АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

КУЗНЄЦОВ Юрій Васильович

УДК 612.82:615.214.31

НООТРОПНІ ПРЕПАРАТИ ЯК МОДУЛЯТОРИ ПЛАСТИЧНИХ ФУНКЦІЙ І ЗАСОБИ ЗАХИСТУ ГЛУТАМАТЕРГІЧНИХ СИНАПСІВ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ПРИ ЙОГО АНОКСИЧНИХ УШКОДЖЕННЯХ

14.03.05 - фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ 2002

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано на кафедрі фармакології з курсом клінічної фармакології Донецького державного медичного університету ім. М.Горького, МОЗ України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор АБРАМЕЦЬ Ігор Ігоревич, Донецький державний медичний університет ім. М.Горького МОЗ України, професор кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор ГРОМОВ Леонід Олександрович, Інститут фармакологіі та токсікологіі АМН України, завідувач відділу нейрофармакологіі.

доктор медичних наук, професор НЕРУШ Петро Опанасович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри нормальної фізіологіі.

Провідна установа: Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра загальної та клінічної фармакологіі.

Захист відбудеться “ 22 ” січня 2003 р. о 1500 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14

Автореферат розіслано “ 21 ” грудня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01,

кандидат біологічних наук І.В.Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ноотропні речовини або нейрометаболічні церебропротектори - психофармакологічні засоби, що постійно привертають увагу дослідників і лікарів-практиків. Теоретичний інтерес до цієї групи лікарських речовин обумовлений їх здатністю підсилювати як релейні, так і пластичні функції глутаматергічних синапсів головного мозку. Саме з впливом на пластичні функції, а також вираженим впливом ноотропів на метаболічні процеси в нервових і гліальних клітинах пов'язана висока терапевтична активність цієї групи лікарських речовин при різних видах амнезій, а також церебропротективна дія при ушкодженнях мозку різного генезу.

До теперішнього часу досить добре вивчено вплив ноотропних речовин на релейні функції центральних глутаматергічних синапсів (І.І. Абрамець та ін., 1994, I. Ito et al., 1990, C.M. Tang et al., 1991). Що стосується їх впливу на пластичні функції глутаматергічних синапсів головного мозку, то є істотні досягнення у вивченні впливу ноотропів на один із проявів пластичних властивостей центральних глутаматергічних синапсів, а саме довготривалу потенціацію (ДП) синаптичної передачі (M. Krug et al., 1988, 1989). Ноотропні речовини знижують поріг індукції, підсилюють експресію і збільшують тривалість ДП синаптичної передачі, що розцінюють як синаптичну основу формування слідів пам'яті й навичок навчання (Н.В. Дореулі та ін., 1990; U. Staubli et al., 1990).

З початку 90-х років відбувається інтенсивне вивчення інших пластичних феноменів у глутаматергічних синапсах головного мозку - довготривалої депресії (ДД) і депотенціації синаптичної передачі (S. Fujii et al., 1990, L. Boulton et al., 1994, V. Y. Bolshakov and S. A. Siegelbaum, 1995, K. Kameyama et al., 1998). Зараз ще немає до кінця усталених уявлень про нейрохімічні механізми індукції та експресії ДД і депотенціації синаптичної передачі, також відсутні експериментальні дані про вплив ноотропних речовин на зазначені пластичні синаптичні феномени. Таким чином, існує нагальна потреба вивчення цих форм синаптичної пластичності і з'ясування характеру впливів на них ноотропів.

Крім того, відсутність кореляційного зв'язку між антиамнестичною і протигіпоксичною дією ноотропних речовин (Т.А.Вороніна, 1989, 1991) припускає, що в основі цих двох ефектів лежать різні механізми дії. Інтенсивне накопичення уявлень про механізми дії гіпоксії на центральну глутаматергічну передачу, отриманих за останні п'ять років (P. Lipton, 1993, T. Dalkara et al., 1996; D. Lobner et al., 1998, R. Tremblay et al., 1999), дозволяє конкретизувати механізми антигіпоксичної дії ноотропів, але останні вивчені недостатньо. Тому дослідження ноотропів дозволить отримати дані щодо оптимального використання іх у комплексному лікуванні ішемічних ушкоджень головного мозку.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом НДР "Механізми корекції функцій і захисту ноотропами головного мозку при його гіпоксичних пошкодженнях" (№ держреєстрації 0100U000003), яка виконується в Донецькому державному медичному університеті і спрямована на вивчення механізмів коригувальної і захисної функцій ноотропів при гіпоксичних пошкодженнях головного мозку.

Мета і задачі дослідження. Експериментально обгрунтувати доцільність використання ноотропів для відновлення функціонального стану нейронів в умовах аноксії мозку.

Для досягнення зазначеної мети вирішувались такі задачі:

1. Вивчення нейрохімічних механізмів експресії НМДА-залежної і НМДА-незалежної форм ДД синаптичної передачі і визначення характеру впливу на них ноотропних речовин (пірацетам, карбацетам, етимізол, гліцін);

2. Дослідження дії ноотропних речовин на нейрохімічні механізми індукції та експресії депотенціації синаптичної передачі;

3. Визначення нейрон-протективної дії ноотропів на основі вивчення глутаматергічних механізмів аноксичних ушкоджень мозку.

Об'єкт дослідження - переживаючі зрізи гіпокампу щурів.

Предмет дослідження – нейрон-протективна дія ноотропних речовин (пірацетам, карбацетам, етимізол, гліцін).

