ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

ЛАРІНА ОЛЬГА АНАТОЛІЇВНА

УДК 612.014.42:612.31:591.431.2

ФУНКЦІОНУВАННЯ Na+–Ca2+-ОБМІННИКА

МЕМБРАНИ ЕКЗОКРИННИХ СЕКРЕТОРНИХ КЛІТИН

У ПРЯМОМУ І ЗВОРОТНОМУ РЕЖИМАХ

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі фізіології людини і тварин

Львівського національного університету імені Івана Франка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Клевець Мирон Юрійович,

Львівський національний університет імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України, завідувач кафедри фізіології людини і тварин

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Скляров Олександр Якович,

Львівський державний медичний університет імені Данила Галицького Міністерства охорони здоров'я України, завідувач кафедри біологічної хімії

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Берегова Тетяна Володимирівна

провідний науковий співробітник Науково-дослідного інституту фізіології імені академіка Петра Богача Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Провідна установа: Інститут фізіології імені академіка О.О.Богомольця НАН України, м. Київ

Захист відбудеться 12.04.2002 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К .051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, , біологічний факультет Львівського національного університету імені Івана Франка, аудиторія № .

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою:

79005, м. Львів, вул. Драгоманова, .

Автореферат розісланий 11.03.2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, кандидат біологічних наук,

доцент Д.І.Санагурський

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Na+–Ca2+-обмінник є однією з іон-транспортних систем (ІТС), які беруть участь у регуляції внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу. Цей антипортер допомагає підтримувати [Са2+]в у стані спокою клітин на рівні значно нижчому за [Са2+]з і опосередковано регулює функції різних типів клітин. Зокрема, в кардіоміоцитах Na+–Ca2+-обмінник відіграє роль центрального механізму у виведенні з клітин Са2+ та розслабленні серцевого м'яза (Egger, Niggli, 1999). Проте, його роль у функціонуванні електронезбудливих, зокрема, екзокринних секреторних клітин (СК) є предметом дискусій.

Протягом останніх років отримано докази функціонування Na+–Ca2+-обмінника в ацинарних клітинах підшлункової залози щурів (Грынькив и др., 1988) і функціональне підтвердження наявності Na+–Ca2+-обмінника в плазматичній мембрані (ПМ) СК слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. (Федірко, 1997; Король, 2000) та теоретично обґрунтована можливість активації вхідного струму Na+–Ca2+-обміну (I(Na/Ca)вх) у відповідь на гіперполяризацію ПМ (Манько, 1995). За наявності фізіологічного градієнта іонів Na+ у відповідь на гіперполяризацію ПМ зареєстровано вхідний струм, який ідентифіковано як I(Na/Ca)вх (Манько, 1995; Федірко, 1997) та проведено його комплексне дослідження (Федірко, 1997). На основі результатів досліджень впливу Cd2+ на амплітуду I(Na/Ca)вх виявлено, що SH-групи відіграють роль у зв'язуванні катіонів обмінником (Манько та співавт., 1997). Встановлено, що зміни амплітуди I(Na/Ca)вх внаслідок залужнення позаклітинного розчину пов'язані з виникненням додаткових від'ємно заряджених іоногенних груп, що знаходяться з позаклітинного боку молекули Na+–Ca2+-обмінника. Це відбувається внаслідок депротонування SH-груп цистеїну (Федірко, 1997).

Цими дослідженнями зроблено значний внесок у розуміння механізму Na+–Ca2+-антипорту в екзокринних СК. Але роль Na+–Ca2+-обмінника і, зокрема, опосередкованого ним надходження Са2+ у СК з'ясована неповністю. Тому дослідження особливостей функціонування Na+–Ca2+-антипортера у прямому та особливо зворотному режимах є актуальним питанням сучасної фізіології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках держбюджетних тем БЛ-370Б “Дослідження Na+-залежного транспорту кальцію через мембрани секреторних клітин у прямому і зворотному режимах та ролі у ньому функціональних груп протеїну обмінника”, № держреєстрації 0198V004853 та БЛ-10Б “Кальцієвий гомеостаз і енергетичний метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під впливом екстремальних факторів”, № держреєстрації 0100О001452. Здобувачем проведено дослідження функціонування Na+–Ca2+-обмінника у прямому та зворотному режимах за умов блокування деяких ІТС та порівняно вплив різних чинників, зокрема, катіонів La3+, NO, протекторів та блокаторів SH-груп на амплітуду I(Na/Ca)вх та вихідного струму Na+–Ca2+-обміну (I(Na/Ca)вих).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дослідити функціонування Na+–Ca2+-обмінника ПМ екзокринних СК слинних залоз личинки Ch. plumosus у прямому та зворотному режимах. Для досягнення поставленої мети необхідно було розв'язати такі завдання:

1) ідентифікувати I(Na/Ca)вих, який відображає функціонування Na+–Ca2+-обмінника у зворотному режимі (Na+-залежне введення Са2+ в клітину), дослідити залежність зареєстрованого у відповідь на деполяризацію ПМ вихідного струму від рушійної сили транспорту іонів Na+ (ДENa) та кальцієвого концентраційного градієнта;

2) з'ясувати особливості впливу катіонів La3+ на функціонування Na+–Ca2+-обмінника у прямому та зворотному режимах;

3) дослідити залежність амплітуди I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих від змін рН поза- (рНз) та внутрішньоклітинного (рНв) середовищ;

4) з'ясувати роль SH-груп молекули Na+–Ca2+-обмінника в його функціонуванні в прямому та зворотному режимах;

5) дослідити вплив NO на Na+–Ca2+-обмін у прямому та зворотному режимах.

Об'єкт досліджень – Na+–Ca2+-антипортер ПМ екзокринних СК слинних залоз личинки Ch. plumosus.

Предмет – прямий та зворотний режими функціонування Na+–Ca2+-обмінника.

