МIНIСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

КИЇВСЬКА МЕДИЧНА АКАДЕМIЯ ПIСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВIТИ

ім. П.Л. ШУПИКА

КУЦЕНКО ОЛЕНА ВОЛОДИМИРIВНА

УДК:616-002.3-089:576.8.097.3

МАРКЕРИ ЕНДОТОКСЕМIЇ ПРИ ГНIЙНО-ЗАПАЛЬНИХ

ПРОЦЕСАХ

14.01.30 - анестезiологiя та iнтенсивна терапiя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

КИЇВ- 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Київській медичній академії післядипломної освіти

ім. П.Л. Шупика МОЗ України

Науковий керівник доктор медичних наук

Тріщинський Анатолій Іванович,

Київська медична академія післядипломної освіти

ім. П.Л. Шупика МОЗ України, професор

кафедри анестезіології та інтенсивної терапії

Офіційні опоненти: –

доктор медичних наук Біляєв Андрій Вікторович, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, професор кафедри дитячої анестезіології та інтенсивної терапії –

доктор медичних наук, член-кореспондент НАН і АМН України

Новицька-Усенко Людмила Василівна, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, професор, завідувач кафедри анестезіології та інтенсивної терапії Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України.

Провідна установа:

Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра медицини невідкладних станів і анестезіології

Захист дисертації відбудеться “_16_” жовтня 2002 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.02 при Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України

( 04112 м. Київ, вул. Дорогожицька, 9)

Автореферат розісланий “ 14 ” вересня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

к. мед. н., доцент Романенко Т.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть теми. Незважаючи на широкi можливостi сучасної дiагностики, проблема визначення вiрного дiагнозу на сьогодняшнiй день лишається актуальною. Ми маємо багато прикладiв, коли рiзнi за етiологiєю захворювання демонструють однаковi клiнiчнi прояви, що веде до помилок в дiагностицi i, вiдповiдно, до помилок в лiкуваннi. Відповiдно сучасним поглядам ця подібність клiнiчних проявiв пояснюється розвитком синдрому системної відповіді (реакції) (ССЗВ) на запалення (Systemic Inflammatory Respons Syndrome – SIRS), яка має подібні механізми розвитку при різних патологіях (Боун Р.,1996, Кузін М.І.,2000, Offenstadt G., et al.,1997). Реакцію запалення можна розглядати як реакцію захисту. Вона проявляє себе підвищенням продукції ендогенних медіаторів, які направлено на усунення пошкоджуючої дії. Ефект зворотнього зв'язку, закладений в цьому процесі, може привести до покращення або до погіршення стану хворого. Подальший розвиток захворювання сприяє зростанню продукції захисних факторів, накопиченню продуктів розпаду патогенів та природніх метаболітів. Власні системи виведення та детоксикації працюють з перевантаженням і всі ці фактори накопичуються в системі циркуляцiї. В цьому випадку ми говоримо про розвиток ендотоксемії. (Макарова Н.П. та співавт.,1995, Дорохін К.М. та співавт.,1994.).

Дані науково-дослідних джерел (Руднов В.А. та співавт.,1995, Сизов Д.М.та співавт., 1998.) доводять, що ендотоксемія – це прояв комплексного клiнiчного синдрому, який знаходить своє вiдображення в клiнiчному стані хворого, показниках загальноклiнiчних, бiохiмичних, імунологічних, бактеріологічних обстежень. Аналіз сучасної наукової літератури (Боун Р., 1996, Кузін М.І.,2000, Offenstadt G., 1997) дозволяє додати те, що ендотоксемія відображує процеси в системі циркуляції під час розвитку синдрому системної запальної відповіді. Для визначення наявності ендотоксемії і ступеня її розвитку пропонується ряд маркерів (Жадкевич М.М. та співавт.,1998, Промислов М.Ш. та співавт.,1989, Пермяков Н.К. та співавт.,1995, Гуніна Л.М.,1998), але пошук специфічних показників, характерних саме для гнійно-запальних процесів, триває.

Якщо погодитись з теорією про подібність розвитку ССЗВ, варто визнати і подібність терапевтичної тактики, з чим не завжди можна погодитися. Так, до групи захворювань, що мають однакові клінічні прояви ССЗВ на етапі загострення і спільну назву лихоманки неясного генезу (ЛНГ), включено захворювання бактеріального (наприклад, інфекційний ендокардит) та небактеріального походження (наприклад, системні захворювання, захворювання крові), але терапевтична тактика цих патологічних станів різна. Виявлення достовiрних критерiїв, якi могли б визначити наявнiсть або вiдсутнiсть бактерiального компоненту в розвитку захворювання, може сприяти поліпшенню діагностики у важких клінічно-діагностичних випадках “неясних” хворих з ЛНГ.

Під час обстеження пацієнтів із захворюваннями,які входять до групи ЛНГ, нами виявлено розбіжності в імунологічних показниках між хворими із патологією бактеріального і небактеріального походження. Цей результат сприяв визначенню напрямку пошуку маркерів ендотоксемії при гнійно-запальних захворюваннях шляхом дослідження динаміки клітин лімфоцитарного ряду, їх активованих форм та цитокінів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацiйна робота виконана згідно з планом науково-дослiдних робiт Київської медичної академiї пiслядипломної освiти ім.П.Л.Шупика, за замовленням МОЗ України, № держреєстрації теми “Маркери ендотоксемії при гнійно-запальних процесах” 0101V004630.

Мета роботи i задачі дослiдження. Мета дослiдження: виявити в системі циркуляції маркери, специфічні для гнійно-запальних процесів; визначити можливість їх використання у диференцiальній дiагностиці захворювань бактерiального та небактерiального походження; обгрунтувати використання цих маркерів для вибору терапевтичноi тактики.

Для виконання цiєї мети поставлені такі задачі:

1. Вивчити особливості клінічних ознак або їх сполучень в обстежуваних групах хворих з наявністю ССЗВ і виділити ті з них, які були б характерні для гнiйно-запальних захворювань.