Методи дослідження – фармакологічні, електрофізіологічні, нейрохімічні та статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено, що ноотропні речовини різних хімічних груп підсилюють розвиток НМДА-залежної форми ДД синаптичної передачі в області СА1 гіпокампу ювенільних щурів і депотенціації в цій же області гіпокампу зрілих щурів. Досліджувані ноотропи послаблюють розвиток НМДА-незалежної форми ДД синаптичної передачі в зубчастій звивині зрілих щурів. Показано, що неоднаковий вплив ноотропних речовин на різні форми синаптичної пластичності обумовлений їх різною нейрохімічною організацією. Запропоновано гіпотезу, що ноотропні речовини підсилюють ДД синаптичної передачі в області СА1 ювенільних щурів, де вона в цей період розвитку є основною формою синаптичної пластичності. Однак у зубчастій звивині, де ДД протидіє тривалій потенціації синаптичної передачі (провідній формі синаптичної пластичності) ноотропні речовини послаблюють ДД. Ці зміни синаптичної пластичності є одним із компонентів антиамнестичної дії ноотропів.

Виявлено, що аноксичні ушкодження синаптичної передачі в області СА1 гіпокампу зрілих щурів, досліджувані на моделі ішемічного інсульту in vitro, перебігають у дві стадії – ранню і відстрочену, які мають різні нейрохімічні механізми розвитку. Показано, що ноотропні речовини, крім гліцину, у високих концентраціях при використанні одночасно з ушкоджувальним впливом зменшують порушення синаптичної передачі, обумовлені ранніми аноксичними ушкодженнями нейронів. Однак пізніше використання особливо низьких концентрацій ноотропів викликає значно більше виражене, порівняно з контролем, пригнічення синаптичної передачі у зв'язку з посиленням відстрочених аноксичних ушкоджень нейронів.

Практичне значення отриманих результатів. Експериментально доведено доцільність використання ноотропів для відновлення функціонального стану нейронів в умовах аноксії мозку.

Встановлений потенціювальний вплив ноотропів на тривалу депресію синаптичної передачі, що забезпечує збереження інформації в гіпокампі щурів у ранньому постнатальному періоді, може бути передумовою для раціонального використання ноотропів у ранні періоди життя дітей з когнітивними розладами.

З'ясовано, що ноотропні речовини поряд з нейрон-протективною дією при аноксичних ушкодженнях мозку здатні потенціювати відповіді нейронів, опосередковані АМРА рецепторами. Оскільки потенціювальна дія викликає деполяризацію постсинаптичних нейронів і підсилює пресинаптичне вивільнення глутамату, вона протидіє нейрон-протективній активності ноотропів. Це є теоретичною основою для комбінування в процесі лікування ішемічних ушкоджень мозку ноотропів з речовинами, що перешкоджають підвищенню внутришньонейрональної концентрації Са2+, тобто блокаторами іонофорних глутаматних рецепторів, потенціалзалежних Na+ і Са2+ каналів.

Результати роботи впроваджено в навчальний процес на кафедрах фармакології, нормальної фізіології, патологічної фізіології, у курсі клінічної фармакології Донецького державного медичного університету (акти впровадження від 05.02.01, 08.02.01, 12.02.01).

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана самостійно. Збирання матеріалу, освоєння методів, проведення досліджень і статистична обробка результатів виконані автором особисто. Автором узагальнені отримані результати, сформульовані висновки і практичні рекомендації.

Апробація результатів роботи. Результати проведених досліджень доповідалися на засіданнях Донецького наукового суспільства фармакологів (1998, 1999, 2000), на II конференції Українського суспільства нейронаук з міжнародною участю (м. Донецьк, 2001), на II з'їзді фармакологів України (м. Дніпропетровськ, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових праць, з них 6 у фахових наукових журналах, 3 у матеріалах з'їздів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 150 сторінках машинописного тексту і включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів дослідження, чотири глави результатів дослідження з обговоренням, заключна частина, висновки, практичні рекомендації, список використаних джерел. Бібліографія містить 141 найменування, у тому числі закордонних авторів – 130. Робота ілюстрована 17 рисунками та 8 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМIСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проводилися на поперечних переживаючих зрізах товщиною 300 - 400 мкм дорсального гіпокампу нелінійних білих щурів і мишей.

Отримані зрізи гіпокампу інкубували в проточній камері протягом 60 - 90 хв, суперфузуючи сольовим розчином стандартного іонного складу (І.В. Комісаров, І.І. Абрамець, 1989, 1990). Сольовий розчин був попередньо насичений газовою сумішшю, що містить 95% О2 і 5% СО2. Після чого кожен зріз переносили до робочої камери, де його суперфузували тим же насиченим карбогеном сольовим розчином при температурі 30°С. Швидкість протоки сольового розчину в робочій камері 1 мл/хв; рН розчину - 7,4.

За допомогою скляних мікропіпеток, заповнених 2 М розчином NaCl, з опором кінчика 1 - 2 мОм у радіальному шарі області СА1 позаклітинно реєстрували популяційні збуджувальні постсинаптичні потенціали (пЗПСП) пірамідних нейронів області СА1 і в середній третині молекулярного шару зубчастої звивини пЗПСП зернистих клітин. Фокальні потенціали підсилювали по перемінному струму, оцифровували за допомогою десятиразрядного АЦП з частотою 10 кГц, усереднювали за 5-10 реалізаціями і фіксували на твердому диску персонального комп'ютера.

Досліджувані пЗПСП викликали електричною стимуляцією колатералей Шаффера (КШ) у радіальному шарі СА1 чи медіального перфорантного шляху (МПШ) прямокутними імпульсами струму величиною 0,02 - 0,1 мА, тривалістю 0,1 мс, частотою 1 в 10 с, що здійснювали за допомогою біполярних ніхромових електродів.

Довготривалу депресію синаптичної передачі в області СА1 і зубчастій звивині викликали низькочастотною (2 Гц, 900 імпульсів) тетанічною стимуляцією КШ чи МПШ. Зміни амплітуди пЗПСП виражали в %% стосовно контролю, прийнятого за 100%.

