НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

Литовченко Анна Володимирівна

УДК 577.124:528.951.4

Вивчення ролі фосфоглюкомутази

у метаболізмі картоплі (Solanum tuberosum L.)

за допомогою трансгенних рослин

03.00.20 - "біотехнологія"

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України (м. Київ) та в Макс-Планк-Інституті молекулярної фізіології рослин (м. Гольм, Німеччина)

Наукові керівники: доктор біологічних наук Кучук Микола Вікторович,

головний науковий співробітник відділу генетичної

інженерії Інституту клітинної біології

та генетичної інженерії НАН України

професор Лотар Вілмітцер,

директор Макс-Планк-Інституту

молекулярної фізіології рослин (Німеччина)

Офіційні опоненти:

д.б.н., член-кор. НАН України, професор Кунах Віктор Анатолійович, зав. відділом генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології та генетики НАН України

к.б.н., Панюта Ольга Олександрівна, доцент кафедри фізіології та екології рослин Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Провідна установа: Національний ботанічний сад ім. М. М. Гришка НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “19” листопада 2002 року о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д. 26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою 03143 Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

Автореферат розісланий “11” жовтня 2002 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради В. Д. Науменко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Широке використання трансгенних технологій дало початок новій біологічній дисципліні - молекулярній фізіології рослин, головна задача якої - дослідження та розуміння на молекулярному рівні фізіологічних процесів та їх регуляції, з подальшою метою використання цих здобутих знань на практиці для того, щоб успішно маніпулювати метаболізмом рослин. Беззаперечним фактом є те, що біотехнологія в цілому та модифікація метаболізму зокрема потребують детального розуміння всіх елементів структурної організації та особливо факторів регуляції функціонування біохімічних шляхів та впливу на них різноманітних ендогенних та екзогенних чинників.

Для такої важливої сільськогосподарської культури як картопля (Solanum tuberosum) одночасно з дослідженнями ендогенних шляхів метаболізму вуглеводів, значні зусилля останнім часом були спрямовані на підвищення ефективності взаємодії між метаболізмом сахарози та крохмалю, таким чином спрямовуючи ресурси на підвищення акумуляції крохмалю в бульбах. На даний момент майже всі гени, які вважаються безпосередньо задіяними в перетворенні сахароза — крохмаль, ізольовані, причому більшість з них в останні роки. Було створено значну кількість трансгенних ліній, в яких активність більшості індивідуальних генів було модифіковано, окремо чи в комбінації (огляд Fernie et al., 2002). Крім того, існує широкий спектр трансгенних рослин, в яких експресуються гетерологічні альтернативні ферменти з інших організмів. Ці дослідження дозволили підтвердити ряд гіпотез, які раніше базувалися на теоретичних розрахунках та експериментах in vitro та вважалися найбільш дискусійними (наприклад, про глюкозо-6-фосфат як попередник біосинтезу крохмалю в амілопласті – Tauberger et al., 2000). Однак деякі ключові проблеми, такі як чітко визначені фактори, важливі детермінанти для врожайності та вмісту крохмалю в бульбах картоплі, на той час були тільки частково розв’язані. Більше того, експерименти в молекулярній фізіології рослин висвітлили неймовірну гнучкість та пристосовуваність рослинного метаболізму та організму в цілому до внутрішніх та зовнішніх пертурбацій. Таким чином, беззаперечним фактом є необхідність проведення всебічного стратегічно продуманого фізіологічного, молекулярно-біологічного та біохімічного аналізу кожної спрямованої модифікації гену, щоб отримати розуміння та наукове обґрунтування наслідків модуляції метаболізму та його можливого практичного застосування.

Фосфоглюкомутаза є одним з ключових ферментів метаболізму вуглеводів, а саме розподілу вуглецю та накопичення енергії. Даний ензим каталізує взаємоперетворення глюкозо-1-фосфату та глюкозо-6-фосфату в пластиді і в цитозолі, тому цей фермент є важливим ключовим пунктом як в реакціях гліколізу, так і в процесах метаболізму сахарози та крохмалю. У вищих рослинах існує дві ізоформи фосфоглюкомутаз, одна локалізована в цитозолі, інша в пластиді (Muhlbach and Schnarrenberger, 1978). Цитозольна ізоформа бере участь у цитозольному катаболізмі сахарози, поставляючи проміжні сполуки для гліколізу та субстрати для біосинтезу різноманітних клітинних компонентів. Пластидна ізоформа грає ключову роль у синтезі крохмалю для зберігання продуктів фотосинтезу протягом дня, а також у процесі синтезу крохмалю, що запасається в гетеротрофних тканинах (наприклад, в бульбах картоплі). Зважаючи на те, що картопля є важливою сільськогосподарською культурою, підвищення вмісту крохмалю в бульбах є значною прикладною біотехнологічною метою. Отже, дослідження ферментів, задіяних в метаболізмі сахарози та крохмалю та потенційно здатних регулювати вміст крохмалю є важливим науковим обґрунтуванням поставленої задачі.

Мета та завдання роботи. Зважаючи на вищевикладене, метою даної роботи було вивчити роль фосфоглюкомутази шляхом дослідження впливу модифікації активності цього ферменту на метаболізм вуглеводів та фотосинтетичну активність рослин картоплі (Solanum tuberosum). До конкретних завдань роботи входило:

1. Проаналізувати вплив різного ступеня зниження активності пластидної та цитозольної ізоформ фосфоглюкомутази на фотосинтетичний метаболізм рослин картоплі, в яких експресія відповідних генів була пригнічена методом антисенс-РНК, використовуючи широкий спектр біохімічних та фізіологічних методів.

2. Встановити механізм пригнічення фотосинтетичної активності цих трансгенних рослин.

