НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОї БіОЛОГії і ГЕНЕТИКИ

______________________________________________________________

Нечипоренко Марина Володимирівна

УДК 577.11+577.21+577.213+616. 832-009. 55

Дослідження мутацій та поліморфізмів послідовності ДНК гена фенілаланінгідроксилази в родинах високого ризику фенілкетонурії

03.00.26 - молекулярна генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИїВ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ і Науковому центрі медичної генетики Інституту гігієни і медичної екології АМН України, м. Київ.

Науковий керівник доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Лівшиць Людмила Аврамівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, в.о. завідувача відділу геноміки людини.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Литошенко Олександр Якович, Інститут геронтології АМН України, м. Київ, керівник лабораторії молекулярної генетики; кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Черепенко Олена Йосипівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, провідний науковий співробітник відділу молекулярної генетики.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра загальної та молекулярної генетики, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться “18” червня 2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 16.05.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Підпала О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Найбільш перспективним підходом у вивченні генів людини в умовах, коли проведення експериментів обмежене особливостями досліджуваного об'єкта, є аналіз генів спадкових захворювань. Вже до 2000 року на хромосомах людини картовано близько 1000 генів, мутації яких призводять до різних спадкових захворювань (McKusick et al., 2000). Одним із перших в геномі людини було картовано та ідентифіковано ген фенілаланінгідроксилази (ФАГ), мутації в якому обумовлюють розвиток захворювання з аутосомно-рецесивним типом успадкування - фенілкетонурії (Lidsky, 1984). Дослідження мутантних варіантів гена цього захворювання надає можливість вивчати природу, походження і механізми розповсюдження в популяціях мутацій геному людини. В свою чергу аналіз асоціації генотипу і клінічних проявів захворювання дає можливість дослідити фенотиповий ефект генетичних змін, а також є основою для актуальних і перспективних досліджень функціонування і взаємодії генів.

З практичної точки зору, дослідження молекулярно-генетичних основ спадкових хвороб людини відкриває нові можливості в діагностиці, профілактиці та лікуванні важких патологій спадкової природи. Реальністю сьогодення є впровадження програм генетичного тестування і пренатальної ДНК-діагностики багатьох захворювань, у тому числі і фенілкетонурії, а справою найближчого майбутнього - впровадження в клінічну практику методів генотерапії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися в рамках тематичних планів Інституту гігієни і медичної екології АМН України №109.98 “Розробка методів молекулярно-генетичної діагностики найбільш поширених в Україні нейродегенеративних захворювань і розумової відсталості спадкової природи” та Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ №2. 28.2.2 “Популяційно-генетичні дослідження мутацій у групах високого ризику важких спадкових патологій в Україні”.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідження мутацій і поліморфізмів гена фенілаланінгідроксилази у хворих на фенілкетонурію, членів їхніх сімей і донорів з різних регіонів України.

Для досягнення мети були поставлені основні завдання дослідження:

1. Створити банк зразків лейкоцитарної ДНК хворих на фенілкетонурію (ФКУ) і членів їхніх родин із різних регіонів України.

2. Дослідити частоту і спектр мутацій гена ФАГ у хворих на ФКУ з України.

3. Провести аналіз алельних варіантів VNTR- і STR- поліморфізмів гена ФАГ в сім'ях високого ризику фенілкетонурії та у регіональних популяціях України.

4. Встановити особливості асоціації визначених мутацій гена ФАГ із різними клінічними формами фенілкетонурії.

5. Розробити ефективну стратегію використання ДНК-аналізу при проведенні пренатальної діагностики і скринінгу гетерозиготних носіїв фенілкетонурії в Україні.

Об'єктом дослідження є спадкове захворювання - фенілкетонурія, а предметом - походження, спектр і поширеність мутацій гена ФАГ в Україні, а також асоціація мутантного генотипу з клінічними проявами ФКУ. У роботі використовувалися методи: виділення та очищення ДНК, рестрикційний аналіз, полімеразна ланцюгова реакція, метод денатуруючого градієнтного гель-електрофорезу, метод високо ефективної рідинної хроматографії в денатуруючих умовах, капілярне секвенування і статистична обробка даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше створено банк ДНК, що налічує 283 зразки лейкоцитарної ДНК хворих на ФКУ і членів їх родин з України. Вперше у хворих на фенілкетонурію з України проведено аналіз мутацій в послідовності 1-го, 3-го, 5-го, 7-го, 11-го та 12-го екзонів, а також 10-го і 12-го інтронів гена ФАГ. Ідентифіковано 11 різних мутацій. За результатами аналізу розповсюдженості мутацій встановлено, що мажорною для популяції України є мутація R408W, частота якої в групі хворих на ФКУ складає 57 %. Частота інших 10 мутацій коливається в межах 0,5-3,7 %. Проведено популяційний та сегрегаційний аналіз алелів інтрагенних STR- та VNTR- поліморфних локусів. Ідентифіковано 8 алельних варіантів для STR-поліморфізму та 7 - для VNTR- поліморфізму. Отримано дані про походження окремих мутацій гена ФАГ в популяції України. Встановлено асоціацію мажорної мутації R408W з мінігаплотипом VNTR03/STR238 гена ФАГ, що вказує на одноподійне балто-слав`янське походження цієї мутації в Україні. Досліджено фенотиповий ефект різних мутацій гена ФАГ. Виявлено асоціацію мутації R408W з "класичною" формою захворювання, а також встановлено модифікуючу взаємодію мутацій різної природи гена ФАГ при формуванні клінічного фенотипу фенілкетонурії.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлено високу інформативність ДНК-аналізу мутації R408W для діагностики ФКУ в Україні. Розроблено модифікований варіант методу полімеразної ланцюгової реакції та рестрикційного аналізу для детекції шести мутацій у 7-му екзоні гена ФАГ.