Депотенціацію синаптичної передачі в області СА1 викликали таким чином. Після стабілізації амплітуди пЗПСП пірамідних нейронів КШ піддавали високочастотну стимуляцію (ВЧС) (100 Гц, 1 с), у результаті чого розвивалася ДП синаптичної передачі. Після того, як амплітуда потенційованих пЗПСП досягала постійного рівня (через 30-60 хв після ВЧС), КШ стимулювали протягом 15 хв частотою 1 Гц; інтенсивність низькочастотної стимуляціі (НЧС) була точно такою ж, як і інтенсивність ВЧС, яка індукувала ДП синаптичної передачі.

Для оцінки нейрон-протективної дії досліджуваних речовин від аноксичного ушкодження моделювали ішемічний інсульт in vitro. Для цього зрізи гіпокампу після їх адаптації до сольових розчинів переносили в камеру, заповнену сольовим розчином того ж іонного складу, але який не містив кисню та глюкози. Зрізи гіпокампу експонували в камері без протоки протягом 10 хв при температурі 30°° С. Після закінчення впливу аноксії/аглікії (АА), реєстрували зміни синаптичної передачі в області СА1.

Церебропротективну дію досліджуваних речовин оцінювали у двох варіантах. У першому випадку досліджуваними речовинами впливали на зрізи гіпокампу одночасно з АА, в іншому – досліджувані речовини аплікували до зрізів після 30 хв від того моменту, як закінчилася дія АА.

Як ноотропи використовували пірацетам, карбацетам, етимізол і гліцин.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ІХ ОБГОВОРЕННЯ

Нейрохімічні механізми НМДА-залежної форми ДД синаптичної передачі в області СА1 і вплив на неї ноотропів. НЧС КШ у досліджуваних зрізах гіпокампу, узятих з мозку щурів віком 12 -15 днів, викликала зменшення амплітуди пЗПСП пірамідних нейронів області СА1 майже на половину. Експресія ДД синаптичної передачі в області СА1 супроводжувалася більш вираженим пригніченням амплітуди АМРА-компоненту пЗПСП порівняно з НМДА-компонентом і супроводжувалася ростом величини парного полегшення.

Це вказує на те, що експресія розглянутої форми ДД синаптичної передачі має змішану природу: основний її компонент – постсинаптичний і помірно виражений пресинаптичний компонент (рисунок).

Рисунок. Популяційні ЗПСП пірамідних нейронів області СА1; їх залежність від інтенсивності стимуляції при збільшенні сили струму на 0,02 мА (А), стрілкою зазначена область робочих ЗПСП; на Б: АМРА- (2) і НМДА-компоненти (3) контрольного пЗПСП (1); на В: зміни амплітуди пЗПСП пірамідних нейронів області СА1 (1), їх АМРА-(2) і НМДА-компонентів (3), викликані стимуляцією (2 Гц, 7,5 хв) колатералей Шаффера (зазначено здвоєною стрілкою). Стовпці в нижній частині рисунка відповідають величинам парного полегшення при межімпульсному інтервалі 50 мс у моменти часу позначені на кривої 1 символами а, б и в.

По вертикальній осі: зліва – амплітуда пЗПСП в %; справа – величина парного полегшення в %; по горизонтальній осі – час у хв. Калібрування: 1 мВ; 20 мс.

Розвиток ДД синаптичної передачі в області СА1 гіпокампу цілком запобігався при суперфузії зрізів сольовим розчином, що містить конкурентний блокатор НМДА рецепторів - APV (50 мкМ). Вплив на зрізи гіпокампу морфіну (10 мкМ) викликав істотне збільшення амплітуди пЗПСП пірамідних нейронів області СА1 і НЧС КШ не викликала в цих умовах розвитку ДД синаптичної передачі. Аплікація до зрізів гіпокампу блокатора потенціалзалежних Са2+ каналів L-типу - ніфедипіну (10 мкМ) і блокатора синтетази оксиду азоту (NOS) – NG-нітро-L-аргініну (10 мкМ) не впливала на гомосинаптичну ДД.

Вплив на зрізи гіпокампу сольових розчинів, що містять інгібітор кальмодуліну – трифторперазин (5 мкМ), інгібітор кальційнейрину (КН) – циклоспорин А (50 мкМ) і інгібітор фосфоліпази А2 (ФЛА2) – мепакрин (50 мкМ) пригнічували розвиток ДД синаптичної передачі в області СА1. Інгібітор каталітичної субодиниці ПКС поліміксин В, навпаки, не перешкоджав розвитку ДД. Усі досліджувані речовини – аналізатори, за винятком морфіну, по-різному впливали на експресію ДД синаптичної передачі, однак істотно не змінювали базальну синаптичну передачу в цій області гіпокампу.

Таким чином, гомосинаптична ДД синаптичної передачі в області СА1 гіпокампу щурів є НМДА-залежною формою синаптичної пластичності, індукція якої пов'язана з активацією постсинаптичних НМДА рецепторів і підвищенням концентрації Са2+ у цитоплазмі дендритних шипиків. Експресія цієї форми ДД синаптичної передачі пов'язана з включенням каскаду фосфопротеїнфосфатаз і зниженням хемосенситивності або кількості АМРА рецепторів у постсинаптичних ущільненнях шипиків. Поряд з цим у пірамідних нейронах активується ФЛА2, яка сприяє утворенню арахідонової кислоти або її ліпооксигеназних метаболітів, які діють на аксонні терміналі КШ і зменшують пресинаптичне вивільнення глутамату.

Далі досліджували вплив ноотропів на цю форму депресії. При НЧС КШ підпорогової інтенсивності спостерігали короткострокову (не більш 15 хв) депресію; ДД синаптичної передачі в цих умовах не виникала. Використання цих же параметрів стимуляції на фоні дії ноотропних речовин призводило до розвитку повноцінної ДД синаптичної передачі, експресія якої зростала зі збільшенням концентрації ноотропних речовин у сольовому розчині, яким суперфузували зрізи гіпокампу.

