НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ ТА РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

КАКАРЬКІН Олександр Якович

УДК 615.28:616 – 006:612.015:615.035

ОПТИМIЗАЦIЯ ХIМIОТЕРАПIЇ ЗЛОЯКІСНИХ ПУХЛИН ШЛЯХОМ МОДУЛЯЦІЇ БІОТРАНСФОРМАЦІЇ ЦИКЛОФОСФАМIДУ

(експериментально-клінічне дослідження)

14.01.07 - онкологія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ-2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Вінницькому державному медичному університеті ім. М.І.Пирогова МОЗ України.

Науковий керівник – доктор медичних наук, професор

Пентюк Олександр Олексійович,

завідувач медико-біологічної лабораторії Інституту хімії поверхні НАН України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Кулик Галина Іванівна,

провідний науковий співробітник відділу механізмів протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України;

доктор медичних наук, професор

Тащієв Рахман Кулієвич,

професор кафедри онкології Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України.

Провідна установа – Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, кафедра онкології, м.Київ.

Захист дисертації відбудеться "11" грудня 2002 року о 1500 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за

адресою: 03022, м.Київ, вул. Васильківська, 45.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий 08.11.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Н.В.Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Циклофосфамід (ЦФ) належить до алкілюючих цитостатиків з широким спектром дії. Він входить до складу майже всіх стандартних схем ад'ювантної та неоад'ювантної поліхіміотерапії раку молочної залози, легені, яєчника, шийки матки, семіноми яєчка, сарком м'яких тканин, кісток, пухлини Вільмса, лімфолейкозів, мієломної хвороби та злоякісних лімфом (Н.И.Переводчикова, 1993). ЦФ застосовується в різних дозах і в різних схемах, тому особливого значення набуває вивчення його метаболізму та фармакологічної взаємодії з препаратами інших груп.

ЦФ належить до препаратів, які потребують попередньої біоактивації ферментними системами організму. Протипухлинна дія ЦФ, як і його токсичні ефекти, значною мірою визначаються повнотою перетворення препарату в активні метаболіти та спектром останніх (Г.И.Кулик, В.А.Филов, 1987). Між тим ферментні системи організму, які приймають участь у біотрансформації ЦФ, відрізняються значним поліморфізмом, що обумовлює індивідуальні варіації в його ефективності та токсичності. Індивідуальні відмінності в метаболізмі та кліренсі метаболітів ЦФ можуть сягати двох порядків (Boddy AV, Yule SM., 2000; Petros WP. et al., 2002). Тому одним з підходів до оптимізації хіміотерапії може бути прогнозування метаболізму ЦФ перед початком лікування.

Ізоформи цитохрому Р450, що каталізують N-дезхлоретилювання (і відповідно утворення токсичних метаболітів), суттєво відрізняються від ферментів, що здійснюють 4-гідроксилювання ЦФ і, відповідно, утворення фармакологічно активних алкілюючих метаболітів. Баланс між метаболічною активацією і інактивацією може бути змінений ізоензим-селективними індукторами та інгібіторами ферментів метаболізму ЦФ (Yu et al., 1999; Huang Z. et al., 2000). Суттєве значення для реалізації протипухлинної дії ЦФ має активність ізоферментів альдегіддегідрогенази та глутатіон-S-трансферази, які приймають участь в інактивації активних метаболітів і обумовлюють резистентність до цитостатика (Чехун В.П., Шишова Ю.В., 2000; Sreerama L, Sladek NE., 2001).

Ємність метаболізуючих ферментів печінки обмежена і до того ж сильно варіює (Chen TL et al., 1995, 1997; Busse D et al., 1999). Повторні введення ЦФ викликають значне зниження активності ізоформ цитохрому Р450, що каталізують утворення алкілюючих метаболітів препарату (McClure MT, Stupans I., 1995).

Пошук способів спрямування метаболізму ЦФ в бік більш повного перетворення в алкілюючі метаболіти і зменшення утворення токсичних метаболітів або протидія небажаним ефектам останніх є перспективним напрямком оптимізації терапії ЦФ. Вимогами до коректорів метаболізму ЦФ є наявність протекторної дії та відсутність негативного впливу на утворення фармакологічно активних метаболітів. Такими препаратами могли б стати антиоксидантні вітаміни та ентеросорбенти (Яремчук А.Я., с соавт. 2000). В літературі є повідомлення про застосування окремих вітамінів як протекторів побічної дії ЦФ (Lamson DW, Brignall MS., 1999, 2000). Однак в жодному з досліджень не вивчався їх вплив на метаболізм і, відповідно, протипухлинний ефект ЦФ, а він може бути як позитивним, так і негативним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Виконана робота є складовою частиною планових науково-дослідних робіт кафедри онкології – ''Наукове обгрунтування заходів покращення ранньої діагностики та ефективності спеціального лікування злоякісних новоутворень людини'' (№ державної реєстрації 0197 U 014958) та кафедри біохімії Вінницького державного медичного університету ім. М.І. Пирогова – “Поліморфізм ферментів біотрансформації лікарських засобів” (№ державної реєстрації 0198 U 002708).

Мета дослідження. Підвищення ефективності та безпечності лікування хворих на злоякісні новоутворення шляхом прогнозування метаболізму ЦФ та модуляції його біотрансформації антиоксидантно-сорбентним комплексом в бік більш повного перетворення в фармакологічно активні метаболіти і зменшення частки токсичних метаболітів.

Задачі дослідження:

1. Виявити зв'язок між швидкістю мікросомального метаболізму ЦФ та активністю ізоформ цитохрому Р450, альдегіддегідрогенази і глутатіон-S-трансферази та оцінити можливість прогнозування утворення алкілюючих метаболітів за допомогою тест-препаратів амідопірину та ацетаніліду.

2. Вивчити вплив пухлини і дози ЦФ на активність ферментів метаболізуючих ЦФ та профіль його метаболітів, які екскретуються з сечею у щурів.

