НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна

КІШКО Тетяна Олегівна

УДК 616.438-008.931:577.152.-

02:[615.31:547.857.3]-092.9

РОЛЬ КСАНТИНОКСИДАЗНО-КСАНТИНДЕГІДРОГЕНАЗНОЇ СИСТЕМИ В МЕХАНІЗМІ ДІЇ КСЕНОБІОТИКІВ

03.00.04 – біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті екогігієни та токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

ДМИТРЕНКО Микола Петрович,

зав. лабораторії біохімії

Інституту екогігієни та токсикології ім.Л.І.Медведя.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

ВИНОГРАДОВА Руфіна Петрівна,

провідний науковий співробітник

Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України;

доктор біологічних наук, професор

МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна,

професор Київського національного університету

імені Тараса Шевченка.

Провідна установа - Інститут фармакології і токсикології АМН України,

відділ біохімічної фармакології, м. Київ.

Захист відбудеться “ 21_” жовтня 2002 року о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України за адресою: м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розісланий “_20_” вересня 2002 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Однією з центральних проблем біохімії є встановлення механізмів токсичної дії ксенобіотиків, зокрема таких поширених екологічних забруднювачів довкілля як оксиди азоту, нітрити, нітрати, канцерогенні нітрозаміни, тощо. Токсична дія хімічних сполук на організм реалізується через специфічні і загальні механізми (С.Н.Голиков и др., 1982). До загальних механізмів можна віднести біотрансформацію ксенобіотиків, продукти якої мають токсичні властивості, а також загибель клітин по типу апоптозу, який згідно з сучасними уявленнями, є генетично запрограмованим процесом (Cohen J.J., 1991, Hughes F.M.Jr. et al., 1998). Особливо високу здатність до апоптозу мають тимоцити. Одним з чинників, який може відігравати значну роль у виникненні і протіканні апоптозу, є оксид азоту (NO) (Fehsel K., et al., 1995). Оксид азоту як ендогенного, так і екзогенного походження в цитотоксичних дозах може викликати загибель клітин, а ряд ксенобіотиків здійснює свою токсичну дію в організмі, впливаючи на обмін NO (Houston M., et al., 1998).

Токсична дія ксенобіотиків опосередковується через ключові ферменти метаболізму. Серед них особливо важливу роль відіграють О2--залежна ксантиноксидаза (КсО)(КФ:1.2.3.2) та НАД-залежна ксантиндегідрогеназа (КсД)(КФ:1.2.11.37), які при певних умовах можуть переходити одна в одну. Ці ферменти виконують ключову роль у катаболізмі пуринів і каталізують такі реакції: гіпоксантин(ксантин)+О2+Н2О = сечова кислота+Н2О2+О2-; гіпоксантин(ксантин) + НАД+ = сечова кислота+НАДЧН. Саме ксантиноксидазна реакція є джерелом активних кисневмісних метаболітів, які мають сильну ушкоджуючу дію, і може відігравати визначальну роль в механізмі реалізації цитотоксичної дії хімічних сполук. (Ягнятинская А.М., 1985). КсД-КсО система разом з монооксигеназною системою бере участь у біотрансформації ксенобіотиків. Враховуючи, що токсичний вплив багатьох ксенобіотиків супроводжується розвитком гіпоксії, внаслідок якої посилюються катаболічні процеси, в тому числі розпад пуринів, можна припустити, що від стану КсД-КсО системи, зокрема від співвідношення та субклітинного розподілу активностей КсД і КсО значною мірою залежить здатність клітин до апоптозу та особливості його перебігу.

У зв'язку з цим, актуальним є дослідження ролі КсД-КсО системи в механізмі токсичної дії ряду ксенобіотиків, таких як папаверин, нітропрусид натрію (НП), нітрит та нітрат натрію, N-нітрозодиметиламін (НДМА) в дослідах in vitro на тимоцитах та in vivo. Інтерес до відомого фармакологічного препарату папаверину обумовлений тим, що він у цитотоксичних дозах пригнічує функцію мітохондрій, знижує рівень АТФ, прискорює катаболізм аденілових нуклеотидів в клітинах (Дмитренко Н.П., 1989) і, отже, може впливати на КсО-КсД систему. Нітрати, нітрити і N-нітрозодиметиламін (НДМА) - поширені екологічні забруднювачі і потенційні донори NO, а нітропрусид натрію - класичне джерело NO.

Зв'язок з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи лабораторії біохімії Інституту екогігієни та токсикології ім. Л.І.Медведя та виконана у рамках теми НДР № 5.4/448 “Дослідження біохімічних механізмів апоптозу клітин імунної системи“, реєстраційний номер (196U024284).

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було встановлення ролі КсД-КсО системи в механізмі токсичної дії папаверину та таких донорів оксиду азоту як нітрити, нітрати, N-нітрозодиметиламін, нітропрусиду натрію.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі задачі: 1. Дослідити характер загибелі тимоцитів під впливом різних ксенобіотиків, зокрема папаверину, нітропрусиду, нітриту, нітрату натрію, НДМА та охарактеризувати цей процес в часі за такими ознаками як одно- та двониткові розриви ДНК, фрагментація хроматину. 2. Визначити активність КсД і КсО та інтенсивність пероксидного окислення ліпідів (ПОЛ) в процесі загибелі тимоцитів щурів, індукованої папаверином. 3. Вивчити стан КсД-КсО системи та утворення оксиду азоту в тимоцитах при цитотоксичній дії папаверину, НДМА, нітропрусиду натрію, нітриту та нітрату натрію. 4. Вивчити участь КсД і КсО у відновленні нітратів і нітритів в тимоцитах в дослідах in vitro та організмі щурів. 5. Дослідити стан КсД-КсО системи, процесів ПОЛ і ендогенний синтез НДМА в організмі щурів в умовах дії нітриту натрію і інгаляції діоксиду азоту, а також посиленні ендогенного синтезу NО. Вивчити вплив акцепторів оксиду азоту - нітоксиделу, комплексу діетилдітіокарбамату з двохвалентним залізом (ДЕТК-Fe2+) на активність КсД і КсО.