Крім посилення індукції ДД синаптичної передачі в області СА1 гіпокампу незрілих щурів пірацетам, карбацетам і етимізол залежним від концентрації способом підсилювали експресію ДД синаптичної передачі. Таку саму дію мав і гліцин (табл.1).

Таблиця 1

Вплив ноотропів на експресію ДД синаптичної передачі в області СА1 гіпокампу (M ± m)

Час післяНЧС,хв Амплітуда пЗПСП, мВ

контроль пірацетам карбацетам етимізол гліцин

0,1мМ 1мМ 1мкМ 10мкМ 10мкМ 30мкМ 1мМ

30 1,2±0,3 0,84±0,1 0,74±0,2* 0,35±0,08* 0,26±0,05* 0,88±0,1* 0,78±0,2* 0,82±0,1*

Примітка: в цій та табл. 2 - 4: М – середнє значення, m – стандартна помилка, “

*” – Р ? 0,05 порівняно з контролем

Оскільки в нашій лабораторії раніше було встановлено, що в основі модулюючого впливу ноотропів на синаптичну передачу в області СА1 гіпокампу лежить підвищення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ за рахунок його вивільнення з внутрішньоклітинних депо, можна припустити, що ноотропні речовини підсилюють як індукцію, так і експресію ДД синаптичної передачі в області СА1 за рахунок збільшення кальцієвого транзієнту в постсинаптичних нейронах, викликаного НЧС синаптичних входів.

Нейрохімічні механізми НМДА-незалежної форми ДД синаптичної передачі в зубчастій звивині і вплив на неї ноотропів. Викликана НЧС ДД синаптичної передачі в системі МПШ - дендрити зернистих клітин зубчастої звивини, що виявляється довгостроковим зниженням амплітуди пЗПСП зернистих клітин і має постсинаптичну природу, про що свідчать зменшення амплітуди АМРА-, але не НМДА-компоненту пЗПСП і відсутність змін величини парного полегшення.

Індукція досліджуваної форми ДД синаптичної передачі пригнічується інгібітором кальмодуліну - трифторперазином, а також інгібітором каталітичної субодиниці протеїнкінази С (ПКС) – поліміксином В і неселективним інгібітором NOS - N-нітро-L-аргініном. З іншого боку, при впливі на зрізи гіпокампу неселективного інгібітора фосфодіестераз цАМФ - IBMX і інгібітора КН - циклоспорину А викликало зменшення амплітуди пЗПСП зернистих клітин щодо контролю і підсилювало тетанус-індуковану ДД синаптичної передачі.

Таким чином, можна припустити, що індукція тетанус-індукованої ДД синаптичної передачі в системі МПШ - дендрити зернистих клітин зубчастої звивини обумовлена синаптичною активацією АМРА рецепторів і метаботропних глутаматних рецепторів першої і другої груп. Підвищення цитоплазматичної концентрації Са2+, що відбувається при цьому, може забезпечити активацію кальмодуліну. Посилення кальцієвого сигналу забезпечується активацією метаботропних глутаматних рецепторів першого типу, утворенням діацилгліцерину та підвищенням активності ПКС, що забезпечує фосфорилювання кальмодуліну. Саме співдружня активація Са2+ і ПКС кальмодуліну забезпечує його стимулювальний вплив на NOS і запуск сигнального шляху гуанілатциклаза - цГМФ - ПК. Остання через G-sub підвищує активність фосфопротеїнфосфатази 1 (ФПФ1) і дефосфорилює АМРА рецептори і знижує їх хемосенситивність. Другий рівнобіжний механізм індукції розглянутої форми ДД синаптичної передачі пов'язаний із залученням метаботропних рецепторів другої групи, активацією аденілатциклази в мембранах зернистих клітин і включенням сигнального шляху цАМФ - ПКА. Остання через регуляторний білок - інгібітор 1 підвищує активність ФПФ1 і викликає дефосфорилювання АМРА рецепторів. Крім синаптичної активації аденілатциклази за посередництвом метаботропних глутаматних рецепторів другої групи і регуляторного Gs білка, можливий інший шлях підвищення активності ферменту. Викликане низькочастотною тетанічною стимуляцією синаптичних входів підвищення внутрішньошипикової концентрації Са2+ за посередництвом кальмодуліну підвищує активність аденілатциклази.

Таким чином, стає очевидним, що нейрохімічні механізми індукції ДД синаптичної передачі в зубчастій звивині істотно відрізняються від таких індукцій ДД синаптичної передачі в області СА1. Це розходження визначає неоднаковий вплив ноотропних речовин на цю форму синаптичної пластичності в різних відділах гіпокампу.

Ноотропні речовини залежним від концентрації чином пригнічували розвиток ДД синаптичної передачі в області зубчастої звивини (табл.2), і це дозволяє думати, що викликане НЧС синаптичних входів підвищення концентрації Са2+ у цитоплазмі шипиків досягає значного рівня, але ферменти, що беруть участь в індукції досліджуваної форми ДД, мають низький афінітет до комплексу Са2+/кальмодулін, причому афінітет NOS і аденілатциклази ненабагато вищий за афінітет Са2+/кальмодулін-залежної протеїнкінази II (ПКII). Обумовлене дією ноотропів подальше підвищення Са2+ у цитозолі шипиків викликає повноцінну активацію ПКII і пригнічення ДД синаптичної передачі.

Таблиця 2

Вплив ноотропних речовин на розвиток довготривалої депресії синаптичної передачі (M± m)

Час післяНЧС, хв Амплітуда пЗПСП, мВ

контроль пірацетам карбацетам етимізол гліцин

1мМ 0,1мМ 1мкМ 10мкМ 10мкМ 30мкМ 1мМ

20 1,5±0,2 1,85±0,2* 2,05±0,3* 1,75±0,3* 2,2±0,5* 1,8±0,2* 2,1±0,4* 1,4±0,2

Таким чином, послаблення цієї форми синаптичної пластичності ноотропними речовинами пов'язане з нейрохімічними особливостями індукції й експресії ДД синаптичної передачі в зубчастій звивині.

