НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

ЛОЗОВА НАТАЛІЯ ОЛЕКСІЇВНА

УДК 612.17“

Роль позасинаптичних НМДА рецепторів в збуджуючій СА3-СА1 синаптичній передачі в гіпокампі ссавців”

03.00.13 – Фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття вченого ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця Національної Академії Наук України

Науковий консультант - академік, доктор біологічних наук Кришталь Олег Олександрович,

зав відділом клітинної мембранології Інституту фізіології ім О.О.Богомольця

НАН України

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Веселовський Микола Сергійович. - заступник директора Міжнародного центру Молекулярної Фізіології НАН України

доктор біологічних наук, професор Костерін Сергій Олексійович. - зав. відділом біохімії м'язів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України

доктор медичних наук, професор Безруков Владіслав Вікторович. - директор Інституту геронтології АМН України.

Провідна установа: Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця, кафедра нормальної фізіології.

Захист відбудеться “_30_” квітня__ 2002 року о _10.00_ годині на засіданні спеціалізованої ради Д- 26.198.01при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий “_30”_ березня_ 2002 р.

Вчений секретар спеціалізовоної ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

Вступ

Актуальність проблеми. Збуджуюча синаптична передача належить до найбільш фундаментальних механізмів обробки інформації в мозку. Принципи модуляції AMPA- та NMDA-компонентів глутаматергічних збуджуючих синаптичних сигналів під впливом різноманітних нейромодуляторних сполук є однією з кардинальних проблем в галузі нейронаук. Більшість літературних даних свідчать про те, що зміна ймовірності вивільнення медіатору викликає пропорційну модуляцію AMPA- та NMDA-компонентів збуджуючих постсинаптичних струмів (ЗПСС) або збуджуючих постсинаптичних потенціалів. Такі факти дозволяють зробити припущення про те, що імпульсіндуковане вивільнення медіатору відбувається за принципом “все або нічого”. Згідно з цією гіпотезою, з кожної окремої пресинаптичної терміналі в синаптичну щілину вивільнюється тільки одна везикула глутамату, а змінювання амплітуди постсинаптичного сигналу пов'язане лише зі зміною кількості функціонуючих терміналей. При моновезикулярному вивільненні нейротрансмітера його концентрація в синаптичній щілині зберігається практично сталою. Отже, оскільки в постсинаптичній області AMPA- та NMDA-рецептори колокалізовані, зміна кількості терміналей, що синхронно активуються, має призводити до пропорційних змінювань AMPA- та NMDA-компонентів сигналу.

У межах класичної парадигми вважається, що ефективна синаптична передача здійснюється за умови незалежності активності та її модифікування в окремих синапсах. Проте постає питання, чи насправді синапси функціонують незалежно один від одного при різних рівнях електричної активності мозку. Інакше кажучи, чи зможе нейротрансмітер, вивільнений в одному синапсі, впливати на рецептори, розташовані в сусідньому синапсі? Відповідь на це питання має принципове значення для розуміння механізмів синаптичної передачі. Взаємодія сусідніх синапсів може бути залучена до таких феноменів синаптичної пластичності, як довготривала потенціація та довготривала депресія. Нещодавно отримані дані свідчать про те, що екстрасинаптична передача, опосередкована дифузією нейроактивних субстанцій через позаклітинну рідину, відіграє важливу роль у взаємодії сусідніх та віддалених нейронів і гліальних клітин. Було сформульовано гіпотезу про можливість “перевиливу” такого найважливішого збуджуючого нейромедіатору, як глутамат, та взаємодію синапсів через дифузію глутамату від одного синапсу до іншого. Знайдено експериментальні докази існування цього явища в гіпокампі - структурі, що бере безпосередню участь у процесах запам'ятовування інформації. Куллман і співавт. зазначали, що глутамат, який вивільнився у синаптичній щілині, може активувати позасинаптичні NMDA-рецептори в сусідніх синапсах. В умовах збільшеного вивільнення медіатору активація екстрасинаптичних NMDA-рецепторів може бути істотною, і, як наслідок, вага NMDA-рецепторопосередкованого компонента в синаптичній передачі істотно збільшується.

Вивчення цієї проблеми є особливо актуальним у зв'язку з тим, що численні патологічні стани мозку (зокрема, епілептичні та ішемічні, травми мозку, нейродегенеративні процеси, порушення активності гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової осі) пов'язані з порушеннями нормального функціонування глутаматергічної передачі. Особлива роль в індукції нейродегенеративних процесів відводиться NMDA-рецепторам. Їх гіперактивність призводить до надлишкового входу кальцію в клітину та активації каскаду біохімічних реакцій, що спричиняють загибель нейронів. Блокатори цих рецепторів досліджуються як протисудомні, аналгетичні та протиішемічні агенти.

Механізми нейротоксичності глутамату досі до кінца не з'ясовані. Одним з принципових механізмів ініціації процесів, що призводять до загибелі нейронів, може бути активація позасинаптичних глутаматних рецепторів.

Мета нашої роботи полягала в з'ясуванні функціональної ролі позасинаптичних NMDA-рецепторів у збуджуючій синаптичній передачі в зонах СА3-СА1 гіпокампа щурів в умовах збільшеного вивільнення глутамату.

Для досягнення даної мети були поставлені такі конкретні завдання:

1. Оцінити внески NMDA- та AMPA-рецепторопосередкованих компонентів у сумарний ЗПСС, а також кінетику перебігу цих компонентів при фармакологічних впливах, які викликають збільшення вивільнення глутамату в зрізах гіпокампа.

2. Встановити залежність цих параметрів ЗПСС від інтенсивності та частоти пресинаптичної стимуляції.

3. З'ясувати механизми активації стимулзалежного затриманого NMDA-рецепторопосередкованого компонента, яка виникає за умов, згаданих вище. Перевірити припущення, що даний компонент є наслідком активації позасинаптичних NMDA-рецепторів.

4. З'ясувати роль позаклітинного кальцію в збільшенні внеску NMDA-компонента в сумарний ЗПСС.