3. Дослідити вплив фенобарбіталу, ретинолу, токоферолу, селеніту натрію, дибунолу та силарду на метаболізм та токсичність ЦФ.

4. Проаналізувати вплив антиоксидантно-сорбентного комплексу (АОСК) на протипухлинну активність та побічні ефекти ад'ювантної хіміотерапії хворих на рак молочної залози.

5. Розробити рекомендації по застосуванню ЦФ при неоад'ювантній, паліативній та високодозній хіміотерапії хворих на злоякісні пухлини.

Oб'єкт дослідження. Лабораторні тварини (щурі) з карциномою Герена, яких лікували ЦФ та вивчали його метаболізм. Хворі на рак молочної залози (РМЗ), яким проводилась ад'ювантна поліхіміотерапія за схемами, що містять ЦФ (ЦМФ та ЦАФ).

Предмет дослідження. Метаболізм ЦФ, токсичні та алкілюючі метаболіти, активність мікросомальних ферментів; тест-препарати для визначення активності метаболізуючих ферментів; вплив антиоксидантів, фенобарбіталу та силарду на метаболізм, токсичність та антибластомний ефект ЦФ.

Методи дослідження – загальноклінічні для вивчення стану хворих під час проведення їм хіміотерапії; статистичний аналіз - для вивчення розподілу хворих за віком, стадією РМЗ, виживанням, схемою лікування та побічними ефектами хіміотерапії; гістологічний - для вивчення морфологічних проявів токсичності ЦФ у щурів; біохімічний - для вивчення вкладу ізоферментів цитохрому Р450, альдегіддегідрогенази та глутатіон-S-трансферази в метаболізм ЦФ, дослідження дії антиоксидантів та фенобарбіталу на ферментні системи печінки щурів та оцінки біотрансформації ЦФ у щурів; токсикологічний - для оцінки протекторних властивостей антиоксидантів, фенобарбіталу та силарду при гострій токсичності ЦФ, їх впливу на ступінь ЦФ-індукованої лейкопенії, уро-, нефро-, пульмо-, гепато- та імунотоксичність ЦФ, оцінки діагностичної інформативності визначення в сечі пацієнтів активності аланінаміно-трансферази та гама-глутамілтрансферази; фармакологічні – для дослідження впливу вітамінів, антиоксидантів, фенобарбіталу та силарду на кінетику активних метаболітів ЦФ у щурів. При статистичній обробці матеріалу користувались критерієм Стьюдента та методом Фішера.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше доведена принципова можливість підвищення ефективності та безпечності лікування ЦФ шляхом спрямування його метаболізму в бік більш повного перетворення в алкілюючі метаболіти і зменшення утворення токсичних метаболітів або протидії небажаним ефектам останніх за допомогою АОСК.

Експериментально обґрунтована доцільність і можливість прогнозування індивідуальних особливостей біоактивації ЦФ до алкілюючих метаболітів ізоферментами цитохрому Р450 за допомогою амідопіринового тесту, а також інактивації цих метаболітів, шляхом визначення активності ізоформ альдегіддегідрогенази та глутатіон-S-трансферази.

Встановлено, що збільшення дози ЦФ в умовах експерименту супроводжується зменшенням частки фармакологічно активних метаболітів і зростанням утворення токсичного метаболіту акролеїну.

Виявлено, що фенобарбітал, збільшуючи частку активних метаболітів, значно посилює токсичність ЦФ, тоді як токоферол, ретинол, селеніт натрію, силард та антиоксидантний препарат Три Ві плюс, поряд з підсиленням біоактивації ЦФ, знижують його токсичність, гальмуючи утворення акролеїну.

Встановлено, що ЦФ у високих дозах і при тривалому застосуванні здатний гальмувати власний метаболізм, проявляючи мембранотоксичну дію, а застосування антиоксидантних препаратів та сорбенту попереджує індуковане пухлиною та цитостатиком гальмування монооксигеназної системи печінки.

Вперше доведена можливість ефективного захисту від уро-, нефро-, пульмо- та гепатотоксичних ефектів ЦФ за допомогою АОСК. Клінічними дослідженнями підтверджена здатність цього комплексу зменшувати частоту та виразність побічних ефектів хіміотерапії хворих на РМЗ, ступінь ендогенної інтоксикації та відновлювати їх антиоксидантний статус.

Практичне значення одержаних результатів. В дисертації експериментально і клінічно обґрунтовано новий підхід до підвищення ефективності та безпечності хіміотерапії ЦФ на основі прогнозування його метаболічної поведінки та цілеспрямованого втручання в метаболізм за допомогою АОСК.

Доведено доцільність призначення АОСК в якості терапії супроводу при хіміотерапії хворих на РМЗ за схемами ЦМФ та ЦАФ. Застосування цього комплексу значно зменшує токсичні ефекти хіміотерапії, відновлює антиоксидантний статус хворих.

АОСК підвищує протипухлинний ефект схем ЦМФ і ЦАФ та підвищує трирічну виживаність хворих на РМЗ, яких лікували за цими схемами, відповідно на 13,5% та 11,1%.

Чутливими маркерами уро- та нефротоксичності хіміотерапії з застосуванням ЦФ є активність гама-глутамілтрансферази та аланінаміно-трансферази в сечі. Своєчасне виявлення їх і застосування АОСК дає змогу запобігти розвитку небезпечних ускладнень.

Збільшення дози ЦФ та тривале його застосування потребує захисту ферментних систем, метаболізуючих ЦФ від інактивації, який може бути здійснений за допомогою АОСК.

Встановлено, що прогресування злоякісної пухлини викликає депресію монооксигеназної системи печінки і зменшує частку ЦФ, яка перетворюється в фармакологічно активні алкілюючі метаболіти. АОСК попереджує цей вплив пухлини і підсилює протипухлинний ефект ЦФ. Тому його застосування набуває особливого значення при лікуванні хворих з розповсюдженими процесами.

