НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

МАШКОВСЬКА СВІТЛАНА ПЕТРІВНА

УДК 582.998.16:581.192

АЛЕЛОПАТИЧНІ ТА БІОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ

ВИДІВ РОДУ ЧОРНОБРИВЦІ (TAGETES L.)

03.00.12 – фізіологія рослин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі алелопатії Національного ботанічного саду імені М.М. Гришка НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

ГОЛОВКО Ераст Анатолійович

Національний ботанічний сад

імені М.М. Гришка НАН України

завідувач відділу алелопатії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

МУСАТЕНКО Людмила Іванівна

Інститут ботаніки імені М.Г. Холодного НАН України,

завідувач відділу фітогормонології

доктор біологічних наук, професор,

СІРЕНКО Лідія Акимівна

Інститут гідробіології НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу екологічної фізіології водних рослин

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Захист відбудеться “ 17 ” жовтня 2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.212.01. при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ-22, вул. Васильківська, 31/17, тел. 263-51-50.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

Автореферат розісланий “ 13 ” вересня 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Труханов В.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним із актуальних напрямів сучасної біології є дослідження алелопатичних і біохімічних особливостей інтродукованих рослин, які започатковані А.М. Гродзинським (1965, 1973,1991) та його учнями (Биляновская,1992; Головко,1984; Горобец, Назаренко, 1992; Крупа, Дзюбенко,1982; Мороз,1990). Над вирішенням цієї проблеми сконцентровані зусилля зарубіжних авторів (Rice,1984; Rizvi,1992, Willis, 1996). Сучасний рівень вивчення флори України потребує пошуку нових природних регуляторів росту і розробки ефективних біологічних способів їх захисту від шкідників, бурянів, хвороб тощо.

У зв’язку з цим важливе науково-практичне значення мають представники родини Айстрових (Складноцвітих) Astereaceae Dum. (Compositae Gisek), зокрема роду Чорнобривці (Tagetes L.) – квітково-декоративні (Бендик,1992, Киселев,1992), ефіроолійні (Касумов,1982, Солдатченко, Кащенко, Пидаев,2001; Zygadlo,1995) та лікарські (Вакуленко,1981, Калошна, Мазулин,1992) рослини ландшафтної архітектури. Найважливішими їх характеристиками є тривалий період цвітіння, стійкість до фітопатогенів, невибагливість до грунтово-кліматичних умов, бактерицидні, фунгіцидні, нематоцидні властивості (Петрова,1955; Кокс,1994; Jimener,1990; Meches, Gaspar,1993; Tereschuk,1995), які не повною мірою використовуються в рослинництві та зеленому будівництві.

Незважаючи на значну господарську цінність представників роду Tagetes, їх фізіолого-біохімічні властивості та причинно-наслідкові зв’язки складових алелопатичного потенціалу з позицій системного підходу практично не вивчалися. У літературі існує лише фрагментарна інформація щодо біохімічного складу кореневих виділень (Benavides,1994; Campbell,1980;Tang, Wat, Towers,1987; Mukundan, Hjortsy,1991) та вторинних метаболітів (Delivers, Grarbers, Laurier; Israilev,1993; Zygadlo, Guzman, Gross,1994) деяких видів Tagetes. У зв’язку з активною інтродукцією чорнобривців в Україні, важливим є вивчення їх алелопатичних особливостей, що визначають їх взаємовідносини з вищими рослинами, ґрунтовою та епіфітною мікрофлорою. Одним з ключових механізмів таких взаємовідносин є леткі та водорозчинні екзометаболіти рослин, які продукуються в навколишнє середовище. Тому актуальним є вивчення біохімічного складу летких і водорозчинних алелопатично активних речовин, можливостей їх використання як фітосанітарних рослин, виявлення перспективних видів-донорів для розробки нових екологічно чистих та економічно дешевих фіторегуляторів росту вищих рослин. Теоретична і практична значущість зазначеної проблеми та її актуальність обумовила вибір теми дисертаційної роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконувалась у відповідності до плану науково-дослідних робіт відділу алелопатії Національного ботанічного саду ім. М.М. Гришка НАН України за темою “Алелопатично активні сполуки вищих рослин та мікроорганізмів: скринінг, ідентифікація та створення на їх основі природних фіторегуляторів”, номер державної реєстрації 0198U000781.

Мета і завдання досліджень. Метою даної робити було виділити й ідентифікувати фізіологічно активні сполуки екзометаболітів інтродукованих видів роду Tagetes та здійснити їх алелопатичний аналіз. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

-визначити алелопатичну активність водорозчинних і летких екзометаболітів різних органів та ризосферного ґрунту T. erecta, T. patula, T. signata протягом онтогенезу рослин;

-дослідити алелопатичну активність пожнивно-кореневих решток T. erecta, T. patula, T. signata;

-зясувати хімічну природу екзометаболітів видів Tagetes та продуктів їх трансформації у ризосферному ґрунті;

-оцінити біологічну (фітонцидну, алелопатичну) активність виділених речовин;

-виявити залежність між алелопатичним потенціалом рослин і таксономічним та кількісним складом ґрунтової мікрофлори;

-обґрунтувати перспективність використання екзометаболітів T.erecta, T. patula, T. signata для розробки фіторегуляторів росту вищих рослин та мікроорганізмів.