2. Зґясувати, які серед вiдомих маркерiв ендотоксемiї можуть бути характерними для захворювань бактеріального походження.

3. Зґясувати наявність особливостей клiтинної активації у популяціях імунокомпетентних клітин в обстежуваних групах, специфічних для захворювань бактерiального походження.

4. Встановити прогностичну цінність активаційних молекул в досліджуваних групах хворих.

5. Зґясувати iнформативну і діагностичну цiннiсть системного рiвня цитокiнiв у хворих із гнiйно-запальними процесами.

6. Встановити прогностичну цінність системного рiвня цитокiнiв у хворих із гнiйно-запальними процесами.

7. Запропонувати для клiнiчного використання показники, котрі можуть бути маркерами саме гнiйно-запальних процесів.

Об'єкт дослідження – гнійно-запальний процес і його прояви в системі циркуляції на етапі розвитку ССЗВ в групах хворих із захворюваннями бактеріального походження.

Предмет дослідження – особливості проявів лейкоцитарної клітинної активації у хворих на гнійно-запальні процеси.

Методи дослідження – комплекс клінічних (соматичний статус), клініко-лабораторних, біохімічних, імунологічних, аналітико-статистичних методів

Наукова новизна одержаних результатів. –

Вперше проводиться комплексна оцінка специфічності показникiв кровi, які в рiзнi часи пропонувались як маркери ендотоксемiї, серед груп хворих із запальними процесами бактеріального та небактеріального походження.–

Вперше, порівнюючи групи хворих iз захворюваннями бактерiального та небактерiального походження на етапi розвитку системної вiдповiдi, демонструються показники, які характеризують розбіжності клітинних механізмів запального процесу. –

Вперше визначення рівня експресії поверхневих активацiйних молекул на лiмфоцитах пропонується для дiференцiальної дiагностики захворювань бактерiального та небактерiального походження.–

Вперше пропонуються імунологічні критерії для диференційної діагностики активної та неактивної фаз інфекційного ендокардиту.

Практичне значення одержаних результатiв. Дослiдження особливостей клітинної реакції та активації у хворих з наявністю або відсутністю гнійно-запального процесу мають науковий і практичний iнтерес. Науковий інтерес спрямований на одержання результатів будь-яких досліджень особливостей реакції клітинного імунітету in vivo за допомогою моноклональних антитіл (мкАт). Кожна практична робота, яка вивчає зміни клітинної активації за допомогою мкАт у групах тяжких хворих, несе додаткову інформацію до тих результатів експерементальних лабораторних пошуків, що вивчають патологічні процеси за допомогою штучно створюваних моделей. Практичне значення цієї роботи полягає у вивченні інформативої цінності імунологічних показників для практичного їх використання у клінічних умовах, а також у пошуках можливостей диференціальної діагностики лихоманок неясного генезу – визначення наявності або відсутності бактеріального компонента в розвитку захворювання. Використання мкАт також дозволяє визначити тривалість бактеріального процесу, існування гострої або хронічної бактеріальної патології.

Доведено, що виявлене в даному дослідженні збільшення експресiї активаційних молекул HLA-DR+ на Т-лiмфоцитах на тлі зменшення циркулюючого пулу натуральних кілерів (NK-клiтин) та збiльшення системного рiвня тумор некротизуючого фактору (TNF) можуть бути достовiрними критерiями для виявлення активного бактерiального процесу.

В пропонованому дослідженні проілюстровано те, що хворі на інфекційний ендокардит не є однорідною групою: розбіжності, що існують між активною та неактивною фазами інфекційного ендокардиту, відображені різними рівнями циркулюючого пулу NK-клітин, глутатіону крові, системного рівня TNF. Ці виявлені розходження показників можуть бути запропоновані як додаткові критерії для визначення активності інфекційного ендокардиту.

Одержанi результати використовувались у диференційній діагностиці хворих, які надходили на лікування до Республіканського центру інтенсивної терапії сепсису. Їх можна запропонувати для впровадження в дiагностичну практику відділень інтенсивної терапії.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є особистою працею автора. Дисертантом проведений ретельний аналіз низки факторів, що пропонуються як маркери ендотоксемії, і визначено їх діагностичну значимість для захворювань із гнійно-запальними процесами. Здiйснено багатостороннє клiнiко-соматичне, клiнiко-бiохiмiчне та комплексне iмунологiчне обстеження 110 хворих із клінічними проявами СЗВ. З обстеженої популяції виділено 87 хворих дослідної групи з патологiєю бактерiального та небактерiального походження. Частину біохімічних досліджень проведено автором особисто. Імунологічні дослідження проведено в науково-дослідній лабораторії, якою керує д.м.н., профессор Чернишов В.П., за участю наукового співробітника лабораторії к.б.н. Водяника М.О.1 Проведено статистичну обробку дослідження. Аналiз та iнтерпретацiя результатiв належить автору. Запропоновані практичні рекомендації належать автору.

Апробацiя результатiв дисертацiї. Основнi положення дисертацiї доповiдалися на з'їздi анестезiологiв України в травні 2000 р.; на пленумi правління Асоціації анестезiологiв України у вереснi 2001 року; всеукраїнській науково-практичній конференції “Хірургічний сепсіс” в жовтні 2001 року; науково-практичній конференції “Актуальні проблеми інтенсивної терапії гнійно-запальних процесів” в листопаді 2001 р.; Х-й науковій конференції Асоціації серцево-судинних хірургів України “Гнійно-септичні захворювання і антибіотикотерапія в кардіохірургії. Нове в серцево-судинній хірургії” в травні 2002 р..

Дисертацiйну роботу розглянуто i рекомендовано до захисту на спiльнiй мiжкафедральнiй конференцiї кафедр анестезiологiї та iнтенсивної терапiї КМАПО ім. Шупика П.Л., дитячої анестезіології та інтенсивної терапії КМАПО ім. Шупика П.Л. із залученням наукових співробітників НДІ Серцево-судинної хірургії та Українського науково-практичного центру ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин.