5. Встановити роль транспорту глутамату в активації позасинаптичних рецепторів.

6. Вивчити феномен модуляції позасинаптичним глутаматом синаптичної передачі в гіпокампі.

7. Дослідити довготривалі зміни синаптичної передачі, викликані впливом позаклітинного глутамата.

Наукова новизна. Вперше показано, що в умовах підвищеного вивільнення медіатору відбувається драматичне збільшення внеску NMDA-рецепторопосередкованого компонента в сумарний ЗПСС, який реєструється в нейронах зони СА1 гіпокампа при стимуляції колатералей Шаффера. Вперше отримано експериментальні докази того, що цей компонент зумовлений активацією позасинаптичних NMDA-рецепторів глутаматом, який при збільшенні ймовірності його синаптичного вивільнення накопичується у позасинаптичному просторі. Продемонстровано, що стимуляція синаптичних входів короткими серіями стимулів (1-10, з частотою 100-200 с-1) призводить до аналогічного збільшення внеску NMDA-компоненти у ЗПСС, і це також також обумовлено активацією позасинаптичних рецепторів внаслідок збільшення концентрації глутамату в позаклітинному просторі. Встановлено, що позасинаптичні рецептори глутамату за своїми фармакологічними властивостями помітно відрізняються від синаптичних: вони більш чутливі до іфенпродилу, тобто ці рецептори є в основному NMDA-рецепторами, котрі містять NR2B-субодиницю (на відміну від синаптичних рецепторів, які є в основному NR2A-вмісними рецепторами). Отже, вперше показано, що при зміні патерну електричної активності пресинаптичних нейронів СА3 (появі високочастотних серій імпульсів) відбувається істотне збільшення NMDA-компоненту збуджуючої передачі до постсинаптичних нейронів СА1 і при цьому збільшується внесок NR2B-вмісних NMDA-рецепторів.

Показано, що активація позасинаптичних NMDA-рецепторів в основному контролюється дигідрокаїнат(каїнат)-чутливими транспортерами, здогадно типу GLT-1. Вперше продемонстровано, що NMDA-рецептори, котрі розташовані в постсинаптичній області, ізольовані від позасинаптичного простору за допомогою систем глутаматного транспорту також GLT-1-типу.

Практична цінність роботи. Отримані в роботі дані про механізми активації та фармакологічні особливості позасинаптичних NMDA-рецепторів можуть стати основою для розробки високоселективних фармакологічних засобів для попередження цитотоксичності глутамату при травматичних пошкодженнях або ішемії мозку. Наші дані про переважний внесок NR2В-субодиниць у позасинаптичні NMDA-рецептори вказують на перспективність підходів, які забезпечували б відвернення “гіперглутаматного” зростання вмісту кальцію під дією селективних блокаторів цієї субодиниці.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дослідження проводилися відповідно до планів наукової праці відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України і Міжнародного Центра молекулярної біології по темі "Вивчення фізіологічних механізмів, що забезпечують включення НМДА рецепторів у зоні СА1 гиппокампа при патофізиологічних умовах".

Робота підтримувалася наступними грантами: HHMІ 75195-548001, ІNTAS 93-0822, 94-072, 96-1493, 97-0382.

Апробація роботи. Основні положення дисертації неодноразово доповідалися на семінарах Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Інституту досліджень мозку ім. Макса Планка (Франкфурт-на-Майні, Німеччина) і представлялися на таких конференціях:

Перший конгрес Федерації европейських фізіологічних товариств (FEPS) (Маастріхт, Нідерланди, 1995); симпозіум “Патологія церебральної нейротрансмісії” (Магдебург, Німеччина, 1997); XXXIII Міжнародний конгрес фізіологічних наук (Санкт-Петербург, Росія, 1997); XII Конгрес Польського фармакологічного товариства (1995); Конференція Американського товариства нейронаук (Вашингтон, 1996; Нью-Орлеан, 1997; Лос Анжелес, 1998; Майамі, 1999; Сан-Діего, 2001); Перша конференція Українського товариства нейронаук (Київ, 1998); Ізраїльсько-Українська конференція “Гени та молекули збудливості" (Ізраіль, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 41 роботу у наукових журналах та книгах.

Обсяг та структура дисертації. Роботу викладено на 329 сторінках друкованого тексту та проілюстровано 104 рисунками і 4 таблицями. Дисертація складається з вступу, опису та аналізу сучасного стану досліджень, опису методів дослідження, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел (377 найменувань).

Обўєкти та методи дослідження. Для дослідження синаптичної передачі в гіпокампі щурів були використані такі методичні підходи: a) реєстрація антидромно та ортодромно викликаних електричною стимуляцією популяційних потенціалів дії (ПД) у зрізах гіпокампа; б) реєстрація ЗПСС окремих нейронів зони CA1 у відповідь на електричну стимуляцію провідних шляхів з зони СА3 .

У роботі були вікористані зрізи завтовшки 300-600 мкм, виготовлені з гіпокампа щурів лінії Вістар WAG\GSto (вік 18-30 діб). Електрофізіологічні параметри реєстрували в позаклітинному розчині такого складу (у мілімолях на 1 л): NaCl, 135; NaHCO3, 18; KCl, 2.7; СаСl2, 1.5; MgCl2, 1.5; глюкоза 20 (pH 7.35-7.4 при насиченні карбогеном) при температурі +31 оС або 20-23 оС. Гальмівні впливи, опосередковані активацією ГАМКА-рецепторів, усували шляхом додавання до позаклітинного розчину антагоністів цих рецепторів бікукуліну або пікротоксину (25-50 мкМ). Щоб отримати викликані синаптичні відповіді в зоні СА1 гіпокампа, ми використовували біполярну стимуляцію колатералей Шаффера за допомогою біполярних ізольованих ніхромових електродів завтовшки 50 мкм. Електрод для відведення фокальних ПД знаходився безпосередньо у зоні, де були розташовані тіла пірамідних нейронів (stratum pyramidale) та дендрити (stratum radiatum). Реєстрацію ЗПСС здійснювали з використанням методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина”. У роботі використовували зрізи, у котрих синаптична передача між зонами СА3 та СА1 гіпокампа була припинена в результаті відповідного перерізу (так звані мінізрізи). Це допомагало запобігти активації рекурентних зв'язків СА3-CA1 та їх впливу на синаптичну передачу СА3-СА1. Внутрішньопіпетковий розчин вміщував (в мілімолях на 1 л): CsF (або Tris-PO4), 100; NaH2PO4, 40; HEPES-CsOH, 10; Tris-Cl, 10 (pH 7.3). Щоб заблокувати натрієві трансмембранні струми, до розчину додавали місцевий анестетик лідокаїн (QX-314, 1-3 мМ). Після заповнення мікропіпетки внутрішньоклітинним розчином її опір складав 1-3 МОм. Оскільки максимальна амплітуда зареєстрованих ЗПСС не перевищувала 2 нА, похибка фіксації потенціалу, зумовлена опором піпетки, була не більше 2-6 мВ.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Активація позасинаптичних NMDA-рецепторів при збільшенні ймовірності вивільнення глутамату в синаптичних закінченнях колатералей Шаффера, зумовленому різними фармакологічними впливами