Методи досліджень – струми Na+–Ca2+-обміну досліджували з використанням методу фіксації потенціалу за умов внутрішньоклітинної перфузії (ВКП). Про секреторну активність залоз судили на основі змін відносної кількості білка у супернатанті. Концентрацію білка визначали за методом Лоурі. Вміст Ca2+ в тканині залоз визначали за допомогою арсеназо ІІІ.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше ідентифіковано I(Na/Ca)вих, який виникає у відповідь на раптову деполяризацію ПМ екзокринних СК слинних залоз личинки Ch. рlumosus за умов ВКП та змінених градієнтів Cl– і К+. З'ясовано, що амплітуда цього струму залежить від змін ?ENa, майже не залежить від змін [Са2+]з та збільшується при підвищенні [Са2+]в. Крім того, виявлено блокуючий ефект на цей струм катіонів La3+.

Встановлено, що функціонування Na+–Ca2+-обмінника екзокринних СК істотно залежить від активності Na+-K+- та Са2+-помп ПМ за умов ВКП, коли іонний склад розчинів підтримується стабільним.

Дослідження залежності амплітуди I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих від рНз та рНв свідчать про подібні зміни функціонування Na+–Ca2+-обмінника у прямому та зворотному режимах внаслідок залужнення чи закислення середовищ. Виявлена залежність ефекту залужнення внутрішньоклітинного середовища на функціонування Na+–Ca2+-обмінника у прямому режимі від змін натрієвого та кальцієвого концентраційних градієнтів. Куполоподібність залежності I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих від рНв та лінійність залежності цих струмів від рНз свідчать про наявність із внутрішньоклітинного боку молекули Na+–Ca2+-антипортера декількох, а з позаклітинного боку – одної ділянки, дія протонів на які може модулювати транспорт катіонів обмінником за різними механізмами.

Протектори та блокатори SH-груп спричиняють зміни Na+–Ca2+-обміну, внаслідок дії лише з внутрішньоклітинного боку ПМ. Крім того, глутатіон (GSH) майже не впливає на функціонування Na+–Ca2+-обмінника у зворотному режимі, а п-хлормеркурійбензоат (ПХМБ) спричиняє його зміни лише внаслідок дії у низьких концентраціях.

Вперше виявлена залежність змін вмісту Са2+ у тканині слинних залоз личинки Ch. plumosus від наявності донорів NO у середовищі інкубації залоз. Припущено, що NO може здійснювати свій вплив на функціонування СК слинних залоз личинки Ch. через його дію на Na+–Ca2+-обмін.

Вперше із застосуванням методу фіксації потенціалу за умов ВКП виявлена залежність амплітуди I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих від концентрації нітропрусиду натрію (НП) за наявності та відсутності у внутрішньоклітинному розчині блокатора SH-груп. Її аналіз дозволив припустити, що у механізмі впливу донорів NO на функціонування Na+–Ca2+-антипортера у прямому та зворотному режимах задіяні SH-групи молекули обмінника.

Практичне значення роботи. Одержані результати поглиблюють розуміння особливостей будови та функціонування Na+–Ca2+-обмінника ПМ екзокринних СК у прямому та зворотному режимах. Вони впроваджені у навчальний процес кафедри біологічної хімії Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького, кафедри фізіології людини і тварин та кафедри біофізики і математичних методів у біології Львівського національного університету імені Івана Франка. Одержані результати можуть бути використані для пояснення причин виникнення і розвитку патологій травних залоз, пов'язаних з порушенням кальцієвого гомеостазу, та розробки методів їхньої фармакологічної корекції, а отже, є важливими для медицини та ветеринарії.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконано весь обсяг експериментальних досліджень, проведено статистичне опрацювання їх результатів, пошук наукової літератури за темою дисертації та її аналіз. Разом із науковим керівником та за участю співавторів публікацій автором проведено планування досліджень, розроблено новий методичний підхід до реєстрації I(Na/Ca)вих у відповідь на деполяризацію ПМ екзокринних СК, проаналізовано одержані результати досліджень, сформульовано основні висновки і підготовлено до друку публікації.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні положення, включені до дисертації, були представлені на: XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998 р.), II з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998 р.), 2-му Конгресі федерації Європейських фізіологічних товариств (Прага, 1999 р.), ІІ з'їзді біофізиків Росії (Москва, 1999), 6-му Міжнародному конгресі з біомедичних досліджень (INABIS, Іспанія, 2000 р.), 3-му Європейському біофізичному конгресі (Мюнхен, 2000 р.), 11-й Європейській студентській конференції для студентів-медиків та молодих докторів (Берлін, 2000 р.), Міжнародній школі “Мембрана і сигналізація” (Київ, 2000 р.), 1-му Міжнародному конгресі студентів медичних наук (Белград, 2001 р.), Міжнародному симпозіумі “Внутрішньоклітинна сигналізація в рослинних та тваринних системах (ISPAS)” (Київ, 2001 р.), 4-му З'їзді молодих фізіологів “Сенсаційна фізіологія” (Кембридж, 2001 р.), конференції до 100–річчя з дня народження заслуженого діяча науки України професора Я.П.Склярова “Механізми фізіологічних функцій в експерименті та клініці” (Львів, 2001 р.), 2-й Міжнародній конференції студентів-медиків та молодих науковців у Львівському державному медичному університеті (Львів, 2001), щорічних звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (1998-2000 р.р.) та на міжкафедральному семінарі біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка та кафедри анатомії і фізіології Львівського державного інституту фізичної культури у листопаді 2001 р.

Публікації. Результати дисертації опубліковані у 7 статтях, 5 з яких – у фахових виданнях, та в 11 тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, їхнього обговорення, висновків, списку використаних джерел із 272 найменувань. Робота викладена на 180 сторінках (основна частина 141 сторінка), ілюстрована 29 рисунками і 5 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проведені на СК слинних залоз личинки Chironomus plumosus(клас Insecta, ряд Diptera, родина Chironomidae, рід Chironomus Meig.).

