МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ЛЬВІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО

МЕЛЬНИК МИКОЛА МИКОЛАЙОВИЧ

УДК 616.006.8307-615.28:616-091.8

КРИТЕРІЇ МОРФОЛОГІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ

ТА ЛІКУВАЛЬНОГО ПАТОМОРФОЗУ САРКОМИ ЮЇНГА

14.03.02 – патологічна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Львів – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті онкології АМН України.

Науковий керівник

Заслужений діяч науки і техніки України

доктор медичних наук, професор

Галахін Костянтин Олександрович,

Інститут онкології АМН України,

завідувач патологоанатомічного відділу

Офіційні опоненти:

Заслужений діяч науки і техніки України,

доктор медичних наук, професор Червяк Петро Іванович,

Військово-медичне управління СБУ,

начальник патологоанатомічного відділення

Доктор медичних наук, професор Михайлюк Іван Олексійович,

Івано-Франківська державна медична академія МОЗ України,

завідувач кафедри патологічної анатомії

Провідна установа

Донецький державний медичний університет ім. М. Горького МОЗ України

Захист відбудеться 13.05.2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.600.03 при Львівському державному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України (79010, м. Львів, вул. Пекарська, 69)

З дисертацією можна ознайомитися у Науковій бібліотеці Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького (79000, м. Львів, вул. Січових Стрільців, 6)

Автореферат розісланий 11.04.2002 р

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Федорів Я.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Важливим питанням сучасної онкології і патологічної анатомії є морфологічна діагностика саркоми Юїнга (СЮ) та оцінка її лікувального патоморфозу. Загальновідомо, що СЮ - дрібнокруглоклітинна саркома, яка виникає в кістках і м'яких тканинах, характеризується швидким інфільтративним ростом, метастазує гематогенним шляхом в легені, середостіння, наднирникові залози, в інші кістки скелета і дає ранні рецидиви. Незважаючи на окремі успіхи в діагностиці та лікуванні злоякісних пухлин, досягнути безрецидивного виживання вище ніж 50-60% не вдається (Колыгин Б.А. и соавт.,1997; Балицкая О.В. и соавт.,1998). Серед онкологічних захворювань кісток СЮ займає 7-10% (Соловьев Ю.Н.,1998).

В останні роки наукові досягнення свідчать, що пухлини, які належать до родини Юїнга (СЮ/PNET) є патогенетично подібними пухлинам зародкової нейроектодермальної тканини, а не кісткової, як вважалося раніше. Це зумовлює терапевтичні підходи до лікування даних новоутворень (Колыгин Б.А. и соавт.,1997). Проте, морфологічна діагностика, також як і диференційна морфологічна діагностика всіх дрібнокруглоклітинних різновидів мезенхімальних пухлин залишається дуже складною, незважаючи на широке використання імуногістохімічних та молекулярно-генетичних методів дослідження (Глузман Д.Ф. и соавт.,1993; Ladanyl M. et al.,1993; Toretsky I. et al.,1995; Unni K. et al.,2000).

Таким чином, проблема диференційної діагностики СЮ серед дрібнокруглоклітинних пухлин кісток і м'яких тканин, які входять в гетерогенну групу злоякісних новоутворень у дітей і дорослих молодого віку залишається особливо актуальною. Хоча сучасна теорія гістогенезу СЮ/PNET базується на її нейроектодермальній природі, окремі її положення залишаються дискусійними до цього часу, а рутинні методи гістологічної діагностики не завжди дають можливість її розмежування з анапластичними остеогенними саркомами, мезенхімальною хондросаркомою, злоякісною лімфомою, рабдоміосаркомою і т.д. (Абраменко И.В.,1998; Parcham D.,1996).

Вирішенню даної проблеми в значній мірі допомагає застосування імуногістохімічного аналізу СЮ, який передбачає застосування моноклональних антитіл до певних онкомаркерів (Лломбарт-Бош А. и соавт.,1994).

Окремим актуальним питанням постає своєчасна морфологічна оцінка реакції пухлини на хіміо- променеве втручання, що має суттєве значення для оптимізації схем комплексного або комбінованого лікування СЮ/PNET. Необхідно відзначити, що наукових робіт, присвячених аналізу лікувального патоморфозу СЮ/PNET вкрай недостатньо (Макрецов Н.А. и соавт.,1997), а існуючі морфологічні критерії (ступені) лікувального патоморфозу за кордоном (Salzer-Kuntschik M. et al.,1983; Rousen S. et al.,1990) не відображають весь спектр морфологічних змін (лікувальний патоморфоз) в пухлинній паренхімі і стромі СЮ під впливом передопераційної антибластомної терапії.

Таким чином, на сучасному етапі розвитку онкоморфології проблема адекватної морфологічної діагностики СЮ, її диференційної діагностики з подібними на неї іншими дрібнокруглоклітинними пухлинами, відкриває широке коло діяльності для патологоанатомів (онкоморфологів), а морфологічне визначення ефективності лікування СЮ дозволяє його коригувати і визначити прогноз.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом планової науково-дослідної роботи “Підвищити ефективність комплексного лікування злоякісних пухлин кісток і м'яких тканин у дітей шляхом індивідуалізації неоад'ювантної хіміотерапії та оптимізації оперативних втручань” Інституту онкології АМН України (№ державної реєстрації: 0199U000648) та спільної роботи в україно-іспанському проекті “Саркома Юїнга в Європі” згідно договору між патологоанатомічним відділом Інституту онкології АМН України (зав. проф. К.О. Галахін) і кафедрою патологічної анатомії медичного факультету Валенсійського університету (зав. проф. А. Лломбарт-Бош) *.

Тема дисертації затверджена на засіданні Вченої ради Інституту онкології АМН України (Протокол №12 від 13 вересня 2001 р.), а також на засіданні РПК “Патологічна анатомія” МОЗ і АМН України (Протокол № 3 від 22 червня 2001р.).