Об’єкт дослідження – інтродуковані в Національному ботанічному саду імені М.М. Гришка НАН України види роду Чорнобривці (Tagetes L.): чорнобривці прямостоячі (Tagetes erecta L.), чорнобривці розлогі (T. patula L.), чорнобривці відзначені (T. signata Bartl.).

Предмет дослідження: кількісне і якісне визначення алелопатично активних речовин видів Tagetes erecta, T. patula, T. signata , їх надходження, нагромадження та перетворення в ґрунті під дією мікроорганізмів, а також виявлення впливу цих сполук на вищі рослини та мікроорганізми.

Методи досліджень: системний підхід у дослідженні з використанням алелопатичних, біохімічних та мікробіологічних методів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено динаміку біосинтезу і виділення в навколишнє середовище алелопатично активних сполук (фенолкарбонових кислот, флавоноїдів, амінокислот та ефірних олій) надземними органами і кореневими системами T. erecta, T. patula й T. signata. Вперше ідентифіковано нові, раніше не описані для досліджених видів, флавоноїди і визначено кількісний та якісний склад фенолкарбонових кислот. Проведено оцінку алелопатичної і фітонцидної активності екзометаболітів рослин. Досліджено мікробіологічні та біохімічні властивості ґрунту ризосфери видів Tagetes. Доповнено літературні дані стосовно перспектив використання інтродукованих видів Tagetes як фітосанітарних культур.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють уявлення про фізіолого-біохімічні властивості представників роду Tagetes. Обґрунтовано перспективність використання видів Tagetes для оздоровлення ґрунту після вирощування айстр, гладіолусів і лілій, а також T. patula та T. signata – для санації приміщень. Показано перспективність вивчення ефірних олій T. patula і T. signata з метою застосування їх у практиці аромотерапії, а ефірної олії T. signata і T. lucida – для розробки фітогербіцидів. Запропоновано рекомендації щодо збору рослинної сировини видів Tagetes для фармацевтичних цілей, що дозволяє вдвічі підвищити її вихід.

Особистий внесок здобувача полягає в оволодінні методами досліджень, опрацюванні даних літератури, підготовці і проведенні експериментів, розробці планів досліджень, обґрунтуванні та статистичній обробці результатів, підготовці до друку наукових робіт. Результати, які викладені у дисертації, отримано здобувачем самостійно.

Апробація результатів дисертаціі. Основні наукові результати були представлені на Всеукраїнській науковій конференції “Екологічна наука і освіта в педагогічних вузах України” (Умань, ), VII молодіжній конференції ботаніків” (Санкт-Петербург, ), VII конференції молодих вчених “Проблеми фізіології та генетики на рубежі третього тисячоліття” (Київ, ), ХІІ Міжнародній науковій конференції “Вивчення онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах і дендропарках Євразії” (Полтава, ), науковій конференції молодих вчених-ботаніків України “Актуальні проблеми ботаніки та екології” (Ніжин, ), ІІ Всеукраїнській конференції молодих вчених “Рослина і середовище” (Харків, ), Міжнародній науковій конференції “Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм” (Тернопіль, ), ІІ Міжнародній науковій конференції молодих дослідників (Умань, 2002), ІІІ з’їзді Українського товариства фізіологів рослин (Тернопіль, 2002), ІІІ Всесвітньому конгресі по алелопатії (Японія, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 робіт, з них 4 статті у провідних фахових виданнях, 4 – у збірниках наукових праць і 5 – тез доповідей.

Структура та об’єм дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, шести розділів, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел ( 295 найменувань, серед яких 120 праць зарубіжних авторів). Робота викладена на 165 сторінках, містить 27 таблиць і 51 рисунок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі, який складається з трьох підрозділів, подано огляд літератури про основні напрямки досліджень в алелопатії. Узагальнено дані стосовно будови та біологічної активності фенольних сполук (фенолкарбонових кислот, флавоноїдів), амінокислот, ефірних олій. На підставі аналізу літературних даних обґрунтована необхідність вивчення алелопатичних та біохімічних особливостей ефіроолійних рослин, зокрема видів роду Чорнобривці (Tagetes L.)

ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктами досліджень обрано інтродуковані в Національнму ботанічному саду імені М.М. Гришка НАН України види роду Чорнобривці: чорнобривці прямостоячі – Tagetes erecta L., чорнобривці розлогі – T.patula L., чорнобривці відзначені– T.signata.

У роботі використовано системний підхід, алелопатичні, біохімічні та мікробіологічні методи досліджень.

Алелопатичні методи досліджень. Алелопатичну активність водорозчинних і летких виділень органів рослин, ґрунту та біологічно активних сполук (фенолкарбонових кислот, флавоноїдів, амінокислот) вивчали методом біотестів (Гродзинский,1991). Алелопатичну активність ефірних олій визначали методом “висячої” каплі (Гродзинский, Головко, Безменов,1992). Тест-об’єктами слугували одноденні проростки крес-салату (Lepidium sativum L.), озимої пшениці м’якої (Triticum aestivum L.) сорту Миронівська 61, гречки звичайної (Fagopyrus Moench) сорту Крупинка та ячменю звичайного (Hordeum vulgare L.) сорту Мир 92., амаранту хвостатого (Amarantus caudatus L.) сорту Кармен, огірка посівного (Cucumis sativus L.) сорту Далекосхідний. Кореневі виділення (ексудати) отримували методом водних культур (Мороз,1990). Донорно-акцепторну взаємодію кореневих виділень проростків видів Tagetes з іншими видами вищих рослин вивчали методом “промивних вод”(Исаева,Савельева, 1982), вирощуючи рослини в лійках Бюхнера на перліті.