Модуляція збуджуючої синаптичної передачі під впливом блокаторів потенціалкерованих каліевих каналів (K+-каналів)

Полегшуючий вплив блокаторів K+-каналів на синаптичну передачу пояснюється збільшенням тривалості пресинаптичного ПД або ініціацією повторних разрядів, які зумовлюють збільшений ступінь деполяризації пресинаптичних терміналей і, отже, підвищення рівня внутрішньоклітинного кальцію ([Са2+]in). Останнє є необхідним для ініціації процесів, які викликають зливання везикул з пресинаптичною мембраною [Augustine, 1990; Jackson, 1991]. Згідно з цими даними, у наших експериментах використовувалися 4-амінопіридин (4-AP), a-дендротоксин (a-DTx) та тетраетиламоній (TEA), котрі є блокаторами K+-струмів відповідно ID-, IA- та IDR-типів [Storm, 1993]. Усі ці агенти збільшували амплітуду ЗПСС (Рис. 1).

Під впливом 4-АР, a-DTx і ТЕА кінетика спаду ЗПСС при збільшенні інтенсивності стимуляції уповільнювалася, тобто вона ставала стимулзалежною. У контролі зміна амплітуди стимулів від 15 до 750 мкА або їх тривалості призводила до пропорційної зміни амплітуди як AMPA-, так і NMDA-компонентів синаптичної передачі; кинетика сумарного ЗПСС при варіюванні сили стимулу не змінювалася (Рис. 2). У присутності в позаклітинному розчині блокаторів K+-каналів збільшення інтенсивності стимуляції спричиняло драматичне уповільнення кінетики спаду ЗПСС: співвідношення амплітуд ЗПСС, виміряних через 50 і 7 мс після нанесення стимулу (I50/7), відповідно збільшувалося (у середньому в два-три рази) і досягало в деяких випадках одиниці. Слід відзначити, що відношення I50/7 зоставалося збільшеним після вилучення 4-АР із позаклітинного розчину щонайменше ще протягом 60 хв (Рис. 3)

У межах звичайних величин амплитуди ЗПСС (<750 пА) коефіцієнти кореляції між I50 та I7 в контролі та в присутності 4-АР статистично відрізнялися. Коли амплітуди перевищували 700 пА, спостерігалося непропорційно більше підвищення I50 порівняно з І7.

У контролі спад ЗПСС визначався сумацією спаду “повільного” NMDA- та “швидкого” неNMDA-компонентів ЗПСС [Hestrin, 1990]. У наших експериментах t спаду фармакологічно ізольованого AMPA-компоненту ЗПСС складала 12.03 ± 0.6 мс (n = 10); отже, амплітуда ЗПСС, виміряного через 50 мс після нанесення стимулу, характеризує саме його NMDA-компонент. Ці кінетичні особливості компонентів ЗПСС, зокрема, відношення I50/7, були використані для оцінки внесків швидкого та повільного компонентів струмів у сумарний ЗПСС, тобто внесків NMDA- та неNMDA-компонентів. У присутності в позаклітинному розчині блокаторів K+-каналів і у разі нанесення відносно інтенсивних стимулів відношення I50/7 дуже зростало, що відповідає збільшенню внеску NMDA-компоненту в сумарний ЗПСС.

З урахуванням цього спостереження заслуговує на увагу той факт, що D-APV у концентрації 50 мкМ спричиняв оборотне блокування появи затриманого стимулзалежного компоненту ЗПСС, зумовленого прикладанням блокатору K+-каналів 4-АР (Рис.4).

Крім того, затриманий стимулзалежний компонент зникав у випадку зміни підтримуваного потенціалу з -50 до -90 мВ, при котрому NMDA-рецепторкеровані канали повністю потенціалзалежно блокуються іонами Мg2+ [Mayer, 1984; Nowak, 1984]. Отже, можна зробити висновок, що збільшення затриманого стимулзалежного компоненту ЗПСС, який виникав після прикладання 4-АР, є опосередкованим активацією NMDA-рецепторів.

Позаклітинна аплікація NBQX призводила до швидкого необоротного пригнічення не-НМДА компоненту ЗПСС, проте не впливала на появу затриманого стимулзалежного компоненту. Останнє спостереження, очевидно, свідчить на користь того, що неNMDA-рецептори не залучені в механізми, зв'язані з появою стимулзалежного компоненту.

У наших експериментах прикладання блокаторів потенціалкерованих K+-каналів викликало збільшення внеску NMDA-рецепторопосередкованого компоненту ЗПСС (ЗПССNMDA) залежне від амплітуди пред'явленого стимулу (Рис.2). При цьому слід враховувати, що істотне збільшення амплітуди постсинаптичного сигналу повинно призводити до певних експериментальних похибок при реєстрації ЗПСС (внаслідок похибок фіксації потенціалу на віддалених ділянках дендритів пірамідних нейронів). Проте кінетика швидкого неNMDA-компоненту в присутності 4-АР не змінювалася.

