МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Олійник Олена Анатоліївна

УДК 615.322.547.915.616-08.001.6-071

ФАРМАКОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ БІОЛОГІЧНО АКТИВНОЇ

КОМПОЗИЦІЇ “ГІПОКЛОВОЙЛ”

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Одеса – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Ліпкан Георгій Миколайович, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри клінічної лабораторної діагностики

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Воскресенський Олег Миколайович, Інститут стоматології АМН України, м. Одеса, завідувач відділом фармакології та токсикології

доктор медичних наук, професор Дев’яткіна Тетяна Олексіївна, Українська медична стоматологічна академія МОЗ України, м. Полтава, професор кафедри експериментальної і клінічної фармакології з клінічною імунологією та алергологією

Провідна установа

Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра фармакології, м. Харків

Захист відбудеться “ 01 ” березня 2006 року о 13-00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті за адресою: 65082, м. Одеса, пров. Валіхівський, 2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету за адресою: 65082, м. Одеса, пров. Валіхівський, 3.

Автореферат розісланий “ 26 ” січня 2006р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

к.мед.н., доцент В.В.Годован

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДИСЕРТАЦІЇ

Актуальність теми. Завдяки вмістові складних комплексів біологічно активних сполук із широким спектром фармакологічної дії і біорегулюючим впливом на різні системи організму, природні лікарські засоби продовжують широко застосовуватися для профілактики та лікування цілого ряду захворювань (особливо хронічних) як у монотерапії, так і в комбінації зі специфічними препаратами (Голышенков П.П., 1990; Алтымышев А.А., 1991; Кархут В.В., 1993; Белокуров А.В. и соавт., 1995; Мінарченко В.М., 1996; Лавренова Г.В., 1997; Горчакова Н.О. та ін., 2003; Чекман І.С., 2004). Їх перевагою є мала токсичність, можливість тривалого використання без суттєвих побічних явищ, ефективність, відносна доступність (Гродзинський А.М., 1998). Бета-каротинвмістні олії (обліпихова, аронієва, шипшинова) в цьому переліку займають особливе місце, тому що виявляють комплексну радіозахисну, протизапальну, ранозагоюючу, противиразкову та інші види лікувальної дії (Хабибулина В.М. и соавт., 1997; Александров В.А. и соавт., 1998; Aitzetmuller K. et al., 1999; Gao X et al., 2000; Johansson A.K et al., 2000).

Зростання негативного впливу на стан здоров’я людини несприятливих факторів зовнішнього середовища, погіршення структури загальної патології з перевагою порушень обміну, широке розповсюдження, неухильний ріст та нерідко обтяжений перебіг захворювань печінки, жовчних шляхів, шлунка, спонукають до подальшого пошуку ефективних засобів профілактики та лікування цієї патології (Букин Ю.В., 1993; Гришина Е.И., 1998; Дзяк Г.В., 1999; Чекман І.С., 2003).

Безумовний інтерес у цьому напрямку представляє вивчення різноманітної лікувально-профілактичної дії нової біологічно активної композиції “Гіпокловойл” (1 % олія обліпихово-гвоздикова у співвідношенні 99/1), діючими основними речовинами якої в обсязі 100 мл є 183 мг бета-каротину, 800 мг евгенолу, 200 мг токоферолів та 5650 мг поліненасичених жирних кислот. Нове сполучення поліненасичених жирних кислот, жиророзчинних вітамінів, провітаміну та евгенолу дозволяє припустити для гіпокловойлу більш широкий спектр фармакологічних ефектів, ніж у олії обліпихової фармакопейної.

Незважаючи на велику кількість робіт, присвячених вивченню хімічного складу, різноманітності біологічної дії олії обліпихової, у доступній літературі є лише поодинокі роботи, що висвітлюють окремі аспекти біологічного впливу гвоздикової олії й евгенолу (Capasso R., 2000; Ghelardini C. et al., 2001; Kim S.S. et al., 2003; Walsh S.E. et al., 2003) і практично відсутні роботи з вивчення впливу комплексу біологічно активних речовин у складі гіпокловойлу на обмінні процеси в організмі і його фармакологічний аналіз.

Викладене стало обгрунтуванням вибору теми наукового дослідження і послужило підставою для визначення мети дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках НДР кафедри клінічної лабораторної діагностики Київської медичної академії післядипломної освіти (КМАПО) ім. П.Л. Шупика МОЗ України “Вивчення впливу бета-каротинвмістних олій на функцію печінки в умовах атеросклерозу й експериментального стресу” (№ державної реєстрації – 0196U010569). Дисертант є співвиконавцем зазначеної науково-дослідної роботи.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є з’ясування фармакологічних властивостей та визначення перспективності медичного застосування нової природної біологічно активної композиції “Гіпокловойл”.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні основні завдання:

1.

2.

3.

4.

5.

Об’єкт дослідження – біологічна активність композиції “Гіпокловойл”. Композиція розроблена на кафедрі клінічної лабораторної діагностики КМАПО ім. П.Л. Шупика.

Предмет дослідження – фармакологічні властивості та нешкідливість біологічно активної композиції “Гіпокловойл” у експериментальних тварин.