3. Отримати трансгенні рослини картоплі, які експресують гетерологічну фосфоглюкомутазу з Escherichia coli, з метою підвищити активність фосфоглюкомутази в цитозолі та здійснити аналіз генетичної модифікації на рівні експресії гену та активності ферменту.

4. Проаналізувати основні характеристики фотосинтетичної активності та метаболізму вуглеводів цих рослин як в автотрофній, так і в гетеротрофній тканинах.

Наукова новизна. Вперше проаналізовано наслідки зниження активності пластидної та цитозольної ізоформ фосфоглюкомутази для фотосинтетичного метаболізму рослин картоплі.

Досліджено вплив різного ступеня пригнічення активності фосфоглюкомутази на відміну від нокаут-мутацій.

Запропоновано механізми пригнічення фотосинтезу внаслідок зниження активності пластидної та цитозольної ізоформ фосфоглюкомутази картоплі.

Вперше отримано рослини картоплі, які експресують гетерологічну фосфоглюкомутазу з Escherichia coli.

Вперше використано широкий спектр біохімічних та фізіологічних методів для аналізу модуляції активності ферменту, включаючи комбінацію радіоактивних методів та метаболічне профілювання за допомогою газової хроматографії, сполученої з мас-спектрометрією.

Теоретична та практична цінність. Висвітлено роль пластидної та цитозольної ізоформ фосфоглюкомутази у регуляції перетворення сахароза — крохмаль та в цілому у регуляції метаболізму вуглеводів автотрофної та гетеротрофної тканин картоплі.

Отримані результати вивчення фотосинтетичної активності рослин зі зниженою та підвищеною активністю фосфоглюкомутази надають нові дані щодо взаємодії циклу Кальвіна та метаболізму сахарози і крохмалю в автотрофній тканині.

Результати цього дослідження представляють нові докази значної гнучкості та пристосовуваності рослинного організму до порушень метаболічних процесів, а також існування компенсаторних шляхів метаболізму.

Результати даної роботи дозволяють розглядати фосфоглюкомутазу як практичну ціль для генетичної інженерії та біотехнології з метою створення рослин картоплі з підвищеним вмістом крохмалю.

Основні положення, які виносяться на захист:

1. Зменшення активності пластидної ізоформи фосфоглюкомутази призводить до пригнічення синтезу крохмалю в листі, перерозподілу вуглецю у напрямку синтезу амінокислот та значного зменшення рівню фотосинтезу, але не має впливу на ріст та розвиток рослин картоплі.

2. Пригнічення фотосинтезу у рослин зі зменшеною активністю пластидної фосфоглюкомутази відбувається за рахунок зменшеної рециркуляції неорганічного фосфату.

3. Зменшення активності цитозольної ізоформи фосфоглюкомутази призводить до значного пригнічення росту та розвитку рослин, зниження рівню біосинтезу нуклеотидів та амінокислот.

4. Лише 6% активності цитозольної фосфоглюкомутази достатньо для підтримання нормального рівню біосинтезу сахарози в фотосинтетичній тканині картоплі.

5. Гетерологічна фосфоглюкомутаза з Escherichia coli може бути успішно експресована в різних тканинах рослин картоплі, що призводить до більше ніж 4-кратного підвищення загальної активності фосфоглюкомутази.

6. Підвищення активності фосфоглюкомутази в цитозолі не спричиняє змін у морфології рослин та фотосинтетичній активності, але призводить до значного дисбалансу в метаболізмі вуглеводів як в автотрофній, так і гетеротрофній тканинах.

Апробація роботи. Результати роботи були представлені на Міжнародному об’єднаному симпозіумі Американського товариства біологів рослин та Канадського товариства фізіологів рослин “Біологія рослин 2001” (Провіденс, Род Айленд, США, липень 2001), на ХІІІ Міжнародному конгресі Федерації європейських товариств фізіологів рослин (Геракліон, Крит, Греція, вересень 2002), а також на наукових семінарах Макс-Планк-Інституту молекулярної фізіології рослин (Гольм, Німеччина): групи “Центральний метаболізм вуглецю”, спеціалізованих семінарах “Метаболізм вуглеводів”, семінарах аспірантів та Прогрес-семінарах.

Публікації. Основні положення дисертації викладені у 5 друкованих роботах, список яких наведено в кінці автореферату.

Структура та об’єм роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів, обговорення, висновків та списку літератури, який містить 183 бібліографічні посилання. Робота викладена на 154 сторінках, містить 21 рисунок та 14 таблиць.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Рослинний матеріал.

1) Рослини картоплі (Solanum tuberosum L.) сорту Desiree були отримані з Saatzucht Lange AG (Bad Schwartau, Німеччина). Вони використовувались як контроль (дикий тип ДТ) в експериментах у порівнянні з трансгенними рослинами.

2) Трансгенні лінії П-5, П-9, П-40 та П-60, отримані Таубергер та ін. (2000) шляхом трансформації листових дисків за допомогою Agrobacterium tumefaciens (Dietze et al., 1995). Рослини було трансформовано бінарним вектором pBinAR (Liu et al., 1990) з конструкцією, яка містила химерний ген у складі фрагменту комплементарної ДНК (2400 пн), що кодує пластидну ізоформу ФГМ картоплі в антисенс-орієнтації під контролем конститутивного 35S промотору та термінатору гену октопінсинтази (Tauberger et al., 2000).

3) Трансгенні лінії Ц-29, Ц-44 та Ц-66, отримані Ферні та ін. (2002) шляхом трансформації листових дисків за допомогою Agrobacterium tumefaciens (Dietze et al., 1995). Рослини було трансформовано бінарним вектором pBinAR (Liu et al., 1990) з конструкцією, яка містила химерний ген у складі фрагменту комплементарної ДНК (1100 пн), що кодує цитозольну ізоформу ФГМ картоплі в антисенс-орієнтації під контролем конститутивного 35S промотору та термінатору гену октопінсинтази (Fernie et al., 2002).