Публiкацiї. Основнi положення дисертацiї викладено у 8 друкованих працях, серед яких 7 – у виданнях, рекомендованих ВАК України. Серед публікацій – 3 самостійні, 5 iз спiвавторами.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 126 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, аналітичного огляду літератури, 4 розділів з викладенням матеріалів і методів дослідження, результатів власних спостережень, висновків, практичних рекомендацій. Роботу ілюстровано 22 таблицями та 26 діаграмами. Бібліографічний показчик включає 130 робіт, серед яких – 65 відчизняних та російськомовних праць і 65 зарубіжних джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження, викладені в дисертації, грунтуються на даних клініко-лабораторного і статистичного аналізу обстеження 87 хворих (24 жінки і 63 чоловіки). Хворі, які увійшли в досліджувані групи, проходили лікування на базах Республіканського центру інтенсивної терапії сепсісу, Науково-дослідного інституту серцево-судинної хірургії (НДІССХ), у відділеннях інтенсивної терапії міської клінічної лікарні №3, міської лікарні швидкої медичної допомоги та науково-практичного об'єднання Медбуд.

У всіх хворих перебіг захворювання супроводжувався розвитком синдрому системної запальної відповіді (ССЗВ). У 62 хворих розвиток синдрому спостерігався на тлі бактеріального компоненту в патогенезі захворювання (інфекційний ендокардит активний (ІЕа), інфекційний ендокардит неактивний (ІЕн) та абдомінальна патологія, ускладнена перітонитом (АП(пн)). У 25 хворих розвиток ССЗВ супроводжував патологію небактеріального походження (системні захворювання (СЗ) та політравма (ПТ)). Тяжкість перебігу синдрому визначалась відповідно до критеріїв Міжнародної погоджувальної комісії і характеризувалась наявністю двох або більше провідних симптомів:температура тіла >380С, або < 360С; ЧСС>90 за хв.; ЧД>20 за хв., або Ра СО2

1 Автор висловлює щиру подяку д.м.н., професору Чернишову В.П. та к.б.н. Водянику М.О.

за консультативну та практичну допомогу.

< 32 мм.рт.ст.; лейкоцити > 12000, або < 4000/мл, або незрілі форми > 10% (Боун Р.,1996 р.,Кузін М.І.,2000 р.). Таким чином, за тяжкістю перебігу ССЗВ 17 пацієнтів (19,5%) мали середній ступінь тяжкості ССЗВ (2 критерії); 53 пацієнтів (61%) – тяжкий ступінь (3 критерії) та 17 пацієнтів (19,5%) – вкрай тяжкий ступінь (4 критерії). Тобто, більша частина хворих (80,5%) за клінічними критеріями ССЗВ перебувала в тяжкому стані. За нозологіями всі хворі розподілені на п'ять груп. Хворі на інфекційний ендокардит складали дві групи: інфекційний ендокардит в активній фазі (ІЕа) та інфекційний ендокардит в неактивній фазі (ІЕн). Активність процесу визначалась за Стенфордськими критеріями. Керуючись ними інфекційний ендокардит вважається активним у випадку наявності однієї з наступних ознак: –

виявлення активного вальвуліту під час гістологічного дослідження матеріалу, який одержується під час операції або аутопсії; –

позитивний результат дослідження гемокультури; –

непідлягаюча корекції лихоманка.

Таким чином, порівнювались групи з гострою хірургічною патологією бактеріального та небактеріального генезу: активний інфекційний ендокардит – перитоніт – політравма, а також групи з тривалим розвитком патологій бактеріального та небактеріального походження: інфекційний ендокардит неактивний та системні захворювання. Інфекційний ендокардит та системні захворювання входять до складу патологій із спільною назвою “Лихоманки неясного генезу” і на етапі загострення мають подібні клінічні прояви, що часто приводить до помилок в діагностиці. Припускалось, що в разі існування особливостей проявів ССЗВ для захворювань бактеріального та небактеріального походження будуть одержані ті показники, які можна охарактеризувати, як специфічні маркери саме для гнійно-запальних процесів. Також припускалось, що маркерами можуть бути показники клітинного імунітету. Ця думка грунтувалась на тому, що система імунітету реагує на вплив бактеріального агенту, створюючи специфічний ланцюг імунного захисту з подальшим формуванням антитіл. Перший етап протиінфекційного захисту належить імунним клітинам. Вони “впізнають” антиген, формують напрямок імунної відповіді і регулюють утворення антитіл. Враховуючи, що інформацію про антиген несуть клітини лейкоцитарного ряду (Кетлінський С.А. та співавт.,1995, Хаітов Р.М. та співавт., 2000, Richer W.,1997.), пошук маркерів проводився шляхом дослідження активації клітин лейкоцитарного ряду, яка виявляє себе експресією поверхнево-клітинних рецепторів та продукцією цитокінів.

Обстеження хворих проводилось на першу добу надходження до лікарні та на чотирнадцяту добу. На цей час визначався клінічний прогноз. В групах із гострою хірургічною патологією: ІЕа, АП(пн) та ПТ померло 15 хворих. В групах із ІЕн та СЗ спостерігалась позитивна динаміка. Всім хворим було проведено повний комплекс клінічних досліджень. Крім того, в кожній групі проводились додаткові клінічні дослідження, важливі для діагностики саме в данній патології: в групах з ІЕ та СЗ проводилось УЗД серця для визначення деструктивних змін серцевих структур та бактеріальний аналіз гемокультури із визначенням чутливості до антибіотиків. У хворих ІЕ –рентген-хірургічне обстеження серця. У хворих на перитоніт проводилось бактеріальне обстеження випоту черевної порожнини. Всім хворим проведений повний комплекс клініко-біохімічних обстежень. За даними клінічних та клініко-біохімічних обстежень проведена клінічна оцінка тяжкості стану в обстежуваних групах за шкалою SAPS.

