ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені юрія федьковича

Кравчук Лариса Олександрівна

УДК 616.36-099-085.272.4/.246.2]-092.9

ПОРУШЕННЯ ЗАХИСНИХ СИСТЕМ ОРГАНІЗМУ У ТВАРИН З ГОСТРИМ ТОКСИЧНИМ УРАЖЕННЯМ ПЕЧІНКИ І КОРЕКЦІЯ ЇХ ЗА ДОПОМОГОЮ АНТИОКСИДАНТІВ ТА ЕНТЕРОСОРБЕНТА

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Чернівці – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Тернопільській державній медичній академії ім.І.Я.Горбачевського Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник:

Доктор медичних наук, професор

Гонський Ярослав Іванович, Тернопільська державна медична академія ім.І.Я.Горбачевського, завідувач кафедри медичної хімії.

Офіційні опоненти: - доктор медичних наук, професор Пішак Василь Павлович, Буковинська державна медична академія, ректор

- доктор біологічних наук, професор Великий Микола Михайлович, Київський національний медичний університет ім.О.О.Богомольця, кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Захист відбудеться 17.04.2002 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 у Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: 580123, м. Чернівці, вул. Коцюбинського, 2

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича ( 58012, м.Чернівці, вул.Л.Українки, 23)

Автореферат розісланий 15.03. 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради Копильчук Г.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Кількість уражень гепатобіліарної системи у різних країнах світу постійно зростає, а серед причин смертності хвороби печінки різної етіології посідають восьме місце [49]. Хімізація народного господарства і побуту, неконтрольоване вживання ліків спричинили збільшення частоти токсичних і медикаментозних уражень печінки. За підрахунками спеціалістів, у середовищі проживання сучасної людини існує біля 5-6 млн хімічних сполук, багатьом з яких притаманні гепатотропні властивості (Губський Ю.І., Долго - Сабуров В.Б., Храпак В.В, 1993).

Важливе місце у списку гепатотропних отрут належить гідразину, який все ширше застосовується в промисловості (ракетне паливо, виробництво пластмас, гуми тощо), сільському господарстві і медицині (Белов А.А., 2000; Гадаскина И.Д., Филов В.А., 1987). Ураження печінки при гострій інтоксикації гідразином характеризується ожирінням гепатоцитів, тобто розвитком жирового гепатозу, проте дані літератури про молекулярні механізми дії даної отрути суперечливі (Авакян А.Х., 1990; Копылова Т.Н., Майоре А.Я., Эрлете Д.Л., 1983; Banks W.L., 1970).

Серед гепатотоксичних факторів важливе місце займає також етиловий алкоголь. Токсичне ураження печінки спостерігається у 10-20 % осіб, котрі зловживають алкоголем (15-20 млн чол.). Результатом токсичної дії алкоголю на печінку є також розвиток жирового гепатозу, проте механізм розвитку цього стану дещо інший. Він включає цілу сукупність порушень обмінних процесів, серед яких є підвищення мобілізації жирних кислот із жирових депо, зниження їх утилізації у печінці, посилення утворення тригліцеринів та зниженя їх екскреції із печінки (Хворостинка В.Н., Тесленко В.Г., 1993; G. Wenzel, B. Kuklinski, C. Ruhlmann, 1993)..

Особливий інтерес являє собою поєднання гепатотоксичної дії ксенобіотиків, в т.ч. і гідразину, з етиловим алкоголем, що в реальному житті зустрічається досить часто. У ряді публікацій вказано, що така взаємодія є складним процесом. З одного боку етанол може підсилювати чи послаблювати гепатотоксичність різних речовин, а з іншого – останні можуть впливати на його токсичність (Di Luzio N.R., Stece T.E., Hoffman E.O., 1973).

Виходячи з того, що патогенез токсичного ураження печінки гідразином повністю не з'ясований, не вивчено механізми поєднаної дії етилового спирту та гідразину на стан захисних систем та мембранних структур гепатоцитів, немає даних про способи лікування токсичного ураження печінки при поєднаному впливі гідразину та етилового спирту, дана проблема зумовлює актуальність проведених нами експериментальних досліджень та вказує на доцільність пошуку нових способів корекції викликаних патологічних змін.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Напрямок дисертаційної роботи тісно пов'язаний з плановою науковою міжкафедральною темою кафедр медичної хімії та біології Тернопільської медичної академії ім. І.Я.. Горбачевського “Вікові особливості перебігу окиснювального і нуклеотидного обміну за умов ураження печінки хімічними і біологічними токсинами та способи їх корекції” № держреєтрації – 0195 U 023938, в якій автор досліджувала зміни функціональної активності антиоксидантної та детоксикаційної систем захисту і стану мембранних структур гепатоцитів за умов токсичного ураження солянокислим гідразином, етиловим спиртом та їх поєднаної дії

Мета дослідження. З'ясувати особливості функціонування захисних систем організму та стану мембранних структур гепатоцитів за умов токсичного ураження солянокислим гідразином та у комбінації його з етиловим спиртом, а також розробити ефективні схеми корекції порушень цих систем за допомогою прополісу, холінфосфатидних ліпосом та ентеросорбції.

Завдання дослідження.

1. Встановити рівень активності процесів ліпопероксидації і стан ферментної та неферментної антиоксидних систем в динаміці токсичного ураження печінки солянокислим гідразином та у комбінації його з етиловим спиртом.