Мета роботи: визначити критерії морфологічної діагностики та лікувального патоморфозу саркоми Юїнга.

Задачі дослідження:

1. Встановити діагностичну інформативність класичних (традиційних) методів мікроскопічної верифікації пухлин сімейства Юїнга.

2. Встановити окремі імунофенотипи пухлин сімейства Юїнга з використанням імуногістохімічної панелі моноклональних антитіл.

3. Встановити морфометричні критерії оцінки ефективності неоад'ювантної поліхіміотерапії і променевої терапії при лікуванні хворих на СЮ (лікувальний патоморфоз).

4. Розробити практичні рекомендації стосовно критеріїв морфологічної діагностики та лікувального патоморфозу СЮ.

Об'єктом дослідження є біопсійний та операційний матеріал дрібнокруглоклітинних пухлин сімейства Юїнга.

Предмет дослідження - мікроскопічна диференційна діагностика пухлин сімейства Юїнга з морфологічним визначенням ефективності хіміотерапії і променевої терапії (лікувальний патоморфоз).

Методи дослідження. Методи дослідження - класичні гістологічні і цитологічні методи фарбування пухлин сімейства Юїнга (гематоксилін-еозин, ван Гізон, кармін, імпрегнація сріблом; за Папенгеймом); імуногістохімічний (імунопероксидазний) АВС-метод з використанням панелі із 22 моноклональних антитіл; морфометрія; варіаційна статистика.

Наукова новизна роботи. Вперше в країні здійснено імунофенотипування пухлинних клітин СЮ, злоякісних пухлин кісток та оточуючих м'яких тканин за допомогою панелі 22 моноклональних антитіл, з яких селективно було виділено 6 основних маркерів та 7 додаткових, що дало змогу розробити морфологічний алгоритм діагностики та диференційної діагностики СЮ. Вперше розроблена схема-шкала оцінки ступенів лікувального патоморфозу СЮ.

Практичне значення роботи. Встановлення імунофенотипів СЮ, дрібнокруглоклітинних пухлин кісток і оточуючих їх м'яких тканин дає об'єктивну змогу покращити діагностику СЮ на біопсійному і операційному матеріалі та проводити адекватну диференційну діагностику з іншими дрібнокруглоклітинними пухлинами.

Гістостереоморфометрична оцінка ефективності лікувального патоморфозу саркоми Юїнга після неоад'ювантної поліхіміотерапії (ПХТ) та променевої терапії (ПТ) дає об'єктивну змогу при дослідженні операційного матеріалу безпосередньо оцінити ефективність передопераційного лікування.

Практична реалізація дисертаційної роботи, яка базується на комплексному (якісно-кількісному) аналізі структурних змін пухлинної паренхіми (неопластичних клітин) СЮ, відображена в інформаційному листі “Схема - шкала оцінки лікувального патоморфозу злоякісних пухлин” (Укрмедпатентінформ МОЗ України, 2000. - вип. 3 - №76). Отримані результати дисертаційного дослідження впроваджено в практичну роботу Хмельницького державного патологоанатомічного центру МОЗ України, а також використовуються в педагогічній роботі на кафедрі патологічної анатомії Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України.

Особистий внесок здобувача. Автором проведена робота з архівним матеріалом патологоанатомічного відділу (мікропрепарати, парафінові блоки хворих на СЮ) та історіями хвороб у відділеннях дитячої онкології та опорно-рухового апарату Інституту онкології АМН України за 14 років (1986 - 1999рр.). Створена інформаційна база даних. Зроблено імунофенотипічний аналіз з 22 моноклональними антитілами матеріал 70 хворих, яким первинно на основі гістологічного дослідження встановлено діагноз саркома Юїнга та кістковомозкові пухлини (виконання імуногістохімічних досліджень проведені при безпосередній консультативній допомозі співробітників професора А. Лломбарта-Боша) з встановленням окремих інформативних онкомаркерів щодо адекватної мікроскопічної верифікації СЮ.

Створено алгоритм морфологічної діагностики СЮ та диференційної діагностики з іншими мезенхімальними дрібнокруглоклітинними пухлинами кісток і оточуючих їх м'яких тканин. Запропонована морфологічна схема-шкала оцінки ефективності неоад'ювантної антибластомної терапії СЮ (співавтор професор Галахін К.О.). Узагальнення отриманих результатів, обґрунтування висновків та практичних рекомендацій проведено дисертантом особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися й обговорювалися на засіданні проблемної комісії “Злоякісні новоутворення“ Інституту онкології АМН України (31 травня, 2001р.), проблемної комісії “Патологічна анатомія” МОЗ і АМН України (22 червня, 2001р.), на V Міжнародному конгресі студентів та молодих вчених в м. Тернополі (10-12 травня, 2001р.), засіданні Вченої ради Інституту онкології АМН України (13 вересня 2001р.), X з'їзді онкологів України в м. Ялта (10-12 жовтня, 2001р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 робіт, серед них 3 статті у фахових наукових виданнях України, 4 роботи у матеріалах і тезах конференцій та конгресів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел та додатків. Робота викладена на 134 сторінках (основна частина 95 сторінок), ілюстрована 41 рисунком, 5 таблицями. Список літератури викладено на 27 сторінках і містить 253 інформаційні джерела.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Використано архівний, поточний (біопсійний та операційний) матеріал морфологічних досліджень патологоанатомічного відділу Інституту онкології АМН України в обсязі 227 випадків на СЮ за 1986-1999 роки, а також історії хвороби (комп'ютерна база даних інституту). Вік пацієнтів складав від 1,1 до 27 років, середній - 14,5 роки, співвідношення осіб чоловічої та жіночої статі склало 1,3:1. Морфологічне дослідження проводилось на гістологічних препаратах (гематоксилін-еозин, ван Гізон, кармін, імпрегнація сріблом). Відібрано 70 хворих на СЮ (критерієм відбору пацієнтів була наявність не менш трьох парафінових блоків на одне дослідження) для поглибленого імуногістохімічного аналізу. Додатково виготовлялись парафінові зрізи пухлинної тканини кісток і м'яких тканин завтовшки 4-5 мкм, які досліджувалися з відповідним моноклональним антитілом (маркером) з набору 22-ох маркерів (HNK-1; S-100; NSE; HBA71; NF; PGP9.5; CAM5,2; P53; RB; RI; VIMENTIN; DESMIN; ACTIN; TRK-A; CНROMOGRANIN; MYO-D; MYOGENIN; OS-CALCIN; OS-NECTIN; C-Erb-2; BCL-2; PCNA) фірм “ДАКО” (Данія), “Coulter/Immunothech” (США) і “PharMingen”, “Becton Dickinson Company” (США) із застосованням стандартного авідин-біотинового методу (Пинчук В.Г. и соавт.,1990; Colnaghi M. et al.,1984; Polak S. et al.,1986; Senry C. et al.,1986). В окремих випадках в якості хромогену замість ДАБ (3,3`-діамінобензидин) використовували аміно-етилкарбазол (дає вишнево-червоний колір, але є нестійким). Ядра дофарбовували гематоксиліном або метиловим зеленим.