Істотна деполяризація дендритів теоретично могла б спричиняти часткове усунення блокування NMDA-каналів іонами Мg2+ і, отже, стимулзалежне збільшення ЗПССNMDA у присутності блокаторів K+-каналів. Щоб перевірити припущення, чи не є прояв стимулзалежної кінетики ЗПССNMDA артефактом, зв'язаним з погіршенням умов фіксації потенціалу у віддалених дендритах при збільшенні амплітуди струмів, величина постcинаптичних струмів була зменшена до контрольних значень за допомогою часткового блокування NMDA-рецепторів під дією 2 мкМ D-APV. Незважаючи на те, що в цих умовах амплітуда ЗПССNMDA зменшувалася, кінетика спаду залишалась уповільненою. Отже, можна зробити висновок про те, що поява феномену стимулзалежності не зв'язана зі збільшенням похибки фіксації потенціалу. Крім того, важливим є відзначити, що спостережуваний нами ефект появи затриманого ЗПССNMDA також був присутнім при деполяризації мембрани до +20 мВ, коли згаданий струм має вихідний напрямок і блокування NMDA-каналів іонами Мg2+ повністю усувається.

4-АР активує пул “мовчазних” NMDA-рецепторів, які не беруть участі в синаптичній передачі в умовах контролю

Враховуючи факт, колокалізації NMDA- та AMPA-рецепторів в глутаматергічних синапсах [Bekkers, 1989], а також те, що синаптичні NMDA-рецептори насичуються глутаматом, який міститься в одній везикулі [Clements, 1996], логічно припустити: глутамат, вивільнений з пресинаптичних терміналей, повинен активувати як NMDA-, так і AMPA-рецептори. Звідси випливає, що внесок синаптичних NMDA- і неNMDA-рецепторів у ЗПСС має зберігатися постійним при будь-яких варіаціях інтенсивності пресинаптичного вивільнення глутамату. Природно, виникає питання щодо локалізації NMDA-рецепторів, здатних опосередковувати затриманий стимулзалежний компонент, який активується під впливом 4-АР. Щоб з'ясувати, чи є додаткові NMDA-рецептори за нормальних умов неактивними, або “мовчазними”, було проведено спеціальний експеримент. Усі активні синаптичні NMDA-рецептори були заблоковані за допомогою блокатору NMDA-рецепторкерованих каналів MK-801. Оскільки даний агент забезпечує блокування MK-801 лише за умови, що NMDA-рецепторкеровані канали є відкритими, блокуються тільки канали, активовані стимуляцією синаптичних входів у поле СА1 гіпокампа. Потім 4-АР прикладається протягом 15-20 хв у відсутності стимуляції входів. У випадку, якщо стимулзалежний затриманий компонент опосередковується синаптичними рецепторами, післе включення стимуляції ЗПССNMDA не повинен спостерігатися. Проте після початку такої стимуляції подібний струм реєструвався. Це факт свідчить про те, що прикладення 4-АР спричиняє активацію пулу “мовчазних” NMDA-рецепторів, які не беруть участі в синаптичній передачі в контрольний умовах (Рис. 5). Аналогічний результат було отримано у разі використання 8-циклопентилтеофіліну (СРТ) замість 4-АР.

Поява NMDA-рецепторопосередкованого компоненту, залежного від інтенсивності стимуляції, зумовлена підвищенням пресинаптичного вивільнення медіатору

Збільшення вивільнення глутамату з пресинаптичних закінчень може викликатися також в умовах блокування тонічно активних аденозинових А1-рецепторів під впливом селективного антагоністу цих рецепторів СРТ [Prestwich, 1987], а також активації протеїнкінази С (ПКС) форболовими ефірами, котрі, як відомо, імітують дію діацилгліцеролу - ендогенного активатора ПКС [Castagna, 1982; Parfitt, 1983]. Прикладання 60-100 нМ СРТ або 2-10 мкМ форбол-12,13-діацетату спричиняло ефекти, які були феноменологічно подібними до описаних вище для випадку блокування K+-каналів: збільшення амплітуди ЗПССNMDA та стимулзалежного уповільнення кінетики їх спаду. Характерно, що як у випадку активації ПКС, так і при блокуванні А1-рецепторів амплітуда фармакологічно ізольованих ЗПССнеNMDA збільшувалася, але кінетика спаду цього компоненту не змінювалася (дані не ілюструються).

Отже, наведені дані демонструють, що цілий ряд фармакологічних впливів (зокрема, активація ПКС, блокування тонічно активних аденозинових рецепторів під впливом селективного антагонисту А1-рецепторів СРТ, а також блокування потенціалкерованих K+-каналів) призводять до появи NMDA-рецепторопосередкованого стимулзалежного компоненту ЗПСС. Загальною властивістю перерахованих вище фармакологічних впливів є їх здатність збільшувати ймовірність пресинаптичного вивільнення глутамату. Зважаючи на ці факти, ми припустили, що поява стимулзалежного ЗПССNMDA зумовлена збільшеним Вивільненням глутамату. Оскільки вивільнення медіатору ініціюється входом Са2+ в пресинаптичну терміналь, для перевірки згаданого вище припущення ми дослідили характеристики ЗПСС в позаклітинному розчині з підвищенною концентрацією Са2+.

Дійсно, збільшення позаклітинної концентрації Са2+ від 1.5 до 5 мМ призводило до появи пізнього стимулзалежного компоненту, який феноменологічно й фармакологічно є таким же як і описаний вище (рис. 2).

Системи транспорту глутамату контролюють активацію позасинаптичних NMDA-рецепторів.