Фітотоксичність ґрунту визначали прямим (Гродзинський, Кострома, Шроль, Хохлова, 1990) і модифікованим методом (Гродзинский, Гродзинский, 1973).

Вегетаційні досліди проводили за методикою Журбицького (1968). Вплив рослинних решток видів Tagetes на ризосферний ґрунт квітково-декоративних рослин (айстр, гладіолусів, лілій) вивчали у модельних дослідах при внесенні 3% від маси ґрунту рослинних решток чорнобривців.

Біохімічні методи досліджень. Первинне розділення алелопатично активних речовин видів Tagetes здійснювали шляхом послідовної екстракції залежно від полярності (Mazzuca, Klaiber, Volger,1996). Фенольні сполуки (ФС) з рослинних органів виділяли за методикою (Александрова, Осипова,1985), а з ґрунту – за методикою (Гродзинский, Горобец, Крупа, 1988). Сумарний вміст ФС визначали за допомогою реактиву Фоліна-Чокальте (Гродзинский, Горобец, Крупа, 1988). Виділення вільних фенолкарбонових кислот (ФКК) із рослинної сировини проводили за (Мийдла, Халдре, Сависаар,1975), у ґрунті за (Гродзинский, Горобец, Крупа, 1988). Кількісний і якісний вміст ФКК визначали за методикою (Мийдла, Халдре, Сависаар,1975). Екстракцію та кількісне визначення флавоноїдів проводили за методикою, розробленою Санкт-Петербурзькою хім.-фарм. академією (1998). Розділення флавоноїдів здійснювали за допомогою ТШХ, використовуючи систему бутанол-оцтова кислота – вода 10:1:3, пластинки 15Х15 см “Silufol UV 254” фірми “Kavalier” (Чехія). Візуалізацію плям проводили тетразолієвим бензидином (Гродзинський, Гродзинський, 1973). Ідентифікацію окремих груп флавоноїдів здійснювали з використанням стандартів фірми “Sigma”. Вільні амінокислоти з рослинної сировини екстрагували 80%-ним етанолом (Каманина, 1975), а з ґрунту – водним ацетоном (ацетон : вода=1:2) (Гродзинский, Горобец, Крупа, 1988). Якісний та кількісний склад амінокислот визначали на амінокислотному аналізаторі “Biotronik C-2001”(Німеччина) в режимі фізіологічних рідин. Ефірні олії отримували методом гідродистиляції (Солдатченко, Кащенко, Пидаев, 2001).Кількість хлорофілів а і в та каротиноїдів у листках визначали спектрофотометричним методом (Мусієнко, Паршикова, Славний, 2001), а відносний вміст антоціанів – спектрофотохімічним (Соловьева, 1988).

Мікробіологічні методи досліджень. Груповий склад ґрунтових мікроорганізмів вивчали за методом Возняковської (1980). Антимікробну активність летких екзометаболітів рослин визначали шляхом осаджування мікрофлори повітря, вплив летких виділень рослинних гомогенатів на чисті лінії мікроорганізмів досліджували методом “колодязя”, антибактеріальну та антифунгальну активність ефірних олій вивчали методом “висячої каплі” (Гродзинський, Головко, Безменов, 1992).

Біологічна повторність дослідів 3-4–кратна, аналітична – 8-кратна. Статистичну обробку експериментальних даних здійснено за Лакіним (1990). Cтатистичні помилки в дослідах коливались у межах 5%.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

АЛЕЛОПАТИЧНІ ОСОБЛИВОСТІ T.ERECTA, T.PATULA, T.SIGNATA

Представники роду Tagetes викликають інтерес у фармацевтів (Василенко, Богданов, Фролова, Фролов, 1990, Гарник, Федишин, Войтенко и др.,1992, Калошина, Мазулин,1992, Cucu, Tarpo, 1988), лікарів-фітотерапевтів (Волынец,1994), працівників харчової промисловості (Капелев, 1981; Касумов,1982) та сільського господарства (Бобрук, Драгалин, Влад, 1983) в якостi перспективної сировини. Однак алелопатичні особливості їх практично не досліджувались.

Нами вивчалась алелопатична активність трьох видів роду Tagetes. Донорно-акцепторні функції кожної рослини тісно пов’язані між собою і залежать від фізіологічного стану, фази розвитку, виду рослини та грунтово-кліматичних умов вирощування (Рощина, Рощина, 1989). Для дослідів використовували всі частини рослини, післяжнивні рештки та ризосферний ґрунт.

Алелопатична активність летких виділень. Встановлено (рис.1), що найбільшою алелопатичною активністю відрізнялись леткі виділення листків та суцвіть, але більшу кількість інгібіторів росту містили листки.

Пік алелопатичної активністі летких виділень органів чорнобривців нами зафіксовано у фазі цвітіння (рис. 2), що пов’язано з утворенням в цей період найбільшої кількості ефірних олій.