Методи дослідження – фармакологічні, морфологічні, біохімічні, гематологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше дано теоретичне обгрунтування доцільності з’єднання комплексу біологічно активних речовин, що входять до складу обліпихової та гвоздикової олій, експериментально визначено їх оптимальне співвідношення у вигляді композиції “Гіпокловойл”. Вперше досліджено фармакологічні властивості гіпокловойлу, обгрунтовано його внутрішньошлункове застосування у тварин та розраховано дози введення. Вперше встановлено, що гіпокловойл є практично нешкідливою композицією, має антиексудативні властивості, пригнічує розвиток місцевої і загальної запальної реакції, а також підвищує фагоцитарну активність лейкоцитів і пов'язаний з нею стан неспецифічної резистентності організму. Вперше показана противиразкова і стимулююча репаративні процеси активність гіпокловойлу, встановлена його гепатопротекторна дія при тетрахлорметановому гепатиті. Отримані дані лягли в основу матеріалів для одержання патенту України “Імуностимулююча композиція Гіпокловойл” № 47354 від 17.06.2002 р. (бюл.№ 6).

Практичне значення отриманих результатів. На підставі результатів експериментальних досліджень обгрунтована доцільність клінічного застосування нової природної біологічно активної композиції “Гіпокловойл” при захворюваннях шлунково-кишкового тракту, токсичних гепатитах, артритах, виразкових ураженнях шкіри і слизових оболонок. Впровадження гіпокловойлу в медичну практику для лікування вказаної патології дасть можливість розширити арсенал вітчизняних лікарських препаратів, перевага яких пов’язана з відсутністю токсичності, можливістю тривалого застосування, ефективністю та доступністю. Матеріали дисертації впроваджені в навчальний процес кафедр клінічної лабораторної діагностики і гематології та трансфузіології КМАПО ім. П.Л. Шупика.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проведено патентно-інформаційний пошук та аналіз наукової літератури за темою дисертації. Спільно з науковим керівником визначено мету і задачі досліджень, розроблено методичні підходи щодо вивчення фармакологічних властивостей гіпокловойлу. Особисто автором виконано запланований обсяг експериментальних досліджень, проведено статистичну обробку отриманих даних, аналіз і узагальнення результатів, сформульовано висновки, опубліковано основні положення дисертації.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались і обговорювались на Міжнародній науково-практичній конференції "Нові технології отримання і застосування біологічно активних речовин" (Алушта, 2002); Науково-практичній конференції з міждународною участю "Актуальні питання тканинної терапії і перспективи застосування природних біологічно активних речовин у сучасній медицині" (Одеса, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць, в тому числі 5 статей у профільних журналах, що входять до переліку, затвердженого ВАК України, із них 3 самостійні, 2 тези доповідей на науково-практичних конференціях і 1 патент України на винахід.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, аналітичного огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, двох розділів власних досліджень, обговорення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел із 309 найменувань (118 вітчизняних і країн СНД та 191 іноземних). Робота викладена на 165 сторінках (основний текст на 129 сторінках), ілюстрована 28 таблицями і 24 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Матеріалом для дослідження служила олія обліпихово-гвоздикова, яку отримували шляхом простого змішування олій обліпихової фармакопейної (ТОВ “Фітолік”, Україна) і гвоздикової (ТОВ “Ароматика”, Україна) у необхідній для кожного дослідження концентрації. Препарати порівняння – олія обліпихова фармакопейна, 1 % соняшниково-гвоздикова олія. Дотримані необхідні умови збереження олій (темний скляний посуд, температура +5°С). Вибір методів дослідження проведено у відповідності до методичних рекомендацій доклінічних досліджень лікарських засобів ДФЦ МОЗ України (Стефанов О.В., 2001). Досліди проводили на 273 мишах масою 18-22 г, 544 щурах масою 190-240 г, 30 мурчаках масою 370-430 г та 68 кролях масою 2,5-3,0 кг обох статей, яких утримували при природному світловому циклі на стандартній лабораторній дієті з постійним доступом до води відповідно до рекомендацій В.В. Меньшикова (2003). Робота з тваринами проводилась згідно з міжнародними вимогами про гуманне ставлення до тварин та з дотриманням вимог директиви 86/609/ЕЕС з питань захисту тварин.

Гостру токсичність обліпихово-гвоздикової олії з визначенням ЛД50 проводили на білих нелінійних мишах за методом Т.М. Алтымышевой и соавт. (1983). Клас токсичності визначали за загальноприйнятою класифікацією (Сидоров К.К., 1973). Олію вивчали в широкому діапазоні емперичних концентрацій 1-5-10 і 20 % (відсоток вмісту гвоздикової олії в олії обліпиховій фармакопейній), вводили одноразово внутрішньошлунково (в/шл), підшкірно (п/шк) або внутрішньоочеревинно (в/оч) в дозах, припустимих фізіологічними нормами, відповідно 0,8, 1,0 і 1,0 мл. Рівень токсичності оцінювали за зміною поведінкових реакцій, нервово-м'язової збудливості і маси тіла тварин протягом першої доби після введення олії і на 14 день експерименту.

Хронічну токсичність вивчали протягом 4-х місяців на білих щурах лінії Ві- стар, яким за допомогою зонда в/шл вводили композицію “Гіпокловойл” (1 % обліпихово-гвоздикову олію) щоденно в дозі 5,4 мл/кг. При виборі дози враховували, що максимально можлива терапевтична доза препарату порівняння – олії обліпихової фармакопейної для людини складає близько 0,27 мл/кг на добу і її рекомендують застосовувати курсами до 30 діб (Машковський М. Д., 2005).