Об'єкт дослідження – тимоцити, сироватка крові, печінка щурів. Предмет дослідження – механізм дії ксенобіотиків, стан ксантиноксидазно-ксантиндегідрогеназної системи при дії ксенобіотиків.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що тимоцити щурів під дією різних хімічних сполук, зокрема папаверину, НДМА, нітропрусиду натрію, нітриту та нітрату натрію гинуть однаково, а саме по типу апоптозу, про що свідчить характер утворення одно-, двониткових розривів ДНК та фрагментації хроматину. Вперше показано, що при апоптозі тимоцитів відбувається зниження активності КсД та підвищення активності КсО, і цей процес найбільш виражено в структурних компонентах тимоцитів. Вперше встановлено, що КсД-КсО система тимоцитів щурів проявляє нітратредуктазну активність, яка підвищується у процесі загибелі клітин, індукованої папаверином, а в організмі щурів вона забезпечує значний внесок в його нітратредуктазну здатність. Вперше виявлено, що дія нітропрусиду натрію на тимоцити обумовлена вивільненням з нього оксиду азоту, а вплив нітрату на тимоцити - перетворенням його в нітрит. Дія нітриту не пов'язана з вивільненням з нього NO. Вперше встановлено, що в організмі щурів при посиленні ендогенного синтезу NO та інтоксикації, обумовленій нітритом натрію або інгаляціями NO2, відбувається зниження активності КсД та підвищення активності КсО і інтенсифікація процесів ПОЛ. Ці зміни усуваються дією препаратів, які комплексно зв'язують та виводять з організму NO.

Теоретичне значення роботи. Отримані в роботі результати вказують на провідну роль ксантиноксидази як джерела вільних радикалів в загальному механізмі дії ксенобіотиків, зокрема виникненні та розвитку апоптозу тимоцитів, а також в патогенезі інтоксикацій в організмі. Виявлено взаємозв'язок між змінами в КсД-КсО системі і процесами ПОЛ при дії вивчених ксенобіотиків та визначена роль NO в механізмах їх токсичної дії. Показана роль КсД-КсО системи у відновленні нітратів в тимоцитах і організмі щурів. КсД-КсО система тимоцитів і цілого організму у відповідь на дію ксенобіотиків реагує однотипно: збільшенням активності КсО і зменшенням КсД.

Практичне значення роботи. Запропоновано визначення активностей КсД та КсО як чутливого показника для оцінки стану загальної інтоксикації організму. Обгрунтовано використання тимоцитів як альтернативний чутливий тест для оцінки токсичної дії ксенобіотиків. Проведені дослідження можуть бути використані при розробці фармпрепаратів, які підвищують стійкість клітин до токсичної дії донорів оксиду азоту. Розроблено преципітаційний метод визначення одно- та двониткових розривів ДНК, який можна використовувати як тест оцінки генотоксичної дії ксенобіотиків.

Особистий внесок автора. Дисертантом особисто здійснений інформаційний пошук та оцінка літературних даних, розроблена схема та обгрунтована методологія постановки експериментів, виконані експериментальні дослідження, проведений аналіз отриманих результатів, підготовлені статті до опублікування. ЕПР-спектроскопічні характеристики досліджені разом з науковим співробітником лабораторії біохімії Інституту екогігієни та токсикології ім.Л.І.Медведя Шандренко С.Г. Визначення ендогенного утворення N-нітрозодиметиламіну в організмі щурів проведені разом з співробітниками інституту експериментальної патології, радіобіології та онкології ім. Р.Є.Кавецького Главіним А.А. і Михайленко В.М. Решта дослідів проводилася здобувачем особисто.

Апробація роботи. . Матеріали роботи були представлені на Міжнародній конференції “Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems (ISPAS)”, Kyiv, Ukraine, 9-14 September, 2001, VII Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1997), 1-му з'їзді токсикологів України ( Київ, 2001 р.), науковій конференції молодих вчених Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім.Р.Є.Кавецького (Київ, 1997), конференції молодих вчених Інституту гігієни праці, Київ-2000. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на засіданнях лабораторії біохімії протягом 1995-2000 років.

Публікації. Результати досліджень представлені у 10 статтях, які опубліковані у профільних журналах і збірниках наукових праць та 9 тезах в матеріалах з'їздів та конференцій.

Обсяг та структура роботи. Дисертацію викладено на 151 сторінках друкованого тексту, вона містить 13 таблиць, 20 рисунків та складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, викладення експериментальних результатів та їх обговорення, висновків, списку використаної літератури. Останній включає 170 джерел, з них 111 іншомовних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Розглянуто роль КсО та КсД в біохімічних процесах та їх місце в механізмах токсичної дії ксенобіотиків. Обговорено дані літератури про структуру, механізм дії, субстратну специфічність КсО та КсД та вплив різноманітних речовин на її активність. Наведено матеріали про участь даного ферменту у розвитку патологічних процесів в організмі людини та тварин. Розглянуто загальні механізми дії ксенобіотиків, в тому числі апоптоз клітин імунної системи. Висвітлено участь NO, N-нітрозосполук, нітритів, нітратів та інших донорів оксиду азоту в біохімічних процесах в організмі.

