ІНСТИТУТ ЕНДОКРИНОЛОГІЇ ТА ОБМІНУ РЕЧОВИН ІМ. В.П.КОМІСАРЕНКА АМН УКРАЇНИ

Пушкарьов Володимир Михайлович

УДК 612.453: 612.453.018: 612.014.3

БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ РЕГУЛЯЦІЇ СТЕРОЇДОГЕНЕЗУ В КОРІ НАДНИРКОВИХ ЗАЛОЗ ІОНАМИ КАЛІЮ

14.01.14 – ендокринологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

КИЇВ

2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті ендокринології та обміну речовин

ім. В.П. Комісаренка АМН України

Науковий консультант – доктор медичних наук, професор, чл.-кор. АМН і НАН України ТРОНЬКО Микола Дмитрович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач відділу патофізіології ендокринної системи

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор, чл.-кор. АМН та НАН України Резніков Олександр Григорович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач відділу ендокринної репродукції та адаптації

Доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Кучеренко Микола Євдокимович, Київський Національний університет імені Тараса Шевченка, головний науковий співробітник кафедри біохімії

Доктор медичних наук Хомінська Зінаїда Борисівна, Інститут педіатрії, акушерства і гінекології АМН України, завідувач лабораторії ендокринології

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України, м.Київ, лабораторія радіобіології

Захист відбудеться 24 січня 2006 р. о 13 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.558.01 з ендокринології в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (04114, м. Київ-114, вул.. Вишгородська, 69).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка (м. Київ-114, вул.. Вишгородська, 69).

Автореферат розісланий 22 грудня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

Доктор біологічних наук Калинська Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Аналіз досягнень ендокринології за останні 20 років свідчить про те, що, окрім інтенсивного розвитку клінічних напрямів, пов’язаних з профілактикою, діагностикою та лікуванням ендокринних захворювань, вона поступово перетворюється на загально-біологічну науку з акцентом на клітинні механізми дії різноманітних гормонів та агоністів.

Однією з найважливіших є проблема ендокринної регуляції водно-сольового гомеостазу. Мінеральний гомеостаз є запорукою життєдіяльності багатоклітинних організмів. Зміни кількості води в організмі та порушення спів-відношення солей в плазмі крові призводить до важких наслідків, часто несумісних із життям. Одним із головних центрів регуляції гомеостазу є кора надниркових залоз, клітини якої секретують альдостерон – життєво важливий гормон, що посилює виведення з організму К+ і затримку Na+. Утворення цього гормону регулюється складною, недостатньо вивченою, системою чинників, одним із яких є іони К+.

Донедавна вважалося, що основними агоністами, які регулюють утворення альдостерону, є ангіотензин ІІ (АІІ) та кортикотропін [Gallo-Payet, Payet, 2003; Mulrow, 1999]. Проте, дослідження 80-х та першої половини 90-х років XX ст. показали, що в регуляції стероїдогенезу беруть участь численні модулятори, функція та механізм дії яких значно менше вивчені, порівняно з АІІ та АКТГ. Незважаючи на те, що вплив іонів калію щодо синтезу альдостерону був встановлений ще в 60-х роках минулого сторіччя, механізми його дії вивчені недостатньо. Залишається незрозумілим значення різноманітних калієвих іонних каналів в опосередкуванні ефектів К+ щодо стероїдогенезу. Хоча участь Са2+ та кальцієвих каналів у цих ефектах була доведена, до цього часу нез’ясований конкретний механізм передачі регуляторного сигналу К+, роль Са2+, що надходять через канали Т- та L-типу, позаклітинної концентрації іона, не визначений напрямок руху іона. Практично не вивчалося значення білкового синтезу в К+–залежній регуляції альдостерону, в той час, як у випадку АІІ та, особливо, АКТГ це питання глибоко і всебічно досліджено.

Погляди на участь месенджерних систем в регуляції стероїдогенезу калієм також значною мірою розходяться. Хоча є докази на користь участі Са2+/кальмодулінової системи [Condon et al., 2002; Gambaryan et al., 2003; Ganguly et al., 1995]., деякі дослідники вважають основною месенджерною системою, що опосередковує ефект К+, каскад цАМФ/ПКА [Tait, Tait, 1999].

До цього часу зусилля дослідників були зосереджені на механізмах стимуляції іонами К+ біосинтезу альдостерону. В той же час, процеси гальмування стероїдогенезу при зниженні вмісту іона в плазмі крові, біохімічні механізми цих процесів залишаються практично недослідженими. Актуальність вивчення цієї проблеми пов’язана з існуванням патологій, що супроводжуються зниженням рівня калію в крові. Вивчення механізмів регуляції секреції альдостерону К+ має важливе значення і для розробки терапевтичних підходів при лікуванні хвороб, пов’язаних із серцево-судинною системою. З регуляцією вмісту К+ в плазмі крові та секреції альдостерону прямо пов’язані порушення тонусу судин організму, що призводить до гіпертензії. Актуальною є проблема пухлин кори надниркових залоз, що продукують гормони, альдостером. Неконтрольована продукція гормонів обумовлює глибокі порушення обміну речовин. Але ні причини, ні патогенетичні механізми розвитку гіперальдостеронізму при альдостеромах практично не досліджені.

Зв’язок дисертаційної роботи з науковими програмами та темами. Робота виконувалась у відділі патофізіології ендокринної системи Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України згідно з планом науково-дослідної роботи відділу за загальним напрямом: Аналіз біохімічних механізмів перенесення регуляторних сигналів у клітинах кори надниркових залоз тварин та пухлин надниркових залоз людини (1986-2004). Номери держреєстрації тем: 1986-1990 – 01.86.0028685; 1990-1992 – 019.0.000.3796; 1991-1995 – 01910047859; 1992-1994 – UA01003067Р та UA01003076Р; 1994 – 1995 – 0194 U017385; 1995-1997 – 0195 U006848; 1998-2000 – 0198 U001283; 2001-2004 – 0101 U000618.