2. Встановити активність процесів мікросомального окиснення за умов токсичного ураження печінки солянокислим гідразином та у комбінації з етиловим спиртом.

3. З'ясувати рівень функціональної активності мембранозалежних ферментів – амінотрансфераз, кислої фосфатази, цитохромоксидази, каталази у плазмі крові та печінці тварин з токсичним ураженням солянокислим гідразином та у комбінації з етиловим алкоголем.

4. Встановити вплив прополісу на стан антиоксидантної, мікросомальної систем та активність мембранозалежних ферментів у печінці тварин з токсичним ураженням, викликаним введенням солянокислого гідразину та етилового спирту.

5. Встановити можливість корекції порушень захисних систем організму, викликаних введенням солянокислого гідразину в комбінації його з етиловим спиртом, за допомогою ентеросорбції та холінфосфатидних ліпосом.

6. Обгрунтувати доцільність використання комбінації розчину прополісу, ентеросорбції та холінфосфатидних ліпосом за умов інтоксикації солянокислим гідразином у комбінації з етиловим спиртом.

Об'єкт дослідження – хімічне ураження печінки солянокислим гідразином на фоні інтоксикації етанолом.

Предмет дослідження – показники вільнорадикального окиснення, вираженості токсичного синдрому, антиоксидантної та мікросомальної систем захисту, активність мембраноспецифічних ферментів у тварин з токсичним ураженням солянокислим гідразином на фоні інтоксикації етиловим спиртом та після корекції прополісом, холінфосфатидними ліпосомами з інкорпорованим токоферолу ацетатом, полісорбом і поєднаному їх застосуванні.

Методи дослідження – стан пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) оцінювали за показниками спонтанної (СХЛ) і індукованої пероксидом водню хемілюмінесценції (ХЛ); ферментної та неферментної ланок антиоксидної системи (АОС) за активністю супероксиддисмутази (СОД), каталази (КТ), глутатіонпероксидази (ГП), церулоплазміну (ЦП), відновленого глутатіону (GSH); показники інтоксикації та дезінтоксикаційної системи за концентрацією молекул середньої маси (МСМ), еритроцитарного індексу інтоксикації (ЕІІ), N-деметилазної та п-гідроксилазної активності мікросом гепатоцитів, тривалістю гексеналового сну; функціональний стан мембранних структур за активністю аланінамінотрансферази (АлАТ) та аспартатамінотрансферази (АсАТ), цитохромоксидази (ЦО), кислої фосфатази (КФ).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше комплексно досліджено функціональний стан плазматичних та субклітинних мембран, захисних систем організму (антиоксидної, мікросомальної) за умов токсичного ураження солянокислим гідразином та у комбінації його з етиловим алкоголем.

Вперше досліджено мембранопротекторні властивості розчину прополісу за умов токсичного ураження печінки солянокислим гідразином у комбінації з етиловим спиртом.

Отримані нові дані про вплив холінфосфатидних ліпосом з токоферолу ацетатом на процеси мікросомального окиснення, стан антиоксидантної системи та активність мембранозалежних ферментів.

Вперше запропоновано комбінацію розчину прополісу, холінфосфатидних ліпосом та ентеросорбції, що дозволяє підвищити ефективність фармакотерапії токсичних уражень печінки.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дають можливість поглибити уявлення про патогенетичні механізми токсичного ураження печінки солянокислим гідразином та у комбінації його з етиловим алкоголем, що дозволяє розробляти більш ефективні методи корекції порушень, які виникають за даної патології.

Комплексна оцінка інтенсивності порушень показників захисних систем організму дозволяє більш достовірно діагностувати ступінь пошкодження печінки та розробити прогноз перебігу даного процесу. Отримані результати дозволяють констатувати ефективність використання розчину прополісу за умов токсичних уражень печінки, що, враховуючи доступність та нетоксичність даного препарату, дає можливість застосовувати його в клінічній практиці. Враховуючи простоту використання та високу ефективність, рекомендовано розширити показання до застосування ентеросорбції полісорбом у комплексному лікуванні токсичних уражень печінки. На основі проведених досліджень пропонується ефективна комбінація лікарських засобів, які впливають на різні ланки патогенезу цих патологічних станів: мембранопротектор – прополіс, препарат замісної терапії – холінфосфатидні ліпосоми та засіб еферентної терапії –ентеросорбент полісорб.

Результати досліджень впроваджені в навчальний процес на кафедрах медичної хімії, фармакології, загальної гігієни та екології Тернопільської медичної академії ім. І.Я.Горбачевського, що підтверджено відповідними актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведені біохімічні та біофізичні дослідження, статистична обробка результатів, оформлення роботи. Аналіз та обговорення матеріалів, викладених в дисертаційній праці, проведено спільно з науковим керівником. Визначення активності мікросомальних ферментів та хемілюмінесценції проводились за участю співробітників кафедри медичної хімії Тернопільської державної медичної академії ім.. І.Я. Горбачевського, за що автор висловлює їм щиру подяку. Приготування суспензії холінфосфатидних ліпосом здійснювалось за сприяння кафедри екології Тернопільського педагогічного університету ім. В. Гнатюка, за що автор висловлює щиру подяку канд.біол. наук Бродіну С.В.