4) Трансгенні лінії Е-53, Е-62, Е-75 та Е-82, отримані нами шляхом трансформації листових дисків за допомогою Agrobacterium tumefaciens (Dietze et al., 1995). Рослини було трансформовано бінарним вектором pART27 (Gleave, 1992) з конструкцією, яка містила химерний ген у складі фрагменту комплементарної ДНК (1100 пн), що кодує ФГМ Escherichia coli (Lu and Kleckner, 1994) в сенс-орієнтації під контролем конститутивного 35S промотору та термінатору гену октопінсинтази. Лінії, що використовувалися в даній роботі, були відібрані з 82 незалежних ліній за результатами аналізу активності ферменту фосфоглюкомутази та рівню транскрипції гену, визначеного за допомогою Нозерн-блот гібридизації.

Умови культивування рослин. Рослини підтримувалися in vitro на поживному середовищі МS (Murasige and Scoog, 1962) з 2% сахарози, при 16-годинному фотоперіоді. В теплиці рослини перебували, якщо не вказані інші умови, в тому ж світловому режимі (мінімум 250 мкмол фот м-2 с-1), при 22°С та відносній вологості 70%. Рослини культивувалися в горщиках діаметром 20 см та забезпечувалися водою та мінеральними речовинами за допомогою автоматизованої системи.

Нозерн-блот гібридизація. Сумарна рослинна РНК була ізольована за методом, модифікованим з Логеманн зі співавторами (Logemann et al. 1987). Нозерн-блот гібридизація в основному була виконана відповідно до Самбрук та ін. (Sambrook et al. 1989). Як зонд використовували послідовність гену фосфоглюкомутази з Escherichia colі.

Визначення активності ферментів. Екстракцію ферментів з тканини листя або бульби картоплі було виконано за методом, описаним Тресьюей та ін. (Trethewey et al., 1998). Тканину було гомогенізовано в епендорфі в присутності рідкого азоту, за тим 500 мкл буферу було додано (50 мМ Гепес-КОН рН 7,4, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ ЕГТА, 5 мМ ДТТ, 2 мМ бензамідін, 2 мМ -амінокапронова кислота, 0,5 мМ ФМСФ, 0,1% БСА, 10% гліцерин, 0,1% Тритон Х-100). Затим зразки були процентрифуговані (11000 g, 10 хв. при 4°C), супернатант обезсолено за допомогою колонок NAP 5 (Pharmacia, Німеччина).

Вимірювання активності фосфоглюкомутази та інших ферментів, задіяних в шляхах метаболізму сахарози, крохмалю, а також гліколізу та фотосинтезу (АДФ-глюкозопірофосфорилази, альдолази, ГАФ – дегідрогенази, НАДФ+-залежної ГАФ – дегідрогенази, гексокінази, енолази, піруваткінази, рибулозо-1,5-бісфосфат карбоксилази/оксигенази, транскетолази, тріозофосфатізомерази, УДФ-глюкозопірофосфорилази, фосфогліцераткінази, фосфоглюкозоізомерази, фосфорибулокінази, фосфофруктокінази, фруктозо-1,6-бісфосфатази, фруктокінази) проводилося у відповідних реакційних сумішах в динаміці при довжині хвилі 340 нм, в реакційному об’ємі 300 мкл за допомогою спектрофотометра Anthos ht II microtiter plate reader (Anthos Labtec Instruments, Німеччина) та програмного забезпечення Biolise. Активність сахарозо-фосфат-синтази (максимальна та селективна) визначалася за залишковою концентрацією сахарози в реакційному об’ємі 1 мл при довжині хвилі 620 нм (Reimholz et al., 1994).

Вимірювання вмісту глюкози, фруктози, сахарози та крохмалю. Визначення вмісту глюкози, фруктози, сахарози проводилося спектрофотометрично згідно з методом Тресьюей та ін. (Trethewey et al. 1998). Реакційна суміш складалася з 20 мкл екстракту, 100 мМ імідазол, 5 мМ MgCl2, 2 мМ НАДФ+, 1 мМ АТФ та 0,66 U Г6Ф-дегідрогенази (Saccharomyces cerevisiae). Для ініціації реакцій 5 мкл відповідного ферменту додавали послідовно: для визначення глюкози 0,33 U гексокінази, для визначення фруктози 0,16 U фосфоглюкозоізомерази, для визначення сахарози 1 U інвертази (-фруктозидази). Визначення вмісту крохмалю проводилося за допомогою комерційного набору (Boehringer Mannheim, Німеччина). Осад промивали 80% етанолом, ресуспендували в 400 мкл 0,2 М КОН, інкубували при 95°C 60 хв, нейтралізували 70 мкл 1 М оцтової кислоти. Після того центрифугували (11000 g, 10 хв) і використовували розведений супернатант (1:5 для листя, 1:20 для бульб) для подальшого аналізу. Принцип дії набору для визначення вмісту крохмалю базується на ензиматичному гідролізі за допомогою -амілоглюкозидази та визначенні глюкози вищезазначеним методом.