Нейрохімічні механізми депотенціації синаптичної передачі і вплив на неї ноотропів. Після ВЧС КШ спостерігався розвиток ДП синаптичної передачі, що виявлялося зростанням амплітуди пЗПСП пірамідних нейронів області СА1 майже в 2 рази. НЧС КШ, здійснювана через 60 хв після тетанізації КШ, коли амплітуда потенційованих пЗПСП стабілізувалася, викликала стійке зниження амплітуди потенційованих пЗПСП майже на 80 % від величини приросту.

Більш інтенсивна депотенціація спостерігалася в тому випадку, коли приріст амплітуди пЗПСП пірамідних нейронів області СА1 перевищував 150% від початкової величини. При відносно слабкій експресії ДП синаптичної передачі (приріст амплітуди пЗПСП менше 150%) депотенціація не спостерігалася; навпаки, у цих умовах НЧС КШ викликала подальший приріст амплітуди потенційованих пЗПСП.

НЧС КШ на фоні дії неконкурентного блокатора НМДА глутаматних рецепторів - кетаміна (100 мкМ) не викликала депотенціації. При впливі ж на зрізи конкурентного блокатора АМРА/ каінатних рецепторів - CNQX (10 мкМ) викликана НЧС КШ депотенціація синаптичної передачі не відрізнялася від такої в контролі. Блокатор потенціалзалежних кальцієвих каналів L-типу - ніфедипін (10 мкМ) викликав послаблення депотенціації.

Зміну депотенціації спостерігали також при пригніченні активності регуляторного Са2+-сполучного білка кальмодуліну трифторперазином (10 мкМ). Навпроти, інгібітор каталітичної субодиниці ПКС - поліміксин В (50 мкМ) не впливав на розвиток депотенціації. Підвищення внутрішньонейрональної концентрації цАМФ при активації D1 дофамінових (вплив на зрізи 10 мкМ дофаміну в присутності 30 мкМ сульпіриду) чи А2 аденозинових (дія 10 мкМ аденозину на фоні 1 мкМ 1,3-діпропіл-8-фенілксантину) рецепторів призводило до усунення депотенціації. Аналогічні результати отримано при впливі на зрізи неселективного інгібітора лужних протеїнфосфатаз - ванадату натрію, вікористованого в концентрації 1 мМ.

У світлі вищевикладеного можна думати, що депотенціація синаптичної передачі в області СА1 спостерігається тільки в тому випадку, якщо експресія ДП має домінуючий пресинаптичний компонент. В основі депотенціації синаптичної передачі лежить опосередковуване НМДА рецепторами підвищення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ і включення каскаду фосфопротеїнфосфатаз, що дефосфорилюють фосфопротеїни які беруть участь в екзоцитозі глутамату й повертають пресинаптичне вивільнення глутамату на рівень, що передує індукції й експресії ДП.

НЧС у присутності ноотропних речовин, що мають антиамнестичну активність - пірацетаму (100 мкМ і 1 мМ), етимізолу (10 і 30 мкМ), карбацетаму (1 і 10 мкМ), а також гліцину (1 мМ) викликала посилення депотенціації синаптичної передачі (табл.3).

Таблиця 3

Вплив ноотропних речовин на депотенціацію синаптичної передачі в області СА1 (M± m)

Час після НЧС, хв Амплітуда пЗПСП, мВ

контроль пірацетам карбацетам етимізол гліцин

1мМ 0,1мМ 1мкМ 10мкМ 10мкМ 30мкМ 1мМ

30 3,15±0,3 2,3±0,4* 2,85±0,3 2,25±0,3* 2,15±0,2* 2,75±0,3* 2,27±0,2* 2,33±0,5*

Найбільш імовірно, що в основі викликаного ноотропами посилення депотенціації лежить їх здатність підвищувати внутрішньотермінальну концентрацію Са2+. У цьому випадку опосередковуване активацією пресинаптичних НМДА рецепторів підвищення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ складається з такою, обумовленою дією ноотропів. Це призводить до більш інтенсивної активації кальмодуліну, КН і посиленню дефосфорилювання внутрішньотермінальних субстратів, що беруть участь у везикулярному вивільненні глутамату.

Глутаматергічні механізми гіпоксичних ушкоджень центральних синапсів і вплив на них ноотропних речовин. Вплив на зрізи гіпокампу АА протягом 10 хв викликало необоротне ушкодження синаптичної передачі в системі КШ – дендрити пірамідних нейронів області СА1, про що свідчить істотне зниження амплітуди пЗПСП пірамідних нейронів області СА1. Порушення синаптичної передачі після впливу АА на зрізи гіпокампу пов'язане із загибеллю нейронів.

Основна причина загибелі нервових клітин - підвищення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ і активація ними процесів протеолізу і фосфоліполізу. Основні джерела підвищення внутрішньонейрональної концентрації Са2+ - іонні канали іонофорних глутаматних, потенціалзалежних Са2+ каналів, а також Са2+- і інозитолполіфосфат – індуковане вивільнення Са2+ із цистерн ендоплазматичного ретикулуму.

Виражену протективну дію при одночасному впливі з АА виявлено у неконкурентного блокатора НМДА рецепторів дизоцилпіну малеату (5 мкМ), а також блокатора іонних каналів НМДА й АМРА/каїнатних рецепторів ІЕМ-1592 (50 мкМ) і блокатора потенціалзалежних Са2+ каналів CdCl2 (100 мкМ) які викликали достовірне збільшення амплітуди пЗПСП пірамідних нейронів області СА1, реєстрованих на 60-й і особливо на 120-й хв після припинення дії АА. У теж час конкурентний блокатор АМРА/каїнатних рецепторів DNQX (10 мкМ), а також блокатор потенціалзалежних Са2+ каналів L-типу – ніфедипін (10 мкМ) у цій же моделі не викликали достовірних змін амплітуди пЗПСП порівняно з контролем.