При гістологічній та імуногістохімічній верифікації враховувалися стать і вік, клініко-анатомічні особливості пухлин сімейства Юїнга за класифікацією ВОOЗ 1994 року (Перси К. и соавт.,1995; Смирнов А.В. и соавт.,1995; Соловьев Ю.Н., 1998; Weis S.W.,1994), зокрема, клітинні варіанти СЮ, PNET-ASKIN та інших пухлин (остеосаркоми, рабдоміосаркоми, хондросаркоми, нейробластоми та інш.), з врахуванням вторинних змін в пухлинах (некрози, крововиливи, запалення), які призводять до помилок, оскільки такі осередки з пошкоджених клітин можуть не створювати імунокон'югати, або навпаки, давати їх гіпернакопичення артефактної природи. Результати імуногістохімічних досліджень оцінювали за допомогою індекса імуноекспресії (ІІЕ).

кількість імунопозитивних клітин

ІІЕ = ---------------------------------------------------------- ґ 100;

2000

У 38 хворих на СЮ досліджено операційний матеріал видалених пухлин (кількісна морфометрія), які перед хірургічним втручанням отримали ПХТ або ПХТ в поєднанні з ПТ за стандартними міжнародними програмами, проведена оцінка лікувального патоморфозу пухлин за допомогою методики, розробленою Галахіним К.О. та співавторами у 2000 році. Хворі отримували передопераційну ПХТ або ПХТ+ПТ згідно міжнародним програмам протокольного лікування - 4 блоків ПХТ VAC або VAC + цисPt:

Блок №1 Блок №2 Блок №3 (варіанти)

Vcr - 1,5 мг/м2 - 1д (доза). VР-16 - 100 мг/м2 -1,2,3 д. Блоки 1 або 2

Doxo - 60 мг/м 2-1д. цисPt - 40 мг/м2 -1,2,3д. Vcr - 1,5 мг/м 2- 1д.

Cph - 1500 мг/м2 -2д. Doxo - 75 мг/м2 -1д.

Cph - 2000 мг/м2 -2д.

Блок №4 (варіанти)

Vcr - 1,5 мг/м2 - 1д (доза). Vcr - 1,5 мг/м2 - 1д.

Асt-D - 500 мкг/м2 -1,2,3д. Doxo - 20 мг/м 2 - 1,2,д.

Ifo - 2000 мг/м2 -1д. Ifo - 2000 мг/м2 -1,2,3д.

ПТ була застосована в поєднанні з неоад'ювантною хіміотерапією на апараті РОКУС-М з опроміненням зони пухлинного ураження у дробно-фракційному режимі до накопичення загальної дози опромінення 35-40 Грей.

Лікувальний патоморфоз аналізувався наступним чином: з трьох зон пухлини (периферична, проміжна, центральна) вирізали по одній тканинній пластинці, виготовляючи три парафінові блоки; з кожного з них виготовляли по три гістологічних зрізи на трьох рівнях: 3 блоки ? 3 рівня ? 3 зрізи = 27 зрізів. В кожному зрізі аналізували 10 полів зору мікроскопу при допомозі окулярної сітки Автанділова з 25 тест-крапками, зображення яких проектували на профіль зрізу, що відповідало одному полю зору мікроскопу. Кожен випадок СЮ аналізувався окремо із застосуванням формули A=B/C ґ 100, де A - відсотковий вміст пухлинних клітин в стані некрозу до всіх пухлинних клітин, В - кількість пухлинних клітин в стані некрозу, які знаходяться в 10 полях зору, С - кількість всіх пухлинних клітин в 10 полях зору. Отримані дані аналізувались за розробленою семиступеневою шкалою оцінки патоморфозу. Фотозйомка проведена на мікроскопі “Polyvar-2” (фірма “Reichert”, Австрія).

Статистична обробка результатів дослідження проведена за критерієм t-Cт'юдента, з визначенням похибки середнього. Порівняльна оцінка отриманих значень визначена у межах 95% інтервалу (Автандилов Г.Г.,1990; Гланц С.,1999).

Результати досліджень, їх аналіз та обговорення. За 14 років на обстеженні і лікуванні у відділеннях дитячої онкології та пухлин опорно-рухового апарату Інституту онкології АМН України знаходилось 227 хворих, серед яких у 191 хворого діагноз СЮ верифікований гістологічним методом, у 31 пацієнта лікування проводилось на підставі тільки цитологічного заключення і лише у 5 хворих діагноз СЮ встановлено клініко-рентгенологічно.