Запропановано стратегію використання прямого аналізу мутацій гена ФАГ, а також аналізу зчеплення мутантного гена з високоінформативними VNTR- та STR-поліморфними маркерами для пренатальної діагностики, масового і селективного скринінгу гетерозиготних носіїв мутантних генів із метою профілактики цього важкого спадкового захворювання в Україні.

Особистий внесок здобувача. Весь обсяг експериментальної частини дисертації, пошук і опрацювання літературних даних виконані автором особисто. Аналіз і обговорення результатів проводилися разом із науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на міжгалузевій конференції молодих вчених при Інституті біохімії ім. Палладіна (Київ, 2000); на міжнародному симпозіумі “Human Genetics” (Відень, Австрія, 2001); конференції молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (Київ, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 друкованих праць, зокрема 5 статей у вітчизняних і міжнародних профільних виданнях і тези 3-х доповідей на міжнародних і вітчизняних конференціях.

Структура і обсяг роботи. Дисертація містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, обговорення результатів, підсумок, висновки та список використаних джерел. Текст дисертації проілюстровано 18 таблицями і 27 рисунками. Перелік використаних джерел охоплює 132 найменування. Дисертаційну роботу викладено на 126 сторінках машинописного тексту.

ОСНОВНий зміст

Матеріали і методи дослідження

Біологічні матеріали.

Матеріалом для досліджень були зразки периферичної крові зі стандартним консервантом глюгіциром хворих на фенілкетонурію, членів їхніх сімей, донорів із різних регіонів України, пацієнтів включених у програму генетичного тестування, які отримані з установ, де вони проходили клінічне обстеження і медико-генетичне консультування. Матеріалом для дослідження при проведенні пренатальної ДНК-діагностики фенілкетонурії були біоптати хоріона, плаценти і некультивовані клітини амніотичної рідини, отримані від вагітних із цих сімей і надані Інститутом педіатрії, акушерства і гінекології АМН України, Кримським і Криворізьким міжобластними медико-генетичними центрами.

Методи.

Виділення ДНК. Виділення та очищення препаратів ДНК зразків крові проводили за допомогою стандартних методів (Wehnert et al., 1988; Маниатис и др., 1985).

Ампліфікація послідовностей ДНК in vitro. Ампліфікацію in vitro деяких геномних послідовностей ДНК гена ФАГ проводили за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в автоматичному режимі на термоциклері "Perkin Elmer" (фірма "Cetus", США) та “Ампли-2” (фірма "Биоком", Москва, Росія) за методом Saiki et al. (1988).

Метод денатуруючого градієнтного гель-електрофорезу. Для скринінгу мутацій у послідовностях 1-го, 3-го, 11-го і 12-го екзонів використовували метод денатуруючого градієнтного гель-електрофорезу (DGGE) на обладнанні Protean II виробництва компанії “Biorad”. При проведенні полімеразної ланцюгової реакції були використані праймери запропоновані Галбергом із приєднаним CG-багатим фрагментом до 5'-кінця одного з пари праймерів (Guldberg et al, 1993). Фракціонування ПЛР продуктів здійснювали в 12% поліакріламідному гелі з градієнтом денатуранту (сечовина) при температурі 60 ?С.

Метод високо ефективної рідинної хроматографії в денатуруючих умовах. Для скринінгу мутантних алелів у послідовності 7-го екзону гена ФАГ використовували метод високо ефективної рідинної хроматографії в денатуруючих умовах (dHPLC). ПЛР проводили за стандартних умов, а фракціонування ПЛР продуктів здійснювали на обладнанні Wave DNA Fragment Analysis System виробництва компанії "Transgenomic" в денатуруючих умовах, при температурі 62 ?С и 63 ?С.

Рестрикційний аналіз. Для ідентифікації мутацій гена ФАГ застосовували метод рестрикційного аналізу продуктів ПЛР відповідних послідовностей. Реакції рестрикції проводили в об`ємі 10-20 мкл реакційної суміші та 1-10 од.акт. відповідної ендонуклеази рестрикції за умов, рекомендованих фірмами-виробниками. Електрофоретичне розділення продуктів рестрикції проводили в 1,8 % агарозному гелі в трис-боратному буферному розчині.

Капілярне секвенування. Для реакції секвенування використовували “ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequincing Ready Reaction Kits” виробництва компанії “PE Biosystem” до складу якого входили флуоресцентно мічені модифіковані ddNTP. Фракціонування секвенованих зразків проводили на аналізаторі генів ABI Prism, модель 310, версія 3.0 виробництва компанії PE Biosystem відповідно до інструкції виробника.

Електрофоретичне розділеннял флуоресцентно мічених ПЛР продуктів. Електрофоретичне розділення ПЛР продуктів, праймери для яких мітили флуоресцентною міткою Cy5 проводили на автоматичному лазерному флуориметрі “ALF express” виробництва “Pharmacia Biotech”. Після сканування дані обробляли за допомогою програми FM2. 1 (Fragment Manager Software V2. 1, Pharmacia).