Алелопатична активність водорозчинних екзометаболітів. Водорозчинні виділення видів Tagetes характеризувались видоспецифічністю та вибірковістю дії. Найчутливішими до дії водорозчинних алелопатично активних сполук рослин були корені крес-салату та амаранту (рис.3). Серед вегетативних органів найактивнішими виявились водорозчинні виділення листків, а найменш активними – коренів. Найбільшою активністю відрізнялися водорозчинні виділення органів T.signata, а найменшою – T.erecta. Відносно активності коренів прослідковувалась зворотна залежність (рис.4).

Протягом вегетаційного періоду нами виявлено два піки підвищення алелопатичної активності водорозчинних виділень листків (рис.5). Перший пік зафіксовано у фазі бутонізації (кінець червня – початок липня), що можна пояснити інтенсивним ростом рослин, активацією метаболічних процесів, максимальним вмістом біологічно активних речовин (БАР) (Осипова,2000).

Приріст коренів крес-салату під впливом водорозчинних виділень листків T.erecta, T.patula, T.signata (розведення 1:50) становив 26,66, 22,88 і 18,50% по відношенню до контролю, а коренів амаранту – 11,66, 6,82 і 4,5 %. Протягом цвітіння, активність зменшувалась і зростала восени по мірі сповільнення ростових процесів, старіння листків і пов’язаного з ним зниження оводненості тканин. На кінець жовтня припадав другий пік активності, який обумовлений переходом стимуляторів росту в неактивну форму (Мороз, Комиссаренко,1983).

На відміну від пасивного виділення БАР, корені рослин активно виділяли екзометаболіти (ексудати), які відіграють важливу роль у формуванні алелопатичного режиму ґрунту (Матвеев, 1994). Нами встановлено, що кореневі ексудати T. erecta стимулювали ріст люпину жовтого, квасолі, чорнобривців прямостоячих; T. patula – квасолі, а T. signata – кукурудзи, чорнобривців відзначених, а кореневі виділення T. erecta гальмували ріст кукурудзи, T. patula –люпину білого.

Важливим джерелом БАР, які надходять в ґрунт, є продукти мінералізації рослинних решток, які залишаються в полі після збору врожаю. Найчутливішими до дії екстрактів рослинних решток чорнобривців були проростки амаранту, крес-салату, гречки; найменш чутливими – корені пшениці, ячменю та огірків. Найбільшу активність проявляли екстракти із надземних частин T.signata, дещо нижчу – T.patula і найнижчу –T.erecta. Так, водні екстракти із решток надземних

Алелопатична активність ризосферного ґрунту. Ґрунт є одним з найважливіших компонентів і посередників в алелопатії (Гродзинскй,1991). Водні витяжки розосферного ґрунту видів Tagetes проявляли нижчу алелопатичну активність, ніж ціла рослина. Протягом вегетації рослин нами зафіксовано 2 піки активності ґрунту, які співпадали з піками активності рослин. Вивчення токсичності ґрунту в кінці вегетації рослин прямим методом і порівняння їх з токсичністю багаторічного пару показало, що ґрунт після вирощування чорнобривців не є токсичним (вирощування проростків крес-салату, озимої пшениці, огірків на ґрунті з-під видів Tagetes супроводжувався стимуляцією росту коренів). Такі ефекти пов’язані з активним функціонуванням ґрунтової мікрофлори, яка сформувалась у ризосфері чорнобривців, в результаті чого відбувалось часткове розкладання та утилізація алелопатично активних речовин.

Враховуючи стимулюючий ефект вирощування видів Tagetes по відношенню до ґрунту, можна вважати, що вони є перспективними культурами для зняття токсичності ґрунтів в агрофітоценозах.

БІОЛОГІЧНО АКТИВНІ СПОЛУКИ T.ERECTA, T.PATULA, T.SIGNATA: АЛЕЛОПАТИЧНЙ АНАЛІЗ

Ключовим питанням алелопатії є дослідження хімічного складу, концентрації та алелопатичної активності колінів (Гродзинський,1991; Rice,1984). Тому одним із етапів досліджень було з’ясування хімічної природи, кількісного вмісту та алелопатичної активності БАР, що входять до складу екзометаболітів рослин T.erecta, T.patula, T.signata і беруть участь в фізіолого-біохімічній взаємодії рослин.

Кількісний склад та алелопатична активність ефірних олій. Серед летких речовин, які продукуються ароматичними рослинами, до алелохімікатів належать ефірні олії (Юрчак, Побірченко,1997). Показано, що найбільша їх кількість нагромаджувалась в надземній частині рослин у фазі масового цвітіння. Найкращим ефіроносієм є T.signata. У фазі масового цвітіння їх вміст був у 2 рази більшим, ніж у T.patula, і в 19 раз -– ніж у T.erecta (табл.1). З’ясування розподілу ефірних олій в органах T.signata показало, що найбільше їх міститься у листках (57,5±2,5 % від загального вмісту), дещо менше – у суцвіттях (41,15±1,5%) і найменше у стеблі (1,35±1,5 %). Ці дані прямо корелюють з алелопатичною активністю летких виділень органів рослин.