Відмічена тенденція до збільшення кількості хворих по роках, особливо в 1996 році (табл.1). Нерідко час від перших клінічних симптомів захворювання СЮ i до встановлення морфологічного діагнозу був тривалим, на що вказує детальний аналіз 70 історій хворих з даною патологію: від 1 місяця до 6 місяців у 80,4 % хворих, від 6 до 12 місяців - 12,9% пацієнтів і більше 1 року 6,7%. Отримані власні результати суттєво не відрізняються від даних інших авторів (Дурнов Л.А. и соавт., 2000), які вказують, що від перших клінічних симптомів до встановлення діагнозу СЮ термін звернення пацієнтів складає від 1 до 6 місяців у 78% випадків, від 6 до 12 місяців у 20% хворих і більше 12 місяців у 2% випадків. Це безумовно вказує на необхідність покращення діагностичних заходів, які насамперед, повинні здійснюватись в загальній мережі дитячих поліклінік і лікарень (хоча б на рівні рентгенологічних обстежень) при звертанні дітей та юнаків у зв'язку з частими побутовими та спортивними травмами опорно-рухового апарату, при необхідності з направленням на біопсію (Parcham D.M., 1996).

Біопсійна діагностика СЮ залежить від багатьох об'єктивних і суб'єктивних причин, які впливають на її достовірність. Біопсійний матеріал може найчастіше містити поодинокі неопластичні клітини або їх скупчення, які характеризуються невираженим клітинним атипізмом округлою (“лімфоцитоподібною”) формою, гіперхромними ядрами з рівномірним дрібнозернистим хроматином та невеликим обідком базофільної цитоплазми. На основі таких цитологічних ознак, можна лише вірогідно судити про пухлинну природу новоутворення, що однак не дозволяє остаточно встановити цитологічний діагноз СЮ. В рідких випадках можна не тільки встановити гістологічний і цитологічний діагноз СЮ, але й вказати її різновид. Отже, морфологічна (гістологічна, цитологічна) діагностика групи дрібнокруглоклітинних пухлин, зокрема СЮ та PNET, на рівні світлової мікроскопії проводиться нерідко методом виключення і лікар - патолог змушений

Таблиця 1

Розподіл хворих на саркому Юїнга по роках (1986-1999 роки)

Роки Кількість хворих %

1986 9 4,0%

1987 9 4,0%

1988 13 5,7%

1989 11 4,8%

1990 12 5,3%

1991 18 7,9%

1992 13 5,7%

1993 23 10,1%

1994 17 7,5%

1995 17 7,5%

1996 26 11,5%

1997 23 10,1%

1998 19 8,4%

1999 17 7,5%

Всього 227 100%

зупинитися на загальному заключенні “кістковомозкова пухлина” або “дрібнокруглоклітинна пухлина”.

На сучасному етапі розвитку онкоморфології вирішенню даної проблеми допомагають додаткові методи імуногістохімії (цитохімії). З 222 хворих (із загальної кількості пацієнтів - 227, було виключено 5, оскільки вони мали тільки клініко-рентгенологічний діагноз СЮ), пухлини сімейства Юїнга були верифіковані гістологічним і цитологічним методом, було остаточно відібрано 70 пухлин, якість парафінових блоків і збереженість морфологічної будови котрих дозволяла провести імунофенотипування пухлинної тканини (рис.1).

Проведено розподіл пухлин сімейства Юїнга на типову і атипову СЮ, PNET, ASKIN пухлину, та проведена диференційна діагностика з анапластичною остеогенною саркомою, мезенхімальною хондросаркомою, рабдоміосаркомою, міксоїдною пухлиною, метастазами нейробластоми, карциноми.

Найбільш інформативними для ідентифікації типової і атипової СЮ (38 пацієнтів) були визначені три імуногістохімічні маркери - МІС2, МКАТ до нього НВА-71, віментин i NSE. Перше місце посідає НВА-71, який був позитивним у 36 (94,7%) хворих з СЮ, відповідно індекс імуноекспресії коливався від 57% до 75% (середнє значення - 66±1,27%).

Віментин посідає друге місце, він ідентифікувався у 33 (86,8%) пацієнтів з СЮ, індекс імуноекспресії коливався від 43% до 60% (середнє значення - 51,5±12,46%). Третє місце належить маркеру NSE, позитивний у 26 (68,42%) пацієнтів, границі коливання індексу імуноекспресії від 12% до 49% (середнє значення - 30,5±9,5%). Після нього йде PGP9.5, який дав позитивну реакцію в 22 (57,9%) хворих на СЮ, індекс імуноекспресії коливався від 38 % до 44% (середнє значення - 41±5,7%). Серед інших маркерів, зокрема HNK - 1, експресія була позитивна у 4 (10,5%) пацієнтів з типовою і атиповою СЮ, а експресія протеїна S-100 зареєстрована у 9 (23,7%) хворих. Всі інші маркери не проявляли позитивної реакції.

У 12 хворих ідентифіковано PNET пухлини і у 1 пацієнта ASKIN пухлину. PNET пухлини мали позитивну реакцію при визначенні НВА-71, NSE, PGP9.5, віментина. Реакція на антиген СD99 (НВА-71) була позитивною у 8 (66,6%) пацієнтів з PNET, індекс імуноекспресії коливався від 59% до 71% (середнє значення - 65±4,47%). Позитивний результат імуногістохімічної реакції на NSE був 11 (84,6%) хворих на PNET, індекс імуноекспресії складав від 47% до 61% (середнє значення - 54±6,35%). Реакція на віментин і PGP.9.5 була імунопозитивною в усіх 12 (100%) хворих на PNET, індекс імуноекспресії та їх середнє значення, відповідно становили: від 39% до 58% (48,5±4,1%) та від 50% до 65% (56,9±2,7%). Антитіла до білка S-100 взаємодіяли з пухлинною тканиною PNET у 10 (83,3%) пацієнтів. Окрім вище зазначених клітинних маркерів, імунопозитивна реакція спостерігалася також при застосуванні МКАТ до антигена HNK-1 у 6

Рис. 1. Схема комплексного гістологічного та імуногістохімічного дослідження.