Методи експериментальних досліджень. У роботі було використані такі реагенти та матеріали: НДМА, гіпоксантин, ксантин, аллопуринол, нітропрусид натрію, ксантиноксидазу, амідопірин, піразол, дигітонін фірми “Sigma”, нітрит натрію, нітрат натрію, папаверин (реахим, ч.д.а.).

Досліди проведено на щурах лінії Вістар з масою тіла 130-160 г. Тимоцити отримували протиранням тимуса через капронову сітку в середовище Хенкса з 10 мМ трис-HCl (рН 7,3). Клітини інкубували в 24-лунковому планшеті при 37оС у вказаному середовищі з 5% інактивованою сироваткою теляти в концентрації 1Ч 107 клітин на 1 мл з додаванням ефекторів у різних концентраціях протягом 7-ми годин. Кожну годину визначали кількість живих та загиблих клітин фарбуючи їх 0,2% трипановим синім за методикою наведеною Дж.Клаусом, 1990. Для розділення тимоцитів на фракції клітини обробляли на холоду 0,008% дигітоніном. В дослідах in vitro ефектори використовували в різних кінцевих концентраціях: папаверин - від 0,1 мМ до 0,3 мМ, НДМА – від 0,007 мМ до 0,28 мМ, нітропрусид натрію – від 0,05 до 0,2 мМ, нітрит натрію – від 0,1 до 0,4 мМ, нітрат натрію – від 0,25 мМ до 4 мМ, аллопуринол та гіпоксантин – 2 мМ. Для визначення утворення NO в тимоцитах в їх структури включали пастку NO, яка являє собою комплекс диетилдитіокарбамату (ДЕТК) і двохвалентного заліза (ДЕТК-Fe2+). Для цього тимоцити інкубували 20 хв. при 37оС в середовищі Хенкса, яке містило 0,1 мМ ДЕТК, далі клітини відмивали центрифугуванням та знов інкубували 20 хв. при 37оС у середовищі Хенкса, яке містило 0,1 мМ Fe2SO4. В результаті такої обробки в мембранних компонентах тимоцитів формувався комплекс ДЕТК-Fe2+, здатний уловлювати та міцно зв'язувати NO у вигляді мононітрозильного комплексу, який має парамагнитні властивості і реєструється методом ЕПР. Для визначення нітрит- і нітратредуктазної активності ксантиноксидази in vivo тваринам вводили підшкірно нітрат натрію в концентрації 600 мг/кг маси тіла і внутрішньочеревно гіпоксантин – 300 мг/кг та аллопуринол – 100 мг/кг. В дослідах in vivo по вивченню впливу діоксиду азоту та нітриту натрію на КсД-КсО систему дослідних тварин утримували 1-ну годину в інгаляційній камері при середньому вмісті діоксиду азоту (NO2) 8 –12 мг/м3; нітрит натрію вводили per os в концентрації 125 мг/кг маси тіла, аллопуринол – 50 мг/кг маси тіла. Препарат нітоксидел вводили підшкірно в концентрації 0,01 ЛД50 або 8 мг/кг маси тіла; комплекс ДЕТК–Fe2+ вводили per os в концентрації 120 мг/кг маси тіла. Кількість одно-, двониткових розривів ДНК в тимоцитах проводили за методом Дмитренка М.П., и др., 1997р. Фрагментацію хроматину визначали по Рябченко Н.И., Иванник Б.П. и др., 1986. Активності КсД та КсО в тимоцитах, печінці та сироватці крові визначали спектрофотометрично за утворенням сечової кислоти з ксантину (Anderson R.F. et al., 1989). Інтенсивність пероксидного окислення ліпідів (ПОЛ) визначали за накопиченням малонового діальдегіду (МДА) (Кузьминская У.А. и др., 1989). N-деметилюючу та денітрозуючу активності цитохромів Р-450 вимірювали за утворенням нітрит-йону та формальдегіду за методом (Yang C.S. et al., 1994). Нітрити та нітрати визначали по Грісу з використанням кадмієвих колонок (Green L.C. et al., 1982). Дослідження за допомогою електронно-парамагнітного резонансу (ЕПР) проводили на радіоспектрометрі “Varian Е-109” при наступних умовах: напруга магнітного поля – 2500 – 3500 Gs, потужність СВЧ – 5 мВт ( для реєстрації сигналу вільних радикалів – 0,2 мВт), температура рідкого азоту (-196 оС) (Варич В.Я. и др.,1987). Статистичну обробку результатів проводили за програмою “Statistica”.

Вивчення характеру загибелі тимоцитів під дією різних ксенобіотиків. Дослідження характеру загибелі тимоцитів щурів показало, що при додаванні всіх досліджуваних сполук до клітин, їх загибель розвивається однотипно (рис. 1). Тимоцити починають масово гинути після латентного періоду, який складає 3-4 години. На 6-7 годину інкубації у присутності ефектора загибель клітин дещо уповільнюється.

Утворення одно-, двониткових розривів та фрагментації ДНК в тимоцитах при дії папаверину характеризувалося збільшенням кількості однониткових розривів ДНК, яке спостерігалося вже через 0,5 год. інкубації клітин і протягом 4 годин лінійно зростає майже в 3 рази (рис.2). Також лінійно, але з меншою швидкістю відбувалося зростання двониткових розривів ДНК. Є дані (Peitsch M.C. et a.), що саме збільшення частоти однониткових розривів ДНК в першу чергу є причиною фрагментації при апоптозі тимоцитів. Пізніше, через 2 год інкубації, починається накопичення низькомолекулярних фрагментів ДНК. Таким чином, посилення утворення розривів (спочатку однониткових) і фрагментації хроматину випереджують у часі масову загибель тимоцитів, що дає підставу зв'язувати ці процеси з механізмом розвитку апоптозу. Характер утворення одно-, двониткових розривів та фрагментації ДНК був подібний і при дії класичного індуктора апоптозу дексаметазону та НДМА. Це вказує на те, що процес загибелі тимоцитів розвивається за однаковим механізмом незалежно від хімічного чинника, що її викликає.