Алелопатичну активність ефірних олій T.signata і Т.patula вивчали в газоподібному стані, у вигляді водних та етанольних фракцій (рис.6). Найчутливішими до дії ефірних олій виявились корені крес-салату. Леткі та водні фракції ефірних олій сильніше інгібують ріст тест-об’єктів, ніж спиртові. Ефірні олії Т. patula по відношенню до рослинних тест-об’єктів проявляли більшу активність. Вилучення із рослинної сировини ефірних олій істотно знижувало алелопатичну активність летких виділень. Так, різниця між активністю летких виділень вихідної рослинної сировини і сировини, з якої були вилучені ефірні олії, була для T.signata – 78,41%, для T.patula – 71,61%, для T.erecta – 56,53%. Отримані результати свідчать про те, що алелопатична активність летких виділень рослин значною мірою обумовлена ефірними оліями.

Фізіологічно активні сполуки водорозчинних екзометаболітів. Фенольні сполуки та їх алелопатична активність.Серед водорозчинних алелохімікатів вищих рослин найпоширенішими є фенольні сполуки (ФС) (Запрометов,1993, Мороз, 1990). Нами виявлено найбільшу кількість ФС у листках та водних витяжках листків, а найменшу – у екстрактах тканин коренів чорнобривців . Кількісний вміст та динаміка накопичення ФС в органах видів Tagetes позитивно корелювала з показниками алелопатичної активності їх виділень (рис.7). До складу екзометаболітів рослин входить ряд інших сполук, які разом із ФС впливають на алелопатичну активність рослин. Для того, щоб дослідити в якій мірі ФС визначають алелопатичний потенціал видів Tagetes, нами проведено дослід з обробкою рослинних витяжок поліамідом, який є специфічним сорбентом для ФС. Виявлено (рис.8), що приріст коренів крес-салату на витяжках, оброблених поліамідом значно зростає, що свідчить про зниження їх алелопатичної активності після вилучення фенолів. Фракції ФС інгібують ріст коренів крес-салату, хоча дещо меншою мірою, ніж вихідні витяжки (це пояснюється тим, що деякі феноли незворотно адсорбуються на поліаміді).

Таким чином, алелопатична активність чорнобривців значною мірою обумовлена ФС.

Фенолкарбонові кислоти. Найактивнішими серед природних інгібіторів фенольної природи є фенолкарбонові кислоти (ФКК) (Гродзинский,1991; Rice, 1984).

Дослідження вмісту вільних ФКК (оскільки, саме вільні сполуки є потенційними алелохімікатами) у листках впродовж вегетації рослин показало (табл.2), що найменша різноманітність ФКК притаманна листкам T.patula (фаза 4-6 справжніх листки), а найбільша – T.signata (фаза бутонізації). З листків чорнобривців ми виділили та ідентифікували 14 ФКК. Спільними для всіх видів Tagetes були кавова, галова, гентезинова, ванілінова, м-кумарова кислоти. Для листків T.erecta і T.signata характерна наявність м- і п- оксибензойних кислот, а для T.patula і T.signata – протокатехової кислоти. Специфічними для листків T.erecta була о-кумарова, для T.patula - сирінгова, а для T.signata – г-резорцилова, п-кумарова, ферулова (транс- і цис-) кислоти. Найбільший вміст вільних ФКК був локалізований у листках T.signata, а найменший – T.erecta. Динаміка накопичення вільних ФКК у тканинах листків позитивно корелює з динамікою сумарного вмісту ФС і з динамікою алелопатичної активності водорозчинних виділень листків (див. рис. 5 і 7).

Найчутливішими до дії ФКК чорнобривців були корені амаранту і крес-салату, слабочутливими – колеоптилі пшениці та корені огірка. Алелопатична активність ФКК чорнобривців була вищою по відношенню до росту коренів амаранту, ніж крес-салату (крім хлорогенової кислоти). Огірок і пшениця проявляли однакову чутливість до ФКК, лише гентизинова кислота на 10 %, п-кумарова – на 20%, ферулова – на 14 %, а хлорогенова – на 23% підвищували приріст коренів огірка порівняно з приростом коренів пшениці.

Для з’ясування фізіологічних механізмів дії ФКК на тест-об’єкти ми досліджували цитостатичну активність суми ФКК. Дійшли висновку, що пригнічення ростових процесів рослин значною мірою пов’язане з затримкою мітотичного поділу клітин і подальшим гальмуванням росту коренів.

Флавоноїди. Серед ФС до групи алелопатично активних речовин належать також флавоноїди (Мороз, Комісаренко, 1983). Встановлено, що пік їх нагромадження у листках видів Tagetes припадає на період бутонізації. Лише у листках T.erecta їх кількість на початку вегетації та в період бутонізації знаходилася на одному рівні. Найбільший вміст флавоноїдів виявлено у середніх пробах листків T. patula (10,18± 0,24 % абс. сух. речовини у перерахунку на рутин), тоді як у T.signata (3,64±0,38 %) їх було майже в 3 рази, а у T.erecta (2,01± 0,21%) в 5 разів менше. Суцвіття чорнобривців містили 9,86±0,11, 8,00±0,48 і 1,86±0,64 % флавоноїдів відповідно.

Крім описаних у літературі флавоноїдів для рослин видів Tagetes, нами ідентифіковано у листках та суцвіттях цих рослин ще й такі як кверцетин-3-глікозид, кверцетин-3-рутинозид, кверцетагенин, кверцетин-пентаацетат, кампферол, морин, кверцетрин, кверцетин, рутин.