Для визначення існування специфічності проявів ССЗВ в системі циркуляції для захворювань бактеріального та небактеріального походження серед найбільш відомих маркерів ендотоксемії визначались молекули середньої маси (МСМ): загальна кількість (О), ліпідна фракція (ЛФ), процент ліпідної фракції (%ЛФ) (Промислов М.Ш. та співат.1989 р.); рівень б2 макроглобуліну (б2М) (Веремєєнко К.Н. та співавт., 198 8); рівень загального, окисленого (GSSH) та відновленого (GSH) глутатіону (Tietze F. 1969). В комплекс імунологічного обстеження входило визначення популяцій імунокомпетентних клітин методом триколірної проточної цитофлуорометрії на приладі FACScan (Becton-Dicinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA,USA) за допомогою відповідних моноклональних антитіл (мкАт). Визначалась кількість основних лейкоцитарних популяцій: гранулоцити, моноцити, лімфоцити та відсоток, який складали клітини з експресією на них молекул адгезії

L-селектинів (CD62L+) в кожній з цих популяцій. Ці молекули відповідальні за початок міграційного процесу клітин через ендотелій. Також визначалась кількість основних популяцій лімфоцитів: Т-клітини (СD3+), В-клітини (CD19+), природні кілери – NK-клітини (CD3+CD16+CD56+). Серед Т-лімфоцитів визначались

Т-хелперні клітини (СD3+CD4+), Т-цитотоксичні клітини (CD3+CD8+) та відсотковий рівень Т-клітин з експресованими активаційними поверхневими молекулами HLA-DR+. За допомогою молекул цього класу лімфоцити одержують інформацію про антиген. Серед цитокінів, що визначались за методом ELISA, вимірювався рівень в сироватці крові тумор некротизуючого фактору (TNF) (Водяник М.О., 2000 р.) та розчинні рецептори до нього: r1TNF та r11TNF (Wallach D., Rehovot, Israel); інтерферон –г (IFN-г) та інтерлейкін-10 (IL-10) (CLB, Amsterdam).

Математична обробка статистичних даних проведених досліджень проводилася за допомогою пакета прикладних програм STATISTICA i MS EXCEL на персональному комп'ютері. Оскільки отримані варіаційні ряди були наближені до нормального закону розподілу, були розраховані середні значення кількісних показників і їх стандартні помилки. Для визначення імовірності розходжень між відповідними показниками двох груп використовувався критерій Стьюдента.

Результати досліджень та їх обговорення. Під час розподілу хворих за тяжкістю стану відповідно до міжнародних критеріїв ССЗВ спостерігались наступні тенденції: всі чотири основні критерії мали хворі в групах захворювань бактеріального походження: ІЕ а –31,1%; ІЕ н – 4%; АП(пн) – 22,7% відповідно. Також, зниження лейкоцитів нижче 4000/мл спостерігалось у 8% випадках серед хворих із захворюваннями бактеріального походження. По три клінічні критерії мали всі групи хворих: ІЕ а-68,9%; ІЕ н-70,8%; ПТ-80%; АП(пн) – 56,2%; СЗ-70%. Подальший аналіз клінічної картини, який визначався за даними систолічного та діастолічного тиску, периферійної температури, частоти серцевих скорочень, добового діурезу, між групами хворих із захворюваннями бактеріального та небактеріального походження достовірної відмінності не визначив (P>0,05). Загальновизнані клініко-біохімічні методи також не мали специфічності, характерної для гнійно-запальних процесів. Через те, наступним етапом пошуку було порівняння найбільш поширених маркерів ендотоксемії: МСМ (МСМо, ЛФ, %ЛФ), б2М, глутатіон (загальний, GSH,GSSH) (табл.1).

Відповідно до одержаних даних (табл.1), показники найбільш відомих маркерів ендотоксемії (МСМ, б2М, глутатіон) між захворюваннями бактеріального та небактеріального походження достовірної відмінності не продемонстрували (Р>0.05), що підтверджує їх причетність до проявів універсальної неспецифічної ланки запальної реакції при будь-якій патології, тож, використання їх для визначення специфічності гнійно-запальних процесів не може бути інформативним. На чотирнадцяту добу у хворих з позитивною клінічною динамікою спостерігалось наближення показників цих маркерів до меж норми.

Таблиця 1

Показники найбільш відомих маркерів ендотоксемії у групах

обстежуваних хворих на першу добу перебування у лікарні (M±m)

Показники, що визначалися Досліджувані групи хворих за нозологіями Статистичні показники

ІЕа (n=16) ІЕн (n=24) ПТ (n=15) АП(пн) (n=22) СЗ (n=10) P 2-4 P 2-5 P 2-6 P 4-5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

SAPS (в балах) 10,5±1,1 6,3±0,4 7,7±0,5 6,1 ±0,1 5,9 ± 0,7

М С М l = 254 нм O(мсм) (0,56± 0,05 од опт.щ)* 1,05±0,2 0,85±0,17 0,42±0,05 0,63±0,21 0,68±0,1 <0,01 >0,05 <0,05 >0,05

ЛФ (0,14± 0,03од, опт. щ) 0,55±0,05 0,7 ±0,01 0,3 ±0,02 0,3 ±0,02 0,54±0,04 <0,05 <0,05 >0,05 <0.05

% ЛФ (25,2±2,2%) 52,4 ± 1,8 82,3 ± 1,3 71,4 ± 2,2 47,6 ± 1,3 79 ± 2,1 <0.01 <0,05 <0,01 <0,01

a-2М (1,8±0,1г/л) 2,6 ± 1,1 2,2 ± 0,4 3,3 ± 1,2 3,4 ± 0,9 3,2± 0,05 >0.05 >0,05 >0,05 >0,05

Заг. глутатіон (1000-1400mcM) 700,1 ±207 1210,9 ±290,6 P2-3 <0,05 1120 ±270 981,4 ±186,2 860 ±120,6 >0.05 >0,05 >0,05 >0,05

GSH (800-1000 mcM) 492,4 ±121,1 801,2 ±190,7 P2-3 <0,01 582 ±164,3 496 ±142,1 554,6 ±127,5 >0.05 >0,05 >0,05 >0,01

GSSH (250-450 mcM) 233,3 ±78,7 426,6 ±138,1 P2-3 <0,05 537,5 ±62,4 482,6 ±184,7 306,7 ±50,4 <0.01 <0,05 >0,05 >0,05

* у дужках приведені значення норми.