Для дослідження струмів Nа+–Cа2+-обміну мембранний потенціал (МП) фіксували на рівні –20 мВ і перевіряли за допомогою універсального вольтметра В7–16. І(Na/Ca)вх, який відображає функціонування Na+–Ca2+-обмінника у прямому режимі, реєстрували у відповідь на гіперполяризаційне зміщення МП до –60 мВ, а I(Na/Ca)вих, що відповідає роботі антипортера у зворотному режимі, – у відповідь на деполяризацію ПМ до +20 мВ. Для гіпер- та деполяризаційних зміщень МП використовували прямокутні імпульси тривалістю 3,5 с і частотою 0,1 Гц. Струми, що виникали внаслідок зміщень МП, після підсилення реєстрували за допомогою електрокардіометра ЕКМ-01

Під час досліджень впливу різних чинників на функціонування Na+–Ca2+-обмінника лише у прямому режимі використовували розчин для ВКП, який містив, ммоль/л: NaCl – 16,0, трис-Cl – 146,14, глюкоза – 5,55; рН 7,0. Вихiдний позаклiтинний розчин (ПКР) мiстив, ммоль/л: NaCl – 136,9, KCl – 5,4, CaCl2 – 1,76, MgCl2 – 0,49, трис-Cl – 0,20, глюкоза – 5,55; pH 7,2. Для реєстрації I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих на одній і тій же клітині використовували вихідний ПКР, в якому катіони К+ замінювали на еквімолярну кількість трис-Cl та додавали блокатор кальцієвих потенціал-керованих каналів (ПКК) – верапаміл (10-4 моль/л). Базовий внутрішньоклітинний розчин (ВКР) у цьому випадку містив, ммоль/л: NaCl – 16,0, трис-Cl – 50,3, трис-SO4 – 79,84, глюкоза – 5,55, еозин Y – 10 мкмоль/л; рН 7,0. При використанні цих розчинів ЕNa становив +54,2 мВ, а ЕСl – +20 мВ. Такий склад розчинів дозволяє відокремити струми Na+–Ca2+-обміну від струмів кальцієвих, калієвих та хлорних ПКК, а також запобігти активації Са2+- і Na+-K+-помп плазматичної мембрани.

Про секреторну активність залоз судили на основі змін вмісту білка у супернатанті. Кількість білка у супернатанті та гомогенаті залоз (сумарний білок) прийнято за 100Відносну кількість білка в супернатанті виражали як відсоток від сумарного білка. Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Вміст Са2+ у тканині залоз визначали за допомогою арсеназо ІІІ (“Simko–Ltd”, Львів) і виражали у нмолях на залозу. Для інкубації залоз використовували вихідний ПКР, в якому буфер трис–Cl замінювали на фосфатний буфер (Na2HPO4/KH2PO4). З метою активації функціонування Na+–Ca2+-обмінника у прямому або зворотному режимах концентрацію Na+ у розчині для інкубації залоз відповідно збільшували до 180 ммоль/л або зменшували до 35 ммоль/л, замінюючи еквімолярною кількістю трис-Cl.

З метою дослідження ролі SH-груп у функціонуванні обмінника використовували їх протектори (1,4-дитіотреітол (ДТТ), GSH) та блокатор цих груп – ПХМБ. Джерелом NO слугували НП та нітрогліцерин (НГ). Варіаційно-статистичну обробку одержаних результатів проводили за Стьюдентом за допомогою Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Залежність функціонування Na+–Ca2+-обмінника від функціональної активності Са2+- та Na+-K+-помп. Відомо, що в збудливих клітинах виявлено взаємопов'язане функціoнування Na+–Ca2+-обмінника, Са2+- та Na+-K+-помп ПМ (Reeves et al., 1994). Подібне взаємоузгоджене функціонування цих систем наявне, очевидно, і в СК.

Ми з'ясували, що за умов ВКП додавання до ВКР блокатора Са2+-помпи еозину Y (10 мкмоль/л) спричиняє збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх на (15,44±1,64)(P<0,001, n=6). Аналогічно діє й інший блокатор Са2+-помпи – ортованадат натрію (10 мкмоль/л), хоча ефект зменшувався при збільшенні його концентрації до 100 мкмоль/л. Додавання до ВКР блокатора Са2+-уніпортера мітохондрій рутенію червоного (10 мкмоль/л) або активатора ріанодин-чутливих кальцієвих каналів ЕПР теофіліну (8 ммоль/л) не викликало змін амплітуди I(Na/Ca)вх. Усе це свідчить про взаємоузгодженість функціонування Na+–Ca2+-обмінника та Са2+-помпи ПМ досліджуваних СК за умов ВКП, що можливе за наявності внутрішньоклітинних примембранних просторів.

Додавання блокатора Na+-K+-помпи уабаїну (25 мкмоль/л) до ПКР не викликало змін I(Na/Ca)вх. Але від функціональної активності Na+-K+-помпи залежали зміни I(Na/Ca)вх, спричинені зміною концентраційних градієнтів Na+ та К+.

Зміна [К+]з від 0 до 5,36 та 20 ммоль/л спричиняла статистично достовірне збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх як за відсутності, так і за наявності уабаїну. Причому, статистично достовірної різниці між збільшенням амплітуди I(Na/Ca)вх, викликаним підвищенням [К+]з від 0 до 5,36 ммоль/л за відсутності уабаїну ((16,00±4,72) %) та його наявності ((21,13±6,39)не було. Проте при зміні [К+]з від 5,36 до 20 ммоль/л за відсутності уабаїну збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх становило (16,56±1,57)тоді як за його наявності – лише (7,31±2,01)Це вказує на залежність роботи Na+–Ca2+-обмінника від функціонування Na+-K+-помпи при підвищеній [К+]з до 20 ммоль/л за умов ВКП. Внаслідок збільшення [К+]в від 0 до 129,4 ммоль/л за наявності у ПКР уабаїну спостерігали менш виражене зменшення амплітуди I(Na/Ca)вх ((35,72±11,08) %), ніж за його відсутності ((79,07±17,06) %).

