академія медичних наук україни

інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В. Громашевського

мороз Лариса василівна

УДК 616-022:616.36-002:616-076

ХРОНІЧНІ ВІРУСНІ ГЕПАТИТИ в ТА с.

ПОШИРЕНІСТЬ,

КЛІНІКО-МОРФОлогічні ПАРАЛЕЛІ

14.01.13 – інфекційні хвороби

Автореферат

на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ _2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Вінницькому державному медичному університеті ім. М.І. Пирогова МОЗ України

Науковий консультант: член-кореспондент АМН України, Заслужений діяч науки і техніки України, Заслужений лікар України, доктор медичних наук, професор Возіанова Жанна Іванівна, завідувач кафедри інфекційних хвороб Національного медичного університету ім. акад. О.О.Богомольця МОЗ України

Офіційні опоненти:

- Заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Громашевська Любов Леонтіївна, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, завідувач лабораторії біохімії;

- доктор медичних наук, професор Фролов Валерій Митрофанович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри інфекційних хвороб;

- доктор медичних наук, професор Нікітін Євген Васильович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри інфекційних хвороб.

Провідна установа: Івано-Франківська державна медична академія МОЗ України

Захист дисертації відбудеться 2 липня 2002 р. о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.614.01 при Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України (01015, м. Київ, вул. Січневого повстання, 23).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України (03038, м. Київ, узвіз Протасів Яр, 4).

Автореферат розісланий 31.06.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук Ж.Б. Клименко

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Вірусні гепатити являють собою глобальну проблему медицини, все ще далеку від свого остаточного вирішення. Згідно даним ВООЗ в різних країнах світу вірусами гепатитів інфіковано або перехворіло до 2 млрд. осіб (Шахгельдян Й.В., 1999; Соринсон С.Н., 1998; Crofts N. et al. 1999; Arbuthnot P, Kew M., 2001). Про важливість та актуальність цієї проблеми свідчить значна частота несприятливих наслідків цих захворювань при досить скромних успіхах терапії. Зокрема, у 50-70% хворих на гостру HCV-інфекцію та 5-8% пацієнтів з HBV-інфекцією формуються хронічні форми гепатитів з розвитком в подальшому у частини з них цирозу та первинного раку печінки (Okuda K., 2000; Arbuthnot P, Kew M., 2001). Ризик виникнення гепатоцелюлярної карциноми при гепатиті С сягає 30% (Tanaka H. et al., 2001).

Україна за рівнем інфікованості вірусом гепатиту В займає одне з перших місць в Европі (Гураль А.Л. та співавт., 1998, 2000). Даних стосовно поширеності HCV-інфекції в Україні немає через відсутність обов’язкової реєстрації цього захворювання. Основні прояви епідемічного процесу HCV-інфекції в Україні, групи підвищеного ризику інфікування, частота реалізації різних шляхів передачі збудника вивчені недостатньо. Для цієї інфекції типовою є висока варіабельність клінічних проявів і наслідків захворювання, що обумовлено різною географічною поширеністю генотипів та квазівидів вірусу гепатиту С (Львов Д.К. та співавт. , 1997; Smith D. В. еt al., 1997; Zein N. N., 2000; Wasley A, Alter MJ., 2000).

Наркозалежний тип епідемічного процесу, що формується в Україні, веде до зростання мікст-вірусних уражень печінки, ставить нові проблеми відносно діагностики та лікування (Возіанова Ж.І. та співавт., 2000; Байкова, 2001).

Відомо, що інтенсивність поширення інфекційного процесу початково визначається кількістю активних джерел інфекції серед сприйнятливого населення, тому напруженість епідемічного процесу при вірусних гепатитах знаходиться в прямому зв’язку з числом носіїв маркерів цих інфекцій. Прийняті в Україні заходи не забезпечують надійного попередження інфікування при переливанні крові та її компонентів (Гураль А.Л., 1999), головним чином через недостатню повноту лабораторного обстеження (Busch MP., 2001). В Україні практично відсутні дані щодо інфікованості донорів вірусами гепатитів. А між тим саме донори є важливим джерелом цієї інфекції. Тому нагально постає проблема удосконалення обстеження цієї категорії потенційних джерел інфекції.

Особливістю епідемічного процесу є формування нових джерел інфекції за рахунок передачі збудників від матерів-носіїв до їх дітей (Фарбер, 1990; Yeung LT. et al., 2001). Оцінка поширеності інфекції серед цього контингенту _необхідна умова формування раціональної системи профілактичних заходів, направлених на розрив природних механізмів передачі цієї інфекції.

В сучасних умовах зростає кількість пацієнтів з прихованими формами захворювання, насамперед хронічних її варіантів (Ивашкин В.Т. и соавт., 1994; Puoti C. et al., 2000; Maddrey WC., 2001); частка хворих з HBV- та HCV-інфекціями з прогресуючим ураженням печінки, але нормальними показниками цитолізу (за деякими даними від 15 до 48% (Alter HJ et al., 1997; Hoofnagle, 1997; Herve S. al., 2001)). Це вимагає пошуку більш чутливих маркерів печінкової дисфункції та розробки рекомендацій щодо оптимальної тактики ведення таких пацієнтів.

Практично важливою є проблема відповідності клінічних та лабораторних маніфестацій вірусної інфекції патологічним процесам, що відбуваються в печінці. Застосування пункційної біопсії печінки суттєво покращило верифікацію діагнозу гепатиту, оцінку форми і ступеня важкості ураження (Desmet V.J. et al., 1994; Аруин Л.И., 1995; Серов В.В., 1998). В Україні, де практично відсутня практика проведення пункційної біопсії печінки у хворих на вірусні гепатити, робіт, присвячених таким дослідженням, мало. Задача пошуку адекватних лабораторних тестів, які б максимально відображали важкість морфологічних змін в печінці, продовжує залишатись актуальною. Недостатньо вивчена морфологічна картина мікст-вірусних гепатитів в залежності від активності кожного з вірусів.