Результати дослідження впроваджені в клінічну практику хіміотерапевтичних відділень Вінницького, Івано-Франківського, Рівненського, Миколаївського та Дніпропетровського обласних онкологічних диспансерів. Одержані теоретичні та практичні дані використовуються в навчальному процесі кафедр онкології та біохімії Вінницького державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно зробив патентно-інформаційний пошук, провів аналіз наукової літератури з обраної проблеми, здійснював планування експериментів, підбір та клінічне обстеження хворих. Автором проведені всі експериментальні та клінічні дослідження, виконана статистична обробка та аналіз даних, підготовані до друку статті.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на XIV об'єднаній науковій медико-технічній конференції (Київ – Вінниця – 1996); І-ому з'їзді онкологів країн СНД (Москва, 1996); конференції молодих вчених ВДМУ ім. М.І.Пирогова (Вінниця, 1997); засіданнях обласних товариств онкологів та біохіміків (Вінниця, 1998, 1999); Республіканській науковій конференції ''Застосування в медичній практиці лікарських препаратів на основі високодисперсного кремнезему та механізми їх дії'' (Вінниця, 1999); II-му з'їзді онкологів країн СНД (Киев, 2000); IV Республіканській науково-практичній конференції молодих онкологів України “Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 статей – всі у фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 4 тези конференцій та з'їздів, видано 2 інформацийні листи Вінницьким ДЦНТІ.

Структура та обсяг дисертацiї. Дисертацiя викладена на 195 сторiнках машинописного тексту і складається зi вступу, огляду лiтератури, розділу “Матерiали та методи дослідження”, 4 розділів власних дослiджень, обговорення, висновкiв, практичних рекомендацій та показчика цитованої лiтератури, який мiстить 313 вiтчизняних та зарубiжних публiкацiй. Дисертація містить 55 таблиць та 12 рисунків.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на 481 щурі лінії Вiстар: на 421 тварині без пухлин та на 60 щурах з перещепленою карциномою Герена (штам отриманий з банку пухлин Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім Р.Е. Кавецького). Під час дослідів тварини перебували на напівсинтетичному раціоні, що забезпечує надходження оптимальних кількостей незамінних нутрієнтів. При проведенні експериментальних досліджень керувались міжнародними правилами проведення робіт з експериментальними тваринами.

Дослідження біотрансформації і фармакокінетики ЦФ. Вміст алкілюючих метаболітів ЦФ в сироватці крові та сечі оцінювали за реакцією з 4-(4'-нітробензил)-пірідином за Christian R.A. (1980). Загальний вміст ЦФ визначали після його переведення в алкілюючі деривати шляхом нагрівання проб. Акролеїн визначали за Wagner T., et al. (1981); вміст меркаптурових кислот акролеїну та хлорацетальдегіду в сечі визначали турбідіметричним методом (Doorn V.R. et al., 1981); ЦФ-гідроксилазну активність мікросом печінки оцінювали за Wagner T., et al. 1981.

Параметри фармакокінетики розраховували в рамках двохчастинної моделі (В.К.Пиотровский, М.Вайс, 1988).

Дослідження активності ксенобіотик-метаболізуючих ферментів.З гомогенату печінки отримували мiкросомну фракцію за Kamath., et al. (1971). Чистоту мiкросомної фракцiї тестували за маркерними ферментами мітохондрій, лізосом, плазматичних мембран та мiкросом. Активнiсть мiтохондрiальної глутаматдегiдрогенази оцінювали за реакцією вiдновлювального амiнування альфа-кетоглутарової кислоти, а кислої фосфатази лiзосом та глюкозо-6-фосфатази мiкросом за кількістю неорганiчного фосфату, що звільнюється при гiдролiзi бета-глiцерофосфату, чи глюкозо-6-фосфату (А.А.Покровский, А.И.Арчаков, 1968).

Ефективність цитостатичної дії визначали за ступенем гальмування росту пухлини, індексом ефективності та тривалістю життя тварин (З.П.Софьина, А.Голдин, 1979).

Токсичний вплив пухлини і цитостатиків на організм тварин визначали за клінічними проявами (кон'юнктивіти, ентерити, зміною маси тіла та їх органів), біохімічними та гістологічними змінами в органах.

В мікросомній фракції органів визначали загальний вміст цитохрому Р450, ацетанілід- і анілінгідроксилазну активності, амідопірин-, еритроміцин-N-деметилазні активності, активність гексобарбіталгідроксилази (Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977). Кількість 3-гідроксигексобарбіталу визначали методом тонкошарової хроматографії (Breyer U., Villumsen D., 1975). Активність NADH і NADPH-редуктаз оцінювали за швидкістю відновлення дихлорфеноліндофенолу (Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977).

Визначення активності глутатіон-S-трансферази проводилось за утворенням кон'югатів глутатіону з 1-хлор-2,4-динітробензолом (Habig W.H., Jacobi W.B., 1981; Ploemen JP, et al., 1996); з нітрогліцерином (Nigam R, et al., 1996); етакриновою кислотою (Kashiwada M, et al., 1991; Satoh K. 1995).

Визначення активності альдегіддегідрогенази класів 1 та 3 проводили спектрофотометричним методом (Dockham PA. et al., 1997; Moreb JS. et al., 2000).

Активність аланін амінотрансферази та аспартатамінотрансферази визначали уніфікованими методами Райтмана-Френкеля (В.В. Меньшиков, 1987), активність гама-глутамілтрансферази за швидкістю вивільнення 4-нiтроанiлiну з гамма-глутамiлнiтроанiлiду, вміст білірубіну уніфікованим методом Єндрасика-Грофа, креатиніну за реакцією з пікриновою кислотою (В.В. Меньшиков, 1987).

Вміст білка визначали мікробіуретовим методом з реактивом Бенедикта (Кочетов Г.А.,1980). Рівень молекул середньої маси визначали спектрофото-метричним методом (Н.И.Габриэлян та співавт. 1985)

Вмiст вiльного токоферолу визначали за реакцією Еммерi-Енгеля, а рівень ретинолу в печінці – флуориметричним методом (Ю.М. Островский, 1979).