Наші результати свідчать про те, що у випадку збільшення ймовірності вивільнення глутамату частина вивільненого медіатору стає доступнішою для якоїсь популяції NMDA-, але не AMPA-рецепторів. У дослідженнях Куллмана та співавт. було виявлено, що NMDA-рецептори здатні активуватися тим глутаматом, котрий дифундує після везикулярного вивільнення із сусідніх синаптичних терміналей, тоді як АМРА-рецептори не беруть істотноі участі у подібній міжсинаптичній сигналізації внаслідок нижчої спорідненості до глутамату [Patneau, 1990]. Цей феномен було названо перевиливом (spillover) глутамату

[Kullmann, 1996]. Розподіл глутамату в межах синаптичної щілини і поза нею лімітується активністю систем глутаматного транспорту, котрі істотно обмежують дифузію глутамату з місця вивільнення [Asztely, 1997]. Щоб з'ясувати роль систем захоплення глутамату в спостережуваних нами феноменах, ми дослідили дію інгібітора глутаматного транспорту дигідрокаїнату (DHK) на синаптическую передачу. Було виявлено, що ізольовано прикладений DHK у концентрації 100 мкМ не викликав змін ані амплітуди, ані кінетики ЗПСС; цей факт відповідає літературним даним [Hestrin, 1990] (рис. 6). Очевидно, відсутність ефекту може бути зв'язана з тим, що лише вельми незначна кількість глутамату дифундує за межі синаптичної щілини при синаптичному вивільненні за нормальних умов. Проте, коли DHK прикладали на тлі аплікації 4-АР у невисокій концентрації (10 мкМ), цей агент викликав істотне стимулзалежне уповільнення сумарного ЗПСС і, відповідно, збільшення відношення І50/I7 у випадку пред'явлення стимулів великої інтенсивності, тобто ефекти, подібні результатам прикладання 4-AP у великих концентраціях (рис. 6). Ці дані свідчать про підвищення ролі зворотного захоплення глутамату за умов інтенсифікації вивільнення нейротрансмітеру. Можна припустити, що DHK полегшує дифузію глутамату після його везикулярного вивільнення із синаптичної терміналі у позасинаптичний простір і спричиняє селективну активацію позасинаптичних NMDA-рецепторів. Отже, можна вважати, що стимулзалежний ЗПССNMDA опосередковується активацією позасинаптичних NMDA-рецепторів у випадку перевиливу глутамату за межі синаптичної щілини. Позасинаптичні рецептори можуть бути розташовані як у сусідніх не функціонуючих (так званих мовчазних) синапсах, так і на позасинаптичних ділянках дендритів. Відомо, що сусідні збуджуючі синапси в полі СА1 гіпокампа знаходяться в середньому на відстанні приблизно 1 мкм один від одного [Sorra, 1993]. Позасинаптична локалізація рецепторів класичних нейротрансмітерів являє собою феномен, широко розповсюджений в межах ЦНС [Копаниця, 1997]. Позасинаптичне дифузне розташування NMDА-рецепторів було виявлено, зокрема, у нейронів гіпокампа [Benke, 1993, Siegel, 1994] і візуальної зони кори [Aoki, 1994]. Цілком ймовірно, що ці рецептори активуються при проникненні глутамату за межі синаптичної щілини. Очевидно, що коли зростає ймовірність вивільнення медіатору, ймовірність активації таких рецепторів також істотно зростає і, відповідно, збільшується внесок NMDA-рецепторів у синаптичну передачу. Подібні явища ми і спостерігали за умов різних фармакологічних впливів, які збільшують вивільнення медіатору .

Анализ кінетики блокування NMDA-ЗПСС за допомогою MK-801 дозволяє виявити компонент, зумовлений активацією позасинаптичних NMDA-рецепторів малими кількостями глутамату

Для перевірки гіпотези про те, що за умов підвищенного вивільнення медіатору ймовірність активації позасинаптичних рецепторів драматично зростає, ми застосували аналіз кінетики блокування NMDA-каналів за допомогою MK-801 - агента, який широко використовується в нейрофізіологічних дослідженнях для кількісної оцінки зміни ймовірності вивільнення медіатору [Hessler, 1993; Rosenmund, 1993]. Така оцінка, мабуть, є вірною лише при допущенні, що всі NMDA-рецепторі активуються глутаматом з однаковим рівнем ймовірності. Проте рецептори, розташовані в постсинаптичній ділянці, піддаються дії глутамату в концентрації порядку 1-3 мМ, яка досягається в синаптичній щілині після вивільнення везикули. В той самий час позасинаптичні рецептори повинні активуватися набагато меншими кількостями дифундуючого із щілини глутамату: згідно з існуючими оцінками, на відстані 250 нм концентрація глутамату знижується до 250 мкМ [Clements, 1992; 1996]. Відповідно, синаптичні рецептори повинні блокуватися MK-801 набагато швидше, ніж позасинаптичні. Якщо швидкості блокування цих двох популяцій рецепторів дуже відрізняються, цю різницю можна виявити в перебігу аналізу кінетики блокування ЗПССNMDA. Прикладання 50 мкМ MK-801 призводило до блокування ЗПССNMDA, динаміка якого в контролі описувалась моноекспоненціальною функцією з t = 49.5 мс (n = 4) (рис. 7A). Цей факт указує на те, що у випадку, який ми розглядаємо, активуються в основному саме синаптичні NMDA-рецептори. Це узгоджується зі згаданим вище висновком про те, що в контролі дифузія глутамату поза

межами синаптичної щілини є незначною і частка залучення позасинаптичних рецепторів у синаптичну передачу відповідно вельми низька. У присутності 4-АР кінетика блокування під впливом MK-801 описувалась двома експонентами з t1 = 12.5 мс і t2 = 200 мс (n = 4) (рис. 7B). Постійна часу швидкого компоненту кінетики блокування ЗПССNMDA, викликанного дією MK-801, приблизно в чотири-п'ять разів коротша контрольної. Це зв'язано з посиленням вивільнення медіатору в присутності 4-АР і, отже, зі збільшенням ймовірності відкривання NMDA-рецепторкерованих каналів і наступним прискореним їх блокуванням під дією MK-801.