(50%) випадках та TRK-A в 3 (25%) випадках. ASKIN пухлина мала позитивну реакцію з NSE, НВА-71 і негативну рекцію на віментин. У трьох пацієнтів діагностовано остеосаркому з позитивною реакцією на OS-нектин, OS-кальцин, віментин і негативну реакцію на NSE і НВА-71. В одному випадку виявлена хондросаркома, пухлинні клітини якої позитивно взаємодіяли з антитілами до HNK-1, S-100, віментина, OS-нектина, OS-кальцина і негативно з МКАТ НВА-71 до MIC2. Верифіковано випадок альвеолярної рабдоміосаркоми на підставі позитивної імуногістохімічної реакції з NSE, актином, міогеніном і негативної на HNK-1, білок S-100, HBA-71, TRК-A і PGР9.5.

Випадок міксоїдної пухлини відповідав позитивному фарбуванню тільки з антитілами до білка S-100 і віментина, а випадок хондросаркоми з реагентами до OS-нектина, OS-кальцина, віментина, білка S-100 та HNK-1.

Діагностовано метастаз нейробластоми, яка у вигляді осередків мала позитивну реакцію на NSE і негативну на НВА-71 та при визначенні b2-мікроглобуліна (RI). В однієї хворої встановлено метастаз карциноми, завдяки позитивній реакції з МКАТ до “ЕМА” (антиген епітеліальних мембран). Матеріал у 9 випадках не піддався остаточній імуногістохімічній оцінці. У хворих, виділених за імуногістохімічним діагнозами: типова і атипова СЮ - 38 випадків, PNET-ASKIN пухлин 13 випадків, проведено додатковий аналіз за віком та статтю (табл.2).

Отримані результати потребують деяких пояснень, виходячи з наукових джерел, пов'язаних з імуногістохімічними дослідженнями СЮ. Віментин - належить до проміжних філаментів, які містяться в усіх мезенхімальних клітинах (Глузман Д.Ф. и соавт.,1993).

Таблиця 2

Розподіл хворих в залежності від статі і віку груп пухлин сімейства Юїнга

Групи хворих сімейства Юїнга (n = 51) Кількість хворих в залежності від статі Межі коливання віку (роки) Середній вік (роки)

чоловіки жінки чоловіки жінки чоловіки жінки

min max min max

Саркома Юїнга (типові і атипові форми) 23 15 5,5 18 6 25 11,8±0,7 13,7±1,4

PNET-ASKIN 9 4 6 21 2,8 15 11,9±1,6 7,7±2,6

Відсутність клітинної маркерної специфічності для СЮ була встановлена R. Moll et al. (1987), які довели, що СЮ містить десмосомальні білки, а також цитокератини, які знаходяться в звичайному епітелії. Ретельний аналіз випадків пухлин сімейства СЮ у власних дослідженнях та за результатами інших авторів свідчить про те, що в окремо розташованих групах та в поодиноких клітинах спостерігається експресія нейро-, і міофіламентів, що в свою чергу, вказує на походження СЮ з плюрипотентних клітин, тобто здатних до диференціювання різних типів клітин (Greco M. et al.,1988; Moore K.,1988; Sorensen P. et al.,1995). Дану концепцію підтверджують наші дослідження, які показують, що пухлини СЮ і PNET (зокрема деякі клітини їх атипових форм) проявляють м'язеву диференціацію, на що вказують 5 випадків (13,2%) позитивних реакцій на актин, десмін та поодинокі з міогеніном. Результати досліджень інших авторів, які також свідчать, що окремі периферичні нейроепітеліоми (PNET), були десмін- i актин-позитивні, гіпотетично демонструють міогенну диференціацію нейральних клітин (Daugard S. et al.,1989; Parcham D. et al.1992). Деякі автори повідомляють про цитокератин-позитивні випадки серед СЮ (Лломбарт-Бош А. и соавт.,1994; Daugard S. et al.,1989). СЮ експресує такі нейропротеїни, як NSE, PGP9.5, Leu-7 (Лломбарт-Бош А. и соавт.,1994), що ми відмічали за отриманими власними результатами. Наявність даних маркерів в СЮ є поганою прогностичною ознакою (Hartmann K. et al.,1991; Noguera R. et al.,1996), але інші автори не підтверджують цей факт. Це протиріччя було знято дослідженнями D. Schmidt et al.(1991), які показують, що наявність не окремих, наприклад NSE, а ідентифікація множинних нейрогенних маркерів є поганою прогностичною ознакою. Для прогнозування перебігу захворювання у пацієнтів з СЮ має також значення локалізація первинного пухлинного осередку (Novacovic B. et a1.,1994). За отриманими власними даними, домінувала сама важка топографічна форма - тазова з переважним ураження клубової кістки, що погіршує прогноз хвороби (табл.3). Заслуговує на увагу ідентифікований нами TRK-A (тирозин-кіназний рецептор), який виявився у 25% випадків PNET, що є рецептором інсуліноподібного фактору росту ІІ (IGF-II), молекули якого приймають участь у проліферації, диференціації та підтриманні трофіки нейронів (Bothwell M.,1995; Nischio S. et al.1998; van Valen F. et al.,1997; Yee D. et al.1990). За даними інших авторів, експресія TRK-A знайдена у гангліомах та нейробластомах (Kim C. et al.,1999; Nischio S. et al.,1998). У власних дослідженнях цей маркер не проявив себе (негативний результат), його можна додатково застосовувати для розмежування СЮ з PNET і нейробластомою.

За отриманими власними результатами диференційно-діагностичні маркери клітин ендотелію були негативні. Унікальним за своєю специфічністю виявився клітинний поверхневий маркер МІС2 (СD99) для діагностики СЮ і периферичних нейроепітеліом.