Стан ксантиноксидазно-ксантиндегідрогеназної системи та інтенсивність пероксидного окислення ліпідів в процесі загибелі тимоцитів, індукованої папаверином. Важливу роль у механізмі запуску і протіканні апоптозу відіграють активовані кисневі метаболіти (АКМ) (Buttke T.M. et al., 1994, Bustamante J. et al., 1997, Зеньков Н.К. и др., 1999). Одним з джерел утворення АКМ, зокрема гідропероксиду водню та супероксидного аніону (О2-) в клітинах та тканинах організму є ксантиноксидазна реакція (Haberland A. et al.,1994). Нами встановлено, що у інтактних тимоцитах превалює активність КсД, яка складає біля 80% від

сумарної активності обох ферментів. В процесі інкубації (7 годин) тимоцитів в без ефектору в них спостерігається повільне зниження активності КсД на 20% і одночасне збільшення активності КсО на 114 %. Це складає – 7,5 і 9,5 нмоль/хв. на 107 клітин відповідно. Виходячи з одержаних даних, можна припустити, що зниження активності КсД в тимоцитах при їх інкубації в середовищі без ефектору є результатом часткового переходу активності КсД в КсО. Під впливом папаверину значно зростає сумарна активність ферментів, і через 7 годин інкубації вона на 55% перевищує початкову (рис.3). При інкубації тимоцитів з папаверином зміни в активностях КсД і КсО мали таку ж саму спрямованість, як і в контрольних дослідах, але були значно більшими. Співвідношення КсО/КсД в тимоцитах після 7-годинної інкубації з папаверином збільшувалося в 44 рази, тоді як в контролі ця величина була на порядок меншою. Істотні зміни активності КсД і КсО відзначалися вже на першу годину інкубації клітин, і, таким чином, їх можна віднести до ранніх подій у генезі апоптозу, що передують загибелі тимоцитів.

Щоб з'ясувати локалізацію КсД і КсО у тимоцитах, клітини розділяли на відповідні субклітинні фракції. Показано, що активність обох ферментів в тимоцитах після їх виділення виявлена переважно в цитоплазматичній фракції (70% для КсД і 80% для КсО). У фракції структурних компонентів тимоцитів, яку головним чином складають ядра та мітохондрії, знайдено 30% для КсД та 20% для КсО від загальної активності. Величина співвідношення активностей КсО/КсД в цій фракції в 2 рази перевищує таку в цитоплазматичній фракції. Під впливом папаверину в обох фракціях тимоцитів визначалося зростання активності КсО, але в структурних компонентах воно виражено значно більше і розвивається швидше, так, що через 2 години інкубації клітин відношення КсО/КсД в 4 рази перевищує цитоплазматичне. Можливо тому локальне збільшення утворення супероксиду і гідропероксиду водню в ядрах та мітохондріях тимоцитів призводить до загибелі клітин.

Оскільки при загибелі клітин, індукованій папаверином, відбувається зниження активності КсД і підвищення активності КсО, то створюються умови для надлишкового утворення гідропероксиду і супероксидного аніону, а отже до прискорення реакцій ПОЛ. Дійсно, як видно з рис.4 через 7 годин інкубації тимоцитів з папаверином в них майже вдвічі збільшується спонтанне, аскорбатзалежне і ферментативне накопичення малонового діальдегіду. Виявлене прискорення процесів ПОЛ передує загибелі тимоцитів і може відігравати ключову роль в апоптозі, викликаючи ушкодження клітинних мембран.

Підвищення активності ксантиноксидази разом із пригніченням активності ксантиндегідрогенази при цитотоксичній дії папаверину обумовлено, можливо, порушенням функцій мітохондрій тимоцитів, внаслідок чого прискорюється катаболізм нуклеотидів. Методом ЕПР спектроскопії показано, що при інкубації тимоцитів з папаверином відбувається зменшення величин сигналів ЕПР, характерних для убіхінонних вільних радикалів та залізо-сірчаних центрів, локалізованих в дихальних ланцюгах мітохондрій. Це може вказувати на те, що папаверин, на початковому етапі апоптозу тимоцитів, інгібує процеси транспорту електронів по ланцюгах вільного біологічного окислення, зв'язаного з процесами фосфорилювання. При дії папаверину було зареєстровано значне підвищення сигналу ЕПР, який відображає загальну кількість Mn2+-вмісних ферментів. Mn2+ входить до складу каталітичних центрів АТФ-аз та протеїнкіназ, які відіграють значну роль у катаболізмі аденіннуклеотидів, мембранотранспортних і регуляторних процесах клітин.

Прямим доказом того, що ксантиноксидазна реакція відіграє важливу роль в механізмі апоптозу тимоцитів, є збільшення загибелі клітин майже на 60% в присутності в культуральному середовищі субстрату КсО та КсД - гіпоксантину, та посилення більше ніж у 2 рази загибелі тимоцитів при додаванні до клітин гіпоксантину разом з КсО. В присутності інгібітору КсО та КсД – аллопуринолу ці ефекти на проявляються.

.