Успішне вирішення багатьох цих питань є можливим лише на основі більш глибокого розуміння молекулярних основ взаємодії вірусу з клітиною. В останні роки досягнуті значні успіхи в дослідженні механізмів цитопатичної дії вірусів, процесів їх елімінації з організму, причин хронізації вірусної інфекції. Зокрема показано, що інфікування вірусом клітини ініціює механізми імунного та апоптичного знищення вірусів разом з інфікованою клітиною (Teodoro J.G., Branton P., 1997; O’Brien V. , 1998; Roulston A. et al., 1999; Tai DI, Tsai SL., 2001). З іншого боку, надмірні масштаби імунних та апоптичних реакцій є причиною важких змін в печінці, які у випадку гострої інфекції можуть привести до фульмінантного гепатиту, а у випадку хронічної - до фіброзу чи цирозу печінки та карциноми (Lau J.N. et al, 1998). Значна роль в цих процесах належить оксиду азоту, запальним цитокінам, активним формам кисню (Schwarz, 1996). Виявилось, що крім регуляції клітинної відповіді на вірусну інфекцію, ці медіатори виявляють безпосередню вірусоцидну дію. З іншого боку модифікація вірусної нуклеїнової кислоти може стати джерелом мутацій вірусного геному і посилення його агресивності. Накопичений на сьогодні масив інформації переважно стосується молекулярних основ взаємодії вірусів і клітини та ролі оксиду азоту, активних форм кисню і апоптозу в цих процесах. Але нечисленні клінічні дослідження з цього питання не можна визнати досконалими, оскільки в них, як правило, відсутнє співставлення показників з вірусологічними та морфологічними маркерами вірусних гепатитів. Тому діагностична цінність показників оксидативного, нітрозативного стресу та апоптозу у пацієнтів з хронічними вірусними гепатитами залишається практично невідомою. Не визначено їх значення як маркерів важкості перебігу гепатитів, критеріїв формування ускладнень, предикторів ефективності лікування. Не з’ясована діагностична чутливість цих маркерів у пацієнтів без чітких клінічних та лабораторних маніфестацій хронічної вірусної інфекції.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконано відповідно до плану науково-дослідних робіт Вінницького державного медичного університету ім. М.І. Пирогова в рамках затвердженої МОЗ України НДР “Наукове обґрунтування заходів покращення ранньої діагностики хронічних вірусних гепатитів” (№ держреєстрації 0197U014958).

Мета дослідження. Шляхом вивчення поширеності маркерів вірусних гепатитів В та С серед донорів, вагітних та хворих з хронічними захворюваннями печінки оцінити діагностичну цінність існуючих стандартних схем обстеження, що використовуються для етіологічної розшифровки діагнозу та уточнення ступеню активності процесу та розробити критерії оптимального ведення пацієнтів з хронічними вірусними гепатитами.

Задачі дослідження:

1. Вивчити поширеність маркерів вірусних гепатитів В та С серед донорів, вагітних та хворих з хронічними захворюваннями печінки.

2. Уточнити питому вагу хронічних гепатитів В, С та мікст-вірусного ураження печінки в загальній структурі хронічних вірусних гепатитів.

3. Із застосуванням пункційної біопсії дослідити морфологічні особливості хронічних вірусних гепатитів на різних етапах перебігу патологічного процесу.

4. Встановити характер змін біохімічних показників та ступінь їх кореляції з морфологічним змінами.

5. Оцінити дігностичну цінність визначення прозапальних цитокінів, показників оксидативного та нітрозативного стресу, рівня глікозаміногліканів та медіаторів апоптозу, як критеріїв активності запально-некротичних та фібротичних процесів у пацієнтів з хронічними вірусними гепатитами та цирозом печінки, їх кореляцію з традиційними біохімічними тестами і морфологічними змінами.

6. Визначити вплив автоімунних розладів на формування клінічних проявів та лабораторних показників при хронічній вірусній В, С та В+С інфекції.

7. Визначити комплекс найбільш доступних та інформативних тестів, які дозволяють більш достовірно виявляти інфікованих HBV/HCV серед донорів, вагітних і хворих з хронічними захворюваннями печінки.

8. Оцінити діагностичну цінність деяких показників (прозапальні цитокіни, показники оксидативного та нітрозативного стресу, рівень глікозаміногліканів та медіаторів апоптозу), як критеріїв ефективності терапії пацієнтів з хронічними вірусними гепатитами.

Об’єкт дослідження: донори, вагітні, хворі на хронічні захворювання печінки, гострі та хронічні вірусні гепатити.

Предмет дослідження: клінічні особливості перебігу хронічних вірусних гепатитів В та С, морфофункціональний стан печінки, маркери вірусних гепатитів, автоімунні та позапечінкові прояви вірусної інфекції, процеси апоптозу, оксидативного та нітрозативного стресу, інтерферонотерапія.

Методи дослідження: в роботі використані клінічні, біохімічні, морфологічні, інструментальні, молекулярно-біологічні методи дослідження.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Україні з використанням повного спектру серологічних маркерів та клініко-біохімічних показників виявлена реальна поширеність HBV та HCV інфекцій серед донорів та вагітних жінок, а також серед хворих на хронічні захворювання печінки, які традиційно лікуються в терапевтичному стаціонарі.

Вперше проведено комплексне співставлення клінічного перебігу захворювання з морфологічною картиною ураження печінки при хронічних вірусних гепатитах В та С.