Загальнофармакологічну дію гіпокловойлу вивчали шляхом визначення рівня гемоглобіну, еритроцитів і лейкоцитарної формули крові білих нелінійних щурів та оцінки змін ЕКГ, пульса, ЧСС й ЕЕГ у статевозрілих самців кролів за допомогою відповідно одноканального електрокардіографа ЕК-1ТО3212 та вітчизняного комп’ютерного комплекса ЕЕГ 19-01.

Визначення впливу гіпокловойлу на основні види обміну (білкового та вуглеводного), а також на функціональний стан лейкоцитів проводили відповідно за показниками сечовини і глюкози в периферичній крові та за фагоцитарним тестом у мурчаків. Концентрацію сечовини визначали уніфікованим уреазним методом (модифікована реакція Бертелота з саліцилато-гіпохлоритом) (Аксененко Л.П. і співавт., 1994), рівень глюкози – глюкозооксидазним (Комаров Ф.И. и соавт., 2001), а фагоцитарний тест – за методами Н.В. Васильева и соавт. (1972) та М.Т. Александрова и соавт. (1988). В останньому – визначали кількість мікроорганізмів Staphylococcus aureus (штам 209) поглинутих та перетравлених нейтрофілами в умовах їх спільної інкубації. Здатність фагоцитів до поглинання відображали показники фагоцитарної активності (ФА – відсоток фагоцитів з числа полічених нейтрофілів) та фагоцитарного індексу (ФІ – середнє число мікробів, поглинених одним фагоцитом). Функцію перетравлення характеризували показник завершеності фагоцитоза (ПЗФ – відношення кількості перетравлених мікробів до загальної кількості поглинених мікробів) та індекс бактеріцидності нейтрофілів (ІБН – відношення кількості неперетравлених мікробів до перетравлених).

Протизапальний потенціал гіпокловойлу, при застосуванні його у лікувальному та профілактичному режимах, вивчали на моделі ад’ювантого поліартриту у білих щурів лінії Вістар, за умов введення їм повного ад’юванта Рамона-Фрейнда (Rumon F, 1952; Freund J., Mc Dernoff K., 1962). Оцінку перебігу поліартриту проводили за показниками ступеня запального процесу в суглобах і тривалості клінічної картини запалення. Кількісну оцінку місцевої запальної реакції і генералізованої форми перебігу ад’ювантної хвороби здійснювали за методом М.А. Мохорта (1971). Препаратами порівняння служили бутадіон (АТ “Галичфарм”, Україна) та аспірин (ВАТ “Стирол”, Україна).

Противиразкову лікувальну та профілактичну активність гіпокловойлу досліджували у білих нелінійних щурів на моделях виразкоутворення іммобілізаційним стресом (Анічков С.В. та ін., 1969), а також шляхом уведення ульцерогенних речовин гістаміну (“Биомед”, Росія), серотоніну (“Reanal”, Угорщина), аспірину та резерпіну (“Polfa”, Польща). Для одержання “гістамінових” та “аспіринових” виразок використовували метод Г.В. Оболенцевої та ін. (1995). Серотонінові виразки викликали за методом L. Voroshazy (1966), резерпінові – І.С. Заводської (1964). Ульцерогеннісь, лікувальну та профілактичну дію препаратів оцінювали за індексом Паулса (Pauls F. et al., 1947). Замість визначення ступеня виразкоутворення підраховували площину виразок слизової оболонки шлунка в балах, що більш об'єктивно відображає характер дистрофічних порушень (Ліпкан Г.М. та ін., 1997). Під час вивчення лікувальної антивиразкової дії гіпокловойлу препаратом порівняння був обраний кверцетин (НВЦ “Борщагівський ХФЗ”, Україна), з огляду на його антилейкотрієновий механізм дії.

Гепатотропну дію гіпокловойлу вивчали в умовах тетрахлорметанового (ТМ) гепатиту у кролів породи Шиншила. Схему експерименту запозичено з праць E. Nagababu et al. (1995), I. Nishigaki et al. (1992), як скринінгову модель оцінки гепатопротекторної активності. В умовах патології, оцінку цитолітичних процесів проводили за рівнем аланінамінотрансферази (АЛТ) і аспартатамінотрансферази (АСТ) (Reitman S., Frankel S., 1957), ступеня ураження паренхіми печінки, а також процесів регенерації гепатоцитів – за активністю сорбітолдегідрогенази (СДГ) (Sevela M., Tovarek J., 1961). Екскреторну функцію печінки досліджували шляхом проведення бромсульфалеінової проби (БП) (Меньшиков В.В., 2003), стан синтетичних процесів – за рівнем загального білка сироватці крові уніфікованим біуретовим методом та специфічного мідьзв’язуючого білка церулоплазміну (Ravin H.A., 1961). Для визначення характеру взаємодії вивчаємих олій у складі композиції “Гіпокловойл”, отримання доказів потенціювання дії її компонентів, препаратами порівняння було обрано 1 % соняшниково-гвоздикову та олію обліпихову фармакопейну. Визначення біохімічних показників проводили на біохімічному аналізаторі “Mikrolab 200” фірми AVL (Німеччина).