Проте ймовірність активації NMDA-рецепторів може змінюватися не лише у випадку зміни концентрації медіатору. Повільний компонент блокування ЗПССNMDA може з'являтися також при активації пресинаптичних терміналей, імовірність вивільнення глутамату з яких істотно нижче, ніж у контролі [Rosenmund, 1993]. Щоб визначити, який із механізмів зв'язаний з появою повільного компонента, ми провели аналогічні експерименти в присутності конкурентного низькоафінного антагоніста NMDA-рецепторів D-аміноадипату (D-АА). Ступінь блокування позасинаптичних рецепторів, що активуються при низьких концентраціях глутамату, під дією D-АА повинна бути істотно вищою, ніж ступінь блокування синаптичних рецепторів, які активуються при високих концентраціях глутамату. Якщо появлення повільного компонента прогресуючого блокування MK-801 зв'язане з активацією позасинаптичних NMDA-рецепторів малими кільностями глутамату, внесок повільного компонента в присутності D-AA повинен бути повністтю виключений або істотно зменшений. Ми виявили, що в наших експериментах повільний компонент у присутності D-АА повністю усувався (рис. 7C).

Збільшення внеску NR2B-вмісних рецепторів у синаптичну передачу в умовах посиленого вивільнення медіатору

Численні спостереження свідчать про те, що позасинаптичні та синаптичні NMDA-рецептори мають різну субодиничну композицію. Так, наприклад, NMDA-рецептори, які вміщують NR2B-субодиницю, експресуються переважно екстрасинаптично, тоді як у постсинаптичних ущільненнях експресуються і NR2A-, і NR2B-вмісні рецептори [Tovar, 1999; Kirson, 1996]. Позасинаптичні кластери NR2В-вмісних NMDA-рецепторів були виявлені на сомі і на поверхні стовбурів дистальних дендритів [Rao, 1998]. Відомо, що NR2A- та NR2B-вмісні рецептори можуть бути диференційовані фармакологічно на підставі їх чутливості до іфенпродилу, оскільки NR2B-вмісні рецептори приблизно у 400 разів більш чутливі до цієї сполуки. Іфенпродил блокує NMDA-рецептори, які вміщують NR1\NR2A-субодиниці, з ЕС50 = 0.34 мкМ, тоді як рецептори з NR1\NR2B-субодиницями блокуються з ЕС50 = 146 мкМ [Williams 1993]. Ми виявили, що повільний компонент кінетики блокування ЗПССNMDA, який з'явився під впливом MK-801, є селективно чутливим до іфенпродилу (рис. 7D). Отже, при збільшеному вивільненні і, відповідно, посиленій дифузії глутамату за межі синаптичної щілини істотно збільшується внесок NR2B-підтипу NMDA-рецепторів у синаптичну передачу.

Зміни ступеня блокування синаптичної передачі конкурентними блокаторами NMDA-рецепторів у присутності 4-АР.

Прикладання 5 мкМ конкурентного високоафінного блокатору NMDA-рецепторів APV у контролі призводило до пригнічення фармакологічно изольованого в присутності 10 мкМ NBQX ЗПССNMDA до 50 ± 5 % (n = 4), тоді як викликане 4-АР пригнічення було істотно меншим (78 ± 3% (n = 4)) (рис. 8). Ступінь блокування ЗПССNMDA конкурентними блокаторами залежав від інтенсивності стимуляції синаптичних входів. Проте навіть після зменшення інтенсивності стимуляції до рівня, достатнього для розвитку ЗПССNMDA, тотожних за амплітудою контрольним струмам, ступінь блокування ЗПССNMDA низькоафінним блокатором NMDA-рецепторів D-АА, був істотно нижче: у середньому амплітуда знижувалася до 45 ± 9 % (n = 4) при контрольному значенні 30 ± 5 % (рис. 8). Ці спостереження свідчать про те, що концентрація (або тривалість перебування) глутамату в синаптичній щілині та за її межами в присутності 4-АР істотно збільшена.

Збільшення внеску позасинаптичних рецепторів у синаптичну передачу в гіпокампі при тетаничній стимуляції синаптичних входів.

Збільшення тривалості пресинаптичного піка та ймовірність пресинаптичного вивільнення трансмітеру при тетаничній стимуляції.

Загальновідомо, що ефективність синаптичної передачі вельми істотно залежить від характеру електричної активності пресинаптичного нейрона [Nicoll, 1995; Salin, 1996; Malinow, 2000; Manabe, 1997]. Зокрема, зміни частот аферентної електричної активності супровджуються змінами ймовірності вивільнення медіатору. Нещодавно було показано, що стимуляція гіпокампальних входів з частотою, яка відповідає частоті активності так званих “place”-клітин, властивій тваринам у певні фази сну, призводить до істотних змін ефективності синаптичної передачі у зрізах гіпокампа переважно внаслідок зміни ймовірності вивільнення медіатору [Fenton, 1998; Dobrunz 1999]. У нашій роботі ми використовували стимуляцию входів у зону СА1 гіпокампа з високими частотами (100-200 с-1), які відповідали частоті імпульсіції в так званих швидкохвильових пачках (sharp wave burst, SPW), зареєстрованих в клітинах гіпокампа щурів in vivo під час імобілізації та фази повільного сну [Buzsaki, 1983]. SPW-пачки розрядів, що виникали в підзонах СА3а-в гіпокампа, поширюються спочатку в СА3с, а потім у зону СА1. Синхронна активність більше 10 % неронів СА3 у межах 100-мілісекундного інтервалу забезпечувала ініціацію імпульсної активності в зоні СА1, що реєструвалася у вигляді фокальних ПД [Csicsvari, 2000].

Форма пресинаптичного піку є одним з ключових факторів, що визначає ефективність синаптичної передачі [Augustine, 1990, Sabatini, 1999]. У свою чергу, тривалість таких піків є функцією частоти сигналу, що надходить до синаптичних входів, і піддається як коротко-, так і довготривалим змінам. [Jackson, 1991, Byrne, 1996]. Збільшення ймовірності вивільнення медіатору при подразненні пачками стимулів високої (100-200 с-1) частоти відбувається внаслідок інактивації пресинаптичних потенціалкерованих K+-каналів, подальшої деполяризації пресинаптичних закінчень та збільшення входу Са2+ у пресинаптичні терміналі [Geiger, 2000; Hu, 2001]. Отже, зміна частоти електричної активності синаптичних входів у зону СА1 гіпокампа може призводити до істотних варіацій імовірності вивільнення медіатору [Jackson 1991; Geiger, 2000; Hu, 2001]. Динамічний контроль входу Са2+ у пресинаптичні закінчення і, як наслідок, інтенсивності вивільнення медіатору швидкоінактивованими K+-каналами було виявлено в гіпокампі [Geiger, 2000]. Аналогічну залежність тривалості пресинаптичних спайків від частоти стимуляції і в присутності блокатору K+-каналів ми виявили в пресинаптичних закінченнях колатералей Шаффера.