На основі комплексного морфофункціонального дослідження печінки доповнений механізм прогресуючого запального процесу при вірусному гепатиті В. Удосконалені морфологічні критерії діагностики гепатитів В і С на різних етапах запального процесу. Глибоко вивчено морфогенез хронічного гепатиту з поєднаною HBV/HCV інфекцією у співставленні з клінічними, лабораторними та вірусологічними маркерами інфекції.

Вперше проведено комплексне дослідження взаємозв’язків та співставлення біохімічних, вірусологічних та морфологічних даних, визначена діагностична цінність цитокінів, показників нітрозативного, оксидативного стресу та апоптозу, як критеріїв важкості запально-некротичних та фібротичних змін в печінці хворих на вірусні гепатити. Встановлено чіткий кореляційний зв’язок між ступенем запально-некротичних та фібротичних змін в печінці та вищезазначеними процесами.

Поглиблено уявлення про роль медіаторів запалення та апоптозу в патогенезі хронічного вірусного ураження печінки. Показано, що саме вірусна реплікація причетна до активації синтезу прозапальних цитокінів, активації процесів оксидативного та нітрозативного стресу, апоптозу.

Вперше в нашому регіоні визначена частота кріоглобулінемії, інших автоімунних розладів (антитіла проти фосфоліпідів, нуклеїнових кислот, ядер, мітохондрій) та позапечінкових проявів хронічної HCV, HBV та мікст-інфекції. Встановлено, що наявність автоімунних розладів супроводжується більш глибокими морфо-біохімічними порушеннями стану печінки.

Встановлено, що успішна терапія хворих на вірусні гепатити, незалежно від етіології, веде до нормалізації рівня цитокінів, маркерів оксидативного, нітрозативного стресу та апоптозу. Доведено, що визначення вмісту ІЛ-6, ФНП-альфа, нітротирозину, сфінгозину, 1,2–діацилгліцерину і лізофосфатидилхоліну належать до чутливих предикторів ефективності інтерферонотерапії та надійних тестів для контролю за лікуванням.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлені факти, що свідчать про нездатність існуючих традиційних методів виявити всіх донорів та вагітних, інфікованих вірусами гепатиту В і С, що потребує розширення спектру обстеження. Обґрунтована необхідність створення спеціалізованого гепатологічного центру, який має здійснювати діагностику, диспансеризацію і лікування пацієнтів з захворюваннями печінки та координацію практичної діяльності закладів охорони здоров’я з питань вірусних гепатитів.

Розроблені принципи оптимізації діагностики активності вірусного гепатиту, які полягають в раціональному поєднанні клінічних, вірусологічних, морфологічних, імунологічних та біохімічних тестів. Обстеження пацієнтів з хронічними вірусними ураженнями печінки на першому етапі повинно включати розширене вірусологічне та морфологічне тестування, оцінку активності запального процесу та функціонального стану печінки. В залежності від гістологічної картини та реплікативної активності вірусів подальше спостереження за пацієнтами має здійснюватись диференційовано. У випадку переважання фібротичних процесів в печінці діагностичний комплекс має бути доповнений дослідженням вмісту гіалуронової кислоти та глікозаміногліканів; при наявності депозитів заліза в печінці, додатково потрібно визначати рівень сироваткового заліза та феритину; при виявленні стеатозу печінки додатково визначати рівень сироваткових тригліцеридів.

Традиційні методи оцінки активності хронічних вірусних гепатитів мають бути доповнені більш чутливими тестами, включаючи визначення рівня прозапальних цитокінів, нітротирозину, карбонільних груп, сфінгозину, 1,2-диацилгліцерину та лізофосфатидилхоліну.

Діагностика автоімунних розладів у пацієнтів з хронічними вірусними гепатитами повинна базуватись на виявленні позапечінкових проявів вірусної інфекції та дослідженні ступеня кріоглобулінемії. У випадку їх виявлення діагностичний комплекс слід розширити за рахунок пошуку специфічних автоантитіл, зокрема проти фосфололіпідів, ядер, нуклеїнових кислот, мітохондрій та інших антигенів.

Встановлені морфологічні особливості ураження печінки гепатотропними вірусами. Ознаками ХГВ є матово-скловидні гепатоцити, гепатоцити з пісочними ядрами, гідропічна дистрофія, а ознакою ХГС - формування лімфонодулів.

Доведено, що важливим методом контролю за перебігом хронічних вірусних гепатитів з нормальним рівнем трансаміназ може бути визначення рівнів запальних цитокінів, нітротирозину, сфінгозину, лізофосфатидилхоліну.

Виявлені нові предиктори ефективності терапії хворих на вірусні гепатити та чутливі тести для динамічного спостереження за хворими в процесі лікування, які включають дослідження гіалуронової кислоти, інтерлейкіну-6, фактору некрозу пухлини-альфа, нітротирозину, сфінгозину, лізофосфатидилхоліну.

Впровадження результатів дослідження в практику. Результати дослідження впроваджені в практику міського гепатологічного центру, що був організований у м. Вінниці у 2000 році за нашою ініціативою, відділень гастроентерології м. Вінниці, обласної інфекційної лікарні м. Хмельницького та у вигляді публікацій на республіканському та міжнародному рівні.

Наукові розробки за матеріалами дисертації, використовуються в навчальному процесі кафедр інфекційних хвороб та дитячих інфекційних хвороб Вінницького державного медичного університету ім. М.І. Пирогова. За матеріалами дисертації підготовлені методичні рекомендації, готується до друку монографія.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є завершеним науковим дослідженням. Внесок автора полягає в аналізі та узагальненні спеціальної літератури, в розробці основних завдань та методології дослідження, самостійному веденні та обстеженні хворих, проведенні клініко-функціональних досліджень. Дисертантом особисто проведена систематизація отриманих даних, узагальнення результатів дослідження. Біохімічні обстеження проводилися на кафедрі біохімії (зав. кафедри професор О.О.Пентюк), морфологічне дослідження біоптатів печінки – на кафедрі патологічної анатомії (зав. кафедри професор В.В. Біктіміров).