Таким чином, загибель тимоцитів внаслідок дії папаверину, як і інших вивчених ксенобіотиків, відбувається за апоптозним типом, оскільки їй передує збільшення кількості двониткових, однониткових розривів і накопичення низькомолекулярних фрагментів ДНК. Механізм цитотоксичної дії папаверину, очевидно, полягає в тому, що він пригнічує функцію мітохондрій і можливо посилює гідроліз АТР. В результаті цього прискорюється катаболізм аденіннуклеотидів і накопичується гіпоксантин - субстрат ксантиноксидазної реакції. Разом з тим, в результаті прямої і/або опосередкованої дії папаверину значно зростає сумарна активність КсО і КсД та відбувається перерозподіл активностей цих форм ферменту на користь КсО. Вказані зміни активностей особливо виражені в структурних компонентах тимоцитів - мітохондріях і ядрах. Посилення в останніх активності КсО призводить до локального збільшення концентрації супероксидних аніонів і гідропероксиду, які ушкоджують ДНК, викликаючи її розриви і фрагментацію. Позаклітинне накопичення гіпоксантину і КсО згодом створює умови для ушкодження плазматичної мембрани активними формами кисню ззовні і тим самим потенціює прооксидантний ефект структурної і цитоплазматичної КсО. Цей механізм участі ксантиноксидазної системи в розвитку апоптозу тимоцитів, мабуть, є універсальним і істотньо не залежить від чинника, що його викликає.

Дослідження механізмів цитотоксичної дії донорів оксиду азоту: нітропрусиду, нітриту та нітрату натрію, N-нітрозодиметиламіну на тимоцити щурів. Механізм розвитку апоптозу часто зв'язують з надмірним утворенням в організмі не тільки активованих форм кисню, зокрема супероксиду (О2), але і оксиду азоту (NO-). Ці радикали швидко взаємодіють між собою з утворенням пероксинітриту (ONOO-), який легко окиснює високомолекулярні сполуки (ліпіди, білки, ДНК), що призводить до апоптозу клітин (Fernandez A. et al., 1994; Bustamante J. et al., 2000). Разом з тим, за іншими даними, NO може знижувати частоту апоптозу тимоцитів, пом'якшуючи цитотоксичну дію О2- (Brune B. et al., 1998). В зв'язку з цим становить інтерес з'ясування ролі оксиду азоту та супероксидного аніону в розвитку апоптозу тимоцитів.

Щоб визначити здатність тимоцитів до синтезу NO, в їх структури вводили пастку, яка являє собою комплекс ДЕТК-Fe2+. Останній має здатність утворювати мононітрозильний комплекс з характерним сигналом ЕПР (g=2,03). При 7-ми годинній інкубації тимоцитів, що містять пастку NO в культуральному середовищі з субстратом NO-синтази аргініном, методом ЕПР-спектрометрії не було виявлено утворення сигналу мононітрозильного комплексу з NO. Синтез NO не було виявлено також при інкубації тимоцитів без пастки в культуральному середовищі з аргініном, коли по Грісу визначали кількість нітрит-аніону в клітинній суспензії. Утворення NO не було виявлено вказаними методами і в процесі загибелі тимоцитів, індукованої папаверином. Одержані результати не узгоджуються з дослідженням, в якому виявлено утворення NO тимоцитами в процесі апоптозу індукованого метилпреднізолоном використовуючи опосередковані показники (Bustamante J. et al., 2000). Оскільки тимоцити не синтезують NO, вони є зручною моделлю для вивчення ролі цієї сполуки в індукції і розвитку апоптозу.

Із досліджених нами донорів NO найбільшу цитотоксичність відносно тимоцитів виявляв нітропрусид натрію (НП), який в концентрації 0,1 мМ за 1,5 години контакту з тимоцитами викликав загибель біля 40% клітин. НДМА, нітрит і нітрат натрію проявляли подібний цитотоксичний ефект за концентрацій 0,14 мМ; 0,2 мМ і 2 мМ та інкубації з клітинами упродовж 2,5; 2,0 і майже 3,0 годин відповідно.

Загибель клітин, спричинену НП, деякі автори зв'язують з дією оксиду азоту, який з нього вивільняється. Але цитотоксична дія може бути обумовлена також і іншими продуктами розкладу НП, такими, як ціанід і йони ферроціаніду (Manzoni O., et al., 1992). Нами показано, що чинником дії НП є саме NO. Так, при дії НП в тимоцитах за допомогою ЕПР-спектрометрії виявлено зв'язування NO НП-ду з введеною в тимоцити штучною пасткою (ДЕТК-Fe2+). При інкубації з 0,1 мМ НП тимоцитів, які не містили ДЕТК-Fe2+, в їх спектрах ЕПР з'являється характерний сигнал нітрозильного комплексу негемового заліза з білками, що містять парні SH-групи (R-NO, gcp=2,03) (рис. 5).

Через 2 години інкубації тимоцитів з НП кількість NO в цьому комплексі складала 12 мкмоль на 107 клітин, що призводило до загибелі біля 40% клітин. Ця кількість NО та % загибелі клітин відповідають показникам, які виявляються після пропускання NO через суспензію тимоцитів. Згідно з даними літератури (Lincoln J., et al., 1997), саме зв'язування NO з Fe-S групами ферментів, ключових для життєдіяльності клітин, є основною причиною цитотоксичної дії NO.