Апробація результатів дисертації: Результати досліджень, які проводились в ході виконання дисертаційної роботи, докладались на обласних науково-практичних конференціях (Тернопіль, 1998-2000), Республіканській науково-практичні конференції “Дослідження та невирішені питання гастроентерології (Харків, 1998); ІІІ Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих учених (Тернопіль, 1999); ІУ Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих учених (Тернопіль, 2000), ІІІ Національному конгресі геронтологів та геріатрів України (Київ, 2000).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 8 наукових робіт, з яких 3 – у фахових виданнях, що затверджені ВАК України, 5 робіт у матеріалах і тезах конференцій та симпозіумів.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 187 сторінках і складається із вступу, огляду літератури, опис матеріалів та методик дослідження, 5 розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел (всього 262 найменування). Робота проілюстрована 40 таблицями та 12 рисунками. Загальний обсяг ілюстрацій, таблиць та списку використаних джерел дорівнює 68 сторінкам.

Огляд літератури. В огляді літератури розкриваються питання функціонального стану мембранних структур гепатоцитів, антиоксидантної та мікросомальної систем захисту за умов інтоксикації солянокислим гідразином, а також корекції патологічних порушень.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди виконані на білих безпородних щурах-самцях масою тіла 150 - 180 г, які утримувалися на стандартному раціоні віварію. В процесі роботи використано 362 тварини.

Моделями токсичного ураження печінки служила інтоксикація тварин солянокислим гідразином, який вводили щурам внутрішньоочеревинно одноразово у вигляді 6 % водного розчину в дозі 56 мг/кг , та комбіноване ураження гідразином та етиловим спиртом, котрий вводили за 3 год до ін'єкції гідразину внутрішньошлунково в дозі 125 мл/кг у вигляді 40 % розчину . Тварин декапітували під легким ефірним наркозом через 24 год, 3 та 7 діб з моменту інтоксикації.

Для дослідження брали цільну кров, плазму, сироватку крові, гомогенат печінки, мікросоми, мітохондрії та лізосоми гепатоцитів. Всі піддослідні тварини були поділені на такі групи: 1- інтактні щури; 2 – уражені солянокислим гідразином, 3 – уражені солянокислим гідразином та етиловим спиртом; 4 - корекція прополісом; 5 – корекція холінфосфатидними ліпосомами з інкорпорованим токоферолу ацетатом; 6 - корекція ентеросорбентом полісорб; 7 – корекція за допомогою комбінації прополіс+ліпосоми+полісорб.

Прополіс вводили щоденно з розрахунку 0,25 г/кг маси тіла тварини у вигляді 10 % спиртового розчину внутрішньошлунково одночасно з введенням солянокислого гідразину та етилового спирту (дозу якого зменшували на ту, яка вводилась разом з прополісом) протягом усього експерименту [Падалко В.І., Суходуб А.Л., Козлова О.В., 1996].

Суспензію холінфосфатидних ліпосом з токоферолу ацетатом, приготовану за методикою (В.Г.Будкера, Т.Е.Вахрушева, Е.В.Киселева, 1987), вводили внутрішньоочеревинно щоденно одноразово в дозі 0,1 г/кг протягом усього експерименту (Корда М.М., 1997).

Ентеросорбент полісорб вводили внутрішньошлунково зондом із розрахунку 1 г/кг маси тіла через 1 год після введення солянокислого гідразину та етилового спирту щоденно протягом усього експерименту.

Дослідження активності процесів ПОЛ та стану АОС проводили наступними методами: визначали інтенсивність спонтанної та індукованої пероксидом водню хемілюмінесценції плазми крові та печінки на квантометричній установці, детектором в якій служив фотоелектронний помножувач ФЕП-39А (Журавлев А.К., Шерстнев М.П.,1985); активність СОД визначали за ступенем інгібування відновлення нітротетразолію синього (Чвари С., Чаба И., Секей И., 1985); КТ – фотоколориметричним методом за інтенсивністю забарвлення комплексу, який утворюється при взаємодії пероксиду водню з молібдатом амонію (Королюк М. А. и соавт, 1988); активністю ГП – за кількістю відновленого глутатіону, що використовується у реакції (Кругликова Т.О., Штурман Ц.П., 1976); концентрацію церулоплазміну визначали за кількістю окисленого п-фенілендіаміну (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982); вміст відновленого глутатіону – за методом Ellman G. L. (1959). Ступінь вираженості токсичного синдрому визначали за вмістом МСМ (Габриэлян Н.И. и др., 1983) та ЕІІ (А.А. Тогайбаев и др.. 1988). Активність окислювальних процесів та функціональний стан мікросом досліджували наступними методами: N-деметилазну активність за кількістю утвореного формальдегіду в реакції окисного деметилювання диметиланіліну (ДМА); п-гідроксилазну активність – за кількістю утвореного п-амінофенолу в реакції гідроксилювання аніліну (Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977); тривалість гексеналового сну визначали за ефектом бокового положення. Дослідження стану плазматичних і цитоплазматичних мембран проводили з використанням таких методів: визначення активності АлАТ та АсАТ в плазмі крові з використанням уніфікованих методик; ЦО - за швидкістю окислення диметил-п-фенілендіаміну (Кривченкова Р.С, 1977); КФ - за кількістю неорганічного фосфору, вивільненого в процесі гідролізу b-гліцерофосфату уніфікованим методом (Меншиков В.В., 1973).

Результати досліджень піддавали статистичному аналізу (Гублер Е.В., 1978). Достовірність отриманих результатів визначали, використовуючи критерій Стьюдента. Зміни вважали достовірними при Р<0,05. Для розрахунків використовували комп'ютерну програму Exel (Microsoft, USA).