Автором обґрунтовані висновки, практичні рекомендації, підготовлені до друку наукові праці, виступи, проведено впровадження наукових розробок у роботу медичних закладів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації викладені на: Міжнародній конференції “Current Trends in Chronically Evolving Viral Hepatits (CEVH)” (Lyon, France, 1997); науковій конференції “Актуальні питання терапії” (Вінниця, 1999); на VI та VII конференціях гастроентерологів ВПС України (Вінниця, 2000, 2001); на науковій конференції “Актуальні питання в клініці інфекційних хвороб” (Хмельницький, 2000); на Вченій медичній раді МОЗ України “Вірусні гепатити – проблема сторіччя” (Київ, 2001); на науковій конференції “Вирусные гепатиты с парентеральным механизмом передачи возбудителей и их исходы” (Київ, 2001); на Міжнародній науково-практичній конференції “Парентеральні гепатити: актуальні питання діагностики, клініки, лікування” (Рівне, 2001).

Публікації. За матеріали дисертації опубліковано 30 робіт з них 25 у фахових виданнях затверджених ВАК України.

Обсяг i структура дисертації. Робота викладена на 289 сторінках тексту і включає вступ, огляд літератури, розділ матеріали та методи, 7 розділів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновки, практичні рекомендації та список літератури, який включає кирилицею _169, латиницею _461. Робота ілюстрована 91 таблицею та 59 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об’єкт та методи дослідження. На першому етапі роботи об’єктом дослідження стали 104 донори, 107 вагітних та 204 хворих з хронічними захворюваннями печінки. У них визначались маркери вірусних гепатитів В (HВsAg, HВеAg, анти- HВеAg, анти-HВсAgM та G, анти-HВs) та С (anti-HCV, HCVcor, NS4 та NS5) за допомогою тест-систем другого покоління. При позитивних результатах у обстежених проводилось біохімічне та морфологічне дослідження.

На другому етапі обстежувалися хворі з хронічними вірусними гепатитами (304), що знаходилися на диспансерному та стаціонарному лікуванні в міському гепатологічному центрі. У хворих вивчено епідеміологічний анамнез, проведено фізикальне обстеження, комплекс клінічних, біохімічних, імунологічних, інструментальних та морфологічних досліджень. Діагноз вірусного гепатиту виставляли згідно з класифікацією, прийнятою на Міжнародному конгресі гастроентерологів (Лос-Анджелес, 1994).

Ступінь активності печінкового процесу враховували за даними клінічного, морфологічного обстеження (Desmet V. et al., 1994) та активності аланінамінотрансферази. Проводилась оцінка основних біохімічних синдромів: цитолізу, холестазу, печінково-клітинної недостатності.

Синдром цитолізу оцінювали визначенням активності АлАТ (КФ 2.6.1.2) та АсАТ (КФ 2.6.1.1) уніфікованими методами Райтмана-Френкеля (В.В.Меньшиков, 1987), синдром холестазу оцінювали визначенням активності ГГТП (КФ 2.3.2.2) та вмістом білірубіну і його фракцій (В.В.Меньшиков, 1987). Синдром печінковоклітинної недостатності оцінювали за вмістом загального білку (мікробіуретовий метод), білкових фракцій (електрофорез на папері) та величині протромбіновому індекса (В.В.Меньшиков, 1987). Стан ліпідного обміну оцінювали визначенням вмісту холестерину та тригліцеридів, кількість яких визначали уніфікованим методом (В.В.Меньшиков, 1987). Вміст заліза в плазмі крові визначали за реакцією з бато-фенатроліном (В.В.Меньшиков, 1987).

Кількісне визначення карбонільних груп білків проводили за їх здатністю утворювати гідразони з 2,2-динітрофенілгідразином, які поглинають при 270 та 363 нм (Levine RL. et al., 1994; Дубинина Е.Е та співавт., 2000). Перекисну модифікацію ліпідів оцінювали за вмістом диєнових кон’югатів (В.Г.Гаврилов, М.И.Мишкорудная, 1983). Вміст нітритів та нітратів визначали за реакцією з реактивом Гріса (Коренман И.М., 1975; Сиггиа С., Ханна Д.Г. 1983). Рівень 3-нітротирозину та сфінгозину визначали методом високоефективної рідинної хроматографії на хроматографі HP 1100 “Leonardo” (M.A.Tabrizi-Fard. et al., 1999; Merrill AH. et al.,. 1988; Wang E. et al., 1999).

Вміст ГАГ оцінювали за відомим методом з застосуванням карбазолової реакції (Е.В.Карякина, Д.В.Косягин, 1982), а ГК - карбазоловим методом після хроматографії на тонкому шарі целюлози (М.Шаршунова та співавт., 1980). Ліпідний склад сироватки крові визначали після екстракції ліпідів за методом Bligh, Dyer (М.Кейтс, 1975). Загальний вміст ліпідів визначали за реакцією з фосфорнованіліновим реактивом, а фосфоліпідів екстракційно-фотометричним методом (О.О.Пентюк та співавт., 1987). Ліпідний спектр визначали методом тонкошарової хроматографії на силікагелі Л5/40 (М.Кейтс, 1975).

Вміст 2-мікроглобуліну в сироватці і сечі визначали імуноферментним методом (Viedma J.A. et al., 1992) стандартними наборами фірми UBI MAGIWEL (США). Вміст прозапальних цитокінів – інтерлейкіну-6 (ІЛ-6) та фактору некрозу пухлини- (ФНП-), інтерлейкіну 1- (ІЛ-1) визначали імуноферментними методами (Smith R., Bagloni S., 1987; Brailly H. et al., 1994) з використанням стандартних наборів фірми IMMUNOTECH, Франція.