Алелопатична активність флавоноїдів виявилась нижчою, ніж ФКК, при цьому спостерігалась тенденція до стимулювання росту коренів тест-об’єктів. При концентрації 0,0125 мг/л флавоноїди Т.patula і T.signata стимулювали приріст коренів крес-салату, а флавоноїди T.erecta проявляли індиферентні властивості. При збільшенні концентрацій (0,025 і 0,05 мг/л) флавоноїди Т.signata продовжували стимулювати приріст коренів крес-салату, тоді як відповідні аналоги Т.patula і T.erecta виявляли гальмувальну дію. Таким чином, найбільшу рістінгібуючу активність по відношенню до росту коренів крес-салату проявляли флавоноїди T.erecta, дещо нижчу – Т.patula і індиферентну – T.signata. Цитостатична активність суми флавоноїдів усіх трьох видів Tagetes була слабо вираженою, що пов’язано з їх мембраностабілізуючими властивостями (Запрометов,1992).

Динаміка накопичення вільних амінокислот у листках та кореневих ексудатах. До алелохімікатів відносяться також амінокислоти, оскільки вони виявляють фізіологічну дію на системи життєзабезпечення рослин (Гродзинський,1991; Стефанский,1992) Амінокислоти надходять у ґрунт разом з кореневими екзометаболітами і вимиваються з надземних частин рослин. У зв’язку з цим, ми вивчали динаміку вмісту вільних амінокислот у листках та у складі кореневих виділень видів Tagetes.

З’ясовано (табл.3), що загальна кількість амінокислот була найвищою у листках T.signata, меншою у листках T. patula і T. erecta. Отримані результати узгоджуються з даними про алелопатичну активність листків (див. рис.5). Найбільша кількість вільних амінокислот містилась в листках у фазі 4-6 справжніх листків, а у фазі цвітіння їх було найменше, що пов’язано із включенням їх у біосинтез білків. Щодо якісного вмісту амінокислот, то їх різноманітність була незначною. У листках T. erecta і T. patula нами ідентифіковано лише 4 , а T.signata – 6 вільних амінокислот. Серед них виявлені водорозчинні кислоти (аспарагінова кислота, гліцин, гістидин) та важкорозчинні чи нерозчинні у воді амінокислоти (валін, фенілаланін, лейцин) , при чому останніх було менше, ніж перших.

Якісний склад амінокислот кореневих ексудатів був різноманітнішим, ніж у листках. Корені чорнобривців виділяли лізин, гістидин, гліцин, тирозин, аспарагінову та глутамінову кислоти. У складі кореневих ексудатів T. patula і T. signata також виявлено лейцин. Cпецифічними для кореневих ексудатів T. patula були аланін, а для T. signata – фенілаланін, а також вони містили велику кількість тирозину, що відіграє важливу роль в утворенні ФС. Найбільшу кількість амінокислот виділяли корені T.erecta (114,99 мкг/г сухої маси коренів) і T.signata (70,02 мкг/г ) у фазі 4–6 справжніх листків, а корені T.patula (150,07 мкг/г) – у фазі бутонізації. В період цвітіння корені рослин виділяли найменшу кількість амінокислот.

Таким чином, листки і кореневі ексудати T.erecta, T.patula, T.signata містять амінокислоти, серед яких переважають водорозчинні (найактивніші в алелопатичному відношенні). Кількісний вміст вільних амінокислот у листках корелював з їх алелопатичною активністю. Отже, на алелопатичний потенціал видів Tagetes, особливо на ранніх етапах розвитку, суттєво впливають амінокислоти. На відміну від ФС, вони не є стійкими у ґрунті і зазнають сильного впливу з боку ґрунтової мікрофлори.

БІОХІМІЧНИЙ ТА МІКРОБІОЛОГІЧНИЙ СКЛАД ҐРУНТУ

ПРИ ВИРОЩУВАННІ ВИДІВ TAGETES

Алелопатично активні сполуки рослин, надходячи у ґрунт зазнають певних змін, які зумовлені найчастіше впливом ґрунтової мікрофлори (Головко,1984). Нами показана метаболізація алелопатично активних речовин (ФС, ФКК, амінокислот) та динаміка розвитку основних груп мікроорганізмів (спороутворючих, неспороутворюючих бактерій, грибів, стрептоміцет) у ризосфері видів Tagetes.

Встановлено, що у ризосфері чорнобривців формується агрономічно корисна мікрофлора. Так, у ґрунті під рослинами вміст азотобактера, який є одним з показників родючості ґрунту, був в 1,5 – 2 рази більшим, ніж у контрольному варіанті. Збільшення вмісту споро- та неспороутворюючих бактерій (кількість яких залежить від наявності легкодоступних органічних речовин) та зменшення кількості грибів і стрептоміцетів (які здатні розкладати важкодоступні сполуки ґрунту і утворювати токсини) у ґрунтовому середовищі досліджуваних рослин свідчить про спрямовану зміну мікробіологічних процесів в ґрунті під чорнобривцями. Це зумовлено зменшенням кількості складних органічних сполук та фітотоксичних речовин у ризосфері досліджуваних видів.