Статистичний аналіз. Відповідність розподілу генотипів до теоретично очікуваного (розрахованого на основі рівняння Харді-Вайнберга), оцінювали за критерієм ? 2 (Лакин, 1980). Нерівновагу за зчепленням оцінювали за значенням тетрахоричного коефіцієнта Пірсона і відповідного критерію ?2 (Лакин, 1980). При розрахунках використовували пакети програм “GENEPOP” (Raymond et al., 1986).

Отримані результати та їх обговорення

Аналіз спектра і поширення мутацій гена фенілаланінгідроксилази в Україні. Відповідно до даних міжнародного консорціуму із вивчення фенілкетонурії до 2001 року було ідентифіковано більш ніж 600 мутацій у послідовності гена ФАГ (Scriver et al., 2000). Вивчення спектра і розповсюдженості мутацій гена ФАГ проводили у хворих на ФКУ з України та членів їхніх родин. З цією метою нами було створено банк ДНК, що нараховує 283 зразки, із них - 101 хворий на ФКУ, 155 батьків хворих, 12 сибсів і 5 інших близьких родичів.

Дослідження мутацій проводили у два етапи: І-й - скринінг мутантних алелей і ІІ-й етап -ідентифікація мутацій.

Скринінг мутантних алелей у послідовності 7-го екзону гена ФАГ проводили за допомогою методу dHPLC. Було показано, що в 19-ти пацієнтів dHPLC профіль представлений двома піками, що свідчить про мутацію в 7-ому екзоні гена ФАГ у цих пацієнтів (рис. 1 А,Б).

Рис. 1. Аналіз сьомого екзону гена ФАГ методом dHPLC: А) Контроль- генотип норма/норма; Б) Генотип R 261 Q/норма

Для точної ідентифікації мутантних алелей виявлених dHPLC методом було використано метод рестрикційного аналізу продуктів ПЛР послідовності 7-го екзону. Розроблена нами власна модифікація цього методу дозволила провести аналіз 6-ти мутацій в послідовності 7-го екзону, а саме R252W, R261Q, R261X, G272X, S273F та P281L, використовуючи одну пару праймерів та 6-ть різних ендонуклеаз рестрикції (Eco881, HinfI, BamHI, DdeI, Sau3A, MspI).

За допомогою цього ж підходу нами було проведено детекцію мутацій R158Q (5-й екзон), R408W (рис. 2)Y414C (12-й екзон), Ivs10nt546 (10-й інтрон) та Ivs12nt1 (12-й інтрон). Результати аналізу однієї з цих мутацій, а саме R408W наведено на рис.2.

Із 11-ти проаналізованих нами мутацій було ідентифіковано 10. Мутація R261X в обстеженій нами групі хворих не була виявлена.

Для скринінгу інших мутантних алелей у послідовності 1-го, 3-го, 11-го і 12-го екзонів використовували метод DGGE. За результатами проведеного аналізу в обстеженій групі хворих не було виявлено жодного мутантного алеля в послідовності 1-го, 3-го та 11-го екзонів гена ФАГ. DGGE –профіль усіх аналізованих зразків був представлений одним піком і не відрізнявся від норми. В послідовності 12-го екзону було виявлено один мутантний алель, який за DGGE –профілем відрізнявся від норми та мутацій R408W і Y414C (рис. 3).

Для ідентифікації цього мутантного алеля було використано метод капілярного секвенування. За результатами аналізу нуклеотидної послідовності було встановлено, що в досліджуваному зразку гуанін у складі 413 кодону, що кодує аргінін, замінений на цитозин (рис. 4), тобто даний пацієнт є носієм мутації R413P.

Частота цієї мутації в групі хворих на ФКУ з України склала 0,5%. У попередніх дослідженнях було встановлено, що мутація R413P є мажорною в Японії (Sueoka et al., 2000).

Рис. 4. Фрагмент послідовності 12-го екзону гена ФАГ (капілярний електрофорез секвенованої ДНК хворого Г.): генотип R413P/норма

При геніалогічному аналізі родини цього хворого вдалося одержати дані про азіатське походження родичів батька хворого-носія цієї мутації. Цікаво зазначити, що це перший випадок виявлення мутації R413P у слов'янських популяціях і другий випадок в Європі в цілому.

Таким чином, у 101-го хворого на ФКУ з різних регіонів України нами було проведено молекулярно-генетичний аналіз мутантних алелей в послідовності 1-го, 3-го, 5-го, 7-го, 11-го та 12-го екзонів, а також 10-го і 12-го інтронів, що дозволило нам ідентифікувати мутації на 73 % ФКУ хромосом. Частоти розповсюдження виявлених нами мутацій наведено в таблиці 1.

Таблиця 1

Частоти мутацій гена ФАГ у хворих ФКУ в Україні

Мутація Кількість проаналізованих хромосом Кількість хромосом із мутацією Частота, %

R408W 202 115 57

R158Q 190 7 3,7

R252W 174 5 2,9

P281L 174 4 2,3

Y414C 192 3 1,6

Ivs10nt546 202 3 1,5

Ivs12nt1 202 2 1

R261Q 172 2 1,2

G272X 172 1 0,6

S237F 172 1 0,6

R413P 178 1 0,5

Разом 202 144 73

За результатами наших досліджень встановлено, що найбільша кількість мутацій зосереджена в 7-му екзоні, це збігається з даними інших авторів, згідно яких саме в послідовності цього екзону зосереджено найбільший кластер мутацій в гені ФАГ(Konecki, 1991). Нами було встановлено, що мажорною в Україні, як і в багатьох країнах Європи є мутація R408W, частота якої в обстеженій нами групі складає 57 %.