Морфофункціональну характеристику патоморфологічних процесів в печінці піддослідних тварин в умовах тетрахлорметанового гепатиту отримали в експерименті на білих щурах (Watanabe А. et al., 1976). Методами гістохімії й ензимогістохімії (Пирс Е., 1962) визначали кількість нейтрального жиру (забарвлення суданом чорним), глікогена (Шабадаш А.Л., 1947), активність мембранної аденозинтрифосфатази (“транспортної” АТФ-ази) та глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-Ф-ази) (Wachstein М., Мeisel Е., 1957), сукцинатдегідрогенази (СДГ1) (Nachlas M. М., 1957), лактатдегідрогенази (ЛДГ) (Hess R., Scarpelli D.G., 1958; Пирс Е., 1962 ), кислої фосфатази (КФ) (Gomori G., 1950). В залежності від інтенсивності та розповсюдження забарвлення продукта гістохімічної реакції, оцінку ферментативної активності проводили візуально загальновизнанним напівкількісним методом у порівнянні з нормою. Мікроскопію і мікрофотографування проводили на мікроскопі Zetopan 1,3 (Австрія).

Одержані результати оброблені методами математичної варіаційної статистики (О.П. Мінцер, 2003).

Результати досліджень та їх обговорення.

Внутрішньошлункове введення мишам 20 % та 10 % обліпихово-гвоздикової олії (співвідношення обліпихової та гвоздикової олій відповідно 4/1 та 9/1) супроводжувалося клінічними проявами інтоксикації тільки у випадку, коли доза 20 % олії складала 40 мл/кг та 25 мл/кг (вміст евгенолу 7200 мг/кг та 4500 мг/кг відповідно в обсягах 0,8 мл та 0,5 мл), а 10 % олії – 25 мл/кг (вміст евгенолу 3200 мг/кг в обсязі 0,8 мл). Протягом першої доби у тварин спостерігалося тахіпное, зменшення спонтанної рухової активності, збільшення частоти серцевих скорочень, погіршення прийому корму, але не змінювалася реакція на світлові, звукові та больові подразники, а також характер калу (IV клас токсичності), всі тварини вижили. Введення 5 % олії та гіпокловойлу (співвідношення обліпихової та гвоздикової олій відповідно 19/1 та 99/1) в дозах 10 мл/кг, 25 мл/кг та 40 мл/кг (вміст евгенолу від 80 мг/кг до 1600 мг/кг в обсягах 0,2 мл, 0,5 мл та 0,8 мл) не супроводжувалося розвитком токсичної реакції. Тварини добре приймали корм, додавали в масі, були однаково активними, адекватно реагували на світлові, звукові і болючі подразники; патологічних вегетативних ефектів не спостерігалося; загибелі тварин не було (V клас токсичності). Встановити ЛД50 для обліпихово-гвоздикової олії при такому шляху введення не вдалось.

Підшкірне застосування 20 %, 10 % та 5 % олії в усіх дослідних дозах (50 мл/кг, 25 мл/кг та 10 мл/кг), максимум яких обмежено фізіологічними нормами введення речовин мишам (до 1,0 мл), супроводжувалося 100 % загибеллю тварин. В них спочатку спостерігалося прискорене поверхневе дихання, ціаноз хвоста, збільшення спонтанної рухової активності, нетипові способи пересування у вигляді підскакування та судомості, аритмії, гіперсалівація, скуйовдження, виражене уповільнення реакції на світло, звук і біль, відмова від прийому води та їжи, а перед загибеллю з’являлися асфіксичні судоми клонічного типу, що відповідало III класу токсичності. Час загибелі залежав від концентрації олії та її дози. Після введення 20 % олії (вміст евгенолу в обсязі 1,0 – 0,5 та 0,2 мл відповідно 9000 – 4500 та 1800 мг/кг) загибель спостерігалася через 1 – 5 та 30 хв. Введення 10 % та 5 % олії приводило до загибелі тварин відповідно через 50 хв – 1 год та 30 хв – 1 год (вміст евгенолу коливав в межах 4000 мг/кг – 400 мг/кг). Введення гіпокловойлу не викликало загибелі тварин, але в них спостерігалося тахіпное, зменшення спонтанної рухової активності, збільшення частоти серцевих скорочень. Тварини були млявими, погано приймали корм тільки протягом першої доби після введення олії, деякі – пригніченими, з вираженою уповільненою реакцією на світлові, звукові і больові подразники. Кал залишався твердим та сухим.

Аналогічна картина клінічних проявів гострої токсичності у піддослідних тварин, що відповідала III класу токсичності, спостерігалася після введення обліпихово-гвоздикової олії внутрішньоочеревинно. З 84 тварин вижило 28 (33,3 %), яким вводили 5 % олію в мінімальній дозі 10 мл/кг (вміст евгенолу 400 мг/кг в об’ємі 0,2 мл) та гіпокловойл в дозах 10 мл/кг, 25 мл/кг та 50 мл/кг (вміст евгенолу в об’ємах 0,2 – 0,5 та 1,0 мл відповідно 80 – 200 та 400 мг/кг).

Порівняльна оцінка гострої токсичності обліпихово-гвоздикової олії, з урахуванням обов’язкової рекомендації щодо її подальшого клінічного використання, показала, що оптимальне співвідношення обліпихової та гвоздикової олій є в композиції “Гіпокловойл” (99/1), ступінь токсичності якої відповідає V класу при внутрішньошлунковому шляху введення.