Таблиця 3

Топографія уражень пухлинами сімейства Юїнга

Місце ураження кісток скелета Кількість хворих

Кістки таза клубова лобкова клубова+сіднична клубова+сіднична+лобкова 13 8 3 1 1

Стегнова 10

Мала гомілкова 9

Велика гомілкова 7

Плечова 6

Ребро 3

Ліктьова 2

Променева 1

Загальна кількість хворих 51

Епітопи антигена МІС2 розпізнаються моноклональними антитіла НВА-71, 013, 12 Е7, які вперше були отримані до лінії Т-клітинної лейкемії, і незважаючи на дану перехресну реактивність з лімфоїдними клітинами, імуногістохімічні дослідження виявили високу чутливість цього маркера при СЮ та PNET (більше 90%) (Ambros I. et al.,1991; Collins B. et al.,1998; Hamilton G. et al.,1991), а за нашими даними у 87%.

Про гістогенетичну спорідненість СЮ і РNET пухлин свідчить наявність ідентичної транслокації t(11;22) (q24;q12), яка виявлена в лініях пухлинних клітин при цитогенетичних дослідженнях (Arvandt A. et al.,1998; Dellatre O. et al.,1994; Mastik M. et al.,1999). Морфологічний та імуногістохімічний порівняльний аналіз підтверджує вищесказане на підставі власних отриманих результатів, позитивних імуногістохімічних реакцій з маркерами нейральної диференціації NSE, PGP9.5, HNK-1, білком S-100.

Окремим актуальним питанням постає морфологічна оцінка ефективності неоад'ювантної ПХТ, ПТ, що дозволяє визначити об'єм оперативного втручання, ефективність неоад'ювантних методів лікування. Виконано комплексний морфологічний аналіз оперативно видалених СЮ (38 пухлин у 38 хворих), які на передопераційному етапі лікування послідовно отримали так звані “хіміотерапевтичні блоки” (курси) згідно протокольного лікування СЮ міжнародних програм (Grier H. et al.,1996; Maygarden S. et al.,1993). Оскільки передопераційні ефекти лікування досліджувались на операційному матеріалі, то оцінка лікувального патоморфозу за об'єктивними причинами представляє собою морфологічний аналіз сукупної дії того чи іншого блоку поліхіміотерапії (тобто декількох хіміопрепаратів). За результатами аналізу морфологічних змін СЮ (від осередкових до субтотальних) приводимо такий перелік хіміопрепаратів, до яких пухлинна паренхіма СЮ проявляє чутливість: вінкристин, дактиноміцин і циклофосфан. Подолання природньої резистентності пухлинних клітин СЮ з підвищенням їх чутливості до ПХТ зареєстровано у випадках, коли вищезазначені препарати використовувались у поєднанні з доксорубіцином, етопозидом, іфосфамідом, препаратами платини. Найбільш ефективними клінічними засобами передопераційного лікування виявилися чотири “блоки ПХТ” у поєднанні з гама-опроміненням, що суттєвим чином призводило до реєстрації поширених пухлинних осередків альтерації пухлинних клітин СЮ у вигляді субтотальних некрозів.

Загальний морфологічний аналіз 38 пухлин хворих на СЮ свідчить про те, що протипухлинні ефекти ПХТ і ПТ починають реєструватись під мікроскопом з дистрофічних змін у вигляді внутрішньоклітинного та міжклітинного набряку з дисоціацією пухлинних клітин на хаотичні дрібні скупчення та поодинокі клітинні елементи; появою в ядрах патологічних мітозів, які в контролі зустрічаються дуже рідко.

Слід окремо підкреслити, що цілеспрямована доставка хіміопрепаратів в СЮ через їх власне судинне русло, завдяки селективній внутрішньоартеріальній ПХТ, призводила до масивних крововиливів з подальшим розвитком геморагічних некрозів пухлинної паренхіми. Оскільки переважна більшість кровоносних судин в СЮ не мають базальної мембрани, то логічно припустити, що молекули хіміопрепаратів, не маючи такої анатомічної перешкоди як базальна мембрана, вільно поступають в зону васкуляризації пухлинного ураження і вступають в безпосередній контакт з пухлинними клітинами. В останніх виникають порушення структури ядерного хроматину з розривами ДНК, що в свою чергу призводить до патологічних мітозів або індукованого апоптозу, внаслідок чого такі пухлинні клітини вже не в змозі розмножуватися.

При передопераційному застосуванні ПТ у поєднанні з 4 “блоками ПХТ” макро- і мікроскопічно реєструються більш поширені зони некрозу пухлин, які розповсюджені в ураженій кістці як по довжині, так і по глибині (на розрізах макроскопічних препаратів операційного матеріалу і у виготовлених мікроскопічних зрізах). Такі поширені некрози, якщо з початку лікування пройшло 2-3 неділі, як правило оточуються сполучною тканиною внаслідок розвитку так званого “променевого фіброзу”. У деяких випадках морфологічного дослідження таких відстрочених ефектів ПХТ спостерігались значні склеротичні зміни і уражена кістка мала зовнішній вигляд “фіброзної” (склеротичної), а не пухлинної. При мікроскопічному дослідженні постійно реєструються локальні, іноді поширені депозити гемосидерину, периваскулярний склероз, масивні нашарування новоутвореної (непухлинної) сполучної тканини різного ступеня зрілості. При забарвленні по ван Гізону остання мала різні кольори - від оранжевого до інтенсивного червоного. Серед пластів сполучної тканини іноді зустрічаються осередки реактивного кісткоутворення з явищами хондроїдної метаплазії. Слід відзначити, що повної нормалізації гістоархітектоніки ураженої пухлиною кістки, з відновленням кісткового мозку, тобто гемопоезу, мікроскопічно не виявлено в жодному з 38 досліджених випадків хвороби. Виходячи з цього, стає очевидним, що протипухлинні хіміопрепарати, а також ПТ, викликають депресивні та руйнівні зміни не тільки в пухлинних клітинах, але і в гемопоетичних клітинах.