Звертає на себе увагу також той факт, що в обстеженій нами групі хворих не було виявлено жодної мутації в 1-му, 3-му і 11-му екзонах, хоча для кожного з них відомо від 1-го до 4-х десятків різних мутацій (http://www.mcgill.ca/pahdb). Більшість цих мутацій відносяться до числа малопоширених, проте мутації I65T і F39L, які локалізовані в послідовності 1-го екзону є достатньо поширеними на північному заході Європи (частота зустрічальності 10-20%). Найбільш імовірно, що саме цей регіон є місцем іх виникнення. Проте у східному напрямку частота цих мутацій градієнтно знижується і в сусідніх з Україною популяціях не перевищує 1-го % (Kalaydjieva et al., 1991).

Молекулярно-генетичний аналіз інтрагенних поліморфізмів гена ФАГ у сім'ях високого ризику ФКУ та у популяції здорового населення України.

Молекулярно-генетичний аналіз VNTR-поліморфізму в популяції здорового населення України та у групі хворих на ФКУ. Аналіз алельного поліморфізму VNTR-локусу 3'- нетрансльованої ділянки гена ФАГ проводили серед 470 здорових донорів з різних регіонів України. В результаті дослідження було виявлено 7 алельних варіантів мінісателітного VNTR-локусу. Число тандемних повторів при цьому варіювало від 3-х до 12-ти. Розподіл частот алелів подано на рисунку 5.

Рис. 5. Розподіл алелів VNTR-поліморфізму гена ФАГ на "нормальних" і ФКУ хромосомах

У обстежених індивідів було виявлено 15 різних генотипів, причому 7 із них зустрічались тільки в групі донорів. Рівень гетерозиготності VNTR-локусу складає 72 %, що дозволяє ефективно використовувати аналіз алельних варіантів цього мінісателіту для встановлення діагностичної інформативності в родинах високого ризику ФКУ під час проведення сегрегаційного аналізу зчеплення VNTR-алеля з мутантним варіантом гена ФАГ.

Молекулярно-генетичний аналіз STR-поліморфізму гена ФАГ. Алельні варіанти STR-поліморфізму, локалізованого в 5'-частині гена ФАГ у послідовності 3-го інтрону були ідентифіковані на 164-х “нормальних” (аналізували зразки ДНК доноров із різних регіонів України) і на 148 мутантних ФКУ хромосомах. При проведенні ампліфікації in vitro відповідної ділянки гена ФАГ було виявлено продукти ПЛР розміром від 226 п.н. до 254 п.н., що відповідало восьми різним алельним варіантам (рис. 6).

Рис. 6. Аналіз STR - поліморфізму гена ФАГ в трьох сім'ях високого ризку ФКУ з використанням автоматичного лазерного флуориметра “A.L.F. express”: 1-3 родина П. 1 - мати (234/238 п.н.), 2 - батько (234/238 н.н.), 3 – пробанд (238/238); 4 – 6 родина М. 4 – мати (242/246 п.н), 5 – батько (226/250), 6 – пробанд (226/242); 7 – 9 родина К. 7 – мати (238/246), 8 – батько (238/242), 9 – пробанд (238/238)

Розподіл алелів на "нормальних" і ФКУ хромосомах наведено на рисунку 7.

Виявлені нами 8 алельних варіантів STR-локусу гена ФАГ були презентовані в 26 генотипах, а рівень гетерозиготності склав 78 %, що свідчить про високу інформативність використання цього маркера для проведення пренатальної ДНК-діагностики фенілкетонурії в сім'ях високого ризику ФКУ шляхом аналізу сегрегації поліморфного алеля з мутантним варіантом гена ФАГ.

Походження мутацій гена ФАГ у популяції України. З метою вивчення походження мутацій гена ФАГ нами було проведено вивчення асоціації цих мутацій з алельними варіантами VNTR-та STR-поліморфізмів. Характер асоціації оцінювали за значенням тетрахоричного критерію Пірсона (Лакин, 1980). За результатами такого аналізу встановлено, що всі 115 хромосом із мутацією R408W зчеплені з VNTR-алелем із 3-ма повторами. Таким чином, для VNTR-поліморфізму було встановлено статистично достовірну нерівновагу за зчепленням мутації R408W з алелем VNTR-поліморфізму, що містить три повторювані одиниці (r=0.81, ?2=48.5). Зчеплення ж із STR-поліморфізмом не було таким сталим: у 54-х випадках мутацію R408W було виявлено на хромосомах з алелем 238 п.н., у шести випадках на хромосомі з алелем 242 п.н., у трьох випадках на хромосомі з алелем 246 п.н, і лише в поодиноких випадках на хромосомах з алелями 230 і 234 п.н. Тому цілком логічно, що для STR-поліморфізму було показано статистично достовірну нерівновагу за зчепленням мутації R408W з алелем розміром 238 п.н. (r=0. 537, c2=41.6). На сьогодні відомо, що частота мутацій в мікросателітних локусах коливається в межах 1-3 х 10-3 (Kayser et al., 2000). Саме такими мутаційними подіями і можна пояснити існування інших алельних варіантів STR-локусу гена ФАГ на хромосомі з мутацією R408W.