Отримані нами результати свідчать, що ґрунт після вирощування видів Tagetes не є фітотоксичним. Ми розглядаємо таке явище як позитивне в алелопатичному плані, тому наші подальші дослідження були спрямовані на виявлення можливостей використання алелопатичного потенціалу чорнобривців.

ФІТОСАНІТАРНА РОЛЬ ЕКЗОМЕТАБОЛІТІВ ВИДІВ TAGETES

Фітонцидна активність летких екзометаболітів видів Tagetes. Актуальною проблемою фітофізіології є розробка теоретичних принципів і практичних методів оздоровлення біосфери за рахунок дії фітонцидів. Виявлення високої алелопатичної активності летких екзометаболітів видів Tagetes послужило основою для вивчення їхньої оздоровлюючої дії на довкілля, яка забезпечується збагаченням леткими лікувальними (захисними) речовинами, зниженням токсикантів і зменшенням кількості патогенних мікроорганізмів (Крючков, Новоселова, Степанова, Семенова,1985). Виходячи з цього, ми вивчали вплив фітонцидів видів Tagetes на кількісний склад мікрофлори повітря, ріст і розвиток окремих мікроорганізмів. Показано, що на чашках Петрі (з поживним середовищем) з повітря у приміщенні, де вирощувались контейнерним способом чорнобривці, висівалось приблизно на 20–40% менше мікроорганізмів, ніж у контрольному варіанті (рослини не виставлялись). Леткі екзометаболіти T. patula і T. signata проявляли вищу антимікробну активність, ніж T. erecta. Дослідження фітонцидної активності гомогенатів листків та суцвіть чорнобривців показало, що найсильнішою антагоністичною дією володів гомогенат трьох видів Tagetes на культуру Sarcina flava, Pseudomonas aeruginosa та Staphylococcus aureus, дещо меншою – на Micrococcus albus, Mucor mucedo, Escherichia coli, Bacillus subtilis. По відношенню до культури Micrococcus roseus фітонциди видів Tagetes проявляли індиферентну дію. Антимікробна активність фітонцидів чорнобривців зафіксована як проти грампозитивних (Micrococcus albus, Sarcina flava, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) так і грамнегативних (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) бактерій, а також мікроскопічних грибів (Mucor mucedo), що свідчить про широкий діапазон їх антимікробної дії. Активність гомогенату листків була вищою, ніж суцвіть. Отримані дані прямо корелювали з алелопатичною активністю летких виділень надземних органів рослин (див. рис.1). Оскільки, алелопатична активність летких екзометаболітів чорнобривців значною мірою визначається ефірними оліями, ми досліджували їх антимікробну активність. Встановлено (табл. 4), що ефірні олії T. patula і T. signata проявляли однакову активність, лише за концентрації 5 мкг/м3ефірна олія T. patula проявляла більшу активність по відношенню до Fusarium solani, а T. signata – по відношенню до Pseudomonas aeruginosa, а за концентрації 25 мкг/м3 ефірна олія T. signata суттєвіше пригнічувала ріст і розвиток Mucor mucedo, Bacillus subtilis та Staphilocoсcus aureus. Ефірні олії T. patula і T. signata (за концентрації 25 мкг/м3) повністю гальмували розвиток Pseudomonas aeruginosa, Fusarium solani, Aspergillus niger і Aspergillus flavus, водночас затримували ріст і розвиток Staphilococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, стимулювали ріст і розвиток грибів роду Penicillium. Очевидно, останні використовують леткі фракції ефірних олій даних видів у трофічних цілях. В післядії антимікробний ефект зменшувався, однак зберігався по відношенню до Pseudomonas aeruginosa, Fusarium solani, Aspergillus niger та Aspergillus flavus. Оскільки, ці мікроорганізми належать до фітопатогенної мікрофлори, то для регулювання їхнього вмісту у агрофітоценозах можна рекомендувати рослини видів T. patula і T. signata.

Біологічна активність рослинних решток по відношенню до ґрунту. Безвідходний спосіб вирощування чорнобривців передбачає раціональне використання рослинних решток, які залишаються у полі після збору промислової сировини. При мінералізації рослинних решток утворюються речовини з високою біологічною активністю, що спричиняють значний вплив на ґрунтові мікроорганізми, в т.ч. на фітопатогенні гриби, які потрапляють у ґрунт з ураженими частинами рослин (Пурсиянова,1987).

Примітки:

1. Оцінка антимікробної активності подана в балах (0 – стимулююча дія, 1 –нейтральна, 2 – слабке інгібування, 3 – середнє інгібування, 4 – сильне інгібування).

2. Перед рискою – дія ефірних олій після 3 діб інкубації, під рискою – післядія через 7 діб.

В літературі є недостатньо даних стосовно біологічних шляхів оздоровлення ґрунту під квітково-декоративними рослинами. Серед них є такі, що часто ушкоджуються збудниками грибкових захворювань (Геельхар, Коев, Бухар, Клешнина, 1990). Так, практика квітникарства свідчить, що айстри, гладіолуси і лілії, які використовуються в зеленому будівництві, не можна вирощувати два роки підряд на одному місці, оскільки у ґрунті накопичуються токсичні речовини, в результаті чого рослини втрачають свою декоративність, знижується їх врожайність тощо.