Перші достовірні розходження показників між групами було одержано під час порівняння процентного перерозподілу клітин з наявністю поверхневих L-селектинів (-CD62L+) основних лейкоцитарних популяцій. Звернули на себе увагу наступні тенденції: найменьша процентна кількість відносно норми (P<0,05) моноцитів (50,7±1,3%) та лімфоцитів (55,2±2,2%) з експресованими на них L-селектинами спостерігалась в групах хворих із захворюваннями бактеріального походження; для політравми характерним було збільшення відносно норми (P<0,05) кількості гранулоцитів (88,7±1,1%) і зменшення відносно норми (P<0,05) моноцитів (43,8±3,2%) з експресованими L-селектинами; при системних захворюваннях спостерігалось зменшення лімфоцитів (57,4±1,2%) відносно норми (P<0.05) з експресованими L-селектинами. Зменшення рівня клітин з L-селектинами може свідчити про активацію клітин на початку міграційного процесу, т.зв. “шеддінгом”- скиданням L-селектинів. Одержаний результат підтверджував думку про існування різних шляхів імунної відповіді для різних патологій на фоні однакових клінічних проявів ССЗВ. На чотирнадцяту добу у хворих з позитивним клінічним прогнозом кількість клітин із експресованими на них L-селектинами наближена до норми в усіх групах, крім груп на інфекційний ендокардит. В групах хворих на інфекційний ендокардит простежувалось зменшення процентної кількості лімфоцитів із експресованими на них L-селектинами: в групі з ІЕа ця кількість зменшилась на 25±0,1% в порівнянні з нормою (P<0,05) та на 9 ±2,2% в порівнянні з першою добою, але це розходження не було достовірним (P>0,05). В групі хворих з ІЕн спостерігалось зменшення процентної кількості лімфоцитів із експресованими на них L-селектинами на 23 ±0,4% в порівнянні з нормою (P<0,05) та на 12±2,1% в порівнянні з першою добою (P<0,05). Цей результат навів на думку про існування подальшої клітинної активації в цих групах і продовження розвитку запального процесу.

Подальші розходження спостерігались серед лімфоцитарних популяцій і субпопуляцій. Серед основних лімфоцитарних популяцій достовірна відмінність спостерігалась в популяції NK-клітин: найнижчий рівень NK-клітин відносно норми (P<0,001) спостерігався у хворих із гострою хірургічною патологією бактеріального генезу – ІЕа (66,3±19,1/мкл при нормі 200-400/мкл (P<0,001)) та АП(пн) (54,8±13,9/мкл при нормі 200-400/мкл (P<0,001)), але в випадку ІЕн рівень NK-клітин був в межах норми і не мав достовірної відмінності в порівнянні із ПТ та СЗ (P>0,05).

Найбільш результативним виявилось визначення проценту Т-лімфоцитів із експресованими на них активаційними поверхнево-клітинними молекулами HLA+DR-. Збільшення експресії цих молекул на Т-клітинах на час надходження до лікарні спостерігалось лише у хворих із захворюваннями бактеріального походження. Підтверджувало їх причасність до ідентифікації бактеріального компоненту зменшення експресії цих молекул на чотирнадцяту добу перебування у лікарні у хворих з позитивною клінічною динамікою (рис.1).

Рис. 1. Динаміка експресії HLA-DR+ на Т-лімфоцитах на першу та на чотирнадцяту добу в групах хворих з позитивними клінічними наслідками

Варто зауважити, що після ретроспективного розподілу хворих на тих, що одужали, і тих, що померли, процент експресії HLA-DR+ на Т-лімфоцитах на час надходження до лікарні у хворих з негативним прогнозом був достовірно нижче (P<0,05) ніж у хворих з позитивним клінічним прогнозом (рис.2).

Рис.2. Показники експресії HLA-DR+ на Т-лімфоцитах у хворих з позитивним і негативним прогнозом в першу добу перебування у лікарні.

Ці спостереження дозволяють припустити, що несприятливий прогноз перебігу захворювання супроводжується відсутністю, або зменшенням клітинної активації. А для захворювань бактеріального генезу можна припустити, що негативний прогноз супроводжується неспроможністю імунної системи “впізнавати” антиген. При цьому, може бути, що у випадку ІЕ тривалість захворювання сприяє неспроможності імунної системи і, тому, зменшенню клітинної активації. Але, з іншого боку, неспроможність імунної системи може сприяти тривалості захворювання. Припускалось, що у випадку абдомінальної патології відсутність реакції на бактеріальний агент була обумовлена вродженою неспроможністю імунної відповіді, або скомпрометованістю імунної системи за період життя до нинішнього захворювання.

Подальші результати дослідження клітинної активації стосувалися системного рівня цитокінів.Звертає увагу те, що одержані в даному дослідженні системні рівні цитокінів були різні в усіх досліджуваних групах. Вони не залежали ні від кількості клінічних критеріїв ССЗВ, ні від тяжкості стану за шкалою SAPS, що може свідчити про те, що їх рівень в системі циркуляції відображує не стільки тяжкість перебігу ССЗВ, скільки реакцію імунної відповіді на розвиток ССЗВ (табл.2).

Для визначення прогностичної цінності системного рівня цитокінів, хворих було розподілено на тих, що одужали і тих, хто померли. Отримано наступні результати: у хворих з перитонітом та активним ІЕ перспективний позитивний результат відповідав перевазі системного рівня прозапальних цитокинів над протизапальними, а у випадку політравми прогностично сприятливою була перевага системного рівня протизапальних цитокинів над прозапальними (рис.3).