Отримані нами дані вказують на те, що в популяції населення України мутація R408W має одноподійне походження і виникла саме на хромосомі з алелем 03 VNTR - поліморфізму і 238 п.н. STR-поліморфізму. Результати аналізу зчеплення мутації R408W у популяції населення України збігаються з даними, отриманими для інших популяцій зі слов'янським населенням і підтверджують висловлене раніше припущення про балто-слав`янске походження цієї мутації (Eisensmith , 1995).

STR-VNTR-мінігаплотипи гена ФАГ були визначені для деяких інших ідентифікованих нами мутацій, а також для ФКУ-хромосом з неідентифікованими мутаціями. Встановлено, що мутації R158Q, P281L і R252W виявлені на хромосомах 12 із різними мінігаплотипами, які відрізняються не тільки алельними варіантами STR-, але і VNTR- поліморфізму. Цей факт наводить на думку про рекурентне походження цих мутацій. Важливо також відзначити широкий спектр мінігаплотипів асоційованих з неідентифікованими мутаціями. Спираючись на ці дані можна припустити, що група неідентифікованих нами мутацій є гетерогенною і представлена цілою низкою різних мутацій гена ФАГ.

Вивчення кореляції генотип - фенотип у хворих на фенілкетонурію. Для вивчення асоціації генотипу з клінічними проявами фенотипу при фенілкетонурії нами було розроблено та розіслано спеціальну анкету, в якій клініцистів просили вказати основні клінічні та біохімічні параметри хворих. Таким чином, на основі цієї інформації були отримані відомості про перебіг захворювання для 78 хворих. Дані про найбільш діагностично важливі біохімічні параметри були наведені в анкетах 28 пацієнтів. У 50-ти клінічних формах, наданих лікарями, була представлена неповна інформація про біохімічні показники хворих, але в деяких із них лікарі відзначали характер перебігу хвороби на основі клінічної картини. Спираючись на ці показники ми змогли класифікувати три форми ФКУ у хворих з обстеженої групи. Так "класичну" форму ФКУ мав 21-н пацієнт, "проміжну" - 4 і "м'яку" -3.

Результати генотипування хворих на “класичну” форму ФКУ подано в таблиці 2.

Таблиця 2

Генотипи хворих на "класичну" форму ФКУ

Генотип Кількість хворих

R408W/R408W 7

R408W/R158Q 2

R408W/R261Q 1

R408W/Ivs10nt546 2

R408W/Ivs12nt1 1

R408W/Y414C 1

S273F/R413P 1

R252W/X 1

R408W/X 1

7-ой екзон/X 1

X/X 3

X- неідентифікована мутація

Таким чином нами було показано, що група мутацій асоційованих із “класичною” формою ФКУ гетерогенна. Однозначно можна зробити висновок про те, що мутація R408W у гомозиготному стані призводить до розвитку фенотипу характерного для “класичної” форми ФКУ. З приводу мутацій R158Q, G272X, Ivs10nt546, Ivs12nt1, можна зробити спостереження про те, що дані мутації в компаунді з мутацією R408W також можуть бути асоційовані з класичною формою ФКУ.

У чотирьох пацієнтів біохімічні показники яких відповідали “проміжній” формі ФКУ, нами були ідентифіковані чотири різні генотипи: R408W/P281L, R261Q/X, R408W/R252W і X/X. З нашої точки зору особливий інтерес становлять два випадки в пацієнтів із генотипом R408W/P281L і R408W/R252W. Встановлено, що мутації R408W, P281L і R252W призводять до повної втрати активності ферменту (Erlandsen et al., 1999). При аналізі літературних даних з'ясувалося, що для всіх пацієнтів із такими генотипами визначалася “класична” форма ФКУ (Guldberg et al., 1999) . У нашому ж випадку не тільки біохімічні показники дозволяють класифікувати “проміжну” форму ФКУ, але й аналіз клінічного обстеження цих хворих вказує на нетиповий перебіг хвороби. Одним із пояснень цих фактів може бути припущення, висловлене Скрайвером і співавторами (Guldberg et al, 1998) про те, що при сполученні в генотипі двох різних мутацій з повною втратою функції ферменту можливо формування більш “м'якого” фенотипу за рахунок ще невідомого компенсаторного ефекту. З нашої точки зору ці факти можуть бути також пояснені впливом інших генів, які модифікують формування клінічного фенотипу в даних випадках.

У хворих з “м'якою” формою фенілкетонурії нами було виявлено два генотипи R408W/Y414C, R158Q/X і X/X.

За результатами аналізу генотипів у хворих з різними клінічними формами ФКУ звертає на себе увагу той факт, що в групах хворих із "проміжною" і "м'якою" формами фенілкетонурії відсоток ідентифікованих нами мутацій значно нижчий, ніж у групі хворих з "класичною" формою ФКУ (16% і 41 % відповідно). Можна припустити, що "проміжна" і "м'яка" форми асоційовані з рідкісними мутаціями, локалізованими або в інтронних послідовностях, або в послідовностях екзонів, які нами не аналізувались.

Особливо цікавою є група хворих, які мали однаковий генотип - R408W/Y414C, але суттєво відрізнялись за перебігом хвороби.