Зміна [Na+]з від 136,9 до 16 ммоль/л (у цій серії [Na+]в=100 ммоль/л) за наявності у ПКР уабаїну викликала більш виражене зменшення амплітуди I(Na/Ca)вх ((41,19±0,06)ніж за умов його відсутності ((32,53±0,05)

Зміни амплітуди I(Na/Ca)вх, спричинені зміною калієвого концентраційного градієнта за умов блокування Na+-K+-помпи, можна було б пояснити котранспортуванням іонів К+ обмінником з Са2+. У цьому випадку зміна градієнта К+ повинна порушувати рівноважну [Са2+]в, яка досягається роботою Na+–Ca2+-обмінника. Підтвердженням такого типу взаємодії служить стимулювання функціонування Na+–Ca2+-обміну фоторецепторів хребетних поза- або внутрішньоклітинним К+ відповідно у зворотному або прямому режимі (Lagnado et al., 1990). Але ми отримали інші результати: збільшення [К+]з спричиняло збільшення I(Na/Ca)вх, а збільшення [К+]в – значне його зменшення.

Раніше було показано, що заміна усіх катіонів Na+ у ПКР еквімолярною кількістю катіонів К+ викликає суттєве збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх, зареєстрованого у відповідь на гіперполяризацію ПМ досліджуваних СК, за рахунок більшої спорідненості останніх до катіонзв'язуючих ділянок Na+–Ca2+-антипортера із зовнішнього боку ПМ (Клевець та співавт., 1998). Наявність у середовищі Na+ і К+ призводить до того, що вони можуть одночасно або почергово транспортуватися обмінником. Внаслідок цього його активність збільшується, що супроводжується збільшенням амплітуди I(Na/Ca)вх. Можна припустити, що і внутрішньоклітинний К+ витісняє Na+ із внутрішньоклітинних ділянок зв'язування, транспортується Na+–Ca2+-обмінником з клітин і, тим самим, підсилює функціонування системи Na+–Ca2+-антипорту у прямому режимі (за умови, що ділянки зв'язування Na+ і Ca2+ є різними конформаціями одного центру). Оскільки сумарний струм Na+–Ca2+-обміну відображає різницю між кількістю перенесених катіонами зарядів у клітину і з клітини за одиницю часу, то за таких умов його амплітуда зменшилася б, що і було нами виявлено.

Отже, за умов ВКП, коли іонний склад розчинів підтримується стабільним, Na+–Ca2+-обмінник ПМ досліджуваних клітин взаємоузгоджено функціонує із Na+-K+- та Са2+-помпами ПМ, а іони К+ безпосередньо впливають на його функціонування. Тому для реєстрації струмів Na+–Ca2+-обміну та їх адекватної інтерпретації доцільно блокувати інші ІТС.

2. Ідентифікація вихідного струму Na+–Ca2+-обміну. Як відомо, рушійною силою Na+–Ca2+-антипорту є різниця електрохімічних потенціалів (?м) ?онів Na+ і Са2+. Змінити ?мNa та ?мСа можна шляхом збільшення або зменшення поза- та внутрішньоклітинних концентрацій Na+ і Са2+ або зміщення МП. Для активації I(Na/Ca)вих при фізіологічних градієнтах Na+ та Са2+ ми використали деполяризаційне зміщення МП. Але за таких умов відбувається активація інших ІТС, наявність яких була ідентифікована у ПМ СК слинних залоз личинки Ch. рlumosus, зокрема кальцієвих (Клевець, Гураль, 1990), калієвих (Клевець, 1990) та хлорних (Клевець, 1991) ПКК. Щоб запобігти активації цих ІТС ми проводили дослідження за умов блокування кальцієвих ПКК верапамілом, відсутності у розчинах катіонів К+ та при хлорному градієнті, зміненому таким чином, що ЕCl при деполяризації ПМ дорівнював тестуючому потенціалу (+20 мВ).

З'ясувалося, що амплітуда вихідного струму, виявленого за таких умов, залежить від натрієвого концентраційного градієнта (рис. 1). Зміна [Na+]з від 136,9 до 68,4, 34,2 і 16 ммоль/л викликала зменшення амплітуди цього струму на (31,26±4,51), (43,12±4,74) і (51,11±5,42) % (P<0,01, n=6) відповідно. Зменшення амплітуди струму спостерігалося і внаслідок збільшення [Na+]в від 16 до 34,2, 68,4 та 136,9 ммоль/л і становило (17,22±3,29), (54,58±3,08) та (60,82±3,97)відповідно.

На рис. 2 наводимо графічну залежність амплітуди зареєстрованих нами у відповідь на гіпер- та деполяризацію ПМ струмів від ?ЕNa – рушійної сили транспорту іонів Na+ (Д?Na=Ем–ЕNa) – при тестуючому потенціалі. Оскільки криві залежності амплітуди вихідного струму, що виникає у відповідь на деполяризацію ПМ, від ?ЕNa (криві 3, 4) не перетинають вісь абсцис при ?ЕNa=0 мВ, можна стверджувати, що цей струм, як і вхідний струм, зареєстрований у відповідь на гіперполяризацію ПМ (Клевець та співавт., 1995), не є канальним і визначається не лише ?мNa.

Знак ?ЕNa при фіксованому потенціалі визначає напрям струму, що виникає у відповідь на гіперполяризацію ПМ: негативному значенню ?ЕNa відповідає I(Na/Ca)вх, а позитивному – I(Na/Ca)вих (Клевець та співавт., 1995). Аналогічна залежність є справедливою і для струму, що виникає у відповідь на деполяризацію ПМ: внаслідок зміни ?ЕNa від –74,2 до +34,2 мВ при фіксованому потенціалі цей вихідний струм змінює свій напрям на вхідний.