Рівень селену визначали методом О.А. Ефременко та співавт. (1985).

Кількісне визначення карбонільних груп білків проводили за Levine RL. et al. (1994); вміст малонового діальдегіду визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972).

Ліпідний склад легень визначали після екстракції ліпідів за методом Bligh, Dyer (М.Кейтс, 1975); загальний вміст ліпідів – за реакцією з фосфорнованіліновим реактивом, а загальних фосфоліпідів – екстракційно-фотометричним методом (О.О. Пентюк та співавт., 1987). Ліпідний спектр визначали методом тонкошарової хроматографії. Ідентифікацію індивідуальних нейтральних ліпідів та фосфоліпідів після їх хроматографічного розділення проводили методом свідків (М. Кейтс,1975). Кількісне визначення фракцій ліпідів після їх хроматографії проводили за реакцією з фосфорнованіліновим реактивом.

Титр аглютинінів та гемолізинів, визначали за Е.Ф. Чернушенко, Л.С. Когосовою, (1978).

Статистичну обробку результатiв дослiдження виконували методами бiометрiї (Е.В.Гублер, 1978, В.Н.Носков, 1990).

Клінічна характеристика хворих на рак молочної залози. Обстежено 137 жінок хворих на РМЗ, які отримували ад'ювантну поліхіміотерапію за стандартними схемами ЦМФ (101 хвора) та ЦАФ (36 хворих). Частина хворих (50 жінок) додатково отримували комплекс антиоксидантів Три-ві плюс та ентеросорбент силард, ці хвори і склали дослідну групу: з них 32 пацієнтки лікувались за схемою ЦМФ, а 18 – за схемою ЦАФ. Контрольну групу склали 69 пацієнток, що лікувались за схемою ЦМФ та 18 пацієнток, що лікувались за схемою ЦАФ, яким не призначали вітамінних препаратів та сорбентів.

За віком хворі були розподілені наступним чином: віком до 39 років – 10 жінок (8% в контрольній та 6% в дослідній); віком 40-49 років – 40 (26,4% та 36 %); віком 50-59 років – 56 (42,5% та 38%) та віком 60 років і старше – 31 (23% та 22%). Таким чином особливих відмінностей за віком між хворими контрольної та дослідної груп не було

Розподіл хворих за стадіями захворювання також не виявив суттєвих відмінностей між контрольною та дослідною групами. Всього лікувалось 4 хворих в I-й стадії (за схемою ЦМФ – 3 і за схемою ЦАФ – 1 пацієнтка), що склало 2,9% від числа усіх хворих В ІV стадії захворювання лікувалось 11 хворих (8%). Всі вони отримували лікування за схемою ЦАФ, 5 з них додатково отримували АОСК.

Основну масу хворих, які отримували ПХТ становили пацієнти в ІІ та ІІІ стадії РМЗ. В ІІ стадії захворювання було піддано лікуванню 75 хворих (54,7%), в ІІІ стадії – 47 хворих (34,3%). В групі, яка лікувалась за схемою ЦМФ, частка хворих ІІ стадією становила 63,7%, а ІІІ стадією – 33,3%. В групі, що отримувала ПХТ за схемою ЦМФ на фоні АОСК, хворих ІІ стадією було 68,7%, а ІІІ стадією – 28,1%. В групі хворих, яких лікували за схемою ЦАФ в ІІ стадії знаходилось 16,7% і в ІІІ стадії 44,4%, в ідентичній групі, які отримували антиоксиданти і сорбент, кількість пацієнток в ІІ стадії була вдвічі більшою (33,3%), а в ІІІ стадії навпаки – меншою (38,8%). Усі пацієнти, включені до протоколу дослідження, проходили детальне клінічне та лабораторне обстеження, дані якого щодня заносились до протоколу, складеного у відповідності з рекомендаціями ВОЗ та Міжнародного протиракового союзу, щодо визначення ступеня токсичності цитостатичних препаратів (Н.И.Переводчикова, 1993).

Основні результати дослідження. На першому етапі роботи був проведений експериментальний пошук ''предикторів'' утворення алкілюючих метаболітів та акролеїну серед ізоформ цитохрому Р450, альдегіддегідрогенази та глутатіон-S-трансферази. Оцінена можливість прогнозування біоактивації ЦФ за допомогою метаболічних зондів – амідопірину та ацетаніліду.

В дослідах на мікросомах печінки щурів співставили метаболізм ЦФ до іприту фосфораміду з маркерними активностями найбільш поширених ізоформ цитохрому Р450. Показано, що метаболізм ЦФ найбільше корелює з активністю амідопірин-N-деметилази (СУР2В, 2С, 3А) та гексобарбіталгідроксилази (CYP2С) і слабко корелює, або практично не корелює з активностями інших ферментів - анілінгідроксилази (CYP2Е1), ацетанілідгідроксилази (СУР1А2), еритроміцин-N-деметилази (СУР3А) (табл.1).

Утворення алкілюючих метаболітів та акролеїну тісно, але зворотньо корелює з активністю альдегіддегідрогенази класу 3 (r = -0,62 та -0,49), глутатіон-S-трансферази, особливо її пі форми (r = -0,51 та -0,55). Дещо меншим є вплив альдегіддегідрогенази класу 1.

Таблиця 1

Коефіцієнти кореляції між ЦФ-гідроксилазною активністю та іншими маркерними активностями мікросомальної фракції печінки щурів

Маркерні активності ЦФ

Іприт фосфораміду Акролеїн

Амідопірин-N-деметилаза 0,69* 0,60*

Еритроміцин-N-деметилаза 0,38 0,40

Гексобарбіталгідроксилаза 0,66* 0,65*

Анілінгідроксилаза 0,36 0,34

Ацетанілідгідроксилаза 0,30 0,29

ЦФгідроксилаза Іприт фосфораміду 1,0 0,87*

Примітка. * - вірогідні коефіцієнти кореляції.