В експерименті з вивчення хронічної токсичності гіпокловойлу відмінностей інтегральних показників здоров’я тварин (споживання їжи, води, зміни шкіри, очей, шерсті, слизових оболонок, температури тіла, частоти дихання, а також поведінкової реакції) в основній та контрольній групах не визначено. Зовнішні ознаки інтоксикації були відсутніми. Випадків загибелі тварин не зареєстровано.

Аналізуючи показники, що характеризують загальнотоксичну дію та загальнофармакологічні властивості гіпокловойлу встановлено, що статистично вірогідної різниці концентрації гемоглобіну, кількості еритроцитів та лейкоцитарної формули (нейтрофілів, лімфоцитів, базофілів, еозинофілів, моноцитів) у щурів основної групи під час курсового 4-х місячного введення гіпокловойлу в добовій терапевтичній дозі та групи контролю не було.

В дослідах на кролях негативного впливу гіпокловойлу на функцію центральної нервової та серцево-судинної систем не встановлено. Пероральне введення гіпокловойлу в дозі 5,4 мл/кг не викликало у піддослідних тварин змін графіки ЕКГ, амплітуди зубців та частоти серцевих скорочень. ЧСС в обох групах тварин була у межах 310-350 уд/хв, пульс – ритмічний. Не спостерігалось суттєвих змін ЕЕГ у порівнянні з фоновою. Амплітуда ритмів швидких діапазонів була у межах 10-30 мкВ, повільних – 50-120 мкВ. Курсове введення гіпокловойлу мурчакам протягом 20 діб не привело до статистично вірогідних змін показників білкового та вуглеводного обмінів в сироватці крови (рівня сечовини та глюкози). Коливання цих показників було відповідно у межах 8,8±1,3 – 10,4±1,1 ммоль/л та 7,4±0,9 – 8,2±1,2 ммоль/л. Таким чином доведено, що гіпокловойл є практично нетоксичною БАР і відноситься до препаратів V класу токсичності.

За результатами дослідження впливу гіпокловойлу на фагоцитарну активність лейкоцитів та стан неспецифічної резистентності організму мурчаків вірогідно встановлена властивість гіпокловойлу посилювати поглинаючу та перетравлюючу здатність фагоцитів, підвищувати показники ФА, ФІ, ПЗФ та зменшувати ІБН (рис.1).

ФА ФІ ІБН ПЗФ

(%) (віднос. од.)

Рис. 1. Вплив гіпокловойлу та олії обліпихової на фагоцитарну активність лейкоцитів та стан неспецифічної резистентності організму мурчаків: I – інтактні; II – олія обліпихова; III – гіпокловойл.

Застосування гіпокловойлу у щурів з ад’ювантним поліартритом супроводжувалося статистично вірогідним зменшенням набряку суглобів на 14-ту і 16-ту добу експерименту (на 35,1 % у порівнянні з контролем). В середньому, ефект був в 1,3 рази більш вираженим, ніж при введенні олії обліпихової, але в 2,3 та 1,7 рази меншим, ніж ефекти аспірину та бутадіону відповідно. Достовірних відмінностей показників, що враховувались в групах лікування олією обліпиховою фармакопейною та контролю, не виявлено (рис. 2).

Профілактичне введення гіпокловойлу й олії обліпихової протягом 5-ти діб в дозі 5,4 мл/кг так само приводило до вірогідного зменшення місцевої запальної реакції, починаючи з 2-ї доби.

Рис. 2. Вплив гіпокловойлу, олії обліпихової і нестероїдних протизапальніх засобів на перебіг ад’ювантної хвороби.

Найбільш виражена їх дія спостерігалася на 5-ту добу експерименту (зменшення набряку у порівнянні з контролем на 29,3 % та 20 % відповідно). Протизапальна дія аспірину та бутадіону при цьому перевищувала аналогічну дію досліджуваних олій відповідно в 1,1 – 1,3 рази та в 1,3 – 1,5 рази.

Таким чином, результати вивчення фармакологічних властивостей гіпокловойлу на моделі ад’ювантного поліартриту у щурів у випадку застосування з лікувальною та профілактичною метою свідчать про його виразну протизапальну дію, що перевершує олію обліпихову і наближену до еталонів порівняння – аспірину і бутадіону.

Результати досліджень C. Gheraldіnі et al. (2001), J.H. Leal-Cardoso et al. (2002), S.S. Kіm et al (2003) механізмів протизапальної, знеболюючої та спазмолітичної дії евгенолу дозволяють зробити припущення про ймовірне потенціювання дії олії обліпихової й евгенолу у складі гіпокловойлу, яке виявилося особливо ефективним у режимі лікування.

На моделі нейрогенних виразок шлунку, викликаних іммобілізацією було вста-новлено, що застосування гіпокловойлу з лікувальною метою протягом 2-х тиж, як і препаратів порівняння (олії обліпихової і кверцетину), не приводило до статистично вірогідного прискорення процесів епітелізації виразок. Інакше себе виявили досліджувані олії, коли призначалися у профілактичному режимі протягом 3-х тиж. до іммобілізаційного стресу. Введення гіпокловойлу та олії обліпихової приводило до зниження індексу Паулса з 6,61,0 в групі контроля до 1,60,8 і 2,61,0 відносних одиниць відповідно і зменшення кількості тварин з виразками до 43 % і 57 % (тобто у 2,1 і 1,5 рази), що мало статистично значимі відмінності (рис. 3).