При малій (низькій) клінічній ефективності ПХТ пухлинні клітини знищуються у невеликому обсязі, залишкові життєздатні пухлинні клітини хаотично розташовані серед волокнистої строми, що за власними результатами досліджень відповідає 0-2 ступеням лікувального патоморфозу СЮ. При середній (помірній) клінічній ефективності ПХТ пухлинні клітини зберігаються в малому обсязі та реєструються у вигляді поодиноких скупчень на фоні аморфного некротичного детриту, що відповідає 3-4 ступеням лікувального патоморфозу СЮ. При високій клінічній ефективності ПХТ у поєднанні з опроміненням зони пухлинного ураження кістки неопластичні клітини знищуються у значному обсязі, близькому до максимального, що відповідає 5-6 ступеню лікувального патоморфозу СЮ. При проведенні власних досліджень, був проведений кількісний аналіз структурних змін пухлинної паренхіми з визначенням обсягів об'ємних часток некротизованої паренхіми, а також залишкової (життєздатної) пухлинної паренхіми, яка структурно збереглася після ПХТ або ПХТ+ПТ (рис.2).

В групі контролю 15 пацієнтів, які отримували тільки хірургічне лікування без передопераційної ПХТ або ПТ, середній об'ємний вміст життєздатної пухлинної паренхіми (з виключенням спонтанних некрозів) складає 72,4±5,8%. У 27 пацієнтів, які отримували на передопераційному етапі ПХТ об'ємний вміст залишкової життєздатної пухлинної паренхіми складає у середньому 43,5±4,5% (лікувальний патоморфоз 3-4ст. в більшості випадків), а в 11 хворих при поєднанні ПХТ та ПТ її середній вміст складає вже тільки 13,1±2,9% (лікувальний патоморфоз 5-6ст.).

Таким, чином, виходячи з графічних та цифрових показників можна бачити, що ПХТ у порівнянні з контролем дозволяє у 1,6 рази зменшити об'єм вмісту пухлинних клітин СЮ, а при її поєднанні з опроміненням у 5,5 рази. Співставлення морфометричних показників після ПХТ та ПХТ у поєднанні з ПТ свідчить про вірогідну перевагу останнього лікувального підходу у 3,3 рази.

- саркома Юїнга (контроль, без передопераційних антибластомних втручань);

- саркома Юїнга (передопераційна поліхіміотерапія);

- саркома Юїнга (передопераційна поліхіміотерапія у поєднанні з променевою терапією).

Рис. 2. Морфометричні показники лікувального патоморфозу сарком Юїнга після

неоад'ювантної антибластомної терапії.

При аналізі результатів гістостереометрії мікроскопічних зрізів була створена схема-шкала морфологічної оцінки ефективності неоад'ювантних засобів при дослідженні операційного матеріалу видалених пухлин (табл. 4).

Таблиця 4

Схема-шкала оцінки лікувального патоморфозу злоякісних пухлин

0 ступінь Після протипухлинного впливу залишились збереженими (життєздатними) не менше 95% пухлинних клітин. Лікування неефективне, результат незадовільний

1 ступінь Залишились збереженими від 75 до 95% пухлинних клітин. Лікування незадовільне, результат несуттєвий.

2 ступінь Залишились збереженими від 50 до 75 % пухлинних клітин. Лікування низької ефективності, результат помірний.

3 ступінь Залишились збереженими від 25 до 50% пухлинних клітин. Лікування середньої ефективності, результат задовільний.

4 ступінь Залишились збереженими від 10 до 25 % пухлинних клітин. Лікування високої ефективності, результат добрий.

5 ступінь Залишились збереженими менше 10 % пухлинних клітин. Лікування високої ефективності, результат дуже добрий.

6 ступінь Відсутність збережених пухлинних клітин. Лікування максимально високої ефективності, результат відмінний.

Примітка: “Збереженість” слід розуміти як відсутність в пухлинних клітинах морфологічних ознак апоптозу, каріорексису, каріолізісу, каріопікнозу, фігур патологічних мітозів, що свідчить про потенційну можливість до подальшої клітинної репродукції. При наявності вище зазначених морфологічних маркерів “клітинної смерті” пухлинні клітини вважали нежиттєздатними. “Ефект лікування” слід уявляти як ступінь нежиттєздатності (девіталізації) пухлинного осередку під впливом антибластомного втручання.

На відміну від існуючих за кордоном морфологічних критеріїв запропонованих M. Salzer - Kuntschik et al. (1983), схема яких має 4 градації оцінки деструктивних змін пухлинних клітин СЮ, розроблена власна схема-шкала, яка передбачає морфологічний аналіз пухлинних клітин за 7 послідовними ступенями їх структурної деградації з обов'язковим врахуванням стану генетичного (ядерного) апарату пухлинних клітин СЮ, що дозволяє об'єктивно оцінювати лікувальний патоморфоз. Отже, вище викладений методичний підхід дозволяє ставити діагноз СЮ по біопсії або на операційному матеріалі, а також дає об'єктивну змогу безпосередньо оцінити ефективність антибластомного впливу лікування, якщо воно проводилось перед оперативним втручанням.

ВИСНОВКИ

У роботі вирішено наукове завдання, що полягало у визначенні імуногістохімічних критеріїв діагностики саркоми Юїнга з метою покращення її морфологічної діагностики, шляхом застосування моноклональних антитіл (МКАТ) з наступною морфологічною оцінкою антибластомної терапії на основі розроблених ступенів лікувального патоморфозу.

1. Порівняльний аналіз методів морфологічної діагностики СЮ демонструє, що в 15% випадків гістологічний діагноз може призводити до помилкових результатів гіпер- або гіподіагностики дрібнокруглоклітинних пухлин кісток і оточуючих їх м'яких тканин.

2. Сучасні вимоги морфологічної діагностики СЮ потребують поєднання традиційного гістологічного методу з використанням імунофенотипування пухлини, що дозволяє діагностувати СЮ та проводити диференційну діагностику з іншими дрібнокруглоклітинними пухлинами.

3. Найбільше інформативними для діагностики СЮ виявилися маркер-епітоп антигену МІС2 (87%), що розпізнається завдяки МКАТ НВА-71, 013, 12 ET та маркери NSE i віментин. Маркери РGP9.5, HNK-1 i білок S-100 допомагають диференціювати СЮ з нейроектодермальним компонентом та PNET.