Активність мю форми глутатіон-S-трансферази лише на рівні тенденції впливає на утворення метаболітів ЦФ.

Інгібування активності альдегіддегідрогенази дисульфірамом та глутатіон-S-трансферази - етакриновою кислотою суттєво підвищує утворення алкілюючих метаболітів ЦФ. Рівень алкілюючих метаболітів ЦФ у щурів, що отримували дисульфірам, вірогідно зростає на 30,4%, етакринову кислоту – на 17,7%.

Для визначення можливості прогнозування метаболізму ЦФ у цілісному організмі були використані амідопірин та ацетанілід, метаболізм яких оцінювали за 2 –3 дні до введення тест-дози ЦФ.

Щурі були поділені на три групи: з повільною, середньою та швидкою здатністю деметилювати амідопірин. Виявилось, що утворення з ЦФ алкілюючих метаболітів та акролеїну значно активніше проходить у щурів зі здатністю швидко окислювати амідопірин, ніж у тварин, які повільно його деметилюють. Між реакцією деметилювання амідопірину та біоактивацією ЦФ існують тісні кореляційні зв'язки: r = 0,40-0,60.

Швидкість ацетилювання 4-аміноантипірину практично не впливає на екскрецію з сечею щурів метаболітів ЦФ. Виявилось, що утворення активних метаболітів ЦФ слабко пов'язано і з метаболізмом ацетаніліду. Зокрема, екскреція алкілюючих метаболітів ЦФ та акролеїну практично не залежить від маркерів СYР1А2 та СYР2Е1, активності УДФ-глюкуроніл- та фенолсульфотрансфераз.

Таким чином, амідопіриновий тест в найбільшій мірі відображає можливості організму до перетвореня ЦФ в його активні метаболіти. Простота і безпечність даного тесту дозволяє запропонувати його в якості ''предиктора'' метаболічної активації ЦФ у хворих.

Ми також дослідили вплив величини дози ЦФ на утворення його активних метаболітів. Виявляється, що збільшення дози ЦФ в 4 рази (з 25 мг/кг до 100 мг/кг) не приводить до пропорційного підвищення утворення його алкілюючих метаболітів. Вони зростають лише в 2,9 рази, а частка їх до введеного ЦФ, навпаки, вірогідно зменшується в 1,36 рази. Екскреція незміненого ЦФ зростає в 5,24 рази, а акролеїну в 5 разів, що підтверджує насичуваний характер утворення активних метаболітів і обмежені можливості організму до активації великих доз ЦФ в фармакологічно активні метаболіти. Тому при високодозній хіміотерапії виникає потреба в індукторах цитохрому Р450 для стимулювання більш повного перетворення ЦФ в активні метаболіти.

Дослідивши вплив на фармакокінетику ЦФ препаратів різних фармакологічних груп, ми встановили, що фенобарбітал в найбільшій мірі збільшує частку алкілюючих метаболітів, особливо, на 20-й хвилині після введення ЦФ. Дещо менший ефект мали силард та токоферол. Селен та дибунол слабко впливали на фармакокінетику ЦФ. Тому можна було б сподіватися, що саме фенобарбітал в найбільшій мірі підходить для підвищення повноти перетворення ЦФ в алкілюючі метаболіти і подолання феномену обмеженої ємності метаболізуючих ферментів. Однак, потрібно врахувати ще такий важливий момент, як токсичність ЦФ.

Виявилось, що попереднє введення фенобарбіталу викликає значне підвищення токсичності ЦФ – зростає загальна смертність тварин. В той же час, токоферол, дибунол, силард та ТриВі Плюс, навпаки підвищують тривалість життя тварин (рис. 2).

Під впливом фенобарбіталу зростає ступінь вираженості ЦФ-індукованої лейкопенії, імуносупресорний ефект ЦФ, що підтверджується більш значним падінням утворення антитіл проти еритроцитів барана у тварин, які отримували ЦФ разом з фенобарбіталом.

В той же час токоферол, ретинол, дибунол та селеніт натрію зменшують ступінь лейкопенії а ретинол, дибунол та частково силард зменшують і ступінь імуносупрессії, викликаної ЦФ.

Таким чином, фенобарбітал, хоча і сильно активує утворення алкілюючих метаболітів, однак є малопридатним для використання в клінічній практиці, оскільки збільшує токсичність ЦФ. Більш придатними, на наш погляд, для корекції терапії ЦФ є вітаміни та коферменти, які є природними компонентами внутрішнього середовища, відрізняються нетоксичністю і фізіологічністю дії.

Ошибка! Неизвестный аргумент ключа.

Рис. 2. Середня тривалість життя тварин, які отримали ЦФ в дозі 230 мг/кг на фоні введення модуляторів його метаболізму.

Оскільки ЦФ має здатність пригнічувати власний метаболізм, ми дослідили здатність антиоксидантів захищати ферментні системи печінки від інактивації. У щурів, яким вводили ЦФ (150 мг/кг) без протекторів, активність монооксигеназ падає на 7-й день в 1,5-2,5 рази, та відповідно 2,5-3 рази зменшується перетворення тест дози ЦФ (25 мг/кг) в активні метаболіти. Застосування антиоксидантних вітамінів, селену та фенобарбіталу в значній мірі запобігає інактивації ферментних систем печінки під впливом ЦФ, і збільшує частку активних метаболітів ЦФ.

Таким чином антиоксидантні вітаміни (ретинол, токоферол), селен та ентеросорбент силард здатні не лише зменшувати токсичні впливи ЦФ на організм тварин, але і частково стимулювати перетворення ЦФ в алкілюючі метаболіти, що дозволяє запропонувати їх для супроводу хіміотерапії ЦФ. Враховуючи синергічну спрямованість впливу досліджених вітамінів та селену, ми надали перевагу їх комплексу - препарату Три Ві плюс, який включає вітаміни А, С, Е, селен, цинк та мідь в терапевтичних дозах. Застосування цього комплексу є особливо доцільним при лікуванні пухлин, які, як відомо, виснажують в організмі носія пухлин запаси вітамінів та мікроелементів, збільшують ступінь пероксидації ліпідів та рівень ендогенної інтоксикації. Ентеросорбент силард має інші механізми протекторного впливу, до того ж він здатний потенціювати дію вітамінів та ЦФ. Саме АОСК ми вирішили застосувати у пацієнтів, що лікувались ЦФ, апробувавши його перед тим на щурах з перещепленою карциномою Герена.

