Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

Медведєва Юлія Володимирівна

УДК 612.811.3 + 612.83

Гальмівні постсинаптичні струми в нейронах спінальних гангліїв, культивованих разом з нейронами спинного мозку.

03.00.13 – фізіологія людини та тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Міжнародному Центрі молекулярної фізіології НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук Веселовський М.С., професор, завідуючий лабораторією синаптичної передачі Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук Сторожук В.М., професор, завідуючий відділом фізіології головного мозку інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Кандидат біологічних наук Пархоменко М.Т., провідний науковий співробітник відділу нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України

Провідна установа: НДІ фармакології та токсикології АМН України, Державний фармакологічний Центр МОЗ України

Захист відбудеться 24.12.2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

Автореферат розісланий 20 листопада 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ганглії дорсальних корінців спинного мозку (спінальні ганглії) знаходяться на межі периферичної і центральної нервової системи і беруть участь у регуляції багатьох важливих функцій організму. Нейрони спінальних гангліїв є первинною сенсорною ланкою і проводять у центральну нервову систему значну частину сенсорної інформації. Однак дотепер повністю не вирішене питання, чи відбувається в нейронах спінальних гангліїв будь-яка обробка інформації, або нервові імпульси надходять через них у ЦНС без змін. Тому не викликає сумнівів велике теоретичне і практичне значення вивчення участі первинних афферентних нейронів соматосенсорної системи в передачі сенсорної інформації .

До теперішнього часу на сомі і відростках нейронів спінальних гангліїв була виявлена більшість з відомих типів потенціалкерованих іонних каналів [Kostyuk et al., 1981, Kameyama, 1983] і, більш того, значна частина відомих на сьогодні рецепторів [Koketsu et al., 1969, Krishtal et al., 1983, Todorovic and Anderson, 1992, Sato et al., 1993, Molokanova and Tamarova, 1995, Kerchner et al., 2001]. Варто звернути увагу на деякі особливості будівлі сенсорних нейронів. У спінальних гангліях, крім класично відомих псевдоуніполярних нейронів, існують біполярні клітини і мультиполярні з тонким аксоном і товстими короткими дендритами. Можна також зазначити, що й у псевдоуніполярних нейронів крім основного псевдоуніполярного відростка від соми може відходити кілька тонких коротких нейритів [Dogiel, 1908].

Під час электронномікроскопічних досліджень на сомі нейронів спінальних гангліїв у культурі й у зрізах були виявлені синаптичні структури [Kayahara T.,1986, Miller K. et al., 1970]. Дослідження, проведені Екклсом із співр. [Eccles et al., 1961, Eccles et al., 1962, Экклс, 1966], а пізніше Шмідтом [Schmidt, 1971], показали, що в пресинаптичних закінченнях первинних афферентних волокон може виникати тривала деполяризація, що призводить до зниження ефективності передачі нервового імпульсу. Була висунута гіпотеза про те, що пресинаптична деполяризація є механізмом пресинаптичного гальмування синаптичної передачі; структурно-функціональною одиницею такого гальмування є аксо-аксонний синапс, який розташований на пресинаптичній терминалі.

Грунтуючись на викладених вище фактах, можна зробити припущення, що на нейронах спінальних гангліїв можуть існувати функціональні синапси, що беруть участь у первинній обробці сенсорних сигналів. Наша робота присвячена експериментальній перевірці цієї гіпотези.

Для виконання поставленого завдання ми розробили методику спільного культивування клітин спінальних гангліїв і спинного мозку. Така дисоційована культура нейронів є зручною моделлю для вивчення синаптичних зв`язків і відкриває ряд можливостей: на такій культурі можна досліджувати вибрану окрему пару нейронів, візуально ідентифікувати їх тип, локально стимулювати окремий нейрон спинного мозку і локально аплікувати той чи інший агент на обмежену площину, яку займає досдіджувана пара нейронів.

Мета і задачі дослідження. Метою нашого дослідження було вияснити, чи можуть утворюватися функціональні гальмівні синапси на нейронах спінальних гангліїв. Для досягнення даної мети були поставлені такі задачі.

1. Розробити методику спільного культивування нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку.

2. З використанням методу “patch-clamp” у режимі фіксації потенціалу на цілій клітині, методу локальної позаклітинної стимуляції і методу швидкої локальної суперфузії зареєструвати спонтанні і викликані постсинаптичні струми в нейронах спінальних гангліїв та вияснити їх кінетичні і фармакологічні властивості.

3. Дослідити зміни кінетичних характеристик спонтанних і викликаних постсинаптичних струмів у нейронах спінальних гангліїв у процесі росту нейронів у спільній культурі.