Таблиця 2

Показники (M±m) системних рівнів цитокинів сироватки

крові в досліджуваних групах на час першої доби перебування в лікарні

Показники, що визначалися Досліджувані групи хворих за нозологіями Статистичні показники

ІЕа (n=16) ІЕн (n=24) ПТ (n=15) АП(пн) (n=22) СЗ (n=10) P 2-4 P 2-5 P 2-6 P 4-5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

SAPS (в балах) 10,5± 1,1 6,3 ± 0,4 7,7 ± 0,5 6,1 ± 0,3 5,9 ±0,7

TNF (<4.8 pg/ml)* 31,25 ±4,5 4,2 ±1,9 5,5 ±1,3 150,3 ±52,4 33,5 ±5,6 < 0,01 < 0,001 >0,05 < 0,001

sTNFR1 (<3.6 ng/ml) 6,8 ±1,6 1,8±0,3 0,8±0,2 9,9±2,8 3,1± 0,6 < 0,001 >0,05 <0,05 < 0,001

sTNFR11 (<12.6 ng/ml) 10,4 ±1,2 4,7±0,6 7,2±2,5 17,3±4,1 8,1± 3,2 >0,05 <0,05 >0,05 <0,01

IFNg (<5pg/ml) 39,8±12,5 8,4± 1,2 11,2±1,3 600,3 ±270,4 34,2 ±10,2 <0, 001 <0,0 001 > 0,05 < 0,001

IL-10 (<2pg/ml) 17,1 ±4,3 1,9± 0,2 24 ±3,1 272,8 ±78,5 13,4 ± 2,3 <0,05 <0,0 001 >0,05 < 0,001

IFN-g/IL10 2,3±0,3 4,4±0,5 0,18±0,01 2,2±0,1 2,5±0,1 <0,05 >0,05 >0,05 <0,05

TNF/IL-10 1,8±0,2 2,2±0,1 0,2±0,01 0,5±0,1 2,5±0,2 <0,01 <0,01 <0,05 <0,05

IFNg+TNF IL10 4,1±0,6 6,6±1,3 0,3±0,03 2,7±0,05 5,0±0,5 <0,01 <0,01 >0,05 <0,01

Примітка: * у дужках приведені значення норми.

Щодо діагностичної цінності рецепторів до TNF, в дослідженнях спостерігалась натупна тенденція: несприятливий прогноз в усіх випадках летальних наслідків супроводжувався зменшенням співвідношення sTNFr11/sTNFr1. Це могло би свідчити про те, що протекторною ланкою захисту власних клітин від ушкоджуючої дії TNF, є R11, але за результатами даних досліджень стверджувати цей факт неможливо, оскільки в групі хворих із політравмою, де простежувалась така сама тенденція, що і в групах на ІЕа та АП(пн), рівень рецепторів до TNF в сироватці лишався в межах норми і в групі з летальним виходом, і в групі з позитивною клінічною динамікою. Ці спостереження, безумовно, не охоплюють того масштабу цитокінових взаємодій, що відбуваються під час розвитку запального процесу. Проте навіть це невелике дослідження дозволяє припустити, що важливим є визначення не самого по собі системного рівня будь-яких окремих цитокінів і не системного рівня про- або протизапальних цитокінів для передбачення прогнозу, а, імовірніше за все, їх співвідношення, які формують різні шляхи імунної відповіді.

Рис.3. Співвідношення прозапальних до протизапальних системних рівнів цитокінів

в групах хворих з позитивною і негативною клінічною динамікою.

Позитивна динаміка клінічного стану хворих в досліджуваних групах супроводжувалась наступними змінами: у досліджуваних групах хворих із ІЕа, АП(пн) та СЗ на чотирнадцяту добу зберігся підвищений рівень IFN-г стосовно норми (P<0.01). У хворих з ІЕа рівень IFN-г підвищився відносно першої доби на 76,3% (P<0,001), у хворих із СЗ рівень суттєво не змінився в порівнянні з першою добою (P>0,05). Зменшення рівня IFN-г відносно першої доби на 100% (P<0,001) спостерігалось в групі з ПТ і відповідало межам норми. В групі з АП(пн) рівень IFN-г зменшився в 40 разів відносно першої доби, але перевищував норму майже втричи (P<0,001). За показниками системних рівнів TNF одержано помітне зниження порівняно з першою добою (P<0,05) в усіх групах хворих.

Збереження підвищеного рівня IFN-г доповнюють дані про зменшення процентного рівня L-селектинів на лімфоцитах в групах з ІЕ, що свідчить про продовження існування клітинної активації і подальший розвиток запального процесу. Це можна пояснити тим, що для хворих з активним інфекційним ендокардитом основним методом лікування є оперативне втручання, але саме по собі видалення ушкодженого клапана чи видалення вегетацій не зупиняє патологічний процес. Післяопераційне ведення цієї категорії хворих потребує тривалої реабілітації з продовженням антибіотикотерапії з урахуванням чутливості бактеріальної культури. Для хворих із системною патологією в стадії загострення тривалість терапії складає від 30 діб і більше, і тут важливим є правильна діагностика, тому що хворі із системними захворюваннями у ряді випадків надходять на лікування з діагнозом: “Сепсис?”.

Одержані дані, які наводяться в табл.1-2 демонструють те, що хворі на інфекційний ендокардит не є однородною групою. На початку обстеження хворі на інфекційний ендокардит складали одну групу, але в подальшому, вони були розподілені на дві групи за Стенфордськими критеріями: інфекційний ендокардит в стані активної та неактивної фаз. Такий розподіл хворих клінічно обгрунтований: при активній формі ІЕ необхідно розглянути питання про проведення оперативного втручання. Враховуючи, що диференціальна діагностика активності інфекційного ендокрдиту досить складна, а пропоновані Стенфордські критерії не повністю задовільняють потребу в діагностиці активності процесу, отримані результати були виділені, щоб запропонувати їх як додаткові критерії до диференціальної діагностики інфекційних ендокардитів (табл.3).