Виявлені нами вхідний та вихідний струми визначаються й електрохімічним градієнтом Ca2+. Зокрема встановлено, що їх амплітуда майже не залежать від змін [Са2+]з, але збільшується внаслідок підвищення [Са2+]в від 3 нмоль/л до 10–7 і 10–5 моль/л. Крім того, виявлені струми блокуються La3+.

Таким чином, вихідний струм, який виникає у відповідь на раптову деполяризацію ПМ, залежить від змін ?ЕNa, [Ca2+]в і блокується La3+. Це дозволяє нам ідентифікувати даний струм як I(Na/Ca)вих, що відображає функціонування Na+–Ca2+-обмінника у зворотному режимі.

3. Залежність функціонування Na+–Ca2+-обмінника плазматичної мембрани від змін рН поза- та внутрішньоклітинного розчинів. Як відомо, дослідження впливу змін рН розчинів на функціонування клітин дозволяє на підставі уявної константи дисоціації (рК) робити припущення про хімічну природу функціонально важливих іоногенних груп мембрани (Клевець, 1985). Крім того, науковці (Steenbergen et al., 1977; Doering et al., 1993) відносять Н+ до блокаторів та модуляторів Na+–Ca2+-обміну. Тому дослідження залежності I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих від змін рН розчинів необхідне для повнішого розуміння механізму Na+–Ca2+-обміну.

Ми з'ясували, що закислення ПКР до рН 5 спричиняло зменшення амплітуди І(Na/Ca)вх на (25,99±5,23) %, а закислення ВКР – на (10,48±7,85)(P<0,05, n=7). Одночасне зменшення рНз та рНв до 5 не викликало змін I(Na/Ca)вх. Зміна pHз від 7,2 до 9 спричиняла збільшення амплітуди І(Na/Ca)вх на (32,02±6,13)(P<0,01, n=7). Залужнення ВКР та одночасне залужнення обох розчинів до рН 9 призводило до зменшення амплітуди I(Na/Ca)вх відповідно на (66,70±7,05) та (77,65±6,82)(P<0,01, n=7). Внаслідок градуального залужнення ВКР від рН 7 до pH , 8,5, 9 і 10 спостерігалося зменшення амплітуди І(Na/Ca)вх на (4,03±5,15), (30,72±10,18), (56,96±12,21) і (74,17±10,69)

Дослідження залежності функціонування Na+–Ca2+-обмінника у зворотному та прямому режимах за умов реєстрації I(Na/Ca)вих та I(Na/Ca)вх на одній і тій же клітині показали, що характер змін амплітуди I(Na/Ca)вх, спричинених залужненням та закисленням розчинів, за цих умов та за відсутності блокування деяких ІТС є аналогічним. Також з'ясувалося, що зміни амплітуди I(Na/Ca)вх і I(Na/Ca)вих, спричинені залужненням або закисленням розчинів, є майже однаковими. Внаслідок закислення ПКР до рН 5 зменшення амплітуди цих струмів відповідно становило (19,32±2,93) і (16,01±3,88) %, а в результаті закислення ВКР до рН 5 – (37,62±6,89) і (37,63±5,53) %. Збільшення рНв до 9 в обох випадках спричиняло не лише зменшення амплітуди струмів, але і зміну їхнього напряму на протилежний. А внаслідок зміни рНз від 7,2 до 9 амплітуда I(Na/Ca)вх, та I(Na/Ca)вих збільшувалась на (25,81±6,50) і (30,75±16,05) % (Р<0,01, n=6) відповідно.

Виявлені зміни струмів можуть бути зумовлені впливом закислення та залужнення на зв'язування та/або транслокацію катіонів обмінником. Тому виникла необхідність перевірити залежність цих змін від концентраційних градієнтів іонів Na+ і Ca2+.

З'ясувалося, що із збільшенням кальцієвого концентраційного градієнта зменшення амплітуди І(Na/Ca)вх, зумовлене залужненням ВКР, було більш вираженим і становило (55,57±10,13)при [Ca2+]з=1,76 ммоль/л та (72,38±10,22)(P<0,01, n=7) – при [Ca2+]з=10 ммоль/л.

Більш вираженими змінами амплітуди I(Na/Ca)вх супроводжувалося залужнення ВКР і внаслідок зменшення натрієвого концентраційного градієнта: за наявності у ПКР катіонів Na+ у концентраціях 136,9, 68,4 і 16 ммоль/л зменшення амплітуди І(Na/Ca)вх, спричинене зміною pHв від 7 до 9, відповідно становило (50,05±6,60), (78,72±5,39) та (96,48±3,52) % (P<0,01, n=6).

Залежність ефекту залужнення ВКР від концентраційних градієнтів Na+ і Са2+ можна пояснити пригніченням дисоціації Na+ з внутрішньоклітинної катіон-транспортної ділянки Na+–Ca2+-обмінника і одночасним пригніченням асоціації з нею Са2+. Це веде до зменшення амплітуди струму, а згодом і зміни його напряму. Отже, одним з механізмів, які забезпечують більшу спорідненість іоногенних груп обмінника до внутрішньоклітинного Са2+, ніж до позаклітинного, може бути незначний надлишок Н+ у цитоплазмі, який наявний за фізіологічних умов.