Новизна отриманих результатів. Розроблено оригінальну методику спільного культивування нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку. Така диссоційована культура дозволила дослідити механізм синаптичної передачі на рівні однієї пари нейронів, що є моделлю первинної сенсорної ланки. Вперше досліджені кінетичні і фармакологічні властивості постсинаптичних струмів в нейронах спінальних гангліїв. Показано, що ці струми виникають у процесі активації хлорних каналів ГАМКА-рецепторів. Таким чином вперше встановлено, що в змішаній культурі нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку на нейронах спінальних гангліїв можуть утворюватися функціональні гальмівні синапси.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Виявлено, що нейрони спинного мозку в умовах культури можуть утворювати функціональні гальмівні синапси на нейронах спінальних гангліїв. Не виключено, що за допомогою цих синапсів вже на рівні первинних сенсорних нейронів здійснюється інтеграція сенсорній інформації, що надходить до ЦНС .

Результати дослідження мають очевидне значення для з'ясування механізму проведення сенсорної інформації від рецепторів до спинного мозку, що дуже важливо для розуміння походження багатьох нейропатологічних процесів: ноцицептивних синдромів, вазомоторних і трофічних порушень.

Внесок здобувача. Здобувачем була розроблена методика культивування нейронів спінальних гангліїв разом з нейронами спинного мозку, проведені всі електрофізіологічні експерименти й обробка експериментального матеріалу. Здобувач брав активну участь в обговоренні отриманих результатів і формулюванні висновків. Уперше здобувачем було показано, що в диссоційованій змішаній культурі нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку нейрони спинного мозку можуть формувати функціональні гальмівні синапси на нейронах спінальних гангліїв.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на семінарах сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця (Київ, 1998 – 2001); а також на наступних наукових конференціях: симпозіум для молодих фізіологів “Membranes and signaling” (Київ, 4-8 вересня 2000 р.); II конференція Українського товариства нейронаук, присвячена 70-річчю кафедри фізіології ДонДМУ ім. М.Горького (Донецьк, 23-27 травня, 2001 р.).

Публікації. За результатами роботи опубліковано три статті та тези однієї доповіді.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 143 найменувань. Робота викладена на 135 сторінках та містить 27 рисунків.

Основний зміст дисертації.

Матеріали та методи досліджень.

Приготування змішаної культури дисоційованих клітин спинного мозку та спінальних гангліїв. Первинна культура нервових клітин була отримана від новонароджених щурів лінії Вістар. Після обробки 0,1%-им розчином пронази Е в мінімальному середовищі Ігла з додаванням 20 мМ HEPES спінальні ганглії механічно диспергували за допомогою Пастерівських піпеток. Спинний мозок обробляли 0,025%-їм розчином трипсину, після чого механічно дезагрегували за допомогою пластикових піпеток. Отримані суспензії клітин висаджували на покриті полі-L-орнітином денця чашок Петрі. Нейрони культивувалися протягом трьох тижнів при 37єС у мінімальній середі Ігла з додаванням 10% кінської сироватки, інсуліну (6 мкг/мл) та антибіотиків в атмосфері, що містила 5% СО2.

Реєстрація викликаних і спонтанних постсинаптичних струмів. Електрофізіологічні дослідження проводилися на 7-20-й дні розвитку клітин в культурі. Ідентифікація нейронів спінальних гангліїв та спинного мозку здійснювалася візуально з застосуванням фазового контрасту при збільшенні 320.

Викликані та спонтанні постсинаптичні струми в нейронах спінальних гангліїв реєструвалися з використанням методики “петч-клемп” у конфігурації “ціла клітина”. Базовий позаклітинний розчин містив (у мМ): NaCl – 140, KCl – 3, CaCl2 – 2, MgCl2 – 2, HEPES – 20, глюкоза – 30, рН=7,4. Позаклітинний розчин містив блокатори НМДА- та неНМДА-рецепторів – DNQX та D-L-APV у кількості 20 мкМ кожний, а також блокатори ацетілхолінових никотинових та мускаринових рецепторів тубокурарін (20 мкМ) та атропін (2 мкМ). Для заповнення петч-піпетки використовувався розчин наступного складу (у мМ): К-глюконат – 100, KCl – 50, MgCl2 – 10, EGTA – 10, HEPES – 20, pН=7,4. Скляні мікропіпетки виготовлялися з боросилікатного скла. Зовнішній діаметр кінчика піпеток мав діаметр 2-3 мкм, опір петч-піпетки складав 3-6 МОм. Стимуляція пресинаптичної клітини (нейрону спинного мозку) здійснювалася позаклітинно з частотою 0,25 с-1 за допомогою скляної піпетки, заповненої позаклітинним розчином (приблизно того ж діаметру що і петч-піпетка).