Основні результати дослідження. Результати проведених досліджень свідчать про виражені зміни показників ферментної та неферментної ланок антиоксидної системи.

На фоні інтоксикації солянокислим гідразином нами зафіксовано (табл. 1) достовірне зниження у печінці активності СОД – основного ферменту, який знешкоджує супероксидний аніон-радикал у клітинах. Мінімальна активність ферменту спостерігалась на 1-у добу експерименту, що корелює із підвищенням активності вільнорадикальних процесів у відповідний термін. Значного зниження у печінці зазнає також активність каталази - ферменту, який діє на більш пізніх стадіях вільнорадикального процесу, інактивуючи пероксид водню. Зниження активності ферменту може бути наслідком як зменшення його синтезу у гепатоцитах, так і виходом каталази у кров, оскільки нами виявлено підвищення каталазної активності у плазмі крові.

Важливу роль у захисті клітин від надмірної кількості гідропероксидів ліпідів відіграє глутатіонова система, яка включає глутатіонпероксидазу, глутатіонредуктазу та відновлений глутатіон. Нами зафіксовано достовірне підвищення активності ГП лише на 1-у добу експерименту з поступовим наближенням до норми у наступні терміни. Концентрація відновленого глутатіону змінювалась у зворотній пропорції – найнижчий вміст трипептиду відмічено на початку експерименту з підвищенням показника до його закінчення.

Достовірно зростала у плазмі крові концентрація ще одного антиоксиданта – церулоплазміну. який вважають основним антиоксидантом плазми крові, що здатен знешкоджувати активні форми кисню – ініціатори вільнорадикальних процесів. Це можна пояснити або підвищенням синтезу даного білка, або, що більш ймовірно, порушенням його катаболізму внаслідок пригнічення активності ферменту нейрамінідази, що ацетилює церулоплазмін, активуючи цим його виведення з організму.

Таблиця 1

Показники антиоксидантної системи у печінці щурів за умов введення солянокислого

гідразину та у комбінації з етиловим спиртом (М±m)

Показник Група тварин

Інтактні n = 12 Уражені солянокислим гідразином Гідразин + етиловий спирт

1 доба n = 6 3 доба n = 6 7 доба n = 6 1 доба n = 6 3 доба n = 6 7 доба n = 6

СОД ум. од. ·106 кг-1 0,52 ±0,02 0,36 ±0,02 Р1 < 0,01 0,42 ±0,03 Р1 < 0,05 0,46 ±0,03 Р1 > 0,05 0,32±0,02 Р1 < 0,001 Р2 > 0,05 0,40±0,03 Р1 < 0,05 Р2 > 0,05 0,41±0,03 Р1 < 0,05 Р2 > 0,05

Каталаза, мкат·кг-1 9,37 ±0,35 6,24 ±0,74 Р1 < 0,01 7,82 ±0,55 Р1 < 0,05 7,54 ±0,53 Р1 > 0,05 5,65±0,82 Р1 < 0,01 Р2 > 0,05 6,38±0,91 Р1 < 0,05 Р2 > 0,05 6,84±0,38 Р1 < 0,05 Р2 > 0,05

Глутатіон-пероксидаза, ммоль·хв-1·кг-1 10,62 ±0,68 19,21 ±0,82 Р1 < 0,05 12,32 ±1,02 Р1 > 0,05 9,38 ±0,98 Р1 > 0,05 9,75±0,28 Р1 > 0,05 Р2 < 0,01 9,82±0,32 Р1 > 0,05 Р2 < 0,05 9,94±0,22 Р1 > 0,05 Р2 > 0,05

Відновлений глутатіон, ммоль·кг-1 12,72 ±0,78 7,38 ±0,82 Р1 < 0,01 9,22 ±0,48 Р1 < 0,05 11,94 ±0,65 Р1 > 0,05 18,12±0,46 Р1 < 0,01 Р2 < 0,001 15,96±0,52 Р1 > 0,05 Р2 < 0,001 13,92±0,43 Р1 > 0,05 Р2 < 0,05

Примітка: Р1- достовірність різниці у порівнянні з інтактними тваринами; Р2 – достовірність різниці у порівнянні з тваринами, ураженими солянокислим гідразином

При комбінованому введенні гідразину та етилового спирту показники системи антиоксидного захисту зазнавали більш виражених змін. Активність СОД у печінці, на відміну від тварин, яким вводили лише гідразин, достовірно знижувалась на протязі усього експерименту, становлячи відповідно 49, 23 та 21 % по відношенню до здорових тварин відповідно на 1-у, 3-ю та 7-у доби експерименту. Це ж можна сказати і відносно каталази. У плазмі, навпаки, ми отримали достовірне підвищення активності каталази в усі терміни дослідження, що може вказувати на більш виражену пошкоджуючу дію даної комбінації на плазматичні мембрани, порівняно з ізольованим веденням гідразину. Нами відмічено значне зростання концентрації відновленого глутатіону у даної групи тварин у печінці та плазмі. На наш погляд, це пов'язано з особливостями метаболізму етилового спирту. Як відомо (Хворостинка В.Н., Тесленко В.Г.), окиснення 1 молекули етанолу до оцтової кислоти супроводжується відновленням 2 молекули НАД у НАДН2, а концентрація відновленого глутатіону визначається співвідношенням НАДН2/НАД+ (Erden M., Bor N.M., 1984). Отже, це явище має компенсаторний характер і сприяє нормалізації співвідношення цих нікотинамідних коферментів, а з іншого боку – підвищує відновний потенціал глутатіонової системи. Активність глутатіонпероксидази за комбінованого введення етанолу та гідразину навпаки, знижувалась. Менш виражені зміни ми спостерігали відносно церулоплазміну. Концентрація ферменту на 1-у добу дещо зменшувалась, а в наступні терміни експерименту – зростала. Цим, можливо, і можна пояснити отримані нами результати хемілюмінесценції – показники у плазмі крові були значно нижчими, ніж у печінці, оскільки церулоплазмін є основним антиоксидантом плазми крові (Санина О.Л., Бердинских Н.К. , 1986).