Відповідно до літературних даних мутація Y414C належить до числа “м'яких” мутацій, оскільки зберігається 28-50% активності фенілаланінгідроксилази з цією мутацією (Erlandsen et al., 1999). В обстеженій нами групі хворих два пацієнти з однаковим генотипом R408W/Y414C мали різні клінічні форми ФКУ: "класичну" та "м'яку". Одним із поясненнь цього явища може бути вплив ще невідомих генів-модифікаторів. Ми припускаємо, що при сполученні в генотипі мутацій Y414C і R408W, може порушуватися саме процес утворення тетрамерних форм ферменту за рахунок негативного впливу окремих субодиниць із мутацією R408W, які при такому генотипі також присутні в клітині. Аналогічне припущення про порушення процесу утворення тетрамерної форми білка при мутаціях гена ФАГ було нещодавно висловлено Геттінгом та співавторами (Gjetting et al., 2001).

Використання прямого і непрямого методів аналізу мутантного гена ФАГ для профілактики захворюваності на фенілкетонурію. Основними напрямками профілактики фенілкетонурії є скринінг населення дітородного віку на носійство мутацій гена ФАГ і пренатальна ДНК діагностика ФКУ в родинах високого ризику.

Одним із завдань даного дослідження була розробка стратегії молекулярно-генетичного аналізу мутацій і поліморфізмів гена ФАГ інформативного для проведення дородової ДНК-діагностики фенілкетонурії в сім'ях високого ризику. Аналіз мутацій гена ФАГ, а також сегрегаційний аналіз мутантного VNTR- і STR-поліморфізмів був проведений нами в 60-ти повних родинах (мати, батько, пробанд) за результатами такого дослідження повна діагностична інформативність була встановлена в 93,3% випадків, у решті випадків (6,7%) аналіз був напівінформативним. На рисунку 8 подано діаграму, яка відображає внесок кожної системи у створення діагностичної інформативності при проведенні пренатальної ДНК-діагностики ФКУ в Україні.

Рис. 8. Інформативність використання аналізу мутацій та VNTR-, STR- поліморфізмів для пренатальної ДНК-діагностики у родинах високого ризику фенілкетонурії: 1- прямий аналіз мутацій; 2 - прямий аналіз мутацій + сегрегаційний аналіз VNTR-алелів; 3 - прямий аналіз мутацій + сегрегаційний аналіз VNTR-, STR-мінігаплотипів

Базуючись на попередньо отриманих даних сегрегаційного аналізу мутантних алелів з поліморфізмами гена ФАГ, пренатальну ДНК-діагностику фенілкетонурії було проведено в 24-х родинах.

В 10-ти випадках (41,6%) пренатальну діагностику проводили на основі прямого аналізу мутацій в сім'ях, де у пробанда були ідентифіковані обидві мутації.

У інших 10-ти сім'ях (41,6%) за результатами попереднього аналізу у пробанда було ідентифіковано тільки одну мутацію гена ФАГ - R408W. У цих випадках інформативність прямого аналізу мутацій складала 50 % і для досягнення повної діагностичної інформативності використовували сегрегаційний аналіз зчеплення неідентифікованой мутації з алельними варіантами інтрагенних VNTR- і STR-поліморфізмів.

У чотирьох сім'ях (16,6%) пренатальну ДНК-діагностику проводили тільки за результатами сегрегаційного аналізу поліморфізмів з мутантним алелем, оскільки мутації гена ФАГ у пробанда ідентифіковані не були.

Згідно з результатами проведених нами дородових діагностик у 26% випадків плід не був носієм мутацій гена ФАГ, у 56, 5 % - плід був носієм однієї мутації гена ФАГ. В усіх цих родинах було рекомендовано не переривати вагітність. В 17,4% випадків плід успадкував мутантні алелі від обох батьків, тобто генотип плоду не відрізняється від генотипу пробанда.

Проведені нами дослідження дозволили виявити спектр найпоширеніших мутацій гена ФАГ в Україні і на основі цих даних розробити програму генетичного тестування гетерозиготних носіїв. У рамках цієї програми в осіб дітородного віку в сім'ях, де не було хворих на фенілкетонурію, аналізували мутації R408W, R158Q, Y414C, Ivs10nt546, Ivs12nt1. Усього було проаналізовано 175 індивідів і для двох із них було встановлено статус гетерозиготного носійства мутацій гена ФАГ. У одного пацієнта було виявлено мажорну для популяції України мутацію R408W, а в іншому випадку пацієнт був носієм мутації Y414C. В обох випадках було рекомендовано молекулярно-генетичне тестування мутацій гена ФАГ іншому члену подружжя із наступним медико-генетичним консультуванням.

На підставі отриманих даних нами запропоновано стратегію профілактики захворюваності на фенілкетонурію, яка має стати суттєвим доповненням діючої в Україні програми скринінгу новонароджених. Суть наших пропозицій полягає у проведенні програми масового скринінгу гетерозиготних носіїв, шляхом добровільного генетичного тестування найрозповсюдженіших в Україні мутацій гена ФАГ та селективного скринінгу в родинах високого ризику з подальшим проведенням пренатальної діагностики ФКУ.