Вимірювання вмісту фосфорильованих проміжних сполук. Тканину було гомогенізовано в 1,5 мл охолодженої 16% трихлороцтової кислоти в діетиловому ефірі, після того екстракт інкубували 15 хв. на сухому льоду, додавали 0,8 мл водного розчину 16% трихлороцтової кислоти та 5 мМ ЕГТА, після чого ґрунтовно перемішували, нагрівали до 4°C, переносили в епендорф та залишали при 0°C на 3 години. Після чого відмивали 3 рази в діетиловому ефірі, розділяючи фази центрифугуванням (8000 g, при 4°C 10 хв), нейтралізували до рН 7 додаванням суміші 5 М КОН/1 М триетаноламін (Trethewey et al. 1998). Вміст метаболітів (гексозофосфатів, тріозофосфатів, 3-ФГК, пірувату та фосфоенолпірувату) визначали за Тресьюей та ін. (Trethewey et al. 1998), спектрофотометрично в об’ємі 700 мкл, використовуючи двохвильовий спектрофотометр (ZWSII, Sigma, Німеччина) при довжині хвилі 340 та 430 нм. Вміст неорганічного фосфату визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 620 нм відповідно до Шаркі та Вандервіер (Sharkey and Vanderveer 1989) в об’ємі 300 мкл, використовуючи Anthos ht II microtiter plate reader. Кольорову реакцію отримували змішуванням 50 мкл екстракту, 220 мкл реагенту (0,62 г молібдату амонію, 0,1 г малахітового зеленого на 50 мл 0,8 М НСl) та після 3 хв. 30 мкл 1 М тринатрію цитрату. Результати порівнювали зі стандартними концентраціями KH2PO4.

Вимірювання вмісту нуклеотидів та нуклеозидів. Вміст нуклеотидів та нуклеозидів визначали в тому ж екстракті (об’єм 100 мкл) відповідно до Ферні та ін. (Fernie et al. 2001а) за методом рідинної хроматографії високої розділяючої здатності (HPLC) на аніонообмінній колонці Partisil-SAX (P10SAX-250, Hichrom, Supelco, Німеччина). Нуклеотиди були визначені через абсорбцію при 254 нм та ідентифіковані шляхом порівняння із стандартами аденілатів та уридинілатів. Мобільними фазами були: А – 40 мМ KH2PO4 (pH 3,0), B - 200 мМ KH2PO4, 750 мМ КСl (pH 2,8). Порівняння піків та обробка результатів проводилася за допомогою програмного забезпечення Chromeleon та Gynkotek.

Аналіз метаболітів за допомогою газової хроматографії, сполученої з мас-спектрометрією. Метаболіти (в основному амінокислоти та органічні кислоти) визначалися згідно з методом, розвиненим Росснер зі співавторами (Roessner et al. 2000). Тканину (200-250 мг) екстрагували в 1400 мкл метанолу в присутності 50 мкл (2 мг/мл води) внутрішнього стандарту рибітолу, інкубували 15 хв.при 70°C, змішували з 1 об’ємом води, центрифугували і супернатант висушували в вакуумній центрифузі. Після того екстракт ресуспендували в 80 мкл метоксіаміну гідрохлориді (20 мг/мл) протягом 90 хв. при 30°C та додавали 80 мкл N-метил-N-[триметилсіліл]трифлюороацетаміду з подальшим інкубуванням 30 хв.при 37°C. За тим додавали 40 мкл суміші стандартів для визначення часу утримання та використовували 1 мкл екстракту для аналізу. Система складалася з автосамплера AS 2000, газового хроматографа GC 8000 та Voyager quadrupole мас-спектрометра (Thermo-Quest, UK), колонку використовували SPB-50 (Supelco, USA). Отримані хроматограми та мас-спектри аналізувалися використовуючи програмне забезпечення MassLab (ThermoQuest).

Визначення вмісту хлорофілів та каротиноїдів. Для визначення вмісту фотосинтетичних пігментів (Lichtentaler 1987) приблизно 100 мг тканини листя гомогенізували в рідкому азоті, екстрагували в 80% ацетоні чотири рази та вимірювали оптичну густину при довжині хвилі 663,2, 646,8 та 470 нм на спектрофотометрі Kontron (Kontron Instruments, Німеччина).

Визначення параметрів газообміну нативних рослин. Аналіз проводився в спеціально сконструйованій системі (Walz, Німеччина, детальний опис див. Muschak et al. 1997), лист інтактної рослини знаходився в кюветі з контрольованим вмістом СО2, вологістю, температурою та регульованою інтенсивністю світла. Інтенсивність фотосинтезу оцінювали при освітленні листа 100, 200, 400, 800 та 1000 мкмол фот м-2 с-1, відносній вологості 70% та температурі 24°C. Для аналізу отриманих даних та розрахунку параметрів газообміну використовували програмне забезпечення Diagas (Walz, Німеччина).

Експерименти з радіоактивним ізотопом вуглецю 14С.

Інкубація листових дисків з 14СО2. Диски (діаметром 1 см), вирізані з листя 4 рослин кожної лінії, яке перед тим було витримане в темряві на вологому папері протягом 60 хвилин, інкубували 30 хвилин в кисневому електроді (Hansatech, Norfolk, UK) в атмосфері, насиченій 14СО2 (двооксид вуглецю подавався з суміші 400 мкл 1 М NaH14CO3, специфічна активність 1,96 ГБк ммол-1, рН 9,3 та 10 U карбонової ангідрази, якою було просочено мат на дні електродної камери) і освітлювали з інтенсивністю 250 мкмол фот м-2 с-1.

Інкубація інтактних рослин з 14СО2. Рослини інкубували (згідно з методом Світлав та ін. (Sweetlove et al. 1998)) 2 години при освітленні 250-300 мкмол фот м-2 с-1 таким чином, що 14СО2 надходив з суміші 1 М NaH14CO3 та яблучної кислоти, специфічна активність 1,96 ГВк ммол-1, а вся наземна частина рослини знаходилася в прозорому поліетиленовому кульку, герметично закріпленому навколо основи стебла. Після того рослини витримували ще 4 години, бульби, столони та наземну частину збирали і зберігали при –20°C.