Таблиця 2

N-деметилазна та п-гідроксилазна активність мікросом печінки та тривалість гексеналового сну у щурів за умов уведення солянокислого гідразину та у комбінації з етиловим спиртом, (М±m)

Група тварин Показник

N-деметилазна активність, ммоль ·хв -1·кг –1 п-гідроксилазна активність, ммоль·хв -1·кг –1 Тривалість гексеналового сну, хв

Інтактні, n=12 8,16±0,74 0,77±0,01 38,2±2,8

Уражені солянокислим гідразином 1 доба n = 6 6,23±0,37 Р1 < 0,05 0,57±0,02 Р1 < 0,01 57,3±3,1 Р1 < 0,01

3 доба n = 6 7,21±0,15 Р1 > 0,05 0,61±0,02 Р1 < 0,05 50,1±3,2 Р1 < 0,05

7 доба n = 6 7,61±0,26 Р1 > 0,05 0,72±0,02 Р1 > 0,05 48,4±3,2 Р1 > 0,05

Солянокислий гідразин + етиловий спирт 1 доба n = 6 5,16±0,22 Р1 < 0,01 Р2 < 0,05 0,42±0,01 Р1 < 0,001 Р2 < 0,01 67,3±2,1 Р1 < 0,001 Р2 < 0,05

3 доба n = 6 6,27±0,39 Р1 < 0,05 Р2 < 0,05 0,53±0,02 Р1 < 0,001 Р2 < 0,01 62,8±3,3 Р1 < 0,01 Р2 < 0,05

7 доба n = 6 6,84±0,51 Р1 > 0,05 Р2 > 0,05 0,59±0,04 Р1 < 0,01 Р2 < 0,05 54,5±2,9 Р1 < 0,01 Р2 > 0,05

Примітка: Р1- достовірність різниці у порівнянні з інтактними тваринами; Р2 – достовірність різниці у порівнянні з тваринами, ураженими солянокислим гідразином

Однією з найбільш важливих захисних функцій печінки є детоксикація токсичних сполук ендо- та екзогенного походження. Біохімічною сутністю знешкодження переважної більшості токсинів є їх біотрансформація за участю мікросомальних монооксигеназ. Тому нами досліджено ступінь вираженості токсичного синдрому у тварин, уражених солянокислим гідразином та у поєднанні з етиловим спиртом, а також активність окиснювальних процесів у мікросомах печінки цих груп тварин.

Достовірним маркером важкості токсичного синдрому вважають вміст молекул середньої маси (Оськина В.В., Чекалина К.И., Габриэлян Н.И., 1987). У тварин, яким вводили солянокислий гідразин, цей показник у плазмі крові достовірно зростав на першу добу експерименту, на 27 % перевищуючи рівень здорових щурів, а в наступні терміни зростання було не достовірним. Така ж тенденція спостерігалась і відносно іншого показника – еритроцитарного індексу інтоксикації, хоч зміни його були і більш вираженими. Поєднане введення гідразину з етанолом супроводжувалось значно інтенсивнішим зростанням показників інтоксикації. Так, концентрація МСМ перевищвала рівень інтактних тварин на 1-у добу на 45 %, 3-ю – 36 % і навіть до 7-ї доби показники не повертались до норми. Це свідчить про потенціювання токсичної дії цих обох токсичних агентів. Проведені нами дослідження (табл. 2) показали, що швидкість деметилювання ДМА мікросомами печінки отруєних гідразином тварин достовірно знижувалась на 1-у добу експерименту становлячи 76 % від норми, а в наступні терміни показники хоч і були нижчими, проте це зниження було не достовірним. В дещо більшій мірі пригнічувалась активність гідроксилювання аніліну – достовірне зниження спостерігалось на 1-у та 3-ю доби експерименту (відповідно 74 та 79 % від рівня інтактних тварин). Аналогічні зміни нами були отримані і при дослідженні тривалості гексеналового сну. При введенні солянокислого гідразину цей показник перевищував аналогічний у інтактних тварин на 50, 31 та 27 % у відповідні терміни експерименту.

Поєднане застосування гідразину з етиловим спиртом мало значно інтенсивніший пригнічуючий вплив на стан окиснювальних процесів у мікросомах гепатоцитів. Так деметилазна активність становила на 1-у добу 63 %, 3-ю та 7-у – відповідно 77 та 84 % від норми. Активність гідроксилювання аніліну становила відповідно 54, 69 та 77 %, причому зміни були достовірними по відношенню як до здорових тварин, так і тих, яким проводили ізольоване введення солянокислого гідразину. Наслідком пригнічення окиснювальних процесів є нагромадження недоокиснених продуктів, які, з одного боку, можуть активувати чи бути субстратами реакцій вільнорадикального окиснення, а з іншого – можуть спричиняти зміну рН в цитоплазмі гепатоцитів, що, в свою чергу, зумовлює пригнічення активності ферментних систем енергозабезпечення та стимулює активність лізосомальних протеаз з усіма наслідками цього процесу, основним з яких є ушкодження плазматичних та субклітинних мембранних структур.