Рис. 3. Профілактична антивиразкова дія гіпокловойлу й олії обліпихової фармакопейної на експериментальній моделі виразкових уражень, викликаних іммобілізацією.

Встановити достовірність відмінностей антивиразкової активності досліджуваних олій в умовах профілактичного введення до іммобілізаційного стресу не вдалося. Можливо, в цих умовах на рівень противиразкового ефекту вивчаємих олій впливають полієнові кислоти -3 та -6 (ліноленова та лінолева), що містяться в олії обліпиховій фармакопейній в кількості 4,5 та 3,5 мг% відповідно (Северцева О.В., 1997) і мають відмінну за характером біологічну дію (полієни -3 є попередниками простагландинів (PG) 3 ряду, що мають протизапальну дію, а -6 – прозапальних PG 1 та 2 рядів) (Левицький А.П., 2002).

На аспіриновій моделі виразкоутворення профілактичне введення гіпокловойлу щурам приводило до зниження у 3 рази кількості та поширення виразок слизової шлунка, що значно перевищувало активність олії обліпихової (р<0,05). Індекс Паулса у тварин дослідної групи склав відповідно 2,4 ± 0,2 та 3,6 ± 0,4 відносних одиниць проти 7,2 ± 1,1 відносних одиниць у групі контролю. Профілактичне введення гіпокловойлу та олії обліпихової фармакопейної на моделі резерпінового виразкоутворення приводило до зниження індексу виразкоутворення відповідно у 1,7 (р<0,01) та 1,5 рази (р<0,05). Характер виразкового процесу в групі контроля не відрізнявся від того, що описаний в науковій літературі (М.А. Мохорт та ін., 1971). Ці дані вказують на істотну роль PG 3 ряду в блокуванні розвитку ульцерогенного процесу, особливо разом з евгенолом. Гіпокловойл, ймовірно, має здатність нормалізовувати баланс PG, порушення якого виникає внаслідок інгібування аспірином циклооксигенази та зменшення рівня тромбоксану. Попереднє введення олій в експерименті з гістамином та серотоніном приводило до певного зниження індексу виразкоутворення у тварин відповідно на 34,5-36,6 % та на 15,5 – 22,7 %. Однак отримані дані були статистично недостовірними.

Таким чином, за механізмом захисної дії виявилася незначна перевага гіпокловойлу перед олією обліпиховою на нейрогенній моделі виразкоутворення та достовірно виражена на аспіриновій, в патогенезі яких домінують порушення обміну простагландинів та секреторної активності слизової оболонки шлунка. З погляду на існування подібного механізму виразкоутворення у людини, отримані результати є ще раз підтвердженням доцільності використання гіпокловойлу з метою профілактики виразкоутворення у шлунку та дванадцятипалої кишки.

Вивчення фармакологічної дії олій обліпихової, 1 % соняшниково-гвоздикової та гіпокловойлу (групи II, III, IV) на функцію печінки проводили на моделі експериментального тетрахлорметанового гепатиту, генез якого пов’язаний з індукцією вільнорадикального окислювання ліпідів.

В I групі (контролю – отруєння ТМ без лікування) максимальна затримка бромсульфалеїну в крові піддослідних тварин спостерігалася на 3-тю добу експерименту (43,8 %), (р<0,05). У подальшому відбувалося прогресивне зниження цього показника до нормального рівня (9,5 %), починаючи з 10-ї доби. Активність АЛТ, АСТ, СДГ та рівень церулоплазміну змінювалися так само двофазно: збільшувалися максимально на 3-ю добу після запалу тварин (відповідно у 6,4 – 99,2 – 11,9 та 3,2 рази), (р<0,05), після чого зменшувалися протягом наступних 12-ти діб, але залишалися вищими за норму відповідно у 1,7 – 20,2 – 1,4 та 2,2 рази. Одночасно, з 2-ї до 10-ї доби, відбувалося достовірне зниження рівня ЗБ, максимально виражене (на 21,8 % ) на 3-тю добу експерименту.

Таким чином, за допомогою показників АЛТ, АСТ, СДГ, БП, церулоплазміну та ЗБ було встановлено, що період максимальної гепатотоксичної прооксидантної дії ТМ припадає на 3-тю добу після отруєння тварин. Поетапна нормалізація показників БП і ЗБ та збереження підвищеного рівня АЛТ, АСТ, СДГ та церулоплазміну протягом всього періоду спостереження свідчать про особливості відбудовних процесів в печінці (ліквідація холестазу, поновлення синтезуючої функції на тлі існування залишкових явищ запального процесу та дисфункції органа). Ці дані збігаються з результатами досліджень (Войтенко Г.М. та ін., 1997; Блажиєвська Г.І. та ін., 1998). Суттєве підвищення концентрації церулоплазміну, який повністю синтезується мембранозв’язаними рибосомами ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів є закономірним наслідком перебігу токсичного гепатиту, свідченням його ступеня тяжкості. Одночасно з тим, адаптивна активація його синтезу та антиоксидантної ферментативної дії спрямує до забезпечення захисту клітин та блокування поширеності патологічного процесу в печінці.