4. Додаткове використання МКАТ до маркерів ТRK-A, OS-нектину, OS-кальцину, актину, міогеніну, ?2-мікроглобуліну, ЕМА дає змогу проводити диференційну діагностику СЮ і PNET з остеосаркомою, хондросаркомою, ідентифікувати рабдоміосаркому, міксоїдну пухлину, метастази нейробластоми, карциноми.

5. Морфологічний та імуногістохімічний порівняльний аналіз підтверджує сучасну гістогенетичну концепцію нейроектодермального генезу СЮ на підставі позитивних імуногістохімічних реакцій з маркерами нейральної диференціації NSE, PGP9.5, HNK-1, білком S-100.

6. Морфологічна оцінка передопераційної радіо- та хіміотерапії проведена за розробленою семиступеневою схемою-шкалою оцінки лікувального патоморфозу свідчить, що в порівнянні з групою контролю (середній вміст життєздатної пухлинної паренхіми - 72,4±5,8) у хворих, які отримували неоад'ювантну ПХТ в поєднанні з ПТ середній вміст життєздатної паренхіми складає 13,1±2,9% (лікувальний патоморфоз відповідає 5-6 ступеню). У хворих на СЮ, які отримували перед операцією тільки ПХТ середній вміст життєздатної паренхіми становив 43,1±4,5% (лікувальний патоморфоз відповідає в більшості випадків 3-4 ступені).

7. Визначення морфологічних ефектів реалізації антибластомної дії ПХТ або ПХТ+ПТ у хворих на СЮ дозволяє за ступенями лікувального патоморфозу виявляти випадки пухлин, які резистентні до антибластомного втручання та впливати на тактику подальшого лікування.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Галахин К.А., Югринов О.Г., Курик Е.Г., Мельник Н.Н., Кошубарова М.В., Полякова Т.В., Баздырев В.В. Химиотерапевтический патоморфоз злокачественных опухолей // Український хіміотерапевтичний журнал. - 2000. - № 4. - С. 8 - 12.

2. Мельник М.М. Морфологічні аспекти діагностики і оцінки хіміотерапії саркоми Юїнга // Український хіміотерапевтичний журнал. - 2001. - № 2. - С. 43 - 46.

3. Галахін К.О., Лломбарт-Бош А., Мельник М.М., Ковальчук Е.М., Пономарьов І.О. Диференційна імуногістохімічна діагностика злоякісних пухлин сімейства Юїнга // Онкология. - 2001. - Т. 3, №2 -3. - С. 146 - 150.

4. Мельник М.М. Диференційна морфологічна та імуногістохімічна діагностика злоякісних пухлин сімейства Юїнга // Тези доп. V Міжнародного конгресу студентів і молодих вчених. - 10 -12 травня. - Тернопіль, 2001. - С. 142.

5. Мельник М.М., Тарасова Т.О., Ковальчук Т.О. Мікроскопічна діагностика саркоми Юїнга (можливості та перспективи) // Тези доп. X з'їзду онкологів України. - Ялта, 2001. - С. 302

6. Галахин К.А., Курик Е.Г., Мельник Н.Н., Кошубарова М.В., Баздырев В.В., Полякова Т.В., Башинский С.Н., Гройсман Д.Л. Морфологическая оценка эффективности противоопухолевой терапии // Тези доп. X з'їзду онкологів України. - Ялта, 2001. - С. 297.

7. Галахин К.А., Курик Е.Г., Ковальчук Э.Н., Скорода Л.В., Троицкая И.Н., Мельник Н.Н., Баздырєв В.В., Полякова Т.В., Башинский С.Н., Гройсман Д.Л. Закономерности лечебного патоморфоза злокачественных опухолей // Тези доп. X з'їзду онкологів України. - Ялта, 2001. - С. 296 - 297.

АНОТАЦІЯ

Мельник М.М. Критерії морфологічної діагностики та лікувального патоморфозу саркоми Юїнга. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.02 - патологічна анатомія. - Львівський державний медичний університет імені Данила Галицького

МОЗ України, Львів, 2002.

Дисертація присвячена питанням покращення морфологічної діагностики саркоми Юїнга та морфологічної оцінки ефективності її лікування. Використання панелі з 22 моноклональних антитіл дозволило селективно визначити найбільш інформативні моноклональні антитіла для імунофенотипування саркоми Юїнга до маркерів МІС2 (моноклональне антитіло НВА-71), віментину, NSE, PGP9.5, HNK-1, білку S-100. Встановлені також імуногістохімічні критерії диференційної діагностики саркоми Юїнга з іншими злоякісними дрібнокруглоклітинними пухлинами кісток та оточуючих їх м'яких тканин (анапластична остеогенна саркома, мезенхімальна хондросаркома, рабдоміосаркома, міксоїдна пухлина, метастази нейробластоми, карциноми) з визначенням доцільності використання TRK-A, OS-нектину, OS-кальцину, актину, міогеніну, ?2-мікроглобуліну, ЕМА. Розроблена 7-ступенева схема-шкала оцінки лікувального патоморфозу саркоми Юїнга для визначення ефективності протипухлинних засобів неоад'ювантної терапії. Встановлено, що найбільш ефективним методом передопераційного лікування саркоми Юїнга є поєданння поліхіміотерапії з опроміненням.

Ключові слова: саркома Юїнга, морфологічна діагностика, імуногістохімія, поліхіміотерапія, променева терапія.

АННОТАЦИЯ

Мельник Н.Н. Критерии морфологической диагностики и лечебного патоморфоза саркомы Юинга. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.02 - патологическая анатомия. - Львовский государственный медицинский университет имени Данила Галицкого МЗ Украины, Львов, 2002.

Диссертация содержит сведения о морфологических, иммуногистохимических критериях диагностики саркомы Юинга и морфологических критериях (степени лечебного патоморфоза) эффективности антибластомного лечения.

С 227