Таблиця 3

Розходження між групами ІЕа і ІЕн за результатами(M±m) досліджень

Показники Групи хворих ІЕ Статистичні показники Норма

ІЕ а (n=16) ІЕ н (n=24) Р 2-3 Р 2-7 Р 3-7

1 2 3 4 5 6 7

SAPS 10,5 ± 1,1 6,3 ± 0,4

Лімфоцити 14,2 ± 5,7 31,6 ± 7,7 <0,05 <0,01 >0,05 19-37 %

Лімфоцити 1301,3 ± 343,1 2366,2 ± 530,6 <0,05 >0,05 >0,05 1600-2400/1мкл

Т-лімфоцити 71,9 ± 9,2 73,8 ± 8,9 >0,05 >0,05 >0,05 67-76 %

Т-лімфоцити 936,2 ± 92,3 1746,1± 314,0 <0,01 <0,05 >0,05 1100-1700/1мкл

HLA-DR+ на Т-клітінах 29,7 ± 8,7 26,7 ± 11,01 >0,05 <0,01 <0,01 8-15%

NK-клітини 5,1 ± 2,1 9,3 ± 1,4 <0,05 <0,1 >0,05 10-19%

NK-клітини 66,3 ± 19,1 220,0 ± 95,2 <0,01 <0,01 >0,05 200-400/1мкл

Загальнй глутатіон 700,1 ± 207,4 1210,9± 290,6 <0,05 <0,05 >0,05 1000-1400 mcM

GSH 492,4 ± 121,1 801,2 ± 190,4 <0,05 <0,01 >0,05 800-1000 mcM

TNF 31,25 ± 4,5 4,2 ± 1,9 <0,01 <0,01 >0,05 <5 пг/мл

sTNFRI 6,8 ± 1,6 1,8 ± 0,3 <0,01 <0,05 <0,05 < 3,6 нг/мл

sTNFRII 10,4 ± 1,2 4,7 ± 0,6 <0,01 <0,5 <0,01 < 12,6 нг/мл

sTNFRII/sTNFRI 1,53 ± 0,4 2,47 ± 0,3

TNF/RI 4,6 ± 0,2 1,8 ± 0,1

TNF/RII 2,9 ± 0,3 0,7 ± 0,05

IFN-g 39,8 ± 12,5 8,4 ± 1,2 <0,01 <0,01 <0,05 <5 пг/мл

IL-10 17,1 ± 4,3 1,9 ± 0,2 <0,01 <0,01 >0,05 <2 пг/мл

ВИСНОВКИ

1. Виділити комплекс клінічних ознак серед досліджених груп, характерних саме для гнійно-запальними процесів, неможливо.

2. Визначення у обстежених хворих найбільш розповсюджених маркерів ендотоксемії (МСМ (загальна і гідрофобна фракції), б2М; глутатіон) дозволяють зробити висновок, що специфічної інформації для гнійно-запальних процесів ці показники не несуть, проте можуть бути використані для визначення активності запального процесу будь-якого походження.

3. Особливості клітинної активації у випадках захворювань бактеріального походження демонструє збільшення рівня експресії активаційних молекул

HLA-DR+ на Т-лімфоцитах.

4. Позитивний перебіг запального процесу супроводжується клітинною активацією, відсутність клітинної активації свідчить про порушення формування імунної відповіді.

5. У хворих із різніми патологіями на етапі розвитку ССЗВ визначаються різні системні рівні цитокінів. Сам по собі системний рівень цитокинів реальніше за все не визначає перспективу клінічного результату, але може характеризувати можливості активації імунокомпетентних клітин і демонструвати направлення розвитку запальної відповіді. Показовими можуть бути співвідношення рівня цитокинів до їхніх рецепторів. Можливою умовою, яка визначає прогноз, може бути співвідношення про- до протизапальних цитокинів.

6. Прогностично сприятливою ознакою для хворих із гнійно-запальними процесами в проведених дослідженнях є перевага системного рівня прозапальних цитокинів над протизапальними. Зрушення у бік більшої кількості протизапальних цитокинів у хворих із захворюваннями бактеріального генеза припускає несприятливий клінічний результат.

7. Як маркери гнійно-запального процесу можна запропонувати збільшення експресії активаційних молекул HLA-DR+ на Т-лімфоцитах на тлі зменшення циркулюючого пулу NK-клітин.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ.

Внаслідок отриманих результатів, у клінічній практиці можна запропонувати наступну схему для визначення наявності або відсутності бактеріального компонента в генезі захворювання.

Розподілити ознаки бактеріального походження можна таким чином:

1. “Достовірний” процес бактеріального походження:

1.1. Наявність однакової позитивної гемокультури в 2-3 бак.посівах протягом доби або достовірне виявлення гнійно-запального процесу в ході додаткових досліджень, або під час операції.

1.2. Збільшення експресії HLA-DR+ на Т-лімфоцитах відносно норми.

1.3. Зменшення на цьому тлі циркулюючого пула NK-клітин інформує про активність процесу, “нормальна” або підвищена кількість NK-клітин говорить про хронічне захворювання, або тривалий перебіг процесу

1.4. Збільшення системного рівня цитокинів свідчить про активність процесу.

При цьому п/п 1.2-1.4. припускають сприятливий клінічний результат, оскільки активація клітинної системи демонструє збереженність імунних реакцій.

Несприятливий клінічний результат можна припустити, якщо на тлі ознак п.1.1:

1.1.1. Рівень експресії HLA-DR+ на Т-лімфоцитах наближений до нижньої межі норми або нижче її рівня.

1.1.2. Відсутність системного рівня цитокинів в активній фазі процесу або співвідношення про- до протизапальних цитокинів зсувається убік протизапальних.

