементів і лектинів.

Уперше з бадану товстолистого були виділені лектини і встановлений їх титр у листках і кореневищі.

З листків бадану було виділено та встановлено структура 20 індивідуальних сполук: 4 аглікони флавоноїдів, 4 моноглікозиди і 2 біозиди флавоноїдів, 3 оксикоричні кислоти, 4 галоїльні похідні, 2 С-глікозиди, один з яких, бергенова кислота, є новою природною сполукою, і 1 фенологлікозид.

Уперше було проведене порівняльне анатомічне дослідження листків 8 таксонів роду бадан і були встановлені нові раніше не визначені анатомічні ознаки.

Хемосистематичне дослідження 8 таксонів роду бадан було проведено вперше, вивчені види були згруповані за біохімічними, груповими і парними ознаками у дві групи.

Уперше була визначена противірусна активність екстрактів листків бадану товстолистого до вірусу везикулярного стоматиту.

Розроблені проекти АНД “Листки бадана товстолистого” і “Сухий екстракт листків бадана товстолистого”.

Ключові слова: Бадан товстолистий (Bergenia crassifolia), бадан серцелистий (Bergenia cordifolia), бадан тихоокеанський (Bergenia pacifica), бадан Стречі (Bergenia stracheyi), бадан гімалайський (Bergenia hymalaica), гібрид бадану Делаво (Bergenia delavayi x media), бадан війчастий (Bergenia сiliata), бадан Горбунова (Bergenia gorbunovii), фармакогностичне дослідження, флавоноїди, галоїльні сполуки, оксикоричні кислоти, С-глікозиди, амінокислоти, жирні кислоти, хлорофіли, каротиноїди, токофероли, лектини, мікроелементи, хематоксаномічне вивчання, противірусна активність.

Kozhukh I. A. “The pharmacognostic study of genus Bergenia plants”. – Manuscript. Thesis for the candidate of pharmaceutical science Degree in speciality 15.00.02 – pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. National University of Pharmacy, Kharkov, 2002.

For the first time the pharmacоgnostic study of leaves of 8 species of genus Bergenia, Saxifragacaea family, has been carried out. The objects of the study were both extracts from Bergenia leaves and leaves of Bergenia crassifolia, Bergenia соrdіfоlіа, Bergenia ciliata, Bergenia stracheyi, Bergenia delavayi x media, Bergenia pacifica, Bergenia hymalaica, Bergenia gorbunovii

The presence, qualitative and quantitative determinations of flavonoides, tannins, oxycinnamine acids, gallic derivatives, phenolic glycoside, carbonic and amino acids, carbohydrates, carotinoides, chlorophylls, tokoferols, fatty acids, micro elemental and lectins have been determined with the help of physico-chemical and chemical methods of analysis. 20 individual compounds (4 aglycones, 4 monoglycosides and 2 biosides of flavonoides, 3 oxycinnamine acids, 4 gallic derivatives, 2 C-glycosides, 1 phenolic glycoside) have been isolated.

This