Отримані результати свідчать, що ізольоване введення солянокислого гідразину лише на 1-у добу експерименту достовірно підвищувало в плазмі активність трансаміназ та каталази, а до закінчення експерименту ці показники приходили до норми. Це свідчить про незначний пошкоджуючий вплив гідразину на плазматичні мембрани. По відношенню до лізосомального ензиму – кислої фосфатази, нами були встановлені певні закономірності (табл. 3): активність у печінці загальної фракції ферменту, який ми отримували шляхом руйнування лізосомальних мембран тритоном Х-100, достовірно зростала на протязі усього експерименту (223, 147 та 124 % від норми у відповідні терміни експерименту). Проте, активність вільної фракції ферменту у цитоплазмі не зазнавала достовірних змін. На нашу думку, це вказує на компенсаторний характер зростання активності кислої фосфатази в лізосомах, проте пошкодження лізосомальних мембран за умови інтоксикації солянокислим гідразином не спостерігалось. Підвищення активності ферменту у плазмі також було не достовірним.

Більш виражені зміни в умовах гідразинової інтоксикації ми спостерігали у мітохондріях. Встановлено достовірне зниження активності кінцевого ферменту дихального ланцюга, дислокованого на внутрішній мітохондріальній мембрані – цитохромоксидази на 1-у та 3-ю доби експерименту, становлячи 49 та 64 % по відношенню до здорових тварин.

Таблиця 3

Активність органелоспецифічних ферментів печінки щурів за умов уведення солянокислого гідразину та в поєднанні його з етиловим спиртом, (М±m)

Група тварин Показник

Кисла фосфатаза (плазма), ммоль · хв -1·л –1 Кисла фосфатаза (печінка, вільна фракція), ммоль · хв -1·кг –1 Кисла фосфатаза (печінка, загальна фракція), ммоль · хв -1·кг –1 Цитохром-оксидаза (печінка0, ммоль · хв -1·кг –1

Інтактні n = 12 2,80±0,14 1,72±0,09 2,65±0,18 12,05±0,98

Уражені солянокислим гідразином 1 доба n = 6 3,20±0,28 Р1 > 0,05 2,02±0,13 Р1 > 0,05 5,91±0,32 Р1 < 0,01 5,92±0,46 Р1 < 0,01

3 доба n = 6 3,01±0,22 Р1 > 0,05 1,84±0,14 Р1 > 0,05 3,89±0,24 Р1 < 0,05 7,72±0,32 Р1 < 0,05

7 доба n = 6 2,95±0,18 Р1 > 0,05 1,89±0,11 Р1 > 0,05 3,29±0,21 Р1 > 0,05 11,31±0,84 Р1 > 0,05

Солянокислий гідразин + етиловий спирт 1 доба n = 6 4,21±0,32 Р1 < 0,01 Р2 < 0,05 1,96±0,12 Р1 > 0,05 Р2 > 0,05 6,29±0,42 Р1 < 0,001 Р2 > 0,05 5,21±0,38 Р1 < 0,001 Р2 > 0,05

3 доба n = 6 3,65±0,18 Р1 < 0,02 Р2 > 0,05 1,88±0,11 Р1 > 0,05 Р2 > 0,05 5,46±0,38 Р1 < 0,01 Р2 < 0,02 6,58±0,52 Р1 < 0,05 Р2 > 0,05

7 доба n = 6 3,18±0,22 Р1 > 0,05 Р2 > 0,05 1,84±0,14 Р1 > 0,05 Р2 > 0,05 3,02±0,32 Р1 > 0,05 Р2 > 0,05 8,34±0,73 Р1 < 0,05 Р2 < 0,05

Примітка: Р1- достовірність різниці у порівнянні з інтактними тваринами; Р2 – достовірність різниці у порівнянні з тваринами, ураженими солянокислим гідразином

Комбіноване застосування гідразину та етанолу призводило до більш суттєвих порушень. У всі терміни дослідження достовірно зростає активність АлАТ (169, 155 та 151 % від рівня інтактних тварин), причому різниця достовірна як по відношенню до здорових тварин, так і до тих, яким проводилось ізольоване введення гідразину. Показники АсАТ підвищувались у меншій мірі, хоча на 1-у і 3-ю доби зростання було достовірним по відношенню до інтактних тварин. Ще значніше зростала активність загальної фракції КФ у печінці. Достовірно зростала також активність ферменту у плазмі крові. Спостерігалось ще більше пригнічення активності ЦО у всі терміни експерименту (відповідно на 51, 36 та 17 %).

З метою корекції змін, викликаних введенням солянокислого гідразину та етанолу, було використано засоби, які впливають на патогенетичні ланки, порушення яких ми встановили. Одним з таких засобів є прополіс. Застосування 10 % спиртового розчину прополісу позитивно вплинуло на показники спонтанної та ініційованої хемілюмінесценції. Позитивна динаміка спостерігалась і відносно більшості показників антиоксидантної системи. У печінці підвищувалась активність СОД ( на 28, 20 та 22 % у порівнянні з ураженими тваринами) та КТ ( на 23, 16 та 15 %) - ферментів, які зазнавали найбільш вираженого пригнічення. Не зазнали суттєвих змін показники відновленого глутатіону, проте у плазмі спостерігалось достовірне підвищення ГП на 1-у та 3-ю доби експерименту (на 23 та 17 % відповідно). Активність КТ у плазмі навпаки, достовірно знижувалась, що можна розглядати як ознаку стабілізації плазматичної мембрани і зниження її проникності для внутрішньоклітинних ферментів. Практично не впливало введення прополісу на концентрацію ЦП.