При впливі цих же препаратів на зрізи гіпокампу через 30 хв після АА спостерігали послаблення протективної дії дизоцилпіну малеату, CdCl2. і ІЕМ-1592, про що свідчить зниження амплітуди пЗПСП на 60-й і 120-й хв щодо контролю. Навпроти, блокатор АМРА/каінатних рецепторів - DNQX викликав достовірне збільшення амплітуди пЗПСП пірамідних нейронів на 60-й і особливо на 120-й хв стосовно контролю. І тільки дія в цих же умовах блокатора потенціалзалежних Са2+ каналів L-типу – ніфедипіну практично не відрізнялася від такої при одночасному його впливі на зрізи гіпокампу з АА, крім достовірного підвищення амплітуди пЗПСП на 120-й хв щодо контролю.

Результати цієї серії дослідів показують, що обмеження надходження Са2+ з позаклітинної рідини в цитоплазму нейронів по рецептор-керованих чи потенціалзалежних іонних каналах послаблює ушкоджувальну дію АА на синаптичну передачу в гіпокампі. Таким чином, виявляється, що блокада НМДА рецепторів може забезпечити захисну дію тільки в тому випадку, якщо вона здійснюється перед чи в нетривалий початковий проміжок ішемії мозку.

Вплив на досліджуваний процес конкурентного блокатора АМРА/каїнатних рецепторів – DNQX указує на те, що АМРА/каїнатні рецептори втягненні в процес відстроченого екситотоксичного ушкодження нейронів, нейрохімічну природу якого не з`ясовано.

Роль потенціалзалежних Са2+ каналів L-типу у викликаному АА ушкодженні нейронів є незначною. Можливо, що високопорогові Са2+ канали N-типу роблять певний внесок у викликане АА раннє ушкодження нейронів гіпокампу.

Підвищення внутрішньонейрональної концентрації Са2+, викликане АА, може впливати на цілий ряд Са2+-залежних ферментів. Дуже велика імовірність взаємодії Са2+ з високоафінним Са2+-сполучним регуляторним білком – кальмодуліном, що як і Са2+ активує ПКII.

Вплив на зрізи гіпокампу інгібітора кальмодуліну – трифтазину (1 мкМ) послабляло порушення синаптичної передачї в зрізах гіпокампу при одночасному з АА чи відстроченому впливі.

В основі цього ефекту, імовірно, лежить запобігання активації ПКII, а ПКII відіграє важливу роль у процесах пресинаптичного вивільнення медіаторів і регулює хемосенситивність НМДА й АМРА/каїнатних рецепторів, збільшуючи амплітуду трансмембранних струмів, опосередкованих активацією іонофорних глутаматних рецепторів.

Неоднозначні результати отримано при одночасному з АА впливі інгібітора каталітичної субодиниці ПКС – поліміксину В у концентрації 50 мкМ він не виявляв протективних властивостей, більше того, в 1/3 зрізів підсилювалася ушкоджувальна дія, а при використанні в концентрації 150 мкМ спостерігали протективну дію на синаптичну передачу в зрізах гіпокампу.

Представляється, що активація бета-ПКС у пірамідних нейронах області СА1 є одним з механізмів, що протидіють екситотоксичному ушкодженню нейронів, і пригнічення активності ферменту прискорює загибель нейронів, а в основі протективної дії високих концентрацій поліміксину В в умовах впливу на зрізи гіпокампу АА лежить пригнічення активності пресинаптичної ПКС і ослаблення вивільнення глутамату.

При одночасному впливі на зрізи гіпокампу АА і комбінації речовин поліміксину В (150 мкМ) і DNQX (10 мкМ) спостерігається посилення протективної дії поліміксину В.

Імовірно, в умовах аноксії мозку з аксонних терміналей виділяється глутамат, взаємодіє з пресинаптичними АМРА рецепторами, і це викликає активацію пресинаптичної ПКС і посилення вивільнення глутамату.

При одночасному впливі на зрізи гіпокампу АА та інгібітора ФЛА2 – мепакрину (50 мкМ) відзначено виражену протективну дію, а при аплікації його до зрізів гіпокампу через 30 хв після припинення дії АА відбувається втрата церебропротективної дії мепакрину. Посилення утворення арахідонової кислоти в умовах аноксії мозку пов'язують з активацією НМДА рецепторів, і підвищенням активності Са2+-залежних ферментів ФЛА2, оскільки конкурентні та неконкурентні блокатори НМДА рецепторів перешкоджають утворенню арахідонової кислоти в ішемізованих ділянках мозку. З іншого боку, встановлено, що арахідонова кислота викликає істотне підвищення активності ПКС у пресинаптичних аксонних терміналях і підсилює вивільнення глутамату, причому цей ефект послаблюється інгібіторами ПКС. Опосередковане НМДА рецепторами підвищення активності ФЛА2 у нейронах гіпокампу триває не більш 40 хв. Це робить зрозумілим послаблення протективної дії мепакрину при його впливі на зрізи гіпокампу через 30 хв після припинення дії АА.