Мета роботи. Вивчити роль К+ в регуляції стероїдогенезу, метаболічних та апоптичних процесів у клітинах кори надниркових залоз людини і лабораторних тварин. Охарактеризувати основні механізми передачі та посилення регуляторного сигналу іонів калію всередині адренокортикоцита, впливу на ці процеси деяких модуляторів.

Основні завдання дослідження.

1. Вивчити вплив різних концентрацій К+ на стероїдогенез в корі надниркових залоз людини та тварин.

2. Вивчити вплив різних концентрацій К+ на фундаментальні метаболічні процеси – біосинтез білка, РНК та ДНК.

3. Визначити шляхи передачі регуляторного сигналу К+ в адренокортикоцитах та охарактеризувати основні етапи і механізми такої передачі.

4. Вивчити роль деяких природних та штучних модуляторів функції надниркових залоз (дигідропіридини, о,п’-ДДД, Li+, N-ацилетаноламіни) на залежні від К+ процеси регуляції стероїдогенезу та метаболізму.

5. Дослідити вплив К+ та деяких модуляторів на апоптичні процеси в корі надниркових залоз морських свинок, умовно нормальній та пухлинній адренокортикальній тканині людини.

Об’єкт дослідження: біохімічні процеси в адренокортикоцитах, які забезпечують регуляцію стероїдогенезу, їх зміни в умовах активації та пригнічення функції залози.

Предмет дослідження: регуляція стероїдогенезу та метаболічних процесів в корі надниркових залоз іонами К+ та деякими природними і штучними модуляторами.

Методи дослідження: біохімічні, молекулярно-біологічні, статистичні.

Наукова новизна досліджень. В дисертаційній роботі вперше:

1. Запропоновано концепцію, що характеризує значення іонів К+ в регуляції стероїдогенезу та підтриманні фізіологічного рівня іонів калію в плазмі крові. Сформульовано новий погляд на сукупність сигнальних механізмів, що опосередковують ефекти К+, АІІ та АКТГ в адренокортикоцитах.

2. Продемонстровано вплив К+ на розпад поліфосфоінозитидів, утворення інозитолфосфатів та показана роль внутрішньоклітинного, депонованого Са2+ в регуляції стероїдогенезу іонами калію.

3. Доведена участь протеїнкінази С в опосередкуванні дії К+ на стероїдогенез.

4. Вивчено значення білкового синтезу в реалізації ефекту іонів калію щодо стероїдогенезу.

5. Вивчений вплив К+ на мічення ДНК, сумарної РНК та РНК цитоплазматичних рибонуклеопротеїдів, синтез яких є основою трофічних, проліферативних процесів у тканині кори надниркових залоз.

7. Встановлено факт стимуляції іонами К+ залежного від Са2+ та кальмодуліну фосфорилювання білку, який за своєю масою (37-38 кДа) близький до StAR.

8. Вивчено фосфорилювання білків у різних компартментах адренокортикоцитів під впливом К+ та визначено роль різних кіназних систем у цих процесах.

9. Охарактеризований модулюючий вплив Li+, о,п’-ДДД, NAE та ДГП на залежні від К+ метаболічні процеси та стероїдогенез. Вивчений вплив К+ та деяких модуляторів (ДГП, NAE) на мічення основних глюкокортикоїдів.

10. Виявлені гальмівні процеси, що відбуваються в клітинах кори надниркових залоз при зниженому, порівняно з фізіологічним, вмістом К+ в середовищі.

11. Продемонстровані зміни в апоптичній фрагментації ДНК в умовно нормальній та пухлинній тканинах кори надниркової залози людини при підвищенні концентрації К+.

Науково-практичне значення роботи. Одержані в роботі дані дозволяють стверджувати, що іони К+ і кора надниркових залоз утворюють ефективну регуляторну систему зі зворотним зв’язком. Функціонування цієї системи забезпечує нормальний іонний гомеостаз. Встановлені найважливіші молекулярні механізми роботи такої системи. Вивчення тонких механізмів регуляції біосинтезу альдостерону іонами калію, крім теоретичного, має і суто практичне значення, як фундамент для розробки терапевтичних засобів при лікуванні різноманітних захворювань надниркової залози, гіпертензії, хвороб серцево-судинної системи.

1. Результати досліджень щодо взаємного впливу NАЕ і К+ на утворення альдостерону можуть бути використані для розробки гіпотензивних препаратів на базі природних, не токсичних для організму сполук.

2. Дані щодо модулюючого впливу ДГП на утворення альдостерону можуть бути використані в експериментальних моделях, а новосинтезований препарат ДГП-51 може бути рекомендований до клінічних досліджень, як імовірний гіпотензивний та антиаритмічний препарат.

3. Результати досліджень дії о,п’-ДДД на стероїдогенез та метаболічні процеси в корі надниркових залоз можуть стати основою для пошуків способів подолання стійкості пухлин до цього препарату, посилення його ефективності.

4. Оскільки препарати літію використовуються для лікування депресивних станів людини, дані щодо ефектів літію на стероїдогенез та інші важливі метаболічні процеси в адренокортикоцитах слід враховувати для подолання можливих побічних ефектів препаратів літію.

5. Факт вибіркового посилення апоптозу в умовно нормальній тканині, поряд з деяким пригніченням фрагментації ДНК в пухлинній тканині, при підвищенні концентрації іонів калію повинен враховуватись при лікуванні пухлин надниркових залоз хіміотерапевтичними методами.