Фракціонування тканини з інкорпорованою міткою. Листові диски екстрагували відповідно до методу, описаному Ферні та ін. (Fernie et al. 2001б) в киплячому етанолі (послідовно 80%, 50%, 20%, бідистильованій воді та 80%) по 10 хв. в кожній концентрації, супернатант поєднували та висушували в вакуумній центрифузі, після чого екстракт ресуспендували в 2 мл води (етанолрозчинна фракція). Аліквоту 750 мкл фракціонували далі за допомогою іонообмінної хроматографії (Quick et al. 1989), використовуючи катіонну (Dowex 50W, 100-200 mesh, Bio-Rad, Німеччина) та аніонну (Dowex 1, 100-200 mesh, Bio-Rad, Німеччина) іонообмінні смоли на нейтральну (розчинні цукри), кислу (органічні кислоти та фосфорильовані сполуки) та лужну (амінокислоти) фракції. Осад, що лишився після екстракції етанолом, гомогенізували до однорідної маси з додаванням 0,5 мл води та вважали етанолнерозчинною фракцією (що складається в основному з крохмалю). Аліквоти з кожної фракції були змішані зі сцинтиляційним коктейлем (Ready Safe, Beckman Instruments, USA) та радіоактивність виміряна на рідкому сцинтиляційному лічильнику (LS 1801, Beckman Instruments, USA).

В експерименті з цілими рослинами всі бульби з кожної рослини були гомогенізовано з додаванням 80% етанолу та радіоактивність виміряна в декількох аліквотах з кожного зразка. Столони були екстраговані в 100% етанолі і в етанол-розчинній фракції були виміряні радіоактивність та вміст сахарози.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив зниження активності пластидної ізоформи фосфоглюкомутази на фотосинтетичний метаболізм рослин картоплі.

В даній роботі ми проаналізували вплив зниження активності пластидної ізоформи фосфоглюкомутази на фотосинтетичний метаболізм рослин картоплі. Трансгенні рослини з різним ступенем пригнічення активності ферменту були отримані шляхом антисенсного пригнічення відповідної РНК (Tauberger et al., 2000). В результаті зниження активності пФГМ в листі рослин П-5, П-9, П-40 та П-60 становило 70, 69, 60 та 71 % відповідно; в разі вираження результату у вигляді загальної активності ФГМ — ДТ 100% (16,8 ± 1,1 мікромолей на грам свіжої маси за хвилину), П-5 66% (11,0 ± 0,7), П-9 70% (11,8 ± 0,5), П-40 87% (14,8 ± 1,0), П-60 65% (10,9 ± 0,6).

Для визначення вмісту вуглеводів зразки листя були взяті 6 разів протягом доби з 6 незалежних рослин кожної лінії. Результати показали значне зниження вмісту крохмалю протягом як світлового, так і темнового періоду, причому рівень спаду корелював з мірою зниження активності пФГМ. Вміст сахарози також був зменшений, особливо в темновий період. З метою проаналізувати рівень фотосинтетичної активності цих рослин було проведено аналіз газообміну в листі контрольних і трансгенних рослин, в результаті чого було встановлено, що рослини П-5 і П-60 мають статистично достовірно знижений рівень асиміляції СО2, в той же час як лінія П-40, що має найменше зниження пФГМ активності, посідає місце, близьке до ДТ. Подібні дані були отримані також для показника рівню транспірації. Аналіз вмісту хлорофілу та каротиноїдів не виявив жодних відхилень від показників рослин дикого типу. Також за фенотипом трансгенні рослини не відрізнялися від контрольних.

Як комплементарний метод для дослідження фотосинтетичних процесів, було застосовано експеримент з міченим 14СО2. Результати показали, що як і при газообмін-експерименті, рівень асиміляції СО2 був значно знижений у рослин П-5 та П-60, окрім того спостерігалося яскраво виражене зменшення вмісту мітки, інтегрованої в крохмаль, яке підтверджує попередні дані щодо його вмісту. Також відповідно був збільшений відсоток 14С, інтегрованого в сахарозу та інші етанолрозчинні фракції.

Для того, щоб визначити вплив зниження активності пФГМ на первинний метаболізм вуглецю, було виміряно вміст основних фосфорильованих сполук гліколізу та біосинтезу сахарози та крохмалю. Вміст глюкозо-6-фосфату, глюкозо-1-фосфату та фруктозо-6-фосфату був знижений; хоча рівень 3-фосфогліцеринової кислоти лишився незмінним, спостерігалося значне зменшення вмісту тріозофосфатів та неорганічного фосфату (статистично достовірне у випадку П-60 — лінії, що має найбільше зниження активності пластидної фосфоглюкомутази). Далі вниз по гліколітичному шляху був зменшений вміст фосфоенолпірувату (П-5, П-9) та пірувату (П-9, П-60).

Аналіз нуклеотидів та нуклеозидів, застосовуючи метод рідинної хроматографії, виявив зниження вмісту УДФ-глюкози та зменшене АТФ/АДФ співвідношення, яке може вказувати на недостатній енергетичний потенціал для біосинтетичних процесів.

Для детальнішого біохімічного дослідження було також застосовано метод газової хроматографії, сполученої з мас-спектрометрією, який дозволив виявити численні зміни в складі амінокислот та органічних кислот. В більшості випадків спостерігалося зростання вмісту амінокислот, наприклад, аспарагіну (в 2-4 рази), глютамінової кислоти, ізолейцину, лізину, фенілаланіну, серину, тирозину, валіну (1,2 – 2,2); але був також і спад — метіоніну (1,5 – 2,3) та г-аміно-бутилової кислоти (1,5 – 2,9). Також спостерігалося масивне зниження пулу органічних кислот, включаючи такі ключові, як янтарна, яблучна, лимонна, б-кетоглютарова ( в 1,2 – 3 рази). Окрім цього, за допомогою даного методу було виявлено зниження вмісту мальтози до 35-60% від рослин дикого типу.