На різні механізми цитотоксичної дії НП і папаверину вказує сумація ефекту при їх одночасному використанні.. Дія 0,18 мМ папаверину та 0,01 мМ НП в середовищі інкубації тимоцитів призводить до загибелі 33,0+4,0 % та 50,0+5,8 % клітин відповідно. При їх одночасному використанні спостерігається загибель 84,1+6,3 % клітин. Однакова спрямованість впливів індуктора (L-аргінін) та інгібіторів (L-канаванін, NG-метил-L-аргінін) синтезу NO, що спостерігалися при апоптозі, індукованому НП і папаверином, вказує на непричетність до механізмів їх дії ендогенного синтезу NO. Зокрема, присутність в середовищі інкубації тимоцитів як аргініну, так і L-канаваніну та NG-метил-L-аргініну значно посилюють загибель клітин, спричинену папаверином, і, навпаки, збільшують їх життєздатність при дії НП.

Акцептори NO, зокрема комплекс ДЕТК-Fe2+ і розроблений в лабораторії біохімії Інституту екогігієни та токсикології препарат нітоксидел (розчинний комплекс Fe2+ з низькомолекулярним тіолвмісним лігандом і аскорбіновою кислотою) значно зменшують токсичний вплив НП на тимоцити. Оскільки ці комплекси не здатні проникати через клітинну мембрану можна припустити, що НП вивільняє значну частину NO в позаклітинне середовище вже при контакті з поверхнею тимоцитів, а також внаслідок дії певних ферментів. ДЕТК-Fe2+ і нітоксидел також пригнічували апоптоз тимоцитів, індукований папаверином. Можливо це відбувається тому, що вони, завдяки наявності в їх структурах двохвалентного заліза, в позаклітинному середовищі нейтралізують супероксид.

Роль ксантиноксидазної реакції як одного з основних джерел супероксиду в розвитку апоптозу тимоцитів, спричиненому папаверином, значна. Так, при наявності в середовищі інкубації гіпоксантину загибель клітин під дією папаверину збільшується на 50-60%, а в присутності аллопуринолу вона зменшується на 60%. В апоптозі тимоцитів, індукованому НП, вклад супероксиду, який утворюється в результаті ксантиноксидазної реакції, менший: ефект гіпоксантину незначний, а аллопуринолу в 2 рази слабший. Додавання до тимоцитів ксантиноксидази (КсО) разом з гіпоксантином більше ніж в 2 рази посилює загибель тимоцитів, викликану папаверином, і суттєво не відбивається на загибелі тимоцитів під дією НП. Можливо, що супероксид, який утворюється позаклітинно з гіпоксантину, нейтралізується оксидом азоту, який вивільняється з НП так, що в певних оптимальних співвідношеннях концентрацій NO- та O2-, їх цитотоксичні властивості не проявляються (Brune B. et al., 1998).

Роль ксантиндегідрогеназно-ксантиноксидазної системи у відновленні та цитотоксичній дії нітратів і нітритів. Обмін NO, нітритів і нітратів в організмі настільки тісно пов'язані між собою (Реутов В.П., 2002), що досі залишається нез'ясованим чи мають нітрит- і нітрат-аніони особливу, притаманну тільки кожному з них регуляторну і токсичну дію, чи вона обумовлена відновленням їх у NO (Реутов В.П., 1995, 2000). В організмі тварин існує потужна нітрат (нітрит)редуктазна система, яка здатна відновлювати нітрати та нітрити в NO. Можно припустити, що певний внесок в нітрат-, нітритредуктазну систему вносить ксантиноксидаза, яка має структурну спорідненість із бактеріальними нітрат-, нітритредуктазами. Нещодавно показана здатність КсО ссавців відновлювати нітрит-аніони в NO (Millar T.M. et al., 1998). Нами досліджено участь КсД-КсО системи у відновленні нітратів і нітритів в організмі щурів, а також редуктазній функції ферменту в цитотоксичній дії нітритів та нітратів на тимоцити.

В дослідах in vitro встановлено, що ксантиноксидаза тимоцитів щурів здатна відновлювати нітрати в нітрити. При додаванні до суспензії тимоцитів 2 мМ нітрату натрію через 3 години інкубації з'являлося 0,14 мкмоль NO2- на 108 клітин. Присутність в середовищі інкубації тимоцитів 2 мМ аллопуринолу майже повністю блокує утворення нітриту з нітрату. При загибелі тимоцитів, індукованій папаверином, нітратредуктазна активність КсД-КсО тимоцитів зростає на 64%. Вона також майже повністю пригнічується аллопуринолом. Під впливом гіпоксантину в процесі апоптозу тимоцитів вказана активність зростає майже в 4 рази.

Таблиця 1. Вміст нітриту і нітрату в тимоцитах та сироватці крові щурів.

Умови експерименту Сироватка крові Тимоцити, мкмоль NO2-/108 кл. за 3 год. інкубації

NO3-, мМ NO2-, мкМ Контрольні З папаверином

Контроль 0,12+0,02 ------- ------- ---------

NaNO3 2,34+0,13* 69,05+9,52* 0,135+0,029 0,222+0,034

NaNO3+гіпоксантин 2,01+0,17* 97,62+9,52*,** 0,290+0,057** 0,860+0,078**

NaNO3+гіпоксантин + аллопуринол 2,57+0,16* 47,62+7,14*,** 0,010+0,004** 0,035+0,009**

Достовірно відносно контрольних тимоцитів - * , та відносно тимоцитів,до яких додавали NaNO3 - **.

Оскільки при апоптозі тимоцитів, індукованому папаверином, відбувається значне підвищення сумарної активності КсО і КсД та майже повний перехід активності КсД в КсО, можна припустити, що в тимоцитах нітратредуктазну активність проявляє саме КсО.