Особистий внесок здобувача. Всі результати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі. Представлена дисертація є завершеним дослідженням, виконаним автором відповідно до програми наукових робіт, проведених протягом 1985 – 2004 років. Дисертант особисто обґрунтував концепцію роботи, підібрав методи досліджень, здійснив пошук та аналіз даних наукової літератури з питань, що вивчалися, сформулював основні положення та висновки. Робота виконана у межах держбюджетних тематик, які виконувалися у відділі патофізіології ендокринної системи Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України. Співучасть співробітників відділу патофізіології ендокринної системи та співробітників інших відділів Інституту відображена у спільних публікаціях.

Апробація результатів досліджень. Основні положення роботи були представлені на: IV (Київ, 1987), V (Київ, 1994) та VІ (Київ, 2001) Українських ендокринологічних з’їздах; V (Київ, 1987), VI (Київ, 1992), VII (Київ, 1997), VIII (Чернівці, 2002) Українських біохімічних з’їздах; ІІІ Всесоюзному з’їзді ендокринологів (Ташкент, 1989); Міжнародній конференції „Modern problems of physico-chemical biology and biotechnology” (Alma-Ata, 1989); XIII з'iзді Українського фiзiологічного товариства iм. I.П.Павлова (Київ, 1990); ІІ Всеросійському з’їзді ендокринологів (Челябинск, 1991); 9-му Міжнародному ендокринологічному конгресі (Nice, 1992); ІІІ Європейському ендокринологічному конгресі (Amsterdam, 1994); інститутських та лабораторних конференціях.

Публікації. Згідно з темою дисертації опубліковано 46 робіт, з яких 28 статей - у фахових наукових журналах та збірниках, 18 – тези доповідей у матеріалах наукових зібрань.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, методичної частини, результатів досліджень, викладених у 3 розділах, аналізу і узагальнення одержаних даних, висновків та списку процитованої літератури. Обсяг дисертації 329 стор., ілюстрацій - 98, таблиць - 8, список використаних джерел складає 602 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Дані дисертаційної роботи базуються на експериментах, проведених на надниркових залозах 720 тварин (морські свинки, собаки, новонароджені поросята) та наднирковій тканині 62 хворих. У роботі використовували післяопераційну тканину надниркових залоз людини, яку одержували з хірургічного відділення Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України. Досліджували пухлини (альдостерома, феохромоцитома, аденома, адренокарцинома, фіброма, тканина хворих Іценка-Кушінга) та тканини, що межують з ними. Такі ділянки тканини, що зберігають візуально нормальну будову, позначені в роботі як „умовно нормальна тканина” (УНТ). На проведення досліджень був одержаний дозвіл етичного комітету Інституту.

Зрізи та клітини інкубувались у буфері для інкубації (БІ), що містив 130 мМ NaCl; 1,27 мМ MgSO4; 1,8 мМ CaCl2; 10 мМ Na2HPO4; 1 мМ KH2PO4; 20 мМ HEPES, рН 7,4; БСА (2 мг/мл) при 37 оС протягом вказаного у конкретному досліді часу при легкому струшуванні.

Визначення альдостерону і циклічних нуклеотидів. Альдостерон визначали у гомогенаті за допомогою радіоімунологічних наборів AldoCTK-2 або SB-Aldo-H фірми „Sorin Biomedica” (Італія), згідно з методикою, що рекомендована фірмою. Вміст цАMФ та цГMФ визначали за допомогою радіоімунологічних наборів відповідно TRK 432 та TRK 500 фірми „Amersham Life Science” (Велика Британія) за методикою, що рекомендована фірмою.

Досліди з радіоактивною міткою. На пробу (1 мл) вносили 2,5 МБк 3H-холестерину або 0,01 МБк 14C-кортикостерону, 0,2-0,8 MБк 3H-лейцину, 0,04-0,2 МБк/мл зH-урідину, 0,04 МБк/мл 3Н-тимідину, 0,02 МБк/мл г-32Р-АТФ, 0,05 МБк/мл г-33Р-АТФ, 0,1 МБк/мл неорганічного 32Р. Для одержання радіоавтографів білків, мічених по вуглецю, зрізи (біля 10 мг) або клітини (5 х 104 – 2 х 106/мл) кори надниркових залоз інкубували протягом 20 хв з 14С-амінокислотами (0,1 МБк/мл). Для отримання радіоавтографів білків, помічених фосфором, зрізи інкубували протягом 20 хв, гомогенізували в 1 мл буферу для інкубації, і гомогенат інкубували з 0,4 МБк/мл г-32Р-АТФ або 0,5 МБк/мл г-33Р-АТФ протягом 10 хв. Потім проводили електрофорез білка по Леммлі [Laemmly, 1970]. Висушені гелі експонували на плівці „Hyperfilm MP” („Amersham Life Science”) та сканували за допомогою лазерного денситометра.

Задля мічення внутрішньоклітинного пулу, стероїдні попередники передінкубували з тканиною 30 хв при 37 0С, після чого в середовище вносили необхідні добавки, і інкубація продовжувалась ще 25 хв. Для вивчення транспорту міченого кальцію, дисперговані адренокортикоцити (8-11 х 106) передінкубували протягом 30 хв при 37 оС з 0,02-0,12 МБк/мл 45Са2+ для насичення клітин радіоактивним кальцієм. Потім клітини розділяли на декілька проб, в дослідні проби додавали чинники, що вивчались. Після закінчення інкубації вміст проб переносили на фільтри GF/C (Whatman, Велика Британія), тричі промивали буфером для інкубації, що містив 5 мМ Са2+, і вимірювали радіоактивність клітин.