Подібність змін амплітуди I(Na/Ca)вх і I(Na/Ca)вих свідчить про подібність механізмів, за якими зміни рН впливають на функціонування Na+-Ca2+-обмінника у прямому та зворотному режимах і, як наслідок, механізмів зв'язування та транслокації катіонів під час функціонування антипортера в цих режимах. Вплив Н+ на Na+–Ca2+-обмін може бути зумовлений конкурентною взаємодією Н+ з катіонами Na+ і Са2+ за центри зв'язування або шлях транслокації катіонів молекули обмінника, до складу яких входять не лише СОО–-, але і SH-, NH2- та OH-групи амінокислотних залишків. Під час закислення розчинів механізм дії Н+, очевидно, пов'язаний із протонуванням СОО–-груп цих ділянок. Ефект залужнення ПКР, імовірно, зумовлений виникненням додаткових негативно заряджених груп завдяки депротонуванню SH-, NH2- або OH-груп амінокислотних залишків. Оскільки зміни струмів Na+–Ca2+-обміну, спричинені залужненням ПКР та ВКР, були протилежними, доцільним є вивчення ролі SH-груп у роботі цієї ІТС.

4. Дослідження ролі SH-груп у функціонуванні Na+–Ca2+-обмінника плазматичної мембрани у прямому та зворотному режимах. Відомо, що SH-групи входять до складу ділянок молекули Na+–Ca2+-обмінника, які відіграють важливу роль у транслокації ним катіонів та регуляції його функціонування цитоплазматичними факторами (Reeves et al., 1994; Egger, Niggli, 2000). Тому, для підтвердження наявності SH-груп у молекулі Na+–Ca2+-обмінника СК та його регуляторних ділянках необхідно було дослідити вплив протекторів та блокаторів цих груп на функціонування антипортера.

З'ясувалося, що додавання GSH у низьких (0,1, 0,5 і 1 ммоль/л) та високих (5 ммоль/л) концентраціях до ВКР не впливає на I(Na/Ca)вих та спричиняє збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх на (16,88±3,82), (21,08±6,97), (25,92±7,67) та (16,84±7,67)(P<0,05, n=7) відповідно. Отже, збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх, спричинене дією GSH у високій концентрації, було менш вираженим, ніж внаслідок дії GSH у низьких концентраціях (0,5 та 1 ммоль/л). Очевидно, збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх, спричинене дією GSH у низьких концентраціях, зумовлене хелатуванням катіонів важких металів, які у невеликих кількостях зв'язані з СОО–-групами на шляху транслокації катіонів Na+–Ca2+-обмінником і характеризуються меншою спорідненістю до них, ніж до GSH. Ефект високих концентрацій GSH є, очевидно, наслідком хелатування катіонів важких металів, які зв'язані з SH-групами регуляторної петлі f молекули обмінника.

Вплив GSH на функціонування Na+–Ca2+-обмінника може бути послаблений у зв'язку з тим, що ця речовина, як протектор, може взаємодіяти з катіонами важких металів, що, як домішки, входять до складу солей, які використовуються для приготування розчинів. Тому для вивчення ролі SH-груп у функціонуванні Na+–Ca2+-антипортера більш доцільно використовувати блокатори цих груп, зокрема ПХМБ.

Ми виявили, що додавання ПХМБ до ПКР не викликало змін амплітуди ні I(Na/Ca)вх, ні I(Na/Ca)вих. Проте, додавання ПХМБ до ВКР у концентраціях 1 та 5 мкмоль/л спричиняло збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх на (22,23±5,80) та (42,11±8,95) % (P<0,01, n=6) відповідно. Амплітуда ж I(Na/Ca)вих незначно збільшувалася лише за наявності у ВКР цього блокатора SH-груп у концентрації 1 мкмоль/л (на (7,94±2,47) %; P<0,05, n=6).

Усе це свідчить про важливість для функціонування Na+–Ca2+-обмінника SH-груп саме внутрішньоклітинних ділянок його молекули. Ці SH-групи відіграють певну лімітуючу роль у функціонуванні Na+–Ca2+-обміну, регулюючи, можливо, швидкість транспорту ним катіонів, або ж, як вважає Хазама (Hazama, 1983), беруть участь у визначені режиму функціонування цієї Са2+-транспортної системи.

5. Оксид азоту та кальцієвий гомеостаз екзокринних секреторних клітин. Повнішого розуміння ролі SH-груп у механізмі транслокації катіонів обмінником можна досягти завдяки вивченню інших модуляторів Na+–Ca2+-обміну, які можуть впливати на його функціонування шляхом взаємодії із SH-групами його молекули. Згідно даних літератури таким модулятором може бути NO, який не лише впливає на функціонування ІТС, зокрема, Na+–Ca2+-обмінника (Clementi, 1998), але і бере участь у регуляції секреторного процесу (Buckle et al., 1995; Hanna et al., 1998; Rettori et al., 2000).

Вплив донорів NO на секрецію та вміст Са2+ у тканині залоз. Для виявлення дії NO на Na+–Ca2+-обмін СК слинних залоз необхідно було дослідити зміни кількості білка у супернатанті та вмісту Са2+ у тканині залоз, спричинені дією донорів NO (рис. 3).

Виявилося, що за наявності у середовищі інкубації залоз НП у концентрації 1 мкмоль/л спостерігалося зменшення вмісту білка у супернатанті, а за наявності НП у концентраціях 10, 50, 100 та 200 мкмоль/л кількість білка збільшувалася до контрольного рівня і більше не змінювалася. Вміст Са2+ у тканині залоз під впливом НП у концентраціях 1, 10, 100 та 200 мкмоль/л відповідно зменшувався від (0,62±0,11) до (0,57±0,10), (0,43±0,11), (0,48±0,15) та (0,30±0,05) нмоль на залозу, а під впливом НП у концентрації 50 мкмоль/л збільшувався до (0,74±0,18) нмоль на залозу. Характер цих змін свідчить про те, що ефект НП може здійснюватися за різними механізмами, зокрема, внаслідок дії на різні Са2+-транспортні системи.