Нами встановлено, що АОСК у щурів-пухлиноносіїв, яких лікували ЦФ, зменшує загальну токсичність препарату та дефіцит антиоксидантів (ретинолу, токоферолу, селену), а також підвищує протипухлинний ефект ЦФ.

Пульмотоксичність ЦФ проявилась виходом в рідину лаважу ферментів та білку. Активність гамаглутамiл-, та глутатiон-S-трансферази зростала під впливом ЦФ відповідно в 6,1-7,8 рази. Мембранотоксичність ЦФ проявлялась зниженням рівня мікросомного білка, фосфоліпідів, падінням активності NADPH-редуктази (на 34,7%) при одночасному зростанні більш ніж вдвічі вмісту малонового діальдегіду. Застосований нами лікувальний комплекс ефективно протидiяв ЦФ-iндукованому пошкодженню легень.

Застосування АОСК суттєво зменшує уро- і нефротоксичні ефекти ЦФ. У порівнянні з тваринами, що отримували ЦФ без протекторів, маса сечового міхура була меншою в 1,6 рази, активність гама-глутамілтрансферази в сечі - в 1,6 рази, концентрація білка зменшилась на 58%, вірогідно зростала клубочкова фільтрація - на 18%. Виявилось, що уро- та нефротоксичність ЦФ є наслідком дії токсичного метаболіту акролеїну, про що свідчить наявність тісної кореляції (r = 0,52–0,63) між рівнем його екскреції та мікрогематурією, протеїнурією, зростанням маси сечоваого міхура та екскрецією гама-глутамілтрансферази.

При морфологічному досліджені в нирках тварин, що отримували ЦФ на тлі протекторного комплексу, відзначається лише незначний набряк та зерниста дистрофія епітелію канальців, подекуди незначна гідропічна дистрофія. Структура канальців не порушена, клітини збиральних трубок контрасні, контуровані. Тобто мікроскопічна картина подібна до такої у тварин носіїв пухлини, які не отримували ЦФ.

Гепатотоксичність ЦФ проявилась зниженням активності ферментів та вмісту цитохрому P-450. Відповідальним за ці ефекти є акролеїн і іприт фосфораміду, адже саме печінка є основним місцем їх утворення. В механізмі пошкодження печінки основна роль належить мембранотоксичній дії ЦФ, про що свідчить різке зниження активності мембранозв'язаних ферментів – NADH- та NADPH-редуктаз, арилестерази та зменшення стійкості мікросомних мембран до дії мембраноруйнівних агентів – дезоксихолату натрію та трипсину.

Встановлена здатність карциноми Герена гальмувати активність мікросомальних ферментів, в тому числі і тих, які відповідають за метаболізм ЦФ. Введення ЦФ ще більше знижує здатність печінки до біоактивації ЦФ.

Ці дані знайшли своє підтвердження і при дослідженні метаболізму ЦФ. Наявність пухлини зменшує екскрецію з сечею алкілюючих метаболітів ЦФ (на 26%) і меркаптуратів (на 23%). Застосування АОСК в 1,3-2,2 рази знижує викликану ЦФ інактивацію ферментних систем печінки та повністю попереджує депресію монооксигеназної системи печінки у щурів-пухлиноносіїв. Антиоксиданти зменшують утворення токсичного метаболіту акролеїну, стимулюючи його детоксикацію, про що свідчить зростання рівня меркаптуратів.

Зростання частки активних метаболітів під дією АОСК таким чином здатно посилювати протипухлинний ефект ЦФ.

АОСК також частково гальмує ріст пухлини, об'єм якої, при щоденному застосуванні комплексу, на 8-й день експерименту був вірогідно меншим, ніж в контрольній групі на 39,9%, а також приводить до посилення індексу ефективності лікування ЦФ. Маса пухлини при лікуванні ЦФ разом з АОСК на 16 день була в 3,5 рази меншою ніж у тварин які лікувались одним ЦФ. Гальмування росту пухлини в цій групі склало 99,4%, а в групі, яка отримувала лише ЦФ - 97,3%.

Застосування АОСК збільшує трирічну виживаність хворих на РМЗ, яких лікували за стандартними схемами ЦМФ та ЦАФ (на 13,5 та 11,1%). Зменшує частоту та виразність побічних ефектів хіміотерапії таких, як нудота, блювання, головний біль, серцеві розлади в 1,5–2 рази, лейкопенію на 7-8%, послаблює уро- та нефротоксичну дію хіміотерапії, зменшуючи в 1,3-1,7 рази лейкоцитоурію та екскрецію з сечею аланінаміно- та гамаглутамілтрансферази.

У пацієнтів на РМЗ зареєстровані явища ендогенної інтоксикації та антиоксидантної недостатності, які поглиблюються під дією хіміотерапії. У хворих в плазмі крові зростає рівень молекул середньої маси, малонового діальдегіду, білкових карбонільних груп, падає вміст токоферолу, ретинолу і селену. Застосування АОСК відновлює антиоксидантний статус організму хворих та зменшує прояви ендогенної інтоксикації.

Таким чином запропонований нами антиоксидантно-сорбентний комплекс не лише покращує ефективність хіміотерапевтичного лікування хворих на РМЗ, але і підвищує його безпечність, зменшуючи частоту і тривалість побічних ефектів, ступінь ендогенної інтоксикації і вітамінно-мікроелементної недостатності, вірогідно збільшуючи трирічну виживанність хворих. Це розширює можливості застосування ЦФ і проведення більш ефективного і повноцінного хіміотерапевтичного лікування хворих.