Для вимірювання радіоактивності білків, РНК, ДНК, їх осаджували 7 % ТХО, переносили на фільтри GF/C, які промивали розчином 7 % ТХО, етанолом, після чого визначали радіоактивність фільтрів у стандартному толуольному сцинтиляторі в лічильнику радіоактивності Beckman LS 5000ТА. В аліквотах суспензій визначали білок [Bradford, 1976] і розраховували питому радіоактивність. Мічення, екстракція і хроматографічне розділення фосфоліпідів, що містять інозитол, та їх похідних описано в роботі Пушкарьова та співав. [Пушкарьов та ін., 2005]

Одержання субклітинних фракцій. Зрізи кори надниркових залоз після інкубації, гомогенізували в гомогенізаторі з тефлоновим товкачиком в буфері (2 °С), який містив 0,25 М сахарози, 25 мМ трис-HCl (рН 7,4), 3 мМ MgCl2, 2 мМ ЕГТА, 0,1 мМ спермідину, 0,1% тритону Х-100, 0,1 мМ ФМСФ. Гомогенат, після осадження дебрісу і ядер, центрифугували при 10000 g протягом 10 хв і отримували мітохондріальну фракцію. Одержаний супернатант нашаровували на 0,8 мл 0,5 М розчину сахарози і центрифугували при 105000 g протягом 60 хв для отримання цитозольної фракції та осаду мікросом. Ядра осаджували з гомогенату при 1000 g протягом 10 хв і надалі очищували за методом, описаним у роботі Buckley і співавт. [Buckley et al., 1988].

Виділення та аналіз рибонуклеопротеїдів. РНП виділяли, як описано раніше [Пушкарев, 1983]. Плавучу густину РНП визначали в градієнті густини CsCl 1.3 - 1.6 г/см3 за методом Овчинникова [Овчинников и др., 1975]. Седиментаційні властивості РНП, оброблених ЕДТА для дисоціації рибосом, вивчали за допомогою лінійного градієнту сахарози 15-40 %.

Виділення та аналіз ДНК. Тканину гомогенізували в буфері, що містив 10 мМ трис-HCl (pН 7,5), 10 мМ ЕДТА, 0,1 М NaCl і послідовно інкубували з протеїназою К та РНКазою. Потім додавали NaCl до концентрації 0,5 М, і препарат депротеїнізували сумішшю хлороформ : ізоаміловий спирт (24 : 1). ДНК осаджували з водної фази етанолом протягом ночі при -18 оС. Осад підсушували і розчиняли в буфері для гомогенізації без NaCl (ТЕ-буфер).

Дослідження апоптичної фрагментації ДНК. Тканину надниркових залоз інкубували протягом 3 годин при 37 0С в 1 мл БІ. У проби додавали KCl, LiCl, о,п’-ДДД, та інші чинники. Після 3 годин інкубації проби швидко охолоджували, гомогенізували, виділяли ДНК і аналізували її в 2,25 % агарозному гелі.

Детекція ПКСб та каспаз методом імуноблотингу. Білки, розділені методом електрофорезу, переносили на нітроцелюлозну мембрану напівсухим способом. Мембрани блокували у буфері TBS-T (50 мМ Трис-HCl 0,2 М NaCl, рН 7,5), з 5% лактальбуміну та 0,1% Tween 20, протягом 1 год при кімнатній температурі. Потім промиту у TBS-T мембрану інкубували у розчині первинних антитіл протягом 1 год. Комплекси антиген-антитіло виявляли після інкубації мембрани з вторинними антитілами, міченими пероксидазою, протягом ще 1 год. Візуалізацію здійснювали за допомогою набору ECL™.

Визначення активності ПКС та ПКА. Активність ПКА визначали за методикою, що базується на зміні напрямку руху в агарозному гелі субстрату кемптиду внаслідок його фосфорилювання кіназою [Кеmp et al., 1977]. Активність ПКС визначали за включенням фосфатної мітки в гістони [Pushkarev, Mikosha, 1991] та по міграції нейрограніну, пептидного субстрату ПКС, в агарозному гелі [Uchida et al., 2000].

Тонкошарова хроматографія. Стероїди розділяли за допомогою методу двовимірної тонкошарової хроматографії на силікагелі КСК або на пластинах Silufol UV254 [Челнакова и др., 1990].

Матеріали. Усі солі, HCl, NaOH (кваліфікації о.с.ч.), тритон Х-100, формальдегід фірми „Merk” (ФРН); БСА, цитохалазин В, колхіцин, гепарін, SDS, ТЕА, ЕГТА, ЕДТА, ФМСФ - фірми „Serva” (ФРН); Агароза, трис – фірми „Sigma” (США); HEPES, ЦГИ, гістони, 2-меркаптоетанол, сахароза - „Bio-Rad” (США); Коллагеназа – „Fluka” (Швейцарія); CsCl – „Koch-Light” (Велика Британія); о,п’-ДДД був синтезований Я.Г.Бальоном в лабораторії органічного синтезу та хімреактивів Інституту ендокринології і обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України. Препарат суміші N-ацилетаноламінів був синтезований в лабораторії В.Е.Васьковського (Інститут біології моря РАН, Владивосток, Росія). Усі розчинники додатково очищували перегонкою.

Ізотопи. 3H-холестерин,14С-кортикостерон, 3Н-інозитол - „Amersham Life Science”. 45Са2+, 32P, 32P-ATФ і 33P-ATФ – „Ізотоп”; 14С-гідролізат білку (Чехія).