Введення рослинних олій в дозах 5,4 мл/кг приводило до скорочення терміну відбудовних процесів і супроводжувалося відповідними змінами контрольних показників. При цьому максимальний гепатопротекторний ефект був відзначений у гіпокловойлу. Якщо в групах II і III активність АЛТ досягла нормального рівня на 15-ту добу експерименту, то в умовах введення гіпокловойлу це спостерігалося вже на 10-ту добу. Показник АСТ також досяг нормального рівня, але тільки в IV групі тварин (на 10-ту добу експерименту). Активність СДГ після запалу ТМ і лікування олією обліпиховою фармакопейною і 1 % соняшниково-гвоздиковою не відрізнялася від норми з 10-ї доби, а після лікування гіпокловойлом – з 7-ї. Дослідити відмінності лікувальної дії досліджуваних олій за показником БП не було можливим, так як його значення вже на 7-му добу експерименту в усіх групах відповідало нормі.

Гіпокловойл сприяв більш активному відновленню білокутворюючої функції печінки. Якщо після отруєння ТМ у II групі тварин нормалізація рівня ЗБ спостерігалася на 6-у добу, у III групи цей показник не опускався за межу норми, то в умовах введення гіпокловойлу, з 15-ї доби відбувалося статистично достовірне його зростання. Крім того, тільки в цієї групі досліджень відбувалася нормалізація рівня церулоплазміну (на 15-ту добу), що підтверджує більш значну ступінь відновних процесів в печінці.

Таким чином, проведені експериментальні дослідження гепатотропної дії гіпокловойлу при ураженні печінки, викликаному ТМ, показали його більш ефективний вплив на відбудовні процеси в печінці у порівнянні з олією обліпиховою та 1 % соняшниково-гвоздиковою. Причому, під дією гіпокловойлу відбувається поліпшення показників усіх типів патологічних синдромів даної моделі експериментального гепатиту (цитолізу, холестазу, зниження білокутворення, запалення, дисфункції органу). Це є переконливим доказом потенціювання дії досліджуваних олій у складі гіпокловойлу, перш за все, пов'язаної з поєднанням ефектів антиоксидантів (бета-каротину, токоферолів, евгенолу) та відновленням рівня незамінних полієнових жирних кислот, що “вигорають” під впливом ТМ.

Гепатопротекторна дія гіпокловойлу простежена морфологічними дослідженнями. Період найбільше виражених некробіотичних і дистрофічних змін у печінкових часточках спостерігався між 3-ою і 5-ою добою. В той самий час, у тварин, яким давали гіпокловойл, вищезазначені патологічні зміни в гепатоцитах були значно меншими, або повністю зникали, що свідчить про його пряму захисну дію.

Гістохімічні реакції на КФ, СДГ1, ЛДГ, Г-6-Ф-азу й АТФ-азу дозволили провести порівняльну оцінку стану лізосом, функції мітохондрій, характеру змін ендоплазматичного ретикулуму та функції плазматичної мембрани гепатоцитів відповідно як в нормі так і при патології, в тому числі на тлі лікування гіпокловойлом. Зменшення інтенсивності гістохімічної реакції на АТФ-азу, Г-6-Ф-азу, СДГ1, та її збільшення на ЛДГ і КФ, що були максимально вираженими в печінці тварин протягом 3-ї – 5-ї доби після отруєння ТМ, свідчило про зниження жовчовидільної та детоксикаційної функцій, ушкодження структури мітохондрій та енергетичного обміну в клітинах паренхіми печінки з перевагою анаеробних процесів окислювання, некробіоз з порушенням структури печінкових часточок. Лікування гіпокловойлом приводило до активізації відбудовних процесів, істотно виражених вже на 5-ту добу експерименту.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведені результати вивчення фармакологічних властивостей нової композиції 99:1 обліпихової та гвоздикової олій – Гіпокловойлу. Діючими основними речовинами її є бета-каротин, токофероли, евгенол та незамінні жирні кислоти. Гіпокловойл має широкий спектр фармакологічної дії, головним з яких є протизапальний, гепатопротекторний, противиразковий та стимулюючий репаративні процеси ефекти. Отримані дані є експериментальним обгрунтуванням клінічного застосування гіпокловойлу в профілактиці та терапії захворювань шлунково-кишкового тракту, токсичних гепатитів, артритів, уражень шкіряних покровів та слизових оболонок.

1. В гострих дослідах токсичності в припустимих фізіологічних максимальних дозах гіпокловойл не викликає загибелі тварин. Вивчення хронічної токсичності гіпокловойлу при 4-х місячному в/шл введенні в дозі 5,4 мл/кг на добу не виявило достовірних змін інтегральних показників функціонального стану тварин, негативного впливу на показники периферичної крові, білкового та вуглеводного обмінів, функцію центральної нервової та серцево-судинної систем експериментальних тварин і не супроводжувалося їхньою загибеллю. Нешкідливість гіпокловойлу підтверждена морфологічно. Гіпокловойл є практично нетоксичною біологічно активною речовиною, відповідає V класу токсичності.

2. В умовах введення ад’юванта Рамона-Фрейнда, гіпокловойл на 1/3 зменшує інтенсивність прояву запальної реакції і виразність ад’ювантного поліартриту. За силою протизапальної дії гіпокловойл в 1,3 рази перевищує активність олії обліпихової фармакопейної та наближається до ступенів ефектів бутадіону та аспірину.