З метою визначити можливий вплив пригнічення пФГМ на активність інших ферментів, задіяних в шляхах гліколізу, біосинтезу крохмалю та мобілізації сахарози, були виміряні також максимальні каталітичні активності деяких ключових ферментів. Результати в основному не виявили значних змін (це стосується АДФ-глюкозо-пірофосфорилази, УДФ-глюкозо-пірофосфорилази, енолази, фосфофруктокінази, піруваткінази, фосфоглюкозоізомерази, тріозофосфатізомерази), за виключенням збільшення активності альдолази (П-60), цитозольної фруктозо-1,6-бісфосфатази ( П-5, П-9, П-60), зниження гліцеральдегід-3-фосфат-дегідрогенази та сахарозо-фосфат-синтази (СФС) (П-5). Також не було виявлено відмін в селективній активності СФС та в активаційному стані цього ферменту. Щодо ферментів, задіяних також у циклі Кальвіна, слід відмітити зниження активності фосфорибулокінази та зростання активності транскетолази у рослин лінії П-60. В результаті вимірювання активності рибулозо-1,5-бісфосфат карбоксилази/оксигенази було встановлено, що загальна активність цього ферменту збільшена (достовірно відмінна у випадку П-60). В активностях двох інших проаналізованих ферментів циклу Кальвіна, НАДФ+-залежної гліцеральдегід-3-фосфат-дегідрогенази та фосфогліцераткінази, відмінностей не виявлено.

Наші результати узгоджуються з попередніми дослідженнями безкрохмальних мутантів Arabidopsis thaliana (Caspar et al., 1985) та Nicotiana sylvestris (Hanson, 1990), в яких точкові рецесивні ядерні мутації призвели до майже повної відсутності активності пластидної ізоформи фосфоглюкомутази, в тому, що зменшення активності цього ферменту призвело до значного зниження рівню накопичення крохмалю як в бульбах, так і в листі трансгенних рослин картоплі, а також до пригнічення фотосинтезу. Можливою причиною обмеження фотосинтетичних процесів, виходячи з наявних даних, є лімітація кінцевим продуктом, тобто пригнічення фотосинтезу через зменшену рециркуляцію неорганічного фосфату протягом синтезу сахарози. Дані, що підтримують цю гіпотезу — низький рівень Фн, УДФ-глюкози, зменшення вмісту сахарози, зниження АТФ/АДФ та підвищення 3-ФГК/ТФ співвідношення. З наших результатів випливає, що трансгенні рослини, які характеризуються зниженим рівнем синтезу крохмалю та сахарози, мають збільшений розподіл вуглецю у напрямку синтезу амінокислот. Якщо проаналізувати конкретні амінокислоти, вміст яких підвищено, то можна помітити, що за виключенням серіну, всі ці амінокислоти синтезуються в пластиді (Coruzzi and Last, 2000). Навпаки, вміст тих амінокислот, які синтезуються за межами пластиди (у нашому випадку метіонін та -аміномасляна кислота) знижений в антисенс-пФГМ рослинах. Вищенаведені зміни в амінокислотах та органічних кислотах в основному узгоджуються з моделлю фотосинтетичного синтезу сахарози (Stitt, 1997) в тому, що підвищене співвідношення фосфорильованих проміжних сполук фотосинтезу до неорганічного фосфату пригнічує експорт тріозофосфатів з хлоропласту.

Одним з наслідків такого пригнічення в трансгенних рослинах є зниження забезпечення вуглецем циклу Кребса та його похідних. Всередині ж хлоропласту вуглець, який за нормальних умов був би спрямований на синтез крохмалю, в основному використовувався у напрямку амінокислот, шляхи біосинтезу яких локалізовані в пластиді.

Вплив зниження активності цитозольної ізоформи фосфоглюкомутази на фотосинтетичний метаболізм рослин картоплі.

В даній роботі ми проаналізували вплив зниження активності цитозольної ізоформи фосфоглюкомутази на фотосинтетичний метаболізм рослин картоплі. Трансгенні рослини з різним ступенем пригнічення активності ферменту були отримані шляхом антисенсного пригнічення відповідної РНК (Fernie et al., 2002). В результаті залишкова специфічна активність цФГМ в листі

Рис. 1. Схематичне представлення відмінностей в ферментах і метаболітах антисенс-пФГМ рослин

рослин Ц-29, Ц-44 та Ц-66 становила 18, 21, та 6 % відповідно; в разі вираження результату у вигляді загальної активності ФГМ — ДТ 100% (16,8 ± 1,1 мікромолей на грам свіжої маси за хвилину), Ц-29 54% (9,1 ± 0,4), Ц-44 57% (9,5 ± 1,0), Ц-66 48% (8,1 ± 0,6).

Трансгенні рослини відрізнялись від контрольних за фенотипом, особливо це було помітно на рослинах лінії Ц-66, що має лише 6% цФГМ активності. Рослини значно відставали у рості, цвітіння наступало пізніше на 1,5-2 тижні. Аналіз вмісту хлорофілу та каротиноїдів показав зниження їх вмісту в листі рослин лінії Ц-66. Результати вимірювання біомаси виявили статистично достовірне зниження маси як надземної частини (листя + стебла) (на 30%), так і клубнів (на 45%) у рослин цієї лінії. Окрім цього, суха вага листя була на 25% менша, ніж у ДТ.