Статистичну обробку даних проводили із застосуванням t-критерію Стьюдента, дисперсійного аналізу з наступною оцінкою вірогідності відмін за критерієм Фішера (F), регресійного аналізу [Плохинский, 1980], а також за непараметричним тестом U Вілкоксона [Гублер, Генкин, 1969]. Вірогідній ефекти іонів калію, інгібіторів, іонофорів та модуляторів позначаються на рисунках зірочкою, або хрестиком.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив К+ на стероїдогенез. Роль іонних каналів. Внаслідок особливої чутливості клітин кори надниркових залоз до калію [Spat, 2004] навіть незначне підвищення концентрації К+ в інкубаційному середовищі спричиняє відчутні зміни у швидкості біосинтезу альдостерону в тканині надниркових залоз морських свинок (рис.1А). Максимум синтезу гормону спостерігається в діапазоні концентрацій калію від 5 до 9 мМ, і при подальшому зростанні вмісту іона в середовищі, зазвичай знижується. Останній факт свідчить про те, що клітини кори надниркових залоз реагують посиленням стероїдогенезу на динаміку змін концентрації К+ тільки в досить вузьких межах концентрацій, в яких реально може коливатися вміст іона в живому організмі. Очевидно, в основі регуляторної дії калію лежать не тільки електрофізіологічні явища, пов’язані з деполяризацією клітинної мембрани, а й інші, більш складні процеси, які ініціюються тільки в певних концентраційних межах іона. З рис. 1Б видно, що включення мітки зН-холестерину в альдостерон, як і кількість останнього (рис. 1А), вірогідно зростає при підвищенні концентрації К+. Важливо відмітити той факт, що при низькому вмісті іона в інкубаційному середовищі швидкість мічення альдостерону вірогідно знижується. Це вказує на можливість існування гальмівних механізмів щодо стероїдогенезу при концентраціях калію, нижчих від фізіологічного (3-4 мМ) рівня іона в плазмі крові.

Щоб визначити значення транспорту іонів калію через клітинну мембрану в К+-залежній регуляції стероїдогенезу, були проведені досліди з використанням ряду блокаторів калієвих каналів та сполук, що полегшують транспорт іона (іонофорів К+). Відомо, що в транспортуванні катіонів через мембрану проти градієнта концентрації важливу роль відіграє Na+/K+-ATФаза. На рис. 2А представлені дані досліду щодо вивчення впливу строфантину К на залежний від калію біосинтез альдостерону в корі надниркових залоз. Рівень утворення гормону у присутності інгібітора Na+/K+-ATФази був дещо вищим. Очевидно, цей фермент не відіграє ключової ролі в регуляції стероїдогенезу, хоча його модулюючий вплив цілком імовірний. Іони Сs+, які є інгібітором калієвих каналів, в наших дослідах помітно пригнічували утворення альдостерону (рис. 2Б). Інший інгібітор К+ каналів, апамін, пригнічував синтез альдостерону та кортизону меншою мірою. Іонофор К+, валіноміцин, посилював стероїдогенез при низьких концентраціях іона і пригнічував при високих, що підкреслює факт стимуляції синтезу альдостерону тільки певними концентраціями іона.

Наявні дані не дають можливості однозначно оцінити значення транспорту іонів калію через клітинну мембрану для регуляції стероїдогенезу. Деякі інгібітори каналів стимулюють стероїдогенез, інші, навпаки, його пригнічують. Це, напевно, пояснюється існуванням у мембранах адренокортикоцитів калієвих каналів кількох типів [Matsunaga et al., 1987; Spat, Hunyady, 2004; Vassilev et al., 1992], які відрізняються як за своїми електрофізіологічними та фармакологічними показниками, так і за своїм значенням в регуляції стероїдогенезу.

Багато які процеси трансдукції сигналів в клітинах залежать від Са2+. Тому ми досліджували можливу участь Са2+ в регуляції К+ стероїдогенезу. Підви-

щення концентрації калію в середовищі до 8 мМ призводить до швидкого зростання кількості 45Са2+ в адренокортикоцитах (рис. 3). Інгібітор кальцієвих каналів - лантан пригнічує активований калієм стероїдогенез (рис. 4), що підтверджують і дані літератури. Пригнічення транспорту іона в адренокортикоцити спостерігалось також в присутності ДГП. Інший інгібітор кальцієвих каналів - Ni2+, на відміну від лантану, підвищував швидкість включення мітки холестерину в альдостерон. Стимуляція іонами нікелю секреції альдостерону спостерігалася також при дії ангіотензину [Spat et al., 1990]. Цікаво, що посилення стероїдогенезу спостерігалось також у присутності ЕГТА – хелатора Са2+ [Kigoshi et al., 1997]. В наших дослідах ЕГТА посилював біосинтез альдостерону при знижених концентраціях калію, але пригнічував його при високих.

Ці дані підкреслюють факт існування кількох типів кальцієвих каналів з різними функціями. Кальцій, що потрапив в адренокортикоцити, може мати різне походження (транспорт через певні типи каналів, звільнення з внутрішньоклітинних депо) і неоднакове значення в регуляції стероїдогенезу. Очевидно, для передачі регуляторного сигналу К+ потрібні, по-перше, оптимальні концентрації Са2+, а, по-друге, зосередження кальцію в певних компартментах, пов’язаних з мітохондріями [Cherradi et al., 1996; Python et al., 1995; Rossier et

al., 1998]. Автори підкреслюють можливість проникнення іона в мітохондрії, а також ймовірність безпосереднього впливу Са2+ на транспорт холестерину до внутрішньої мембрани мітохондрій. Недавно була запропонована модель транспортування Са2+ в мітохондрії через люмени ендоплазматичного ретикулюму [Lalevee et al., 2003; Rossier et al., 1998]. У формуванні такого кальцієвого «трубопроводу», що зв’язує клітинну мембрану з мітохондріальною, беруть участь елементи цитоскелету. Можливо, саме цим пояснюється пригнічення К+-залежного стероїдогенезу у присутності сполук, що дестабілізують мікротрубочки та мікрофіламенти [Пушкарьов, Костюченко, 2003].