Усі досліджувані ноотропи, крім гліцину, послабляли ушкоджувальну дію АА на синаптичну передачу в зрізах гіпокампу. Захисна дія пірацетаму та карбацетаму зростала зі збільшенням дози, ефекти ж етимізолу зі збільшенням дози послаблялися. Важливо відзначити, що ця протективна дія досліджуваних ноотропів виявлялася в тому випадку, якщо речовини впливали на зрізи одночасно з АА. У той же час при впливі ноотропів на зрізи гіпокампу через 30 хв після припинення АА вони не тільки не мали захисної дії, але, навпаки, підсилювали ушкоджувальну дію АА на синаптичну передачу в гіпокампі. Особливо добре ця дія спостерігалася при використанні пірацетаму, етимізолу та карбацетаму в концентраціях 100, 10 і 1мкМ відповідно. Гліцин, використовуваний у концентрації 1мМ як при одночасному з АА, так і при відстроченому впливі на зрізи гіпокампу викликав посилення ушкодження нейронів. Тільки етимізол і карбацетам у концентраціях 30 і 10 мкМ відповідно виявляли помірну церебропротективну дію при впливі на зрізи гіпокампу через 30 хв після припинення АА (табл.4).

Таблиця 4

Вплив ноотропних речовин на викликане аноксією порушення синаптичної передачі

в області СА1 (M ± m)

Вплив речовин Час після аноксії, хв Амплітуда пЗПСП, мВ

Контроль пірацетам, 1мМ пірацетам, 100мкМ карбацетам, 10мкМ карбацетам, 1мкМ етимізол, 30мкМ етимізол, 10мкМ гліцин, 1мМ

Одночасно з АА 60 0,5±0,07 2,05±0,08* 0,52±0,08 1,8±0,2* 1,0±0,07* 0,7±0,1* 1,3±0,1* 0,1±0,1*

120 0,1±0,02 0,52±0,04* 0,25±0,03* 0,95±0,1* 0,5±0,03* 0,73±0,06* 1,4±0,1* 0,22±0,06*

Через 30 хв після АА 60 0,5±0,07 0,25±0,1* 0,16±0,07* 1,05±0,1* 0,25±0,06* 0,73±0,06* 0,2±0,07* 0,2±0,09*

120 0,1±0,02 0,15±0,08 0,1±0,06 0,25±0,08* 0,1±0,02 0,68±0,07* 0,1±0,07 0,1±0,05

Таким чином, в основі нейрон-протективної дії високих концентрацій ноотропів лежить послаблення ранніх аноксичних ушкоджень нейронів за рахунок інтенсифікації протективних механізмів, обумовлених помірним підвищенням концентрації Са2+ і посиленням Са2+-залежної інактивації потенціалзалежних Са2+ каналів, іонних каналів НМДА рецепторів і активацією в постсинаптичних нейронах бета-ізоформи ПКС. У той же час використання ноотропів у низьких концентраціях у період розвитку відстрочених аноксичних ушкоджень, імовірно, підвищує хемосенситивність пресинаптичних АМРА рецепторів, що супроводжується посиленням пресинаптичного вивільнення глутамату й аноксичного ушкодження нейронів гіпокампу. Посилення нейрон-ушкоджувальної дії АА гліцином пов'язане з посиленням функції НМДА рецепторів. Двоїстий вплив ноотропних речовин на аноксичні ушкодження мозку змушує віддавати перевагу таким препаратам, як карбацетам і етимізол, що не підсилюють аноксичні ушкодження тканин мозку.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації експериментально обґрунтовано доцільність використання ноотропів для підсилення послаблених патологічними станами процесів формування і консолідації слідів пам'яті та відновлення функціонального стану нейронів в умовах аноксії мозку.

2. Вплив аноксії на зрізи мозку впродовж 10 хвилин викликає незворотне ушкодження синаптичної передачі, що виявляється пригніченням амплітуди пВПСП нейронів гіпокампу на %.

3. Ноотропні препарати дозозалежно посилюють індукцію і експресію ДД, що є основною формою синаптичної пластичності у ювенільних щурів. Це виявлялося вірогідним зменшенням амплітуди пЗПСП пірамідних нейронів області СА1 при дії пірацетаму (1мМ) на 38,4%, карбацетаму (10мкМ) на 78,3%, етимізолу (30мкМ) на 35%, гліцину (1мМ) на 31,6%.

4. Ноотропні речовини дозозалежно пригнічували розвиток ДД в області зубцюватої звивини гіпокампу зрілих щурів, вірогідно підвищуючи амплітуду пЗПСП зернистих клітин: пірацетам (1мМ) на 23,3%, карбацетам (10мкМ) на 46,6%, етимізол (30мкМ) на 40% порівняно з контролем.

5. Депотенціація синаптичної передачі в області СА1 зрілих щурів підсилювалася (Р?0,5) при дії на зрізи гіпокампу пірацетаму (1мМ) на 26,9%, карбацетаму (10мкМ) на 31,7%, етимізолу (30мкМ) на 27,9%, гліцину (1мМ) на 26%.

6. У період ранніх аноксичних ушкоджень ноотропи виявляють нейрон-протективну активність, що підтверджується посиленням ефективності синаптичної передачі (підвищення амплітуди пЗПСП нейронів) пірацетамом, карбацетамом і етимізолом відповідно на 310%; 260%; 160% порівняно з контролем (Р?0,5).

7. У період пізніх аноксичних ушкоджень нейрон-протективну активність значно меншою мірою виявили карбацетам (10мкМ) і етимізол (30мкМ). Ефективність синаптичної передачі вірогідно підвищилася відповідно на 110% і 46% порівняно з контролем.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Абрамець І.І., Самойлович І.М., Кузнєцов Ю.В. Нейрохімічні механізми депотенціації синаптичної передачі// Нейрофізіологія. - 1998. - Т. 30. - С. 113 - 120. Здобувачем особисто виконані дослідження по вивченню механізмів депотенціації синаптичної передачі в гіпокампі, проведено аналіз результатів цих досліджень, написано розділи: методика, результати дослідження, обговорення результатів.