Активація позасинаптичних NMDA-рецепторів при змінах частоти стимуляції синаптичних входів у зону СА1 гіпокампа

Подразнення колатералей Шаффера короткими (1-10 стимулів) пачками з частотою 100-200 с-1 призводило до характерних змін кінетики ЗПСС, якісно аналогічних тим, що викликалися аплікацією 4-АР (рис. 9А). Кинетика спаду фармакологічно ізольованого ЗПССAMPA у разі прикладання пачки стимулів (200 с-1) не змінювалася, а кінетика ЗПССNMDA істотно уповільнювалася.

Уповільненя кінетики спаду NMDA-компонента залежало від інтенсивності стимуляції входів. Стимулу більшої інтенсивності відповідав повільніший спад ЗПССNMDA. Проте уповільнення кінетики спаду ЗПССNMDA при подразненні пачкою із семи стимулів (200 с-1) виявлялося вже при такій інтенсивності подразнення, що амплітуда ЗПССNMDA не перевищувала контрольних значень (рис. 9Б).Характерно, що появлення затриманого ЗПССNMDA при тетанічній стимуляції не залежало ані від амплітуди ЗПССNMDA, ані від підтримуваного потенціалу (рис. 10А).

Останній факт свідчить про те, що спостережуваний нами ефект уповільнення спаду ЗПССNMDA не є зв'язаним з неадекватною фіксацією потенціалу в постсинаптичному нейроні, зумовленою збільшенням амплітуди постсинаптичного струму. Щоб перевірити якість фіксаціїї в постсинаптичному нейроні, ми провели експеримент, в якому високочастотна стимуляція здійснювалася при підтримуваному потенциалі –90 мВ або 0 мВ, а потім з певною затримкою потеціал стрибком зміновали до –45 мВ (протокол експерименту наведено на рис. 10Б. У випадку збільшення похибки фіксації потенціалу кінетика спаду постсинаптичного струму повинна змінюватися. Проте ця кінетика не залежала від підтримуваного потенціалу. Більш того, уповільнення кінетики ЗПССNMDA спостерігалося при підтримуваному потенціалі +20 мВ, при якому ЗПССNMDA має вхідний напрямок (рис. 10Б). І, нарешті, як уже відзначалося вище, кінетика фармакологічно ізольованого ЗПССAMPA при високочастотній стимуляції не змінювалася (рис. 9А). Отже, перелічені вище спостереження дозволяють вважати умови фіксації потенціалу в наших експериментах достатньо адекватними.

Зміни ступеня блокування ЗПССNMDA, викликаного D-AA, при подразненні синаптичних входів короткими високочастотними пачками стимулів

Прикладання 100 мкМ конкурентного блокатору NMDA-рецепторів D-AА значною мірою сприяло усуненню зумовленого високочастотною стимуляцією уповільнення кінетики спаду ЗПССNMDA. Крім того, блокування ЗПССNMDA під дією D-AA практично повністю усувалося після пред'явлення високочастотної пачки стимулів (рис. 11), що, очевидно, зв'язано зі збільшенням концентрації глутамату.

Зміна внеску іфенпродилчутливого компонента ЗПССNMDA при стимуляції синаптичних входів короткими високочастотними пачками

Прикладання іфенпродилу практично повністю усувало уповільнення спаду ЗПССNMDA, зумовлене використанням пачки з двох-трьох стимулів. Усування було частковим, якщо пачка складалась із семи стимулів (рис. 11). Характерно, що на відміну від дії конкурентного блокатора D-AA зменшення пікової величини ЗПССNMDA, викликане неконкурентним блокатором іфенпродилом, не тільки не послаблюється у відповідь на пред'явлення високочастотної пачки стимулів, але, навпаки, посилюється. Це, очевидно, указує на збільшення внеску NR2B-вмісних рецепторів уже через 18 мс післе початку стимуляції, що відповідає максимуму ЗПССNMDA.

Залежність уповільнення спаду ЗПССNMDA від частоти подразнення та кількості стимулів у пачці

Уповільнення ЗПССNMDA спостерігалося і при значно нижчих частотах стимуляціїи синаптичних входів; воно було помітним уже при частотах, які відповідали q-ритму, тобто 5-10 с-1 (рис. 12). Уповільнення спаду ЗПССNMDA при високочастотній стимуляції залежало від кількості стимулів у пачці: воно спостерігалося уже при двох стимулах у пачці і ставало максимальним при шести-семи стимулах (рис. 12).

Механизми активації позасинаптичних рецепторів при збільшенні ймовірності синаптичного вивільненя глутамату

Отже, використовуючи різні вищеописані підходи, ми показали, що збільшення вивільнення медіатору, зумовлене низкою еспериментальних впливів, супроводжується активацією великого пулу “мовчазних” (за умов контролю) позасинаптичних NMDA-рецепторів внаслідок підвищення концентрації глутамату за межами синаптичної щілини.

Загалом, спостережуваний нами феномен непропорційного росту NMDA-компоненту може грунтуватися на таких механизмах, функціонування яких не виключає один одного.

1. У випадку моновезикулярної секреції нейромедіатору [Perkel, 1993] вивільнення кожної синаптичної везикули повинне супроводжуватися локальним (“елементарним”) перевиливом глутамату за межі синаптичної щілини. У нормальних умовах при низькій частоті стимуляції синаптичних входів частка секретуючих терміналей є низькою, тому транспортери швидко усувають ефект дифузії глутамату [Diamond, 1997]. Збільшення ймовірності моновезикулярного вивільнення медіатору в такому випадку спричиняє адитивне перекриття елементарних явищ перевиливу і відповідне збільшення стимулзалежного ЗПССNMDA.