Висновки

1. Вирішення поставлених в даній роботі завдань дозволило з`ясувати походження, спектр та розповсюдження мутацій гена ФАГ в Україні, а також встановити асоціацію цих мутацій з розвитком клінічних форм фенілкетонурії, що відкриває перспективи для дослідження природи взаємодії конкретних генетичних чинників патогенезу та пошуку нових засобів профілактики цього спадкового захворювання.

2. Вперше у хворих на ФКУ з України проаналізовано 140 мутацій гена ФАГ. Мутантні алелі ідентифіковані на 73-х % ФКУ хромосом і представлені 11-ма різними мутаціями: 9 - міссенс мутацій, 1- нонсенс мутація і 2-і мутації сайтів сплайсингу.

3. Встановлено, що мажорною для популяції України є мутація R408W, частота зустрічальності якої в групі хворих на ФКУ складає 57 %.

4. У результаті сегрегаційного аналізу поліморфних послідовностей ДНК (VNTR і STR) із мажорною мутацією R408W встановлено статистично вірогідну нерівновагу за зчепленням з мінігаплотипом VNTR03/STR238, що свідчить про одноподійне походження цієї мутації в популяції України.

5. Встановлено, що мутація R408W у гомозиготному стані обумовлює розвиток “класичної” форми ФКУ, мутації ж інших типів можуть мати модифікуючий вплив на формування фенотипових ознак даного захворювання.

6. Отримані результати свідчать про високу (93,3%) інформативність використання аналізу мутації R408W і алельних варіантів VNTR-і STR-поліморфізмів для пренатальної ДНК-діагностики фенілкетонурії і масового скринінгу гетерозиготних носіїв цього захворювання в Україні.

7. Вперше створено банк лейкоцитарної ДНК хворих на фенілкетонурію (101 зразок), членів їхніх родин (182 зразки) і осіб, які брали участь у програмі генетичного тестування (175 зразків) з України.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Dork T., Macek M., Mekus F., Tummler B., Tzountzouris J., Casals T., Krebsova A., Koudova M., Sakmaryova I., Macek M., Vavrova V., Zemkova D., Ginter E., Petrova N.V., Ivaschenko T., Baranov V., Witt M., Pogorzelski A., Bal J., Zekanowsky C., Wagner K., Stuhrmann M., Bauer I., Seydewitz H.H., Neumann T., Jakubiczka S., Kraus C., Thamm B., Nechiporenko M., Livshits L., Mosse N., Tsukerman G., Kadasi L., Ravnik-Glavac M., Glavac D., Comel R., Vouk K., Kucinkas V., Krumina A., Teder M., Kocheva S., Efremov G.D., Onay T., Kirdar B., Malone G., Schwartz M., Zhou Z., Freidman K.J., Carles S., Claustres M., Bozon D., Verligue C., Ferec C., Tzetis M., Kanavakis E., Cuppens H., Bombiery C., Pignatti P.F., Sangiuolo F., Jordanova A., Kusic J., Radojkovic D., Sertic J., Richter D., Rukavina A.S., Bjorck E., Strandvik B., Cardoso H., Montgomery M., Nakielna B., Hughes D., Estivill X., Aznarez I., Tillis E., Tsui L-C., Zielenski J. Characterization of a novel 21-kb deletion, CFTRdele2,3 (21 kb), in the CFTR gene: a cystic fibrosis mutation of Slavic origin common in Central and East Europe // Hum Genet. – 2000. – Vol. 106, N 3. – P. 259-268.

2. Нечипоренко М.В., Лившиц Л.А. Анализ мутаций гена фенилаланингидроксилазы в семьях высокого риска фенилкетонурии в Украине // Цитология и генетика. –2000.- Т. 34, N 6.-С. 59-63.

3. Нечипоренко М.В., Кравченко С.А, Лівшиць Л.А. Аналіз мутацій та VNTR-поліморфізму гена фенілаланінгідроксилази //Український біохімічний журнал.- 2001.- Т. 73, N 2.-С. 63-67.

4. Нечипоренко М.В., Кравченко С.А., Лівшиц Л.А. Молекулярно-генетичний аналіз мутацій та мінігаплотипів гена фенілаланінгідроксилази в Україні // Біополімери і клітина. – 2001. – Т.17, N6. – С. 556-559.

5. Nechyporenko M.V., Kravchenko S.A., Livshits L.A. PKU in Ukraine: PAH gene mutations and minihaplotype analysis // Bulletin of molecular medicine. –2001.-N 9-10.- P. 1-6.

6. Нечипоренко М.В., Кравченко С.А., Лившиц Л.А. Анализ мутаций и VNTR-полиморфизма гена фенилаланингидроксилазы //Украинский биохимический журнал.- 2000.- Т. 72, N 2.- С. 141.

7. Nechyporenko M.V., Kravchenko S.A., Livshits L.A. Mutation and polymorphisms analysis of the phenylalanine hydroxylase gene in high risk PKU families from Ukrane // European Journal of Human Genetics.-2001.- V. 9, supplement 1.-P. 406.

8. Nechyporenko M.V. Mutations and minihaplotypes analysis of the phenylalaninehydroxylase gene in PKU families from Ukraine // Abstaract of the Conference for students, PhD students and young scientists. – Kyiv (Ukraine).-2001.- P. 154.

Анотації

Нечипоренко М.В. Дослідження мутацій та поліморфізмів послідовності ДНК гена фенілаланінгідроксилази в родинах високого ризику фенілкетонурії. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.26 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2002.