Значення білкового синтезу в К+-залежній регуляції стероїдогенезу. Білковий синтез є одним із основних метаболічних процесів. В регуляцію швидкості стероїдогенезу в корі надниркових залоз можуть бути залучені як регулятор-ні білки (гостра відповідь на дію агоніста), так і ферменти, що беруть участь у багатоступінчастому процесі утворення альдостерону з холестерину.

Іони калію посилюють включення мітки зН-лейцину в білки кори надниркових залоз в концентраціях, вищих та нижчих від фізіологічної (рис. 5). Посилення мічення білків при низьких концентраціях калію, можливо, відображає активацію якихось гальмівних процесів щодо утворення альдостерону, рівень мічення якого знижується при цих концентраціях іона (рис. 1Б). Вивчення кінетики включення мітки в білки тканини надниркової залози показало, що починаючи з 15-ї хвилини різниця між міченням при концентрації 3 та 11 мМ калію стає значущою. Імпульсне мічення полірибосом та ультрацентрифугування їх в градієнті густини CsCl показало, що включення Н3-лейцину відбувається саме внаслідок трансляції.

Для визначення ролі білкового синтезу в утворенні альдостерону, вивчали вплив інгібітора трансляції циглогексиміду (ЦГИ) на мічення кортикостероїдів. ЦГИ знімає ефект підвищених концентрацій калію щодо мічення стероїдів. Оскільки ЦГИ може здійснювати вплив на стероїдогенез безпосередньо, був поставлений дослід з аналогом аргініну, канаваніном, включення якого в білки призводить до порушення їх функцій, але не впливає на інші процеси в клітині [Krueger, Orme-Johnson, 1988]. Канаванін повністю знімав стимульований калієм біосинтез альдостерону, але підвищував рівень секреції гормону при низьких концентраціях іона (рис. 6). Останній факт вказує на необхідність білкового синтезу для гальмівних процесів щодо гормонопоезу в адренокортикоцитах. Інгібітор РНК-полімерази II - б-аманітин також пригнічував секрецію альдостерону при високих, стимулюючих стероїдогенез концентраціях К+. Можливо, це пов’язано з транскрипцією мРНК і подальшим синтезом лабільного білка-регулятора (StAR), який транспортує холестерин на внутрішню мембрану мітохондрій, де він стає доступним для цитохрому Р450scc. Про це свідчать і дані дослідів з іншим інгібітором транскрипції, актиноміцином Д, одержані на клітинах Лейдига [Clark et al., 1997].

Отже, активність білок-синтетичного апарату адренокортикоцитів є необхідною умовою для стимуляції утворення альдостерону та інших кортикостероїдів під впливом підвищених концентрацій калію. К+, крім гострого ефекту щодо стероїдогенезу, може, особливо при тривалій дії іону, впливати на такі фундаментальні метаболічні процеси, як транскрипція та реплікація. Дослідження, проведені на початку 90-х років та останнім часом, показали посилення іонами калію експресії ряду генів, продукти яких беруть участь у стероїдогенезі [Tremblay et al., 1991; 1992]. Причому, калій стимулює не тільки експресію мРНК, але й її трансляцію, про що свідчить збільшення кількості білкових продуктів цих генів. Показана, зокрема, стимуляція гена CYP11B2, який кодує альдостеронсинтазу [Muller, 1995, 1998], а також посилення транскрипції мРНК чинника NURR1, який, в свою чергу, активує експресію hCYP11B2 [Bassett et al., 2004]. Цікаво, що стимуляція транскрипції ряду генів контролюється і К+, і системою ренін-ангіотензин, в той час, як регуляція транскрипції гену, що кодує Р450scc, здійснюється виключно К+ [Tremblay, Lehoux,1992].

Месенджерні механізми, що опосередковують ефекти К+ в адренокортикоцитах. Аналіз літератури свідчить про недостатню вивченість та суперечливість даних щодо внутрішньоклітинних механізмів передачі та посилення регуляторного сигналу К+, розуміння яких є необхідним для створення цілісної картини механізмів регуляції утворення мінералокортикоїдів. Процеси регуляції синтезу мінералокортикоїдів іонами калію досліджені значно гірше, порівняно з іншими агоністами. Вважається, що основною ланкою в опосередкуванні ефектів калію в клітинах клубочкової зони надниркових залоз є система, ядром якої є Са2+/кальмодулін-залежна протеїнкіназа [Ganguly et al., 1992; Condon et al., 2002]. Накопичені, однак, дані, що вказують на участь системи цАМФ-залежної протеїнкінази в реалізації цих ефектів [Tait, Tait, 1999]. З іншого боку, К+, так само, як і ангіотензин, викликає прискорення транспорту кальцію в клітину та активацію протеїнкінази С [Betancourt-Calle et al., 2001].