Ми з'ясували, що НП (200 мкмоль/л) спричиняв незначне збільшення кількості білка у супернатанті та істотне зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз і за умов блокування Са2+-помпи та кальцієвих ПКК. Подібні зміни кількості білка у супернатанті та вмісту Са2+ у тканині залоз спостерігалися і за наявності у середовищі інкубації залоз еозинута кофеїну одночасно, що дозволило виключити можливість дії NO за даних умов не лише на Са2+-помпу, але й на ріанодин-чутливі кальцієві канали. Усе це свідчить на користь припущення про те, що вплив NO на функціонування досліджуваних слинних залоз може опосередковуватися його дією саме на Na+–Ca2+-обмін. Але зміни вмісту Са2+ у тканині слинних залоз, спричинені дією донорів NO (200 мкмоль/л НП та НГ) за умов інкубації слинних залоз у розчинах із різною концентрацією Na+ майже не відрізнялися. Тому для підтвердження нашого припущення ми дослідили вплив донорів NO на струми Na+–Ca2+-обміну.

Вплив NO на струми Na+–Ca2+-обміну. З'ясувалося, що зміни амплітуди I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих, спричинені НП, залежать від його концентрації (рис. 4). За наявності НП у концентраціях 20, 50, 100 та 200 мкмоль/л у ВКР спостерігалося збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх на 23,33, 25,48, 15,43 та 16,03 % відповідно (рис. 4, крива 2). Отже, збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх, спричинене НП у концентраціях 100 та 200 мкмоль/л, було менш вираженим. Подібними були і зміни амплітуди I(Na/Ca)вих: найбільш виражені її зміни спостерігалися внаслідок дії НП у низьких концентраціях (НП у концентраціях 20 і 50 мкмоль/л викликав збільшення амплітуди I(Na/Ca)вих на 14,75 та 13,26а найменші – внаслідок дії НП у концентрації 100 мкмоль/л (на 8,45 %). Додавання НП до ВКР у концентрації 200 мкмоль/л не викликало змін I(Na/Ca)вих (рис. 4, крива ). Це свідчить про вплив NO на функціонування Na+–Ca2+-обмінника. Необхідно відзначити, що ефект НП у високій концентрації (200 мкмоль/л) на функціонування обмінника у прямому та зворотному режимах є різним. Це може бути зумовлено різницею у механізмах дії NO на функціонування обмінника у прямому і зворотному режимах або функціональною асиметричністю антипортера.

Вплив NO на Na+–Ca2+-антипорт може здійснюватися опосередковано – через зміни концентрації цГМФ, або прямо – шляхом впливу NO на SH-групи молекули обмінника. Тому необхідно було дослідити вплив донорів NO на I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих за наявності у внутрішньоклітинному розчині ПХМБ.

Виявилося, що додавання НП у концентраціях 20, 50, 100 та 200 мкмоль/л до ВКР супроводжувалося збільшенням амплітуди I(Na/Ca)вх відповідно на 11,56, 13,74, 29,50 та 28,76 %, і збільшенням амплітуди I(Na/Ca)вих на 0,18, 3,26, 12,08 та 15,55 % (рис. 4, крива 1 і 3). Отже, НП у високих та низьких концентраціях викликав збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих. Але у даному випадку збільшення внаслідок дії НП у високих концентраціях було більш вираженим, ніж внаслідок його дії у низьких концентраціях.

Такі відмінності у залежності амплітуди I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих від концентрації НП за умов блокування SH-груп свідчать про їх участь у механізмі дії донорів NO на функціонування Na+–Ca2+-антипортера. За наявності у розчинах донорів NO у низьких концентраціях NO, найімовірніше, безпосередньо діє на SH-групи амінокислотних залишків молекули Na+–Ca2+-обмінника. При високих же концентраціях НП (100 і 200 мкмоль/л) NO, можливо, не лише зв'язується з SH-групами молекули Na+–Ca2+-обмінника, але і починає конкурувати з Na+ та Са2+ за ділянки їх зв'язування та/або транслокації.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Аналіз результатів досліджень залежності I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих від змін рушійної сили транспорту іонів Na+, кальцієвого і калієвого концентраційних градієнтів та даних літератури дозволяє припустити, що Na+–Ca2+-обмінник мембрани СК слинних залоз личинки Ch. рlumosus (рис. 5) належить до NCX типу, до якого відносять Na+–Ca2+-обмінник кардіоміоцитів та нейронів (Nicoll et al., 2000).

Для цього типу обмінників властива наявність 9 трансмембранних сегментів (ТМС), 5 поза- та 6 внутрішньоклітинних петель (Nicoll et al., 2000). З кожною з цих ділянок пов'язують певні властивості обмінника. Зокрема, між 5 та 6 ТМС знаходиться внутрішньоклітинна петля f, яка відіграє важливу роль регуляції Na+–Ca2+-обміну; між 2 та 3 ТМС – ?1-послідовність, а між 7 і 8 – ?2-послідовність, які разом із ТМС утворюють шлях транслокації катіонів.

Це дозволяє нам припустити наявність лінійного шляху транслокації катіонів через “пору”, утворену ТМС молекули Na+–Ca2+-обмінника досліджуваних СК. Найімовірніше, цей лінійний шлях або його частина утворена петлями ?1- та ?2-послідовностей, які зорієнтовані всередину мембрани назустріч одна одній і функціонально взаємодіють між собою.

Очевидно, зв'язування та транслокація катіонів обмінником при його функціонуванні у зворотному та прямому режимах здійснюється за подібними механізмами. Про це свідчить те, що виявлені нами зміни амплітуди I(Na/Ca)вих, спричинені залужненням або закисленням розчинів, були такими ж, як і зміни I(Na/Ca)вх. Найімовірніше, зв'язування 3-х іонів Na+ з позаклітинного боку Na+–Ca2+-обмінника і 1-го іону Са2+ – з внутрішньоклітинного у випадку його функціонування у прямому режимі, а також зв'язування 1-го іону Са2+ з позаклітинного боку обмінника і 3-х іонів Na+ – з внутрішньоклітинного у випадку його функціонування у зворотному режимі, здійснюється за участю СОО–-груп залишків глутамінової або аспарагінової амінокислот, які входять до скла ду центрів зв'язування катіонів та шляху їх транслокації і забезпечують дегідратацію та естафетне електростатичне зв'язування іонів Na+ та Ca2+. Про це свідчать виявлені нами зміни I(Na/Ca)вих та I(Na/Ca)вх, спричинені закисленням поза- та внутрішньоклітинного розчинів, які, найімовірніше, зумовлені протонуванням цих груп.