Ця ситуація може свідчити про неспроможність імунної відповіді, причиною якої може бути уроджене пошкодження механізму формування імунної відповіді або неспроможність імунної відповіді, яка може розвинутися через тривалий перебіг патологічного процесу, або неправильну терапевтичну тактику лікування.

2. “Імовірна” наявність бактеріального процесу:

2.1. Підвищення експресії HLA-DR+ на Т-лімфоцитах.

2.2. Підвищення системного рівня цитокинів.

2.3.Зменшення циркулюючого пула NK-клітин.

2.4. Співвідношення Тхелперних клітин до Т-цитотоксичних (Тх/Тц) зі зрушенням уліво (при нормі 1-1.5)

3. “Можлива” наявність бактеріального процесу.

Про можливу наявність бактеріального процесу можуть свідчити клінічні критерії ССЗВ.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ:

1.Куценко Е.В, Руденко А.В, Трещинский А.И. Количественные изменения в популяциях лимфоцитов как показатель эндогенной интоксикации. // Бiль, знеболювання, iнтенсивна терапiя. 2000, № 1(9) С. 247-253.

2.Куценко Е.В, Руденко А.В, Трещинский А.И. Динамические изменения Т-клеток, NK-клеток; активационных молекул HLA-DR Т-клеток и HLA-DR NK- клеток, TNF при лечении больных инфекционным эндокардитом. // Бюллетень НЦССХ им. Бакулева РАМН, 2000, № 2, С.240.

3.Куценко Е.В.Показатели сыворотки крови – предполагаемые маркеры эндотоксемии – и их практичская ценность при гнойно-воспалительных процессах//Біль, знеболювання, інтенсивна терапія. 2001, –№ 1, С.6-24

4.Куценко О.В. Прогностична цінність клітинного імунітету у хірургічних хворих.// Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім П.Л. Шупика. Київ. 2001, С.1104-1109.

5.Куценко Е.В. Системный воспалительный ответ в случаях гнойно-воспалительного процесса и неинфекционного воспаления. Сходство и различие // Бiль, знеболювання, iнтенсивна терапiя. 2001, № 2, С. 46-55.

6. Куценко Е.В., Водяник М.А., Федосюк Р.Н., Борисенко С.В., Исаенко Н.П.,

Рябчун Т.И., Трещинский А.И. Прогностическая ценность соотношений TNF и его рецепторов sTNFR1 и sTNFR11 как маркеров при оценке тяжести состояния больных инфекционным эндокардитом.// Бiль, знеболювання, iнтенсивна терапiя. 2001, № 2(Д) С. 163-164.

7. Куценко Е.В., Водяник М.А., Крикунов А.А., Борисенко С.В., Трещинский А.И. Активный и неактивный инфекционный эндокардит в контексте системного воспалительного ответа // Щорічник наукових праць серцево-судинних хірургів України. Випуск 10, 2002 р., С.172-176.

8. Водяник М.А., Чернышев В.П., Омельченко Л.И., Куценко Е.В. применение кооперативных моноклональных антител в иммуноферментном анализе для определения фактора некроза опухолей человека // Укр.біохім.журн., 2001, т.73, № 5, С.77-83.

АНОТАЦІЯ

Куценко О.В.

Маркери ендотоксемії при гнійно-запальних процесах. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.30 – анестезіологія та інтенсивна терапія.

Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, Київ, 2002.

Наукова робота присвячена пошуку маркерів ендотоксемії при гнійно-запальних процесах. Враховуючи роль імунокомпетентних клітин у “впізнаванні” антигену і формуванні специфічного імунного захисту, досліджуються лімфоцитарні популяції, рівень експресії активаційних молекул, системні рівні цитокінів для визначення розбіжностей цих показників у випадку захворювань бактеріального і небактеріального походження. Як маркери ендотоксемії бактеріального походження пропонуються активаційні молекули -HLA-DR+, рівень NK-клітин та системні рівні TNF. Визначення цих показників може сприяти покращенню діагностики серед захворювань із спільною назвою “Лихоманки неясного генезу” та оцінці активності інфекційного ендокардиту.

Ключові слова: ССЗВ, ендотоксемія, інфекційний ендокардит, перитоніт, політравма, імунна відповідь, лімфоцитарні популяції, HLA-DR+ на Т-лімфоцитах, NK-клітини, TNF.

SUMMARY

Kutsenko E.V.

Markers of endotoxemia in purulent-inflammatory processes.

Manuscript.

Thesis for a degree of candidate of medical sciences in the speciality 14.01.30.- anesthesiology and intensive care. Kyiv Medical Academy for Postgraduate Education named after P.L. Shoupik, Ministry of Public Health of Ukraine, Kyiv, 2002.

The research is devoted to the search of markers of endotoxemia in septic processes. Taking into account the role of immunocompetent cells in recognizing antigenes and forming specific immune defense, the investigation of lymphocytic populations, systemic levels of cytokines, and levels of expression of activation molecules is done to determine divergences of these parameters in cases of bacterial and non-bacterial diseases.

Activation molecules HLA-DR+ in CD3+, level of NK-cells, and systemic levels of TNF are proposed as markers of endotoxemia of bacterial origin.

Determining of these parameters may contribute to the improvement of diagnosing among the diseases grouped under the common title “Fevers of unknown origin” and to the assessment of infective endocarditis activity.

Key words: SIRS, endotoxemia, infective endocarditis, peritonitis, multiple trauma, immune response, lymphocytic populations, HLA-DR+ in CD3+, NK-cells, TNF.

Аннотация

Куценко Е.В.

Маркеры эндотоксемии при гнойно-воспалительных процессах

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.30 – анестезиология и интенсивная терапия.

Киевская медицинская академия последипломного образования им. П.Л. Шупика МЗ Украины, Киев, 2002.

Научная работа посвящена поискам маркеров эндотоксемии при гнойно-воспалительных процессах. Необходимость научного поиска обоснована существующими проблемами диагностики лихорадок неясного генеза (ЛНГ). В группу ЛНГ входят заболевания бактериального и небактериального происхождения. Клинические проявления