2. Абрамець І.І., Кузнєцов Ю.В., Самойлович І.М. Вплив низькочастотної тетанічної стимуляції синаптичних входів на різні форми довготривалої потенціації синаптичної передачі в гіпокампі// Нейрофізіологія.-1999.-Т. 31. - С. 378 - 385. Здобувачем особисто виконані дослідження по вивченню впливу низькочастотної тетанічної стимуляції на довготривалу потенціацію синаптичної передачі в системі моховиті волокна – дендрити пірамідних нейронів області СА3 та системі колатералі Шафера – дендрити пірамідних нейронів області СА1 в гіпокампі, проведено статистична обробка та аналіз результатів дослідження, написано розділи: результати дослідження і іх обговорення.

3. Кузнєцов Ю.В., Абрамець І.І., Самойлович І.М. Аноксичне пошкодження нейронів гіпокампу in vitro: дослідження глутаматергічних механізмів і захисної дії фармакологічних речовин// Архів клін. експерим. медицини. - 2000. - Т. 9. - С 338 - 345. Здобувачем особисто було проведено дослідження глутаматергічних механізмів і захисної дії ноотропів при аноксичних пошкодженнях нейронів гіпокампу in vitro, проведено статистична обробка та узагальнення результатів дослідження, аналіз літературних джерел, виконана підготовка матеріалу до друку, написано розділи: методика, результати дослідження і іх обговорення.

4. Абрамець І.І., Кузнєцов Ю. В., Самойлович І. М. Механізми тривалої депресії синаптичної передачі в області СА1 гіпокампу щурів// Нейрофізіологія. - 2000. - Т. 32. - С. 372 - 379. Здобувачем особисто досліджена дія речовин-аналізаторів та ноотропів на тривалу депресію синаптичної передачі в області СА1 гіпокампу, виконано узагальнення результатів дослідження

5. Кузнєцов Ю.В. Вплив ноотропних речовин на різні форми тривалої депресії синаптичної передачі в гіпокампі щурів// Питання експериментальної і клінічної медицини. - 2000. - Т.1, вип.4. - С. 134 - 136.

6. Кузнєцов Ю.В. Вплив ноотропів на депотенціацію синаптичної передачі// Архів клін. експерим. медицини. - 2001. - Т. 10. - С. 175.

7. Кузнєцов Ю.В. Вплив ноотропних речовин на НМДА-незалежну форму тривалої депресії синаптичної передачі в зубчастій звивині гіпокампу щурів// Архів клін. експерим. медицини. - 2001. - Т. 10. - С. 175.

8. Абрамець І.І., Кузнєцов Ю.В., Самойлович І.М. НМДА-незалежна форма тривалої депресії синаптичної передачі в гіпокампі: механізми індукції та вплив ноотропних речовин// Нейрофізіологія. - 2001. - Т. 33. - С. 98 - 105. Здобувачем особисто проведений порівняльний аналіз отриманих даних, написаний розділ обговорення результатів дослідження.

9. Кузнєцов Ю.В. Вплив ноотропних речовин на аноксичні пошкодження зрізів гіпокампу щурів// Матеріали ІІ Національного з'їзду фармакологів України. – Дніпропетровськ, 2001. - С.141.

АНОТАЦІЯ

Кузнєцов Ю.В. Ноотропні препарати як модулятори пластичних функцій і засоби захисту глутаматергічних синапсів головного мозку при його аноксичних ушкодженнях. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за фахом 14.03.05 - фармакологія. Інститут фармакології і токсикології АМН України, Київ, 2002.

Дисертація містить результати досліджень нейрохімічних механізмів гіпоксичних пошкоджень нейронів і найменш вивчених форм синаптичної пластичності - тривалої депресії і депотенціації, а також експериментальні дані про вплив ноотропних речовин на ці процеси.

Встановлено, що ноотропні речовини (пірацетам, карбацетам, етимізол і гліцин) полегшують індукцію і експресію головних форм синаптичної пластичності в гіпокампі: тривалу депресію (ювенільні щурі) і депотенціацію (зрілі щурі) в області СА1, але послаблюють розвиток допоміжних форм синаптичної пластичності - тривалу депресію в зубчастій звивині зрілих щурів. Показано, що такий неоднаковий вплив ноотропних речовин визначається відмінністю нейрохімічних механізмів цих форм синаптичної пластичності.

Розроблено та уточнено нейрохімічні механізми ранніх і відстрочених аноксичних пошкоджень нейронів. Встановлено, що нейрон-протективна активність високих концентрацій ноотропних речовин, крім гліцину, при одночасному їх впливі з аноксією, зумовлена активацією НМДА рецепторів і високопорогових п/з Са2+ каналів і подальшим зменшенням вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо. Показано, що захисна активність ноотропів значно знижується при пізніх аноксичних пошкодженнях і це пов'язано з їх слабким впливом на процеси пресинаптичного вивільнення глутамату, що лежать в основі відстрочених аноксичних пошкоджень нейронів.

Ключові слова: тривала депресія, депотенціації, гіпоксичні пошкодження, ноотропи, гіпокамп, синаптична передача, пластичність.

АННОТАЦИЯ

Кузнецов Ю.В. Ноотропные препараты как модуляторы пластических функций и средства защиты глутаматергических синапсов головного мозга при его аноксических повреждениях. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 – фармакология. Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2002.

Диссертация посвящена изучению механизмов действия и характера влияний ноотропных веществ на длительную депрессию и депотенциацию синаптической передачи, и гипоксическую гибель нейронов, а также выяснению нейрохимических механизмов и факторов, вызывающих эти процессы.

Первая часть работы содержит результаты исследования наименее изученных форм синаптической пластичности - длительной депрессии и депотенциации синаптической передачи, и влияния на них ноотропных веществ (пирацетама, карбацетама, этимизола, глицина).

Установлено, что ноотропы облегчают индукцию и экспрессию тех форм синаптической пластичности, которые являются ведущими: длительная депрессия у ювенильных крыс и депотенциация у зрелых животных, и ослабляют развитие вспомогательных форм синаптической пластичности – длительная депрессия в зубчатой извилине гиппокампа зрелых крыс. Индукция этих