Для того, щоб оцінити вклад ксантиноксидазної системи у відновлення нітритів та нітратів в організмі, щурам внутрішньочеревно вводили гіпоксантин (300 мг/кг маси тіла) та аллопуринол (100 мг/кг маси тіла). У щурів контрольної групи в сироватці крові знайдено тільки нітрати. Через 3 години після введення нітрату натрію (600 мг/кг маси тіла) в сироватці крові в 20 разів збільшився рівень нітратів та з'явилася значна кількість нітриту (69,1+9,5 мкмоль/л). При введенні гіпоксантину разом з нітратом натрію виявлялася тенденція до зниження рівня нітратів та суттєво (на 41%) збільшився рівень нітритів в сироватці крові. Введення аллопуринолу повністю знімало ефект гіпоксантину. Таким чином, ксантиноксидаза вносить значний вклад в нітратредуктазну активність організму.

За допомогою ЕПР-спектроскопії нам не вдалося виявити утворення NO в тимоцитах при їх інкубації (6 годин) в присутності 0,07 мМ НДМА, 0,2 мМ нітриту натрію та 4 мМ нітрату натрію. Тобто їх цитотоксична дія, на відміну від НП, не пов'язана з утворенням з них NO. Нітрити, в значній мірі, мають самостійну дію на тимоцити (введення в тимоцити штучної пастки NO не повністю усувало цитотоксичну дію нітриту натрію і час його контакту з тимоцитами, необхідний для їх загибелі був значно меншим ніж НП), а нітрати викликають апоптоз тому, що відновлюються до нітриту ксантиноксидазою. На це вказує те, що через 2 год інкубації тимоцитів з нітратом натрію в середовищі інкубації накопичуються нітрит-іони (0,25+0,04 мкг/мл). Гіпоксантин більше ніж на 40% посилює загибель тимоцитів, індуковану нітратом натрію, та не впливає на цитотоксичність нітриту. Аллопуринол, навпаки, майже на 70% зменшує кількість загиблих клітин при дії нітрату. Токсичний вплив на тимоцити нітриту також послаблюється аллопуринолом, але значно слабше (на 37%). При сумісній дії на тимоцити нітриту натрію та НП відмічається синергічний ефект. Це вказує на те, що NO та іони нітриту діють за різними механізмами.

Цитотоксична дія НДМА може бути пов'язана з продуктами, що утворюються при його біотрансформації цитохромом Р-450. Дійсно, встановлено, що тимоцити щурів, які отримували для індукції цитохрому Р-450 з питною водою етанол, мають більшу на 34% і 60% денітрозуючу та N-деметилюючу активності і при цьому проявляють меншу стійкість до умов культивування, а також дії НДМА порівняно з тимоцитами контрольних тварин. З іншого боку, в присутності інгібітору денітрозуючої та N-деметилюючої активностей – піразолу суттєво збільшується життєспроможність тимоцитів в умовах дії вказаних ушкоджуючих факторів. Кількість NO, що утворюється з НДМА при денітрозуванні, була значно менша ніж та, що вивільнюється з такої ж дози НП, і за допомогою методів ЕПР-спектрометрії не виявлялася. Отже, цитотоксична дія НДМА мабуть обумовлена продуктами реакції N-деметилювання, що є сильнодіючими алкілюючими агентами, а не з вивільненням NO.

Стан ксантиндегідрогеназно-ксантиноксидазної системи, процесів пероксидного окислення ліпідів і утворення N-нітрозодиметиламіну в організмі щурів в умовах дії нітриту натрію, інгаляції діоксиду азоту і індукції ендогенного синтезу оксиду азоту. Вивчали вплив діоксиду азоту (NO2), нітриту натрію, аллопуринолу та стимулятора ендогенного синтезу NO - вакцини БЦЖ на активності КсД, КсО та вміст малонового диальдегіду (МДА) в печінці, сироватці крові, а також на утворення канцерогенного НДМА із амідопірину в організмі щурів.

Дія вказаних попередників синтезу НДМА, особливо нітриту натрію, призводить до зниження активності КсД і збільшення активності КсО з паралельною активацією ПОЛ в печінці щурів. Введення щурам алопуринолу інгібує активність КсО, при цьому збільшувалася кількість НДМА в крові щурів, які отримували попередники цього канцерогена.

Введення щурам вакцини БЦЖ викликає запальний процес в організмі, що супроводжується індукцією NO-синтази в макрофагах і інших клітинах організму і накопичення NO в організмі. З представлених даних (табл.2) видно, що ін'єкції вакцини БЦЖ призводять до суттєвих метаболічних змін в організмі. Під дією ін'єкцій БЦЖ відбувається збільшення активності КсО та зниження КсД в печінці так, що сумарна активність цих двох форм суттєво не змінювалася. Очевидно, збільшення співвідношення КсО/КсД також відображає прискорення катаболізму аденіннуклеотидів та є причиною збільшення О2-, що, в свою чергу, може бути причиною інтенсифікації ПОЛ (на 27%) в організмі (табл. 2). В сироватці крові щурів, імунізованих БЦЖ, зміни активності КсД и КсО відносно контрольних величин несуттєві. При посиленні ендогенного синтезу NO під дією ін'єкцій вакцини БЦЖ відмічається лише тенденція до збільшення утворення НДМА з амідопірину в організмі щурів.

Інгаляція щурам NO2 викликала однотипні ін'єкціям БЦЖ зміни в КсО и КсД-них активностях в печінці, а також посилення ПОЛ (табл.2). Це вірогідно пояснюється тим, що і в тому і в іншому випадках проходить прискорення катаболізму аденіннуклеотидів, яке супроводжується збільшенням відношення КсО/КсД. Причини такого прискорення різні: в одному випадку це інтенсифікація обміну, і зокрема пуринового, а в іншому - зменшення енергозабезпечення клітин, обумовленого гіпоксією. З нею також пов'язано зниження активності КсД та відношення КсД/КсО в сироватці крові. Під дією NO2, нітрозування амідопірину в тілі щурів зростає в 37 разів. Попереднє введення аллопуринолу інгібувало активність ксантиноксидази. При цьому знижувалася інтенсивність ПОЛ.