Накопичення фітотоксичних сполук пов’язують, головним чином, з діяльністю деяких фітопатогенних мікроорганізмів, зокрема грибів, які інтенсивно розвиваються при вирощуванні рослин. Тому, актуальним є пошук шляхів регенерації ґрунту, які б знижували його токсичність та кількість фітопатогенних грибів. Використання біологічних методів захисту рослин дозволяє скоротити застосування таких небажаних в умовах населених пунктів пестицидів, а також посилити ефективність агротехнічних прийомів, зокрема сівозмін. Залучення рослин з високою антибіотичною активністю відкриває нові можливості для створення стійких до фітопатогенів насаджень. Серед різних комплексів біологічно активних сполук найвираженішими фунгіцидними і фунгістатичними властивостями володіють ФС та ефірні олії (Георгиевский, Комиссаренко, Дмитрук, 1990). Це послужило підставою до вивчення впливу рослинних решток видів Tagetes на фітопатогенні гриби ґрунту, які накопичуються при вирощуванні айстр, гладіолусів і лілій.

Виходячи з цього, нами випробувано дію рослинних решток видів Tagetes на фітопатогенні ґрунтові мікроміцети, які накопичуються при вирощуванні вище зазначених квітково-декоративних рослин. Показано, що в ґрунті знижувався вміст грибів, ФКК та підвищувалась кількість вільних амінокислот. Внесення рослинних решток чорнобривців у кількості 3% від маси ґрунту, призводило до зняття фітотоксичності ґрунту, яка виникала при вирощуванні айстр, гладіолусів і лілій.

Таким чином, використання в культурозміні чорнобривців або заорювання у ґрунт, на якому вирощувались айстри, гладіолуси чи лілії рослинних решток чорнобривців сприяє посиленню фунгистазису у ґрунті і тим самим поліпшенню його фітосанітарного стану. Найперспективнішим в плані зниження фітотоксичності ґрунту виявився вид T. patula.

Екзометаболіти видів Tagetes як перспективні фітогербіциди. В серії дослідів нами показано пригнічуючий вплив рослинних решток, ФКК, ефірних олій видів Tagetes на ріст і розвиток пирію повзучого. Найбільшу алелопатичну чутливість пирій виявляв до ефірних олій. До ФКК він виявився відносно толерантним. Серед видів-донорів виділені види T.і T., які можуть бути застосовані для алелопатичного контролю пирію повзучого та розробки фітогербіцидних препаратів.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Збір рослинної сировини видів Tagetes для фармацевтичних цілей пропонується здійснювати у фазі бутонізації.

2. Для санації закритих приміщень рекомендується використання рослин видів T. patula і T. signata. Для зменшення кількості фітопатогенних асоціацій ґрунтових мікроорганізмів – Fusarium solani, Aspergillus niger і Aspergillus flavus – запропоновані ефірні олії T. patula й T. signata.

3. Для оздоровлення ґрунтів після вирощування айстр, гладіолусів і лілій запропоновано мульчування рослинних решток виду T. patula.

4. Для створення фітопрепаратів з гербіцидною дією для боротьби з пирієм повзучим рекомендуються види T. signata і T. lucida.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Головко Е.А., Машковська С.П. Динаміка алелопатичної активності деяких видів Tagetes L. // Наукові записки Тернопілького державного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка. Серія: Біологія. – 1999. - №3 (6). – С.22-26.

2. Пида С.В., Машковська С.П. Донорно-акцепторна взаємодія між кореневими ексудатами проростків деяких видів Tagetes L. і Lupinus L.// Наукові записки Тернопільського державного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка. Серія: Біологія. – 1999. - №4 (7). – С.32-36.

3. Машковська С.П. Алелопатичні особливості інтродукованих видів Tagetes L.// Інтродукція рослин. – 2000. – №1. – С.56-59.

4. Машковська С.П. Морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості представників роду Tagetes L.// Науковий вісник Ужгородського національного університету. Серія: Біологія. – 2001. - № 9. – С.189-194.

5. Головко Е.А., Машковська С.П. Алелопатичне дослідження ґрунту при вирощуванні видів Tagetes L.// Матеріали Всеукр. наук. конф. “Екологічна наука і освіта в педагогічних вузах України”. – Умань: Наук. світ, 2000. – С.126-128.

6. Машковська С.П. Донорно-акцепторна взаємодія між кореневими ексудатами проростків деяких видів Tagetes L., Triticum L. i Zea L.// Матеріали XII Міжнар. конф. “Вивчення онтогенезу рослин природних і культурних флор у ботанічних закладах та дендропарках Євразії”. – Полтава: “Terra”, 2000. – С.209 – 212.

7. Машковська С.П. Фенолкарбонові кислоти видів роду Tagetes L. // Матеріали Міжнар. конф. молодих вчених “Рослина і середовище”(26-28 вересня 2001 р., Харків). – Харків. – 2001. – С.92-94.

8. Машковська С.П. Ризосферна мікрофлора деяких видів Tagetes L.// Матеріали Міжнар. наук. конф. “Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм” (1-4 жовтня 2001 р., Тернопіль). – Тернопіль: Вид-во Тернопільського державного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка, 2001. – С.218 – 221.

9. Машковская С.П. Аминокислотный состав почвы под некоторыми видами Tagetes L.// Тез. VII Молодежн. конф. ботаников в С.-Петербурге