2. Згідно з іншим сценарієм розвитку подій, зі збільшенням ймовірності вивільнення медіатору відбувається не тільки збільшення кількості одночасно функціонуючих терминалей, але й збільшення кількості мультивезикулярних подій (вивільнювань) [Tong, 1993]. Мультивезикулярні терминалі будут активувати істотно більшу кількість позасинаптичних рецепторів, оскільки кількість глутамату, що дифундує у позасинаптичний простір, істотно зростає; це відповідно приводить до збільшення внеску ЗПССNMDA у синаптичну передачу.

Мультивезикулярний характер вивільнення медіатору в присутності блокаторів K+-каналів можна вважати вірогідним з урахуванням даних, наведених на рис. 8 і 11. В умовах, коли вивільнення медіатору посилюється фармакологічними впливами або в результаті тетанічної стимуляції, ступінь пригнічення ЗПССNMDA конкурентними блокаторами NMDA-рецепторів зменшувався. Аналогічні дані були описані в роботі Тонга та Яра (експерименти на культурі нейронів гіпокампа) [Tong, 1994]. Було показано, що ступінь блокування, викликаного низькоафінними конкурентними блокаторами NMDA-рецепторів L-APV і D-AA, вірогідно зменшується зі збільшенням концентрації позаклітинного Са2+, а також у присутності СРТ і баклофену - впливів, що приводять до збільшення вивільнення медіатору [Tong, 1994]. На думку авторів, таку зміну чутливості до конкурентних блокаторів можна пояснити існуванням так званого мультивезикулярного вивільнення, коли у перебігу елементарної синаптичної події відбувається вивільнення більше однієї везикули глутамату. Проте, існує і альтернативне пояснення - зміна ступеня блокування пов'язується зі збільшенням тривалості перебування глутамату в синаптичній щілині у випадку підвищеного вивільнення медіатору, що зумовлено функціональним насиченням глутаматного транспорту. На підставі отриманих у нашій роботі даних можна запропонувати схему (рис. 13), яка пояснює механізм непропорційного росту NMDA-компонента ЗПСС при збільшеній ймовірності інтенсивного вивільнення глутамату.

Активація великого пулу додаткових позасинаптичних NMDA-рецепторів повинна призводити до драматичного посилення входу Са2+ в постсинаптичні нейрони зі збільшенням частоти стимуляції. При цьому кількість Са2+ , що входить в постсинаптичну клітину, буде залежати від кількості імпульсів, які генеруються в пресинаптичному нейроні і, отже, від частоти та інтенсивності стимуляції аферентних входів.

У наших експериментах уповільнення кінетики спаду ЗПССNMDA в присутності 4-АР або при високочастотній стимуляції виявляло залежність від інтенсивності стимуляції синаптичних входів: зі збільшенням інтенсивності стимуляції внесок затриманого компоненту зростав. Таку інтенсивну стимуляцію входів в зону СА1 гіпокампа in vivo може забезпечити синхронізована активность ансамблю нейронов СА3. Як уже зазначалося вище, зона СА3 гіпокампа має велику систему рекурентних колатералей [Ishizuka, 1990; Li, 1994]. У випадку, коли стан активності відповідає типу SPW, вивільнення підкоркових гальмівних нейромедіаторів істотно зменшене, що призводить до розгальмовування в системі колатералей СА3-СА3 [Hasselmo, 1995]. Це забезпечує високий ступінь синхронізації активності в ансамблях сусідніх клітин, створених за рахунок існування синаптичних зв'язків між пірамідними нейронами СА3. Нелінійна взаємодія цих нейронів забезпечує генерацію синхронних популяційних розрядів у згаданій зоні, що в свою чергу спричиняє ініціацію швидких осциляцій в зоні СА1 [Csicsvari, 2000].Синаптичний зв'язок між парою нейронів СА3-СА1 сприяє виникненню ПД в нейроні СА1 з дуже низьким ступенем ймовірності, оскільки сумарний ЗПСС, створюваний активністю одного нейрона СА3, викликає в цій клітині лише підпорогову деполяризацію [Sayer, 1989, 1990; Fridlander, 1990; Andersen, 1994]. Уповільнення спаду ЗПСС, спостережуване в наших експериментах при високочастотній стимуляції, очевидно, може забезпечити ефективнішу сумацію асинхронних вхідних впливів у зону СА1 і, отже, збільшення ймовірності виникнення розрядів постсинаптичних нейронів. Інтенсифікований вхід Са2+ в постсинаптичний нейрон при підпорогових ЗПСС створює певне тло для інших стимулів, збільшуючи ймовірність імпульсної відповіді нейрона СА1 на стимул, що надходить слідом за пачкою. Ці умови також збільшують ймовірність індукції деяких форм синаптичної пластичності [Zucker, 1999].

Можлива участь позасинаптичних NMDA-рецепторів у збудженні нейронів є істотною складовою запропонованих нещодавно гіпотез про позасинаптичні ефекти класичних нейротрансмітерів і їх ролі в так званій об'ємній передачі інформації в ЦНС [Agnati, 1995; Bach-y-Rita, 1993]. Помітну роль ці рецептори можуть відігравати при деяких паталогічних станах мозку. Так, наприклад, ішемія головного мозку супроводжується збільшенням позаклітинного рівня глутамату. Даний фактор, як вважають, є причиною масової загибелі нейронів в умовах гіперактивації глутаматних рецепторів [Choi, 1990; Meldrum, 1990]. Істотну роль в цьому процесі можуть відігравати саме позасинаптичні NMDA-рецептори [Lozovaya, 1997]. Такі рецептори нейротрансмітерів можуть бути мішенями для нових лікарських препаратів. Як зазначають Херкенхем (1987) та Візі (1984), багато лікарських препаратів, створених з урахуванням концепції пресинаптичної модуляції нейропередачі, реально впливають не на пре- і