ВИСНОВКИ

1. Біотрансформація ЦФ визначається активністю та специфічністю набору ізоформ цитохрому Р450, альдегіддегідрогенази, глутатіон-S-трансферази. Чутливим маркером утворення алкілюючих метаболітів ЦФ є активність амідопірин-N-деметилази. У щурів з високою активністю цього ферменту екскреція з сечею алкілюючих метаболітів була на 36% вищою, ніж у тварин з низькою активністю. На відміну від цього утворення алкілюючих метаболітів та акролеїну зворотньо корелює з активністю альдегіддегідрогенази та глутатіон-S-трансферази.

2. Метаболізм ЦФ характеризується насичуваним характером утворення активних метаболітів. При збільшенні дози ЦФ частка алкілюючих метаболітів зменшується, тоді як екскреція незміненого ЦФ і токсичного метаболіту акролеїну значно зростає.

3. Фенобарбітал індукує метаболізуючі ЦФ ферменти і підвищує концентрацію алкілюючих метаболітів у плазмі крові щурів, підсилює його гематологічну та імунологічну токсичність. В той же час селеніт натрію, силард, дибунол та особливо токоферол і ретинол, навпаки – зменшують імуно- та міелосупресивну дію ЦФ. Токоферол, крім того, на 15% підвищує рівень алкілюючих метаболітів в крові та на 21% зменшує період їх напівелімінації.

4. При зростанні маси карциноми Герена у щурів здатність печінки до біоактивації ЦФ знижується на 32%. Застосування ретинолу, токоферолу та селену і особливо АОСК в 1,3-2,2 рази зменшує викликану ЦФ інактивацію ферментних систем печінки та попереджує депресію її монооксигеназної системи під впливом пухлини. Антиоксиданти стимулюють детоксикацію акролеїну до меркаптуратів і стимулюють утворення алкілюючих метаболітів.

5. АОСК гальмує ріст карциноми Герена, підсилює протипухлинний ефект ЦФ, зменшує токсичність препарату, протидіє індукованій пухлиною та ЦФ інволюції тимусу та лейкопенії, підвищує забезпеченість тварин токоферолом, селеном та ретинолом.

6. Одним з механізмів токсичної дії ЦФ є пошкодження клітинних мембран, яке проявляється зростанням вмісту малонового діальдегіду, падінням активності NADPH-редуктази та інших ферментів, підвищенням (в 1,2–2,5 рази) солюбілізації компонентів мембран під впливом дезоксихолату та трипсину. Прояви нефро- та уротоксичності тісно і прямо корелюють з екскрецією з сечею акролеїну. АОСК на 28-41% зменшує мембранотоксичну дію ЦФ та в 1,2-1,7 рази ЦФ-індуковане ураження легень, нирок та сечового міхура.

7. Застосування АОСК покращує якість життя і збільшує трирічну виживаність хворих на РМЗ, які лікувались за схемами ЦМФ та ЦАФ (відповідно на 13,5 та 11,1%), зменшує частоту та виразність побічних ефектів хіміотерапії в 1,5-2 рази, в тому числі на 7-8% – лейкопенію, в 1,3-1,7 рази – лейкоцитоурію та екскрецію з сечею гама-глутамілтрансферази і аланінамінотрансферази. На 10-30% зменшує прояви ендогенної інтоксикації (рівень молекул середньої маси, малонового діадьдегіду та білкових карбонільних груп), відновлює антиоксидантний статус хворих.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Критеріями уро- та нефротоксичності хіміотерапії за схемами, що включають ЦФ, на доклінічному рівні є підвищення в сечі пацієнтів активності аланінамінотрансферази вище 25 нмоль/мл/хв та гама-глутамілтрансферази вище 2,5 нмоль/мл/хв. Додатковою ознакою уро- та нефротоксичності, як свідчать експериментальні дані, може бути екскреція акролеїну з сечею.

2. Ступінь токсичності хіміотерапії у хворих на РМЗ може бути оцінений за рівнем концентрації молекул середньої маси, білкових карбонільних груп та малонового діальдегіду в сироватці крові. Рівень молекул середньої маси і білкових карбонільних груп вищий за 0,260 та 60 од.опт. щільності відповідно та малонового діальдегіду вищий за 3,6 мкмоль/л слід розглядати як прояв ендогенної інтоксикації.

3. Застосування АОСК (Три Ві плюс та силарду) дозволяє підвищити ефективність хіміотерапії за схемами ЦМФ та ЦАФ та зменшити ступінь ендогенної інтоксикації і антиоксидантної недостатності, частоту і важкість побічних ефектів. Критеріями ефективності протекторного захисту може бути нормалізація загального стану пацієнтів, попередження лейкопенії, нормалізація показників ендогенної інтоксикації та рівнів ретинолу, токоферолу і селену в сироватці крові.

4. При комбінації ЦФ з іншими лікарськими засобами, особливо з тими які здатні модифікувати активність ЦФ-метаболізуючих ферментів, необхідно враховувати можливість впливу останніх на фармакокінетичну поведінку ЦФ.

5. У хворих з генетично обумовленою низькою активністю ферментів метаболізму ЦФ не можна планувати довгострокове його застосування, використовувати високодозну терапію або ущільнювати дозу препарату.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Какарькін О.Я. Вплив комплексу антиоксидантів та ентеросорбенту силард П на токсичні ефекти цитостатичної терапії у хворих на рак молочної залози // Вісник Вінницького державного медичного університету. -1999.-Т.3, №.1.- С.232-233.

2. Какарькін О.Я. Вплив антиоксидантів та фенобарбіталу на ферментні системи метаболічної активації циклофосфаміду у щурів // Экспериментальная онкология -2001. -Т. 23, №3. -С.213-216.

3. Какарькін О.Я, Істошин В.М. Вплив антиоксидантів на метаболічну активацію, токсичність та імуносупресивну дію циклофосфаміду у щурів // Вісник Вінницького державного медичного університету. -1997.- №.1.- С.19-20. Особистий внесок дисертанта: проведення експерименту, імунологічні дослідження, статистичний аналіз матеріалу, підготовка тексту статті.