Вміст кріоглобулінів визначали спектрофотометричним методом за різницею оптичної щільності зразків сироватки, інкубованих на протязі години при 4С і 37С. Проби з оптичною щільністю менше 0,016 вважали за нормальні і в них вміст кріоглобулінів не перевищував 60 мкг/мл.

У частини хворих на ХГС (92) та ХГВ (60) діагноз був підтверджений виявленням РНК/ДНК вірусів відповідно в полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР), якісним методом. Дослідження проводились в Українському лікувально-діагностичному центрі (м. Київ) на тест-системах НПФ “ДНК-Технология” (Росія).

В сироватці крові хворих також визначали вміст антинуклеарних (ANA), антимітохондріальних (АМА) антитіл та антитіл до подвійної спіралі ДНК методом ІФА (UBI Magiwell et Clarc Laboratories, США).

З метою оцінки морфологічної картини при ХВГ проводилась черезшкірна пункційна біопсія печінки голками “UNICUT G16” “Bard” (Німеччина) та “Tru-Cut G14” “Allegiance” (США). Отриманий матеріал фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, а потім фарбували гематоксилінеозином, пікрофуксином. Гістохімічні методи включали фарбування орсеїном на HВsAg (Shikata і співав., 1974), реакцію Перлса для вивчення гемоглобіногенних пігментів, судан ІІІ для виявлення нейтрального жиру, ШИК-реакцію для виявлення глікогену, реакцію Браше для виявлення РНК, а також імпрегнували азотнокислим сріблом за Гоморі. Для вивчення ультраструктурних змін печінки використовували електронну мікроскопію (мікроскоп ЕМ-100 ЛМ).

Ступінь активності хронічного вірусного гепатиту визначали напівкількісним методом з виведенням ІГА (В.В. Серов, Л.О. Севергина, 1996). Ступінь фіброзу визначали за Desmet V., Gerber M.

Проводилось УЗ-обстеження печінки і селезінки відносно еталонного середовища. Ехографічні дослідження проводили на УЗ сканері “Toshiba SSA-220A” (Японія), конвексним датчиком 3,75 МГц.

Лікування рекомбінантним альфа-інтерфероном (Віаферон) (державне підприємство “Ензім” м. Ладижин) отримували 31 пацієнт з ХВГ (з них було 24 хворих на ХГС та 7 хворих з мікст-гепатитом В+С). Інтерферон використовували в стандартних дозах протягом 6 місяців.

В роботі використані реактиви фірм “Лахема” та “Хемапол” (Чехія), “Реанал” (Угорщина), “Сігма” (США), “Мерк” та “Серва” (ФРГ), реактиви вітчизняного виробництва та країн СНД. Статистичну обробку отриманих результатів проводили методами біометрії (Е.В.Гублер, 1978; В.Н.Носов, 1990).

Результати досліджень та їх обговорення

Проведений клініко-епідеміологічний аналіз виявив високий рівень інфікованості донорів, вагітних та хворих на ХЗП: 61,5%, 24,3%, 79,9% відповідно (табл. 1).

Таблиця 1

Поширеність маркерів вірусних гепатитів серед деяких груп ризику

Маркери | Контингент обстежених

Донори | Вагітні | Хворі з ХЗП

Абс. | % | абс. | % | абс. | %

Інфіковано | 64 | 61,5 | 26 | 24,3 | 163 | 79,9

HBsAg | 2 | 1,9 | 3 | 2,9 | 40 | 24,0

HBeAg | 32 | 30,7 | 1 | 1,1 | 46 | 35,1

HBcorIgM | 7 | 6,4 | - | - | 23 | 17,9

HBcorIgG | 28 | 26,9 | 8 | 8,1 | 97 | 47,5

антиHBe | 24 | 23,0 | 1 | 1,1 | 50 | 38,2

антиHBs | 21 | 20,2 | 10 | 11,0 | 48 | 36,6

антиHCV | 9 | 8,9 | 5 | 4,2 | 89 | 43,6

Ретельне обстеження інфікованих донорів та вагітних, які вважались практично здоровими особами, виявило у 63,4% та 30,8%, відповідно, клінічні та біохімічні ознаки ураження печінки. Це ще раз підкреслює той факт, що HBV/HCV належить до повільних інфекцій з тривалим малосимптомним перебігом. Враховуючи, що більшість пацієнтів з ХЗП інфіковані вірусами гепатитів, слід вважати цей контигент небезпечним в плані поширення інфекції в терапевтичних стаціонарах. В групах з моновірусними, а особливо з мікст-гепатитами переважає парентеральне застосування сурогатних наркотичних речовин, що у віковій групі 16-30 років сягає 70%. Хворі цієї групи піддаються впливу не лише вірусного чинника, але й токсичній дії наркотиків, що сприяє прогресуванню хвороби.

Серед обстежених 304 хворих на вірусні гепатити у 87 осіб діагностований ХГВ, у 166 – ХГС та у 51 мікст-гепатит В+С. У більшості реєструвався середньоважкий перебіг хвороби (табл. 2). У половини хворих на ХГВ та ХГС виявлена висока реплікативна активність вірусу.

З метою співставлення основних біохімічних показників обстежено ще 22 хворих з HCV-цирозом, клас А за Child та 33 хворих – з ГГВ.