Дисертаційна робота присвячена вивченню молекулярно-генетичної природи фенілкетонурії в Україні.

При виконанні роботи проведено аналіз 140 різних мутацій гена ФАГ. Ідентифіковано 11 різних мутацій і встановлено, що мажорною для популяції України є мутація R408W, частота зустрічальності якої в групі хворих на ФКУ становить 57 %. Інші 10 мутацій зустрічаються з частотою від 0,5 до 3,7 %. Встановлено, що мутація R408W зчеплена з мінігаплотипом VNTR03/STR238, що вказує на одноподійне виникнення та балто-слав`янське походження цієї мутації в Україні. Показано асоціацію мажорної мутації R408W з "класичною" формою захворювання. Виявлено модифікуючу взаємодію мутацій різної природи гена ФАГ на формування клінічного фенотипу при розвитку фенілкетонурії.

Розроблено стратегію використання прямого аналізу мутацій гена ФАГ, а також аналізу зчеплення мутантного гена з STR- та VNTR-поліморфними маркерами для пренатальної діагностики фенілкетонурії.

Ключові слова: фенілкетонурія, ген фенілаланінгідроксилази, мутація, поліморфізм.

Нечипоренко М.В. Исследование мутаций и полиморфизмов последовательности ДНК гена фенилаланингидроксилазы в семьях высокого риска фенилкетонурии. –Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.26 – молекулярная генетика. – Институт молекулярной биологии и генетики, Киев, 2002.

Диссертационная работа посвящена изучению молекулярно-генетической природы фенилкетонурии в Украине.

В ходе выполнения данной работы был создан банк лейкоцитарной ДНК больных фенилкетонурией, членов их семей и лиц, принимавших участие в программе генетического тестирования (458 образцов).

Впервые в Украине проведен анализ происхождения, спектра и частоты встречаемости мутаций гена ФАГ у больных фенилкетонурией. Проскринировано 140 различных мутаций известных к 2001 году и локализованных в 1-м, 3-м, 5-м, 7-м, 11-м, 12-м экзонах и 10-м, 12-м интронах. Установлено, что мажорной для популяции Украины является мутация R408W, частота встречаемости которой в группе больных ФКУ составляет 57 %. Кроме R408W были выявлены мутации R158Q (5-й экзон), R252W, P281L, R261Q, G272X, S273F (7-й экзон) Y414C, R413P (12-й экзон), , Ivs10nt546 (10-й интрон), Ivs12nt1 (12-й интрон) частота которых варьирует от 0,5 до 3,7 %. Таким образом, мутации были идентифицированы нами на 73% мутантных хромосом.

Проведен сегрегационный и популяционный анализ интрагенных VNTR- и STR-полиморфизмов гена ФАГ. Идентифицировано 7 аллельных вариантов для VNTR-полиморфизма и 8 для STR-полиморфизма. Комбинация VNTR- и STR-полиморфизмов позволила изучить ассоциацию мутаций с минигаплотипами гена ФАГ в результате чего было установлено, что в популяции Украины мутация R408W сцеплена с минигаплотипом VNTR03/STR238. Эти данные подтверждают выдвинутое ранее предположение об едином балто-славянском происхождении этой мутации с последующим распространением путем эндемической диффузии в славянских популяциях. Анализ сцепления других мутаций гена ФАГ с минигаплотипами показал, что мутации R158Q, P281L и R252W ассоциированы с несколькими минигаплотипами, что может указывать на их независимое происхождение путем рекурентного мутационного процесса.

Одной из задач данной работы было изучение ассоциации генотипа и фенотипа у больных ФКУ. Было показано, что мутация R408W в гомозиготном состоянии ассоциирована с "классической" формой ФКУ. При сочетании в генотипе больного разных мутаций мы наблюдали формирование широкого спектра клинических проявлений, что, возможно, указывает на существование некоторого модифицирующего эффекта, возникающего при взаимодействии в тетрамере белка ФАГ разных мутантных субъединиц.

Полученные результаты имеют широкое практическое применение. Во-первых нами установлена высокая информативность ДНК-анализа мутации R408W для диагностики ФКУ в Украине.

Разработана стратегия использования прямого анализа мутаций гена ФАГ, а также анализа сцепления мутантного гена с высокоинформативными ДНК-полиморфными маркерами для пренатальной диагностики, массового и селективного скрининга гетерозиготных носителей мутантных генов с целью профилактики этого тяжелого наследственного заболевания в Украине.

Ключевые слова: фенилкетонурия, ген фенилаланингидроксилазы, мутация, полиморфизм.

Nechyporenko M.V. Phenylalanine hydroxilase gene mutations and polymorphisms analysis of high risk phenylketonuria families. - Мanuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.26 – molecular genetics. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2002.

The dissertation is devote to studing for the molecular basis of phenylketonuria (PKU) in Ukraine. During performance of work the analysis of 140 different mutations of a PAH gene was carried out. It was identified 11 different mutations and it was shown that a major role in determining of PKU in Ukraine could play mutation R408W, because this mutation were found in 57 % of PKU chromosomes. Others 10 mutations meet frequency from 0,5 up to 3,7 %. There is established, that mutation R408W is linked with minihaplotype VNTR 03-STR238. Therefore the present data support the single founding event of mutation R408W and Balto-Slavonic origin of this mutation in Ukraine. There is established the association of R408W with the