Зважаючи на те, що ФГМ є ключовим ферментом у метаболізмі сахарози та крохмалю, нами були взяті зразки листя 6 разів протягом доби для аналізу динаміки вмісту вищеназваних вуглеводів. Результати показали, що в цілому рівень крохмалю та сахарози в трансгенних рослинах істотно не відрізнявся від контрольних рослин (спостерігалося незначне зниження вмісту сахарози в рослинах лінії Ц-44 в 2 пунктах). Якщо результат щодо вмісту крохмалю є очікуваним (так як в хлоропласті присутня пластидна ізоформа ФГМ), то практично незмінний вміст сахарози в трансгенних рослинах є несподіваним, беручи до уваги значне (79-94%) зменшення активності цФГМ, яка надає глюкозо-1-фосфат для подальшого біосинтезу сахарози.

Для вияснення можливої причини було визначено вміст основних фосфорильованих сполук – проміжних компонентів шляхів біосинтезу сахарози, крохмалю та також гліколізу. Результати

показали, що вміст усіх гексозофосфатів та тріозофосфатів був знижений, також спостерігалося значне зменшення пулу фосфоенолпірувату та пірувату (в 2-2,5 рази для рослин ліній Ц-44 та Ц-66), в той же час рівень 3-фосфогліцеринової кислоти та неорганічного фосфату лишився незмінним.

Аналіз нуклеотидів та нуклеозидів методом високопродуктивної рідинної хроматографії виявив значне зниження вмісту УДФ-глюкози та АДФ (статистично достовірне для всіх ліній), також АТФ (Ц-29), суми аденілатів (Ц-29 та Ц-66) та уридинілатів (Ц-29).

З метою отримати детальніший біохімічний аналіз, було застосоване профілювання метаболітів цих рослин за допомогою методу газової хроматографії, сполученої з мас-спектрометрією, яке дозволило виявити численні зміни широкого спектру метаболітів. Серед найважливіших можна відмітити значне зниження вмісту амінокислот, наприклад, аспарагіну (в 4 рази), лейцину, ізолейцину, валіну, серину, лізину, тирозину (1,5-2,2 рази). Аспарагін є одним з найважливіших джерел для зберігання та транспорту азоту, і таким чином, грає одну з визначальних ролей в рості та розвитку рослини. Пул органічних кислот в цілому не зазнав значних змін, хоча можна відмітити зниження вмісту бензойної та шикімової кислот (в 1,5-3 рази), які є попередниками біосинтезу компонентів клітинної стінки. Цікавим також є факт, що за допомогою даного методу було виявлено зниження вмісту катехоламінів (норадреналіну, допаміну та тираміну) у 1,7-3,2 рази в трансгенних рослинах. В сучасній біології дискутується роль цих гормонів для рослинних організмів як антистресових протекторів.

Зважаючи на яскраво виражений пригнічений фенотип трансгенних рослин та знижений вміст хлорофілу, нами було проведено аналіз газообміну в листі нативних рослин ліній Ц-44, Ц-66 та ДТ. Для цього два однакових сета рослин культивувалися на протязі 7 тижнів в умовах високої та низької інтенсивності світла відповідно, після того основні параметри газообміну були виміряні. Рівень асиміляції СО2 трансгенними рослинами у порівнянні з диким типом був значно знижений в умовах вирощування при високій інтенсивності світла. Цей факт було також доведено в експерименті з міченим 14СО2, в якому асиміляція радіоактивного 14С була значно зменшена у випадку трансгенних рослин. Також приблизно на стільки ж (25-30%) був знижений рівень транспірації.

З метою висвітлити можливі причини та наслідки значного зниження фотосинтетичного потенціалу антисенс-цФГМ рослин, було проведено розгорнутий аналіз активності ферментів, задіяних у фотосинтезі, а також у біосинтезі сахарози та крохмалю. В більшості ферментів максимальні активності лишилися незмінними, але варто звернути увагу на значно знижені максимальні активності сахарозо-фосфат-синтази та УДФ-глюкозо-пірофосфорилази. Щодо фотосинтетичних ферментів, загальна активність Рубіско (найважливішого ферменту циклу Кальвіна) незначно зменшена, окрім цього, знижені активності гліцеральдегід-3-фосфат-дегідрогенази (НАДФ+ -залежної), фосфогліцераткінази, тріозофосфатізомерази та транскетолази.

Рис. 2. Схематичне представлення відмінностей в ферментах і метаболітах антисенс-цФГМ рослин.

Таким чином, найважливішим наслідком впливу зменшення активності цитозольної ФГМ на фотосинтетичний метаболізм рослин картоплі стало значне пригнічення фотосинтезу та наступне зменшення відповідних метаболітів (наприклад, тріозофосфатів, аденілатів, амінокислот), що призвело до значного відставання у рості трансформованих рослин. Виходячи з отриманих даних, наступна гіпотеза механізму пригнічення фотосинтезу може бути запропонована: експорт тріозофосфатів з хлоропластів може бути занадто швидким, і тоді їх надлишкове вилучення на початку світлового періоду буде попереджувати автокаталітичний синтез сполук циклу Кальвіна, таким чином знижуючи рівень фотосинтезу. Дані, що підтримують цю гіпотезу — знижений вміст тріозофосфатів, знижені активності деяких ферментів циклу Кальвіна та також спостереження, що в умовах слабкого освітлення рівень фотосинтезу (за даними газообмін-експерименту) у трансгенних рослин не відрізняється від контрольного.

Беручи до уваги значне зниження вмісту УДФ-глюкози як наслідок пригнічення цФГМ, а також знижені активності сахарозо-фосфат-синтази та УДФ-глюкозо-пірофосфорилази, механізм, за допомогою якого рослини можуть підтримувати нормальний рівень синтезу сахарози, лишається невідомим. Можливе використання компенсаторних механізмів, або ж (що представляється більш вірогідним) синтез сахарози підтримується за рахунок зменшення рівню біосинтезу інших клітинних компонентів (наприклад, амінокислот, органічних кислот, нуклеотидів або компонентів клітинної стінки).

Вплив підвищеної активності фосфоглюкомутази, локалізованої в цитозолі, на первинний метаболізм рослин картоплі.