Під впливом розчину прополісу покращувались також показники функціонування мікросом. На 1-у добу експерименту ми отримали достовірне зростання активності деметилювання ДМА ( на 21 % у порівняніі з нелікованими тваринами) та гідроксилювання аніліну ( на 22 %). Достовірно, порівняно з нелікованими тваринами, знижувалась тривалість гексеналового сну, становлячи 88 % від рівня уражених тварин. На 3-ю та 7-у доби активність окиснювальних процесів у мікросомах також зростала у порівнянні з тваринами, яким прополісу не вводили, і під кінець експерименту показники наближались до рівня здорових тварин. Тривалість гексеналового сну також зазнавала подальшого зниження у ці терміни дослідження, проте до показників здорових тварин все ж не наближалась.

Застосування розчину прополісу достовірно знижувало вміст МСМ в плазмі та ЕІІ, причому зміни були достовірними у всі терміни експерименту.

Зниження активності процесів вільнорадикального окиснення, зменшення проявів інтоксикації позитивно вплинуло на стан мембранних структур гепатоцитів. Активність АлАТ у плазмі достовірно знижувалась у всі терміни дослідження, а на 7-у добу знаходилась майже на рівні здорових тварин (108 %). Знижувалась також активність АсАТ, проте у дещо меншій мірі. Активність ЦО у печінці достовірно підвищувалась на 1-у добу експерименту ( на 31 % у порівнянні з нелікованими тваринами), а в інші терміни підвищення хоч і мало місце, проте показники були не достовірними. Введення розчину прополісу не вплинуло суттєво на активність КФ у печінці.

Введення ліпосом з інкорпорованим a-токоферолу ацетатом у значній мірі пригнічувало активність вільнорадикальних процесів, про що можна судити із показників спонтанної та ініційованої H2O2 ХЛ. У всі терміни дослідження ці показники достовірно знижувались, причому під кінець експерименту у плазмі вони майже знаходились на рівні здорових тварин. Використання ліпосом сприяло покращанню також стану антиоксидантної системи. У печінці спостерігалось достовірне підвищення активності. СОД ( на 44, 20 та 24 % у відповідні терміни дослідження), каталази (на 29, 21 та 31 %), глутатіонпероксидази ( на 25, 19 та 7 %), концентрації відновленого глутатіону ( на 22, 13 та 19 % від рівня уражених тварин). У плазмі крові ми спостерігали дещо іншу картину – активність каталази знижувалась у ранні строки експерименту, а глутатіонпероксидази навпаки, підвищувалась, вміст відновленого глутатіону та церулоплазміну не зазнавав достовірних змін. Ці результати можуть свідчити про перерозподіл антиоксидантних ресурсів в залежності від їх найбільшої необхідності.

Нами отримані позитивні результати застосування ліпосом з вітаміном Е по відношенню до функціонального стану мікросом. Зафіксовано підвищення активності деметилювання диметиланіліну у 1,4 рази на 1-у, 1,2 на 3-ю та 7-у доби експерименту, та гідроксилювання аніліну ( відповідно 1,7, 1,4 та 1,3 рази у порівнянні з ураженими тваринами). Достовірно знижувалась на протязі всього експерименту також тривалість гексеналового сну, що свідчить про відновлення активності окиснювальних процесів у мікросомах печінки. Це відобразилось на показниках, що характеризують вираженість токсичного синдрому. Так, вміст у плазмі крові МСМ достовірно знижувався на 1-у та 3-ю доби ( на 17 та 14 %), а еритроцитарний індекс інтоксикації – на протязі всього експерименту ( на 14, 19 та 17 %).

При дослідженні показників, які характеризують стан мембранних структур, нами отримані результати, що свідчать про позитивний вплив ліпосом з вітаміном Е. Ми спостерігали достовірне зниження в плазмі крові активності АлАТ ( на 36, 29 та 23 %) та АсАТ ( на 18, 9 та 6 % у порівнянні з ураженими тваринами), підвищення в печінці активності цитохромоксидази в 1,7 рази на 1-у, 1,8 – на 3-ю та 1,4 на 7-у доби експерименту. Достовірного зниження в печінці зазнавала активність загальної фракції кислої фосфатази, що вказує на зменшення функціонального навантаження на лізосоми. Про це ж свідчить і зниження активності даного ферменту у плазмі крові.

Функціональна недостатність печінки, яка неминуче виникає за умов токсичного ураження, призводить до пригнічення детоксикації ксенобіотиків та ендогенних продуктів метаболізму. Звідси одним із першочергових завдань терапії токсичних уражень печінки повинно бути застосування методів очистки крові від токсичних сполук. З цією метою нами було використано ентеросорбент полісорб, який має високу сорбційну здатність, не викликає побічних ефектів та значно дешевший, ніж інші сорбенти з аналогічними характеристиками.