Ми припускаємо, що у функціонуванні Na+–Ca2+-обмінника беруть участь й інші іоногенні групи, наприклад, OH-, NH2- та SH-групи амінокислотних залишків. Зміни амплітуди I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих внаслідок залужнення розчинів зумовлені, мабуть, виникненням додаткових негативно заряджених груп в ділянках зв'язування катіонів та шляху їх транслокації (у випадку залужнення поза- та внутрішньоклітинного розчину) або ж в межах внутрішньоклітинної регуляторної петлі f (у випадку залужнення внутрішньоклітинного розчину). Це підтверджується і міркуваннями інших авторів (Клевець та співавт., 1996; Nicoll et al., 1996; Iwamoto et al., 2000).

Роль SH-груп амінокислотних залишків внутрішньоклітинних ділянок молекули Na+–Ca2+-антипортера у його функціонуванні у прямому та зворотному режимах є різною. На користь цього свідчить той факт, що додавання до внутрішньоклітинного розчину GSH не викликало змін амплітуди I(Na/Ca)вих, а її зміни, спричинені дією ПХМБ, були менш вираженими, ніж зміни амплітуди I(Na/Ca)вх. Крім того, це свідчить про функціональну асиметрію Na+–Ca2+-обмінника мембрани досліджуваних клітин.

Виявлений ефект донорів NO також підтверджує наше припущення про роль SH-груп у функціонуванні Na+–Ca2+-обмінника. Щоправда, цей ефект може здійснюватися не лише шляхом прямої взаємодії NO з SH-групами молекули обмінника, але і опосередковано – завдяки зміні концентрації цГМФ і, як наслідок, модулюванню Na+–Ca2+-обміну через центр фосфорилювання.

ВИСНОВКИ

Провівши на основі реєстрації I(Na/Ca)вх у відповідь на раптову гіперполяризацію ПМ та I(Na/Ca)вих у відповідь на її деполяризацію порівняльний аналіз функціонування Na+–Ca2+-обмінника екзокринних СК слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. у прямому і зворотному режимах, ми дійшли наступних висновків:

1. Зареєстрований у відповідь на раптову деполяризацію ПМ вихідний струм за умови, що хлорний рівноважний потенціал рівний за величиною тестуючому потенціалу, у внутрішньо- і позаклітинному розчині відсутні катіони К+, а Са2+-помпа і ПК кальцієві канали заблоковані, залежить від рушійної сили транспорту іонів Na+ та кальцієвого концентраційного градієнта і пригнічується La3+. Це свідчить про те, що виявлений вихідний струм відображає функціонування Na+–Ca2+-обмінника у зворотному режимі при коефіцієнті стехіометрії n>2.

2. Закислення поза- або внутрішньоклітинного розчину спричиняє зменшення амплітуди I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих. Найімовірніше, що ці зміни зумовлені порушенням зв'язування катіонів з центрами катіонного зв'язування молекули обмінника.

3. Зміни функціонування Na+–Ca2+-обмінника як у прямому, так і зворотному режимах, спричинені залужненням поза- або внутрішньоклітинного середовищ, є різними: залужнення внутрішньоклітинного розчину призводить до зменшення амплітуди I(Na/Ca)вх й I(Na/Ca)вих, а залужнення позаклітинного – до збільшення амплітуди обох струмів. Це свідчить про те, що залужнення поза- та внутрішньоклітинних розчинів впливає на функціонування обмінника за різними механізмами.

4. SH-групи амінокислотних залишків внутрішньоклітинних ділянок молекули Na+–Ca2+-обмінника відіграють більш важливу роль у його функціонуванні у прямому режимі, ніж у зворотному, оскільки збільшення амплітуди I(Na/Ca)вх внаслідок додавання до внутрішньоклітинного розчину ПХМБ є суттєвішим, ніж амплітуди I(Na/Ca)вих.

5. NO стимулює функціонування Na+–Ca2+-обмінника в обох напрямках: внаслідок додавання до внутрішньоклітинного розчину донорів NO у низьких концентраціях амплітуда як I(Na/Ca)вх, так і I(Na/Ca)вих збільшується, а у високих концентраціях – дещо зменшується. Цей ефект NO реалізується його дією на SH-групи амінокислотних залишків, які входять до складу внутрішньоклітинних ділянок Na+–Ca2+- обмінника, оскільки додавання до внутрішньоклітинного розчину ПХМБ зменшує його.

6. Різна спрямованість впливу залужнення поза- та внутрішньоклітинного розчинів на струми Na+–Ca2+-обміну, а також той факт, що дія блокатора тіосульфатних груп ПХМБ є суттєвішою на I(Na/Ca)вх, ніж на I(Na/Ca)вих, і не проявляється при його додаванні до позаклітинного розчину свідчать про функціональну асиметрію обмінника.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Клевець М.Ю., Манько В.В., Федірко Н.В., Король Т.В., Ларіна О.А. Кальцій і плазматична мембрана секреторних клітин екзокринних залоз Вісник Київськ. ун-ту ім. Т. Шевченка. Фізіологія: Проблеми регуляції фізіологічних функцій. – 2000. – Вип. . – С. 9-13.

2. Larina O.A., Manko V.V., and Klevets M.Yu. Effect of nitric oxide on secretion and accumulation of Ca2+ by the tissue of the salivary glands in