Таблиця 2

Характеристика хворих з вірусним ураженням печінки

ВГ,

n=304 | Маркери

вірусів | Перебіг | АлАТ та АсАТ

Висока | Норма

ХГВ, n=87 | HВsAg

HВeAg

HВcIgM

Анти-Hbe

ДНК-HBV | Легкий (25%) | Реплікативна фаза (51%)

Інтегративна фаза (49%) | 73,9% | 26,1%

Середньоважкий (61%)

Важкий (14%)

ХГС, n=166 | Анти-НСV,

Анти-НСVIgM

Cor, NS4, NS5

РНК-HCV | Легкий (43%) | Висока реплікативна активність (47%)

Низька реплікативна активність (53%) | 76,2% | 23,8%

Середньоважкий (52%)

Важкий перебіг (5%)

ХГВ+С, n=51 | HВsAg, HВeAg

Анти-HВe,

ДНК-HBV,

Анти-НСV

Cor, NS4, NS5

РНК-HCV | Легкий перебіг (22%) | Реплікація обох вірусів (39%)

Реплікація HCV інтеграція HBV (61%) | 73,9% | 26,1%

Середньо важкий (68%)

Важкий перебіг (10%)

При хронічній коінфекції HBV/HCV переважало поєднання реплікативної активності HCV та інтегративної фази HBV. У значної частини хворих хронічний вірусний процес протікав без статистично значимих змін показників цитолізу. У 24-26% пацієнтів виявлявся нормальний рівень трансаміназ.

Основними клінічним проявами хронічної вірусної інфекції були диспептичний та астеновегетативний синдроми (72-76%). Звертає на себе увагу більша частота нудоти та блювоти у пацієнтів з ХГВ (n=32; 36,8% та n=8; 9,1%) у порівнянні з ХГС (n=19; 11,4 та n=2; 1,2%) та мікст-гепатитом (n=6; 11,7 та n=1; 1,9%), що очевидно є відображенням більш вираженої інтоксикації при цьому варіанті гепатиту. Холестаз зустрічався у 50 (57,5%) хворих на ХГВ, у 57 (39,8%) хворих на ХГС та 17 (33,3%) хворих на ХГВ+С. Таким чином, мікст-гепатит В+С за вираженістю клінічних проявів не був важчим, ніж моноінфекції В чи С.

Наявність позапечінкових проявів була виявлена у 192 хворих. Ці прояви вірусної інфекції частіше зустрічалися при ХГС та мікст-інфекції В+С, у порівнянні з HBV-інфекцією (табл. 3).

Таблиця 3

Автоімунні прояви у хворих на ХВГ та HCV цироз печінки

Лабораторні та клінічні ознаки | ХГВ, n=32 | ХГC, n=92 | HCV-цироз, n=22 | ХГВ+С, n=46

Абс. число | % | Абс. число | % | Абс. число | % | Абс. число | %

Кріоглобуліни | 6 | 18,7 | 35 | 38* | 18 | 81,8* | 13 | 28,3

Антитіла до подвій-ної спіралі ДНК | 0 | 0 | 7 | 7,6* | 1 | 4,5 | 2 | 4,3*

Антинуклеарні антитіла | 0 | 0 | 18 | 19,6* | 5 | 22,7* | 6 | 13*

Антимітохондріальні антитіла | 0 | 0 | 6 | 6,5* | 0 | 0 | 2 | 4,3*

Антитіла до фосфоліпідів | 5 | 15,6 | 35 | 38* | 13 | 59,1* | 12 | 26,1

Артралгії | 1 | 3,1 | 9 | 9,8 | 7 | 31,8* | 5 | 10,9

Поліартрит | 0 | 0 | 1 | 1,1 | 0 | 0 | 0 | 0

Синдром Рейно | 0 | 0 | 4 | 4,3* | 2 | 9,1* | 0 | 0

Тромбоцитопенія | 3 з 17 хворих | 17,6 | 19 з 56 хворих | 33,9* | 6 з 13 хворих | 46,1* | 6 з 22 хворих | 27,3%

Міальгії | 0 | 0 | 3 | 3,3 | 1 | 4,5 | 0 | 0

Гломерулонефрит | 0 | 0 | 3 | 3,3 | 0 | 0 | 2 | 4,3*

Автоімунний тіреоідит | 0 | 0 | 1 | 1,1 | 0 | 0 | 0 | 0

Інсулінозалежний цукровий діабет | 0 | 0 | 1 | 1,1 | 0 | 0 | 0 | 0

Примітка: 1. “*” - Р<0,05 щодо групи хворих з хронічним гепатитом В.

Найчастіше зустрічалась кріоглобулінемія, тромбоцитопенія, антитіла до фосфоліпідів, ДНК, ядер та мітохондрій. Клінічними проявами автоімунних порушень при ХГС були артралгії, міалгії, синдром Рейно, тромбоцитопенія, гломерулонефрит і інсулінозалежний цукровий діабет. У жодного з хворих з кріоглобулінемією не було класичного симптомокомплексу васкуліту Мельтцера, проте зростала частота таких проявів HCV-інфекції, як артралгії, міалгії, синдром Рейно, тромбоцитопенія.

Чітко встановлено, що наявність автоімунних розладів супроводжується більш глибокими морфо-біохімічними порушеннями стану печінки. У пацієнтів з кріоглобулінемією та антитілами до фосфоліпідів, ДНК, ядер та мітохондрій зростає ІГА гепатиту, індекси фіброзу та стеатозу. Активність АлАТ та АсАТ у хворих з автоімунними проявами була на 30-50%, більшою, ніж у хворих без автоантитіл та кріоглобулінів, а вміст маркерів фіброзу (ГАГ та ГК) - на 30 і 26%. У цих пацієнтів частіше реєструвались тромбоцитопенія, гіпоальбумінемія, гіпохолестеринемія та гіпертригліцеридемія .

Застосування пункційної біопсії печінки дозволило не лише уточнити ступінь активності процесу, наявність фіброзу чи цирозу, а також співставити ці зміни з клінічною картиною захворювання. На основі аналізу біопсійного матеріалу всі гепатити були поділені на три ступені активності: слабкий, помірний та виражений. Основними морфологічним ознаками ХВГ, крім гідропічної дистрофії, східчастих та мостовидних некрозів, були матовоскловидні гепатоцити і гепатоцити з пісочними ядрами. При фарбуванні біоптатів орсеїном у деяких хворих виявлено HВsAg, а при ультраструктурному дослідженні – HВcorAg. Останнє свідчить про активну реплікацію вірусу.