Щоб оцінити можливу роль цАМФ/ПКА в опосередкуванні стероїдогенного ефекту К+ в клітинах надниркових залоз морських свинок, визначали вміст нуклеотида в залежності від концентрації калію в інкубаційному середовищі. З рис. 7, крива 1 видно, що по мірі росту концентрації К+ кількість цАМФ в тканині надниркової залози поступово зростає. У присутності хелатора кальцієвих іонів, ЕГТА (крива 2), кількість цАМФ була помітно вищою від контрольних значень при цих же концентраціях К+. Ефект ЕГТА щодо вмісту цАМФ легко пояснити пригніченням Са2+-залежної фосфодіестерази [Tremblay et al., 1988]. В той же час, ЕГТА підвищував тільки базальний рівень альдостерону та утворення гормону при знижених концентраціях К+, повністю знімаючи ефект високих концентрацій іона. Визначення активності ПКА в мікросомальній фракції показало, що калій активує цю кіназу (рис. 8). Крім того, у присутності інгібітора ПКА фосфорилювання білків при 5,5 мМ К+ в надниркових залозах морських свинок вірогідно зменшувалося. Ці дані свідчать про можливу участь ПКА у посиленні регуляторного сигналу К+ в адренокортикоцитах морських свинок. При концентрації калію в середовищі, нижчій від фізіологічної (3,5 мМ), активність ПКА знижується (рис. 8).

Той факт, що на тлі високого рівня цАМФ у присутності ЕГТА при підвищених концентраціях К+ спостерігається пригнічення синтезу альдостерону, свідчить, що месенджерна система цАМФ/ПКА не відіграє ключової ролі в опосередкуванні ефекту К+ в адренокортикоцитах. Можливо, цей каскад здійснює модулюючий вплив на залежний від К+ стероїдогенез, або, що імовірніше, опосередковує трофічні ефекти К+, особливо при тривалій дії іона.

Щоб визначити роль Са2+/кальмодулін-залежних процесів у регуляції біосинтезу альдостерону іонами К+ в корі надниркових залоз, проводили досліди з інгібітором кальмодуліну хлорпромазином. Як видно з рис. 9, передінкубація тканини хлорпромазином знижує стимульований калієм біосинтез гормону, починаючи з 5 мМ К+. Утворення альдостерону дещо підвищується у присутності інгібітора при низьких концентраціях іонів калію. Хлорпромазин також пригнічував К+-залежне фосфорилювання клітинних білків та білків, масою близько 75 кДа, в мітохондріях, і близько 40 кДа - в цитозолі.

Дані літератури щодо участі ПКС в К+–залежній регуляції стероїдогенезу дуже суперечливі. Спочатку вважалося, що К+ взагалі не впливає на активність цієї кінази [Lang, Vallotton, 1987; Nakano et al., 1990], потім факт активації був стверджений, але пов’язували це з пригніченням стероїдогенезу [Hajnoczky et al., 1992]. Останнім часом одержані нові дані, які свідчать про участь ПКС в опосередкуванні ефекту К+ в адренокортикоцитах [Betancourt-Calle et al., 2001]. Нами одержані дані, які вказують на участь внутрішньоклітинного депонованого кальцію, фосфоліпідів, що містять інозитом, та пов’язаної з ними активації ПКС, в посиленні регуляторних сигналів іонів К+ [Pushkarev, Mikosha, 1991].

На рис. 10 представлені результати вивчення впливу різних концентрацій іонів калію на вміст мічених 3Н-інозитолом поліфосфоінозитидів в клітинах надниркових залоз людини у присутності іонів літію, який пригнічує фосфатазу інозитол-фосфату і, таким чином, гальмує процес ресинтезу поліфосфоінозитидів. Кількість мічених фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату, фосфатидилінозитол-4-фосфату та фосфатидил-інозитолу при підвищеній концентрації іонів калію (8,5 мМ) помітно зменшується вже на першій хвилині інкубації (рис. 10, криві 1’ – 3’). При концентрації калію 3,5 мМ рівень ФІ та поліфосфоінозитидів протягом 20 хв інкубації майже не змінювався (рис. 10, криві 1 – 3). Розділення інозитолфосфатів на колонці з аніонообмінником показало, що через 20 хв інкубації клітин при підвищеній концентрації іонів калію (8,5 мМ) в середовищі відбувається накопичення інозитолмоно-, ди- і трифосфатів.

Відомо, що дія ангіотензину опосередковується розпадом поліфосфоінозитидів та підвищенням концентрації Са2+ в клітині, як за рахунок транспорту з позаклітинного середовища, так і в результаті звільнення з внутрішньоклітинного депо [Aptel et al., 1999; Rossier et al., 1997]. Однак, дослідження впливу калію на мобілізацію іонів кальцію з внутрішньоклітинних депо дало негативний результат [Kojima et al., 1985; Nakano et al., 1990]. Як вже згадувалось (рис. 3), додавання в інкубаційне середовище КСІ підсилює вхід кальцію в адрено-кортикальні клітини. Попередня інкубація клітин з рутенієвим червоним, який блокує вивільнення іонів кальцію з внутрішньоклітинного пулу [Antoniu et al., 1985], при підвищеній концентрації К+ (8 мМ) знижувала транспорт Са2+ до рівня, що спостерігався у присутності 3 мМ К+ (точка 0 хв). Отримані дані добре узгоджуються з моделлю Putney, згідно з якою швидкість надходження Са2+ у клітину із позаклітинного простору визначається швидкістю вивільнення іону із внутрішньоклітинних депо [Putney, 1986]. У присутності рутенієвого червоного знижувався до базального рівня і стимульований калієм синтез альдостерону. Отже, дія іонів калію, як і ангіотензину, потребує вивільнення кальцію з внутрішньоклітинних депо. Оскільки вивільнення внутрішньоклітинного кальцію у клітині відбувається внаслідок агоніст-залежного утворення інозитолтрифосфату, цей факт можна розглядати, як ще одне підтвердження участі поліфосфоінозитидів у реалізації ефектів іонів калію в адренокортикоцитах.