Використання ентеросорбента у значній мірі нормалізувало активовані гідразином та етиловим спиртом процеси вільнорадикального окиснення. Менш виражений вплив, у порівнянні з прополісом та ліпосомами, сорбент мав на показники АОС. Його застосування достовірно не змінювало активності СОД, каталази, глутатіонпероксидази у печінці. Отримане нами зниження вмісту відновленого глутатіону під впливом ентеросорбції можна пояснити зв'язуванням етилового спирту на поверхні сорбента, що попереджує поступлення його в організм та призводить до зниження швидкості відновлення нікотинамідних ферментів. У плазмі нами також не зафіксовано достовірних змін вмісту церулоплазміну, активності глутатіонпероксидази. хоча й спостерігалась тенденція до їх зростання. Зниження активності каталази у плазмі можна розглядати як ознаку стабілізації плазматичних мембран, а також пригнічення каталазного шляху знешкодження етанолу внаслідок зв'язування останнього сорбентом.

На функціональну активність мікросом вплив полісорбу був більш значним, ніж прополісу та ліпосом. На протязі всього експерименту достовірно зростала N-деметилазна ( на 41, 21 та 16 % ) та n-гідроксилазна ( на 47, 36 та 29 % перевищуючи аналогічний показник уражених тварин у відповідні терміни експерименту) активність мікросом, знижувалась тривалість гексеналового сну. На наш погляд, це пов'язано зі зменшенням функціонального навантаження на мікросоми внаслідок попередження надходження частини токсичних продуктів до печінки, оскільки вони зв'язуються сорбентом. На це вказує також значне зниження показників, які характеризують вираженість токсичного синдрому – молекул середньої маси та еритроцитарного індексу інтоксикації. Так, вміст МСМ становив на 1-у добу 81, 3-ю – 84, 7-у – 96 % від рівня тварин, яким сорбент не вводили), а ЕІІ знижувався відповідно на 19, 12 та 14 %.

Застосування полісорбу, на фоні інтоксикації солянокислим гідразином та етанолом, мало позитивний вплив і на стан мембранних структур. Ми отримали достовірне зниження активності АлАТ у плазмі на протязі всього експерименту (відповідно на 31, 27 та 33 % у порівнянні з нелікованими тваринами), знижувалась, однак дещо менше, також активність АсАТ. Якщо зважати на те, що нами зафіксовано також зниження в плазмі активності каталази та кислої фосфатази, то можна констатувати виражену мембраностабілізуючу дію сорбенту, механізм якої, ймовірно, пов'язаний з позитивним впливом на процеси ліпопереокиснення та зниженням токсичного навантаження на клітини печінки. Стабілізація цих процесів, очевидно, призводить і до нормалізації функціонування інших мембранних структур. Зокрема, нами відмічено достовірне підвищення у печінці активності мітохондріального ензиму – цитохромоксидази ( відповідно на 60, 35 та 24 %), достовірно знижувалась на 1-у та 3-ю доби також активність загальної фракції лізосомального ферменту - кислої фосфатази, становлячи відповідно 59 та 57 % до рівня уражених тварин.

Оскільки роздільне введення прополісу, ліпосом з інкорпорованим токоферолу ацетатом та полісорбу хоч і мало позитивний вплив на досліджувані нами показники стану захисних систем та мембранних структур, все ж ми не змогли добитись повної нормалізації всіх параметрів. Зважаючи на це, нами досліджено ефективність поєднаного застосування цих засобів.

Отримані результати свідчать про значно більшу ефективність поєднаного застосування досліджуваних нами засобів у порівнянні з роздільним їх введенням. Так, спостерігалось більш виражене зниження показників спонтанної та ініційованої хемілюмінесценції як у плазмі, так і в печінці уражених тварин. Наближались до рівня здорових тварин показники АОС: в печінці активність СОД достовірно підвищувалась на 1-у та 3-ю доби експерименту ( відповідно на 44 та 25 % у порівнянні з нелікованими тваринами), а на 7-у майже досягала показників здорових тварин ( 98 % від їх рівня). Аналогічні показники відмічені і в активності каталази, яка зростала відповідно на 53, 39 та 33 % по відношенню до уражених тварин, та глутатіонпероксидази ( зростання на 43, 27 та 17 %). Концентрація відновленого глутатіону достовірно не змінювалась. В плазмі крові спостерігалось достовірне зростання вмісту церулоплазміну в першу добу експерименту. Достовірно, в 1,4 – 1,3 рази порівняно з ураженими тваринами, зростала активність глутатіонпероксидази, а активність каталази навпаки, достовірно знижувалась у всі терміни дослідження і досягала на 3-ю добу 102 %, а на 7-у – 101 % від рівня здорових тварин. Практично наближався до рівня здорових тварин і вміст відновленого глутатіону навіть у ранні терміни експерименту.

Поєднане застосування прополісу, ліпосом та ентеросорбента мало значно ефективніший позитивний вплив і на функціональну здатність мікросом. Достовірно зростала N-деметилазна ( на 43, 23 та 18 %) та п-гідроксилазна ( на 57, 28 та 25 % по відношенню до уражених тварин) активність, причому вже на ранніх етапах показники наближались до рівня здорових тварин. Аналогічні результати ми зафіксували і відносно тривалості гексеналового сну. Це, у свою чергу, зменшувало вираженість токсичного синдрому, про що можна стверджувати, оцінюючи динаміку вмісту МСМ та ЕІІ. Достовірне зниження цих показників спостерігалось на протязі всього експерименту, а на 7-у добу вони становили відповідно 110 та 104 % від рівня здорових тварин.

Нормалізація стану основних захисних систем за умови поєднаного застосування прополісу, ліпосом та полісорбу позитивно вплинула і на стан мембранних структур гепатоцитів.