ХГВ слабкого ступеня активності характеризувався вогнищевою дистрофією гепатоцитів, поодинокими внутрішньочасточковими фокальними некрозами, гіперплазією зірчастих ретикулоендотеліоцитів, появою ланцюжків лімфоцитів у синусоїдах, слабкою запальною інфільтрацією в перипортальній зоні. ІГА становив 9,71,4 бали (за шкалою в модифікації Серова). Для ХВГ помірного ступеня були характерні дифузна гідропічна дистрофія гепатоцитів, внутрішньочасткові фокальні некрози, проліферація купферовських клітин і накопичення лімфоцитів у синусоїдах. ІГА становив 21,81,7 бали. Вираженому ступеню активності були притаманні дифузна гідропічна та вогнищева балонна дистрофія, наявність перипортальних сегментарних та мостоподібних некрозів гепатоцитів, перипортальна та внутрішньочасткова інфільтрація. ІГА складав 32,63,4 бали. Як виявилось, морфологічні прояви ХГВ у більшості пацієнтів мають своє продовження в клінічній картині ХГ. Більш важкі морфологічні ознаки ураження печінки супроводжувались більш виразними клінічними маніфестаціями та співпадали з наявністю вірусної реплікації.

За нашими даними патогномонічною морфологічною ознакою ХГС було формування лімфоїдних фолікулів з гермінативними центрами. ХГС слабкого ступеня активності характеризується наявністю сегментарних перипортальних некрозів, вогнищами гідропічної та жирової дистрофії. Запальний інфільтрат проявляється лімфоїдними агрегатами, гіперплазією ретікулоендотеліоцитів, ділянками ланцюжків лімфоцитів в синусоїдах. ІГА складав 12,50,8 балів. Помірний ступінь активності характеризувався перипортальними сегментарними та фокальними внутрішньочасточковими некрозами, жировою та гідропічною дистрофією гепатоцитів дифузного характеру. В портальних трактах формуються лімфоїдні фолікули. ІГА складав 32,71,4 бали. Некротичні зміни паренхіми печінки при вираженому ступені активності представлені перипортальними, перисинусоїдальними, мостовидними некрозами. Фокальні некрози переважали в більшості часточок. Лімфоїдні фолікули локалізуються в портальних трактах та внутрішньочасточково. В жовчних протоках реєструється перидуктальний склероз зі значною кількістю колагену. ІГА складав 46,52,4 бали.

Однак, морфологічні зміни в печінці при ХГС рідше супроводжувався адекватними клінічними маніфестаціями та активністю вірусної реплікації. У переважної більшості хворих (n= 17; 62,9%), не дивлячись на значні морфологічні зміни в печінці, клінічний стан залишався задовільним (основними скаргами у таких пацієнтів були загальна слабкість, іноді короткочасні болі у суглобах).

Морфологічні маркери при коінфекції HBV/HCV в основному залежали від активності HBV-інфекції. При реплікативній активності обох вірусів морфологічно спостерігається більш високий ступінь активності некрозо-запального процесу та виражений поліморфізм гепатоцитів. Морфологічна картина коінфекції HBV/HCV також рідше співпадає з клінічними маніфестаціями. Незважаючи на клінічне переважання при коінфекції HBV/HCV середньоважких форм захворювання, морфологічна картина хвороби характеризується більш глибокими змінами, наявністю різних форм фіброзу та поліморфізмом гепатоцитів.

Основні морфологічні прояви ХВГ представлені на рис. 1, з якого видно переважання пацієнтів з помірною гістологічною активністю гепатиту. У більшості хворих виявлялися слабкі та помірні фібротичні зміни в печінці. Приблизно у 40% хворих на хронічний гепатит С та В+С спостерігається помірний чи виражений стеатоз, у половини з обстежених були виявлені депозити заліза.

Дослідження показали, що ГГВ супроводжується порушенням функціонального стану печінки, залежно від важкості гепатиту зростали рівні АлАТ, АСТ, білірубіну, знижувався рівень сироваткового білку та падав протромбіновий індекс крові. Суттєві порушення функціонального стану печінки були виявлені у пацієнтів з хронічними гепатитами та HCV-цирозом (табл. 4).

У пацієнтів з ХГВ активність АлАТ перевищувала контроль в 4,6, у пацієнтів з ХГС та ХГВ+С - в 5,1 та 4,6 рази, відповідно. Ступінь гіперферментемії залежала від біологічного циклу вірусів. Так, якщо у хворих з реплікативною фазою ХГВ підвищення активності АлАТ склало 5,8 разів, то у хворих з інтегративною фазою – лише 3,4 рази. Подібні зміни АлАТ були типовими і для пацієнтів з ХГС та ХГВ+С з високою та низькою реплікативною активністю вірусів.