Таблиця 2. Активність КсД, КсО та вміст МДА в печінці щурів при дії діоксиду азоту, нітриту натрію, аллопуринолу та вакцини БЦЖ.

Умови експерименту Активність ферменту, мкмоль/хв Ч мг білка МДА, нмоль/г сирої ваги

КсД КсО КсО/КсД

Контроль 11,42+0,67 4,61+0,43 0,40+0,02 146,1+4,70

Діоксид азоту 7,28+0,26* 5,62+0,19* 0,77+0,04* 209,1+7,40*

Діоксид азоту+аллопуринол 7,01+0,22* 2,53+0,11* 0,36+0,01 224,3+10,2*

Нітрит натрію 7,56+0,62* 5,54+0,40 0,73+0,03* 193,4+4,30*

Нітрит натрію+ аллопуринол 8,12+0,41* 2,90+0,38* 0,36+0,02 189,1+8,10*

БЦЖ 7,87+0,26* 6,81+0,37* 0,87+0,05* 185,5+6,38*

БЦЖ+аллопуринол 9,02+0,40* 3,82+0,25* 0,42+0,02 180,4+4,51*

*- р < 0,05 відносно контролю.

Вплив акцепторів оксиду азоту на активність ксантиндегідрогенази, ксантиноксидази і процесів пероксидного окислення ліпідів в умовах нітритної інтоксикації. На моделі нітритного навантаження у щурів в субхронічному експерименті досліджено дію препаратів – комплексу ДЕТК-Fe2+ та препарату нітоксидел, здатних зв'язувати оксид азоту, на активність КсД, КсО і ПОЛ.

Таблиця 3. Активність КсД, КсО та вміст МДА в печінці щурів, які отримували нітрит натрію (1/10 ЛД50) та донори оксиду азоту – комплекс ДЕТК-Fe2+ і препарат нітоксидел протягом 2,0 місяців.

Умови експерименту Активності ферменту, мкмоль/хв Ч мг білка МДА, нмоль/г сирої ваги

КсД КсО КсО/КсД

Контроль 8,4+0,4 12,7+0,3 1,50+0,06 110,9+38,5

Нітрит натрію 7,7+0,4 14,7+0,9* 1,91+0,08* 137,9+55,8

Нітрит натрію + нітоксидел 10,3+0,7** 5,9+0,5** 0,57+0,04** 157,9+29,1

Нітрит натрію + ДЕТК-Fe2+ 11,3+1,1** 10,9+0,2** 0,96+0,07** 96,7+14,0**

*- р < 0,05 відносно величини контроля, ** - р < 0,05 відносно нітриту натрію.

При дії нітриту натрію як в сироватці крові, так і в печінці щурів збільшувалася активність КсО і зменшувалася активність КсД, що характерно для гіпоксичних станів. При цьому підвищувався вміст МДА в печінці. В результаті дії нітоксиделу сумарна активність КсД і КсО в сироватці крові та печінці значно знижувалась не тільки відносно тварин, які отримували нітрит натрію, але й інтактних тварин. Це зниження відбувається за рахунок активності КсО. Направленість дії ДЕТК-Fe2+ на досліджені показники така сама, як і нітоксиделу, але в деяких випадках виражена слабше. Так, ДЕТК-Fe2+ нормалізує інтенсивність ПОЛ відносно щурів, які отримували нітрит натрію. ДЕТК-Fe2+ як і нітоксидел викликає зниження активності КсО в сироватці крові та печінці, збільшує активність КсД в печінці, але на відміну від нітоксиделу не впливає на сумарну активність обох ферментів в досліджених біосубстратах.

Таким чином, досліджені препарати при введенні разом з нітритом натрію проявляють позитивний ефект, послаблюючи або усуваючи його негативний вплив на організм.

ВИСНОВКИ

1. З'ясовано роль ксантиндегідрогеназно-ксантиноксидазної системи як невід'ємного ланцюга в загальному механізмі токсичної дії різних хімічних сполук на клітинному рівні і в цілому організмі щурів. Визначено особливості цитотоксичної дії на тимоцити папаверину, нітропрусиду натрію, нітриту натрію, нітрату натрію, N-нітрозодиметиламіну та роль оксиду азоту в механізмі дії вказаних сполук. В дослідах in vitro та in vivo при дії донорів та акцепторів оксиду азоту встановлено тісний зв'язок між станом ксантиндегідрогеназно-ксантиноксидазної системи і пероксидним окисленням ліпідів.

2. Загибель тимоцитів під дією папаверину, нітропрусиду натрію, нітриту натрію, нітрату натрію, N-нітрозодиметиламіну відбувається подібно, за типом апоптозу. Про це свідчить динаміка утворення одно-, двониткових розривів ДНК, фрагментації хроматину та загибелі клітин.

3. Загибель тимоцитів, індукована папаверином, нітропрусидом натрію, нітритом натрію, нітратом натрію, N-нітрозодиметиламіном супроводжується зниженням активності ксантиндегідрогенази та підвищенням активності ксантиноксидази. Ці зміни в ксантиндегідрогеназно-ксантиноксидазній системі більш виражені в структурних компонентах клітини ніж в цитоплазмі. Підвищення активності ксантиноксидази, яка є джерелом супероксидного радикалу та пероксиду водню, супроводжується посиленням реакцій пероксидного окислення ліпідів.

4. Ксантиноксидаза