4. Матвійчук М.В, Какарькін О.Я., Черв'як М.М., Дмітрієва К.Ю. Вплив додаткового введення ретинолу, ретиноєвої кислоти та бета-каротину на активність ферментів, що метаболізують ксенобіотики, токсичність нітрозодиметиламіну та циклофосфаміду // Вісник Вінницького державного медичного університету. -1997.- №.2.- С.36-37. Особистий внесок дисертанта: планування і проведення експерименту, дослідження активності ферментів метаболізму циклофосфаміду, статистичний аналіз матеріалу, підготовка тексту статті.

5. Какарькін О.Я., Пушкарь М.С., Кузяків Т.В. Морфологічні зміни в пухлині Герена під впливом лікування циклофосфамідом в комбінації з препаратом Три - Ві плюс та сорбентом силардом // Вісник морфології. -1999. -Т.5,№2. -С.182-184. Особистий внесок дисертанта: планування та проведення експерименту, дослідження антибластомної та токсичної дії ЦФ, приготування мікропрепаратів, аналіз результатів, підготовка тексту статті.

6. Какарькін О.Я., Ільченко О.В., Полеся Т.Л. Комп'ютерна програма для розрахунків параметрів фармакокінетики // Вісник Вінницького державного медичного університету. -2001. -Т.5, №2. -С.601-603. Особистий внесок дисертанта: участь в розробці комп'ютерної прогами, експериментальні дослідження, статистичний аналіз матеріалу, підготовка тексту статті.

7. Какарькін О.Я., Пентюк О.О., Пушкарь М.С., Какарькіна Л.І. Вплив антиоксидантно-сорбентного комплексу на нефро- і уротоксичну дію циклофосфаміду та екскрецію його метаболітів з сечею у щурів з карциномою Герена // Экспериментальная онкология -2001. -Т. 23, №4. -С.287-290. Особистий внесок дисертанта: дослідження екскреції метаболітів ЦФ, статистичний аналіз матеріалу, оформлення статті.

8. Пентюк О.О., Какарькін О.Я, Юрченко П.О. Ферментні системи біотрансформації циклофосфаміду та іфосфаміду: шляхи підвищення ефективності протипухлинної терапії. Огляд // Онкология -2001. -Т. 3, №4. -С.245-252. Особистий внесок дисертанта: збір та аналіз літератури, підготовка тексту огляду.

9. Пентюк О.О., Какарькін О.Я., Юрченко П.О. Шляхи біотрансформації циклофосфаміду та іфосфаміду. Зв'язок з токсичністю та антибластомним ефектом. Огляд // Современные проблемы токсикологии. -2001. №4. -С. 3-9. Особистий внесок дисертанта: збір та аналіз літератури, підготовка тексту огляду.

10. Пентюк А.А., Болюх Б.А., Блажиевская Г.И., Матвийчук Н.В., Какарькин А.Я., Истошин В.М., Пентюк Н.А. Влияние витаминов А и Е на токсичность циклофосфамида, образование алкилирующих метаболитов и активность ферментов, метаболизирующих ксенобиотики // І-й съезд онкологов стран СНГ. Материалы съезда. - Москва, 1996. - С.163-164.

11. Какарькин А.Я., Матвийчук Н.В., Истошин В.М. Влияние препаратов ретинола и токоферола на образование алкилирующих метаболитов циклофосфамида и активность ферментов, участвующих в его биотрансформации // XIV об'єднана наукова медико-технічна конференція з міжнародною участю. Матеріали конференції. - Київ-Вінниця, 1996. - С.53.

12. Какарькин А., Пентюк А., Пушкарь М. Модуляция противоопухолевого и токсического эффекта циклофосфамида у крыс с карциномой Герена комплексом антиоксидантов Три-Ви плюс и энтеросорбентом силлардом // Тезисы II съезда онкологов стран СНГ. – Киев -2000. Экспериментальная онкология. -2000. -Т.22. -С.258

13. Какарькін О.Я., Пентюк О.О. Особливості фармакокінетики циклофосфаміду. Зв'язок з ефективністю хіміотерапії // Тези ІV науково-практичної конференції молодих онкологів України ''Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології'' – Київ -2001. -С.4.

АНОТАЦІЯ

Какарькін О.Я. Оптимізація хіміотерапії злоякісних пухлин шляхом модуляції біотрансформації циклофосфаміду. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.07 – онкологія. Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, 2002.

Дисертація присвячена вивченню метаболізму, протипухлинної та токсичної дії алкілюючого цитостатика циклофосфаміду (ЦФ), дія якого тісно пов'язана з активністю ряду ферментів, які приймають участь в його метаболізмі.

Вивчено вклад різних ізоформ цитохрому Р450, альдегіддегідрогенази та глютатіон-S-трансферази в метаболізм ЦФ до алкілюючих та токсичних метаболітів. Дана оцінка впливу пухлини, дози та схеми введення ЦФ на його біотрансформацію. Виявлено, що збільшення дози або довготривале (більше 7 днів) введення ЦФ приводить до пригнічення системи, яка метаболізує препарат до активних метаболітів. В цій ситуації збільшується кількість акролеїну, що веде до значного зростання токсичності при незначному збільшенні протипухлинного ефекту.

Показано можливість прогнозування активності ЦФ-метаболізуючої системи перед початком лікування за допомогою тест-препаратів (амідопірину та ацетаніліду) та за допомогою визначення початкової активності альдегід-дегідрогенази та глютатіон-S-трансферази.

Показано, що антиоиксидантно-сорбентний комплекс (АОСК) запобігає інактивації ферментів, метаболізуючих ЦФ до алкілюючих метаболітів і ферментів, які приймають участь в інактивації токсичного метаболіта – акролеїна. Таким чином АОСК підвищує протипухлинну активність ЦФ і зменшує його токсичність, що було доведено в експерименті на щурах та у