Рис. 1. Основні морфологічні ознаки хронічних вірусних гепатитів

Таблиця 4

Показники цитолізу, холестазу, фіброзу у пацієнтів з ХВГ (Mm)

Показники | Контроль

n=16 | ХГВ

n=69 | ХГС

n=122 | HCV-цироз

n=22 | ХГВ+С

n=46

АлАТ,мкмоль/год/мл | 0,420,05 | 1,950,14* | 2,150,11* | 1,120,13* | 1,940,16*

Загальний білірубін, мкмоль/л | 13,31,16 | 31,42,38* | 26,91,68* | 100,615,2* | 24,91,25*

ГГТП,мкмоль/год/мл | 2,490,40 | 5,260,33* | 4,460,24* | 13,91,58* | 4,370,39*

ГАГ, мкмоль/л | 36,91,43 | 42,40,93* | 40,60,94* | 48,12,77* | 40,51,18

ГК, мкг/л | 35329 | 50814* | 48012* | 72639* | 48921*

АФП, МО/мл | 5,170,79 | 7,080,67* | 7,000,33* | 13,92,03* | 7,440,68

Примітка: “*” - Р<0,05 - порівняно зі здоровими особами;

У хворих на ХВГ виявлялись явища холестазу, що проявлялось помірним зростанням рівня загального білірубіну (від 1,8 до 2,4 разів) та підвищенням (від 1,8 до 2,0 разів) активності ГГТП. В більшій мірі холестатичний синдром проявився у пацієнтів з НСV-цирозом. Більші зміни в концентрації білірубіну та активності ГГТП реєструвались у хворих з високою активністю трансаміназ.

У пацієнтів з ХГВ активність АлАТ та АсАТ перевищувала референтний інтервал у 74% випадків, рівень загального білірубіну та активність ГГТП – у 55 та 59% відповідно. Подібні співвідношення виявлені і у пацієнтів з ХГС та ХГВ+С. В цілому це вказує на помірну діагностичну чутливість вказаних показників і більш часту презентацію синдрому цитолізу, порівняно з синдромом холестазу. Однак, аналіз частоти відхилень цих показників від референтного інтервалу у пацієнтів з низькою реплікативною активністю вірусів, саме у яких і виникають найбільші складнощі в діагностиці, дав невтішні результати. Відсоток пацієнтів з аберантними значеннями трансаміназ у таких хворих коливався в межах 39-65%. Ще у меншого числа пацієнтів з низькою реплікативною активністю вірусів реєструвались підвищені рівні білірубіну (17-41%) та ГГТП (17-47%).

Виявлено активацію процесів фіброгенезу в печінці хворих на ХВГ, про що свідчить вірогідне зростання вмісту ГАГ (на 10-15%) та ГК (на 36-44%) в сироватці крові. У чверті обстежених хворих рівень ГАГ виходив за межі референтного інтервалу, а вміст ГК - у половини пацієнтів. Активна реплікація HBV та HCV стимулює процеси фіброгенезу. Так, вміст ГК у хворих з низькою реплікативною активністю підвищувався вірогідно на 19-31%, тоді як при високій - на 44-56%. При реплікативних формах ХГ суттєво зростала частка пацієнтів з аномальними рівнями цих показників. Так, при ХГС вміст ГАГ та ГК у хворих з анти-HCV IgM перевищували референтні інтервали у 35% та 68% пацієнтів, тоді як в групі з низькою реплікативною активністю HCV – лише у 14% та 28% хворих. Подібні співвідношення є типовими і для ХГВ та ХГВ+С. У хворих з виразним цитолітичним синдромом частіше реєструвались високі рівні ГАГ та ГК, ніж у пацієнтів з нормальними трансаміназами. Однак, і у третини (28-33%) пацієнтів з нормальним рівнем трансаміназ реєструються аберантні рівні ГК.

Встановлено, що перебіг вірусних гепатитів С та В+С, на відміну від ХГВ, супроводжується порушеннями ліпідного обміну. У хворих на ХГС реєструється зниження (на 15% і 23%) рівнів загального холестерину і холестерину в -ліпопротеїнах при одночасному зростанні (в 1,5 рази) вмісту тригліцеридів. У пацієнтів з HCV-цирозом зростав лише рівень загального холестерину (на 23%) та холестерину в -ліпопротеїнах (на 33%), а вміст тригліцеридів виявляв тенденцію до зниження порівняно з пацієнтами з ХГ.

Достовірні зміни рівнів загального холестерину, холестерину в ліпопротеїнах низької щільності виявляються, відповідно, у 30% та 56% хворих на ХГС і у 59% та 86% пацієнтів з цирозом печінки. Збільшення вмісту тригліцеридів спостерігалось у 34% пацієнтів з ХГС і зовсім не виявлялось у хворих з цирозом. Найчастіше зміни ліпідного обміну реєструються у пацієнтів з високою реплікативною активністю ВГС та підвищеною активністю трансаміназ. Подібна спрямованість порушень обміну ліпідів є характерною і для мікст-гепатиту В+С.

У всіх хворих на ГГВ реєструвалося значне підвищення рівня цитокінів. Так, рівеньФНП- при ГГВ середньої важкості зростав в 3 рази, при важкому _в 10 разів, а при фульмінантному – майже в 40 разів порівняно з контролем. Рівень ІЛ-6 зростав відповідно в 2,3, 8,5 та 70 разів, а вміст ІЛ-1 _ у 2,9 та 49 разів. Активізація синтезу прозапальних цитокінів, очевидно, має захисне значення, адже деякі з них здатні інгібувати реплікацію вірусів і стимулювати елімінацію інфікованих вірусом клітин через апоптоз. Однак, надмірна загибель печінкових клітин може приводити до важкої печінкової недостатності. У хворих з фульмінантим гепатитом виявлялися надзвичайно високі рівні цитокінів.

Рівень прозапальних цитокінів вірогідно зростав у пацієнтів з ХГВ (табл. 5), хоча і в меншій мірі, ніж у пацієнтів з ГГВ. Вміст ІЛ-6 підвищився в 6,2 рази, ФНП- – в 6,3 рази, а ІЛ-1 – в 3 рази. В більшій мірі це зростання було представлено у пацієнтів з реплікативною фазою ХГВ та у хворих з високою активністю трансаміназ. Вірогідне підвищення рівня цитокінів реєструвалось і у хворих з ХГС та ХГВ+С. Так, у хворих з ХГС вміст ІЛ-6 підвищився в 5,3 рази, ФНП- – в 6,1 рази, ІЛ-1 – в 3,1 рази, а