3. Гіпокловойл вірогідно підвищує неспецифічну резистентність організму тварин, посилює поглинальну та перетравлюючу здатність фагоцитів, про що свідчать збільшення у 1,7 рази фагоцитарної активності лейкоцитів, у 3,8 рази фагоцитарного індексу, у 24,4 рази показника завершеності фагоцитозу та зменшення індексу бактеріцидності нейтрофілів з 30,1 ± 1,6 до 0,2 ± 0,1 (р< 0,05).

4. На п’ятьох експериментальних моделях виразок шлунку гіпокловойл виявляє виражену противиразкову дію. Його профілактичне введення на моделі виразкоутворення, викликаного іммобілізаційним стресом, уведенням аспірину та резерпіну призводить до достовірного зниження індексу Паулса та зменшення кількості виразок і ерозій.

5. Гіпокловойл володіє вираженою гепатопротекторною дією, більшою за препарати порівняння. На моделі ТМ гепатиту курсове введення гіпокловойлу попереджає зміни ферментативної активності печінки і гістохімічні прояви. Завдяки механізму потенціювання дії, до 7-ї доби експерименту контрольні показники практично нормалізуються.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

АНОТАЦІЯ

Олійник О. А. Фармакологічні властивості біологічно активної композиції “Гіпокловойл”. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. – Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2006.

На тваринах вивчали спектр фармакологічної дії нової біологічно активної композиції “Гіпокловойл” (1 % олія обліпихово-гвоздикова у співвідношенні 99/1). Встановили, що гіпокловойл є практично нетоксичною біологічно активною речовиною (V клас токсичності). Його головними ефектами є протизапальний, гепатопротекторний, противиразковий та стимулюючий репаративні процеси. Це проявилося відсутністю загибелі тварин, достовірних змін інтегральних показників їх функціонального стану, негативного впливу на показники периферичної крові, білкового і вуглеводного обмінів, функції центральної нервової і серцево-судинної систем під час вивчення гострої та хронічної токсичності. За цілою низкою показників гіпокловойл перевищує активність препаратів порівняння – олію обліпихову фармакопейну та 1 % олію соняшниково-гвоздикову, вірогідно підвищує неспецифічну резистентність організму тварин, підсилює поглинальну і здатність фагоцитів, що перетравлює. В умовах введення ад’юванта Рамона-Фрейнда гіпокловойл на 1/3 зменшує інтенсивність прояву запальної реакції та виразність ад’ювантного поліартриту. На моделях виразкоутворення, викликаного іммобілізаційним стресом, аспірином і резерпіном гіпокловойл достовірно знижує індекс Паулса, зменшує кількість виразок і ерозій. Курсове введення гіпокловойлу попереджає зміни ферментативної активності печінки і гістохімічні прояви тетрахлорметанового гепатиту. Завдяки механізму потенціювання дії, до 7-ї доби цього експерименту контрольні показники практично нормалізуються.

Ключові слова: гіпокловойл, токсичність, протизапальна дія, антивиразкова активність, гепатопротекторний ефект.

АННОТАЦИЯ

Олейник Е. А. Фармакологические свойства биологически активной композиции “Гипокловойл”. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 – фармакология. – Одесcкий государственный медицинский университет МЗ Украины, Одесса, 2006.

На животных изучали спектр фармакологического действия новой биологически активной композиции “Гипокловойл” (1 % масло облепихово-гвоздичное в соотношении 99/1). Установили, что главными являются противовоспалительный, гепатопротекторный, противоязвенный и стимулирующий репаративные процессы эффекты. Гипокловойл содержит основные действующие вещества бета-каротин 183 мг%, эвгенол 800 мг%, токоферолы 200 мг% и полиненасыщенные жирные кислоты 5650 мг%. По целому ряду показателей гипокловойл превышает активность препаратов сравнения – масла облепихового фармакопейного и 1 % масла подсолнечно-гвоздичного.

Изучена острая токсичность облепихово-гвоздичного масла в зависимости от концентрации, объёма и пути его введения с определением ЛД50. Масло вводили в широком диапазоне эмперических концентраций 1-5-10 и 20% (процент содержания гвоздичного масла в масле облепиховом фармакопейном) одноразово внутрижелудочно, подкожно или внутрибрюшинно в количестве, допустимом физиологическими нормами. Расчёт дозы осуществляли в мл/кг с учётом содержания эвгенола, что позволило установить соответствие исследуемого образца биологически активной композиции V классу токсичности. Установлено оптимальное соотношение облепихового и гвоздичного масел в композиции “Гипокловойл”, внутрижелудочное введение которой в физиологически допустимых максимальных дозах не вызывало гибели животных. Изучение хронической токсичности гипокловойла при 4-х месячном внутрижелудочном введении в дозе 5,4 мл/кг не выявило достоверных изменений интегральных показателей функционального состояния животных, негативного влияния на показатели периферической крови, белкового и углеводного обменов, функции центральной нервной и сердечно-сосудистой систем экспериментальных животных и не сопровождалось их гибелью. Безвредность гипокловойла подтверждена морфологически. Гипокловойл является практически нетоксичным биологически активным веществом (V класс токсичности). Гипокловойл достоверно повышает неспецифическую резистентность организма животных, усиливает поглотительную и переваривающую способность