Зміни рівня інозитолфосфатів та поліфосфоінозитидів внаслідок інкубації тканини у середовищі з різним вмістом іонів К+ вказують на можливу участь ПКС в опосередкуванні регуляторних сигналів іону в адренокортикоцитах людини. Розподіл ізоформи ПКСб в субклітинних фракціях, одержаних з умовно нормальної тканини надниркових залоз людини, після інкубації зрізів у середовищі з різним вмістом К+, вивчали за допомогою імуноблотингу. Встановлено, що кількість ферменту зростає в мікросомах і знижується в цитозолі при підвищенні концентрації К+ до 8,5 мМ (рис. 11). Таке накопичення ПКСб у мембранній фракції (її транслокація) свідчить про активацію ферменту. Щоб переконатися у цьому, визначали активність ПКС в цитозолі і мікросомах, одержа-

них з надниркових залоз людини (УНТ). Максимальна активність фермента в УНТ також спостерігається при концентрації калію 8,5 мМ. Цікаво відмітити, що після інкубації зрізів у середовищі без калію, активність ПКС в мікросомах дещо знижується, порівняно з активністю при фізіологічній (3,5 мМ) концентрації К+. Можливо, цей факт якось пов’язаний з гальмуванням синтезу альдостерону при низьких концентраціях калію. Оскільки УНТ людей із хворобою Іценка-Кушинга могла нести певний відбиток хвороби і не відображати повною мірою характер процесу в нормальній тканині, був поставлений ряд дослідів на надниркових залозах морських свинок. При цьому, для встановлення залежності процесу активації ПКС від обміну фосфоінозитидів та стану внутрішньоклітинного депо Са2+, в дослідах використовувались іони літію та барвник рутенієвий червоний. Активність ферменту визначали в безклітинній системі після інкубації тканини надниркової залози в середовищі з різним вмістом К+. З рис. 12 видно, що зі збільшенням концентрації калію в середовищі, активність ПКС в мікросомах значно зростає, досягаючи свого максимуму при 5-8 мМ іона. В той же час, активність ферменту в цитозолі майже не змінювалась, а при 8 мМ К+ навіть знижувалась, порівняно з контролем (1 мМ К+). Фракціонування білків мікросом та цитозолю на хроматографічній колонці з ДЕАЕ-целюлозою підтвердило факт транслокації ПКС з цитозолю в мікросоми. У присутності 10 мМ літію, інгібітора обміну фосфоліпідів, що містять інозитол, та блокатора кальцієвих внутрішньоклітинних депо, рутенієвого червоного, активність ПКС в мікросомах не змінювалась, залишаючись на низькому рівні. У присутності барвника знижується також стимульоване підвищеними концентраціями калію фосфорилювання білків [Pushkarev et al., 1991; Пушкарев, Тронько, 1992б]. Очевидно, для активації фермента іонами калію необхідно вивільнення кальцію з внутрішньоклітинного пулу. Пригнічення стимульованої К+ секреції альдостерону та кальцієвого сигналу у присутності рутенієвого червоного пізніше спостерігали і в ізольованих адренокортикоцитах щурів [Szabadkai et al., 1999]. Зважаючи на те, що в присутності рутенієвого червоного та інгібітора ПКС, стауроспорину, К+-залежний синтез альдостерону значною мірою пригнічується, можна дійти висновку, що активація цієї кінази є важливим етапом у залежній від К+ регуляції стероїдогенезу.

Визначення активності ПКС в ізольованих ядрах показало значне посилення її активності, що, можливо, пов’язано з фосфорилюванням транскрипційних чинників, а через них - посиленням експресії генів, продукти яких кодують ферменти стероїдогенезу та регуляторні білки.

Таким чином, активація ПКС спостерігається в надниркових залозах людини та морських свинок, які є близькими за спектром кортикостероїдних гормонів, що секретуються адренокортикоцитами. Така активація залежить від обміну поліфосфоінозитидів та мобілізації Са2+ з внутрішньоклітинних депо.

Останнім часом з’являються нові дані щодо участі інших месенджерних систем в регуляції біосинтезу альдостерону, в тому числі і цГМФ-залежної протеїнкінази [Gambaryan et al., 2003]. Ми вивчали вплив концентрації іонів калію в інкубаційному середовищі на вміст нуклеотиду в тканині надниркових залоз. Підвищення концентрації калію призводить до поступового зниження вмісту цГМФ у клітині. Не виключено, що гальмування мічення альдостерону при низьких концентраціях іонів калію пов’язано з високим рівнем цГМФ в адренокортикоцитах. Підтвердженням цього припущення може слугувати факт стимуляції утворення цГМФ інгібітором стероїдогенезу, атріальними натрійуретичними пептидами [Barrett, Isales, 1988].

Фосфорилювання і дефосфорилювання білків визначають направленість та інтенсивність багатьох біохімічних процесів, в тому числі і в надниркових залозах [Микоша, Тронько, 2004]. Як було показано вище, ефект підвищених концентрацій іонів калію в адренокортикоцитах реалізується за участю різних месенджерних систем. В результаті активації протеїнкіназ відбувається фосфорилювання та дефосфорилювання клітинних білків, що обумовлює фізіологічну відповідь клітини.

Викликане підвищенням концент-рації калію в середовищі посилення біосинтезу альдостерону (див. рис. 1А) супроводжується посиленням фосфори-лювання білків (рис. 13). Радіоавтограф поліпептидів мітохондрій і цитозолю, після їх розділення в поліакриламідному гелі, також свідчить про більш інтенсивне включення мітки в білки зрізів, передінкубованих у середовищі, що містить 8 мМ К+, порівняно зі зрізами, інкубованими з 3 мМ калію. При підвищенні рівня калію в середовищі, у мітохондріях найбільш інтенсивно мітиться білок з молекулярною масою близько 75 кДа та, меншою