В представленій роботі були успішно отримані рослини картоплі, в геномі яких експресується ген фосфоглюкомутази з Escherichia coli (Lu and Kleckner, 1994). Так як в конструкції, яку було введено в рослини, відсутня будь-яка послідовність, що спрямовує синтезований протеїн в пластиду, фермент продукується і функціонує в цитозолі клітин рослин картоплі. Ступінь гомології гену фосфоглюкомутази (EcФГМ) на рівні послідовності нуклеотидів по відношенню до цитозольної та пластидної ізоформи картоплі складає 49% та 38% відповідно. Нами було проведене пряме визначення рівню експресії гену фосфоглюкомутази з Escherichia coli в трансгенних рослинах за допомогою Нозерн-блот гібридизації (Рис.3). Результати показали наявність транскрипту гену EcФГМ в трансгенних рослинах. За результатами вимірювання загальної активності фосфоглюкомутази, трансгенні рослини характеризувалися активністю ФГМ в бульбах більшою, ніж 200% у порівнянні з контрольними рослинами. Виміряна активність ферменту корелювала з рівнем експресії відповідної мРНК у всіх трансгенних лініях. Активність фосфоглюкомутази в листі становила 260% від контрольної у разі кращої транвгенної лінії.

Метою аналізу EcФГМ трансгенних рослин була базова характеристика впливу підвищеної активності фосфоглюкомутази в цитозолі на метаболізм вуглеводів в тканині бульби та листа, а також аналіз фотосинтетичної активності рослин. Під впливом підвищеної активності ФГМ в цитозолі можна передбачити більший потік субстрату (глюкозо-1-фосфату) у напрямку синтезу

Рис 3. Рівень експресії EcФГМ гену в 10-тижневих бульбах трансгенних та контрольних рослин (ДТ)

сахарози в цитозолі та, відповідно, зменшення пулу метаболітів, що використовуються для синтезу крохмалю в пластиді. В EcФГМ трансгенних рослинах має місце підвищений вміст сахарози в листі та знижений вміст крохмалю в бульбах, що узгоджується із запропонованою схемою метаболічних змін.

Пояснення причини зниження вмісту крохмалю в бульбах і відсутність змін в його вмісті в листі можна запропонувати таке, що крохмаль в бульбах є основним домінуючим вуглеводом, і крім того, бульби є кінцевим пунктом запасання крохмалю, на відміну від листя, де синтезується транзиторний крохмаль. Таким чином, вплив модифікації шляхів біосинтезу крохмалю в бульбах мають більш істотні наслідки для первинного метаболізму вуглеводів. Цей факт можна також проілюструвати чіткою кореляцією залежності зниження вмісту крохмалю в бульбах від підвищення активності фосфоглюкомутази в цитозолі рослин картоплі.

Фотосинтетична активність EcФГМ рослин була не змінена, принаймні результати експерименту з радіоактивним СО2 свідчили про відсутність будь-яких ушкоджень рівню фотосинтезу. Крім того, активність Рубіско не зазнала змін та рослини не відрізнялися за фенотипом від контрольних рослин. Як протилежний ефект порівняно до антисенсних рослин, які мають знижену активність фосфоглюкомутази в цитозолі, можно було б очікувати підсилення фотосинтетичної активності рослин, які експресують E.coli ФГМ в цитозолі. Але широко відомим є факт, що пригнічуючий вплив завжди має істотніші наслідки на метаболізм вищих рослин, особливо це стосується фотосинтезу. Виходячи з наведених нами даних, можна зробити висновок, що створення та аналіз рослин картоплі, які характеризуються підвищеною активністю фосфоглюкомутази в цитозолі за рахунок експресії гену фосфоглюкомутази з Escherichia coli, підтвердили важливу роль цього ферменту в метаболізмі вуглеводів як в гетеротрофній, так і в автотрофній тканинах. Модифікація активності ФГМ в сторону збільшення призвела (як і у випадку зменшення) до значного перерозподілу вуглецю між синтезом сахарози та крохмалю, що є визначальними метаболічними процесами життєдіяльності вищих рослин.

ВИСНОВКИ

1. Вперше було проаналізовано вплив зниження активності пластидної та цитозольної ізоформ фосфоглюкомутази на фотосинтетичний метаболізм рослин картоплі, дослідженого за допомогою трансгенних рослин, в яких експресія відповідних генів була пригнічена в різному ступені методом антисенс-РНК.

2. Показано, що зниження активності пластидної ізоформи фосфоглюкомутази картоплі призвело до зниженого рівню біосинтезу крохмалю в листі, зсуву розподілу вуглецю у напрямку синтезу пластидних амінокислот та пригнічення фотосинтезу за рахунок зменшеної рециркуляції неорганічного фосфату.

3. Продемонстровано, що зниження активності цитозольної ізоформи фосфоглюкомутази картоплі призвело до значного пригнічення росту та затримки розвитку рослин, істотного пригнічення фотосинтезу та значних змін в таких біосинтетичних процесах, як синтез нуклеотидів та амінокислот.

4. За допомогою трансгенного підходу встановлено, що зниження активності цитозольної фосфоглюкомутази до 6% не викликає значних змін у рівні синтезу сахарози в фотосинтетичній тканині картоплі.

5. Вперше були отримані та проаналізовані рослини картоплі, в яких експресувалася гетерологічна фосфоглюкомутаза з Escherichia coli. Результати аналізу рослин з підвищеною активністю фосфоглюкомутази в цитозолі підтвердили важливу роль цього ферменту як в гетеротрофній, так і автотрофній тканинах, так як модифікація активності цитозольної фосфоглюкомутази призвела до значного перерозподілу вуглецю між синтезом сахарози та крохмалю.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації:

1.