Аплікація блокатора гальмівних постсинаптичних струмів. Для ідентифікації рецепторів, що беруть участь у синаптичній передачі, здійснювалася швидка локальна суперфузія області досліджуваної пари нейронів [Veselovsky et al., 1996] розчином, який містив 20 мкМ блокатора ГАМКА-рецепторів бікукулліну.

Обробка одержаних результатів. Аналіз даних виконувався з використанням аналітичних програмних продуктів (pClamp 6.0, pClamp 8.0, Axon Instruments; Origin 4.1, Microcal Software). Статистична обробка результатів здійснювалася за допомогою дисперсійного аналізу (ANOVA), а також з використанням критерію Манна-Уітні з коефіцієнтом значимості 0,01, побудова графічного матеріалу - за програмою PageMaker 6.5.

Результати досліджень.

Морфологічні особливості нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку, що розвиваються в умовах змішаної культури. На 7-й – 8-й день культивування більшість нейронів спинного мозку і спінальних гангліїв можна було візуально ідентифікувати під світловим мікроскопом (фазовий контраст, збільшення 320). Округлі соми нейронів спінальних гангліїв інтенсивно опалесціювали, у той час як менш правильні за формою соми нейронів спинного мозку опалесціювали слабше і виглядали, відповідно, темнішими. Крім того, більшість нейронів спинного мозку набувала з часом культивування добре окреслену веретеноподібну або полігональну форму.

На 11-й – 12-й дні культивування в змішаній культурі клітин спинного мозку і спінальних гангліїв під світловим мікроскопом у фазовому контрасті можна було легко візуально ідентифікувати веретеноподібні біполярні, трикутні (рис.1) і мультіполярні нейрони спинного мозку з розвитими дендритами. Нейрони спінальних гангліїв мали типову округлу форму. Більшість таких нейронів були псевдоуніполярними (рис.1). Вони мали один відросток, що на певній відстані від соми розгалуджувався на два відростки другого порядку: товстий і більш тонкий. Іноді від соми такого нейрона окрім основного, псевдоуніполярного, відходили ще кілька тонких коротких відростків. Крім того, зустрічалися нейрони, які за характеристиками мали бути віднесені до клітин спінальних гангліїв, але були біполярними. Невелика кількість клітин спінальних гангліїв мали один тонкий і кілька товстих коротких відростків.

Рис.1 Фазово-контрастне зображення синаптично зв'язаної пари нейронів: 1 - полігональний нейрон спинного мозку, 2 – псевдоуніполярний нейрон спинального ганглія.

Кінетичні і фармакологічні властивості викликаних постсинаптичних струмів у нейронах спінальних гангліїв. Для проведення фізіологічних експериментів ми використовували змішану культуру дисоційованих нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку віком від 7 до 20 днів. Після встановлення режиму фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” на візуально ідентифікованому нейроні спінального ганглія ми проводили позаклітинну локальну стимуляцію соми або відростка нейрона спинного мозку, що мав візуально передбачуваний синаптичний зв'язок з нейроном спінального ганглія. Таким чином, в даній ситуації нейрон спінального ганглія являв собою постсинаптичну клітину, а нейрон спинного мозку - пресинаптичну. У цих умовах у 27 нейронах спінальних гангліїв (9% усіх досліджених) були зареєстровані постсинаптичні струми (рис.2 ).

Викликаний постсинаптичний струм (вПСС) розглядався як моносинаптична відповідь, якщо в описаних вище умовах інтервал від початку стимулу до початку виникнення струму не перевищував 6 мс (Hirano et al., 1986). Середнє значення цього параметра в наших эксперіментах склало 4,7±0,29 мс (n=16).

Час до піка (часовий інтервал від моменту виникнення струму до моменту досягнення його пікової амплітуди) вПСС був порівняно невеликим і варіював у діапазоні від 1,5 до 4,5 мс. Середнє значення цього параметра склало 3,1±0,14 мс (розраховано для 22 пар нейронів) (рис. 3 ).

Рис. 2 Викликані постсинаптичні струми, що виникають в нейроні спинального ганглія при позаклітинній локальній стимуляції нейрона спинного мозку.

Під час дослідження потенціалозалежних властивостей вПСС в нейронах спінальніх гангліїв ми прийшли до висновку, що потенціал реверсії даних струмів близький до рівноважного потенціалу для іонів хлору, який розрахований за рівнянням Нернста для концентрацій цих іонів у наших розчинах (–19 мВ). Середнє значення цього параметра -15±3 мВ. Вольт-амперна характеристика вПСС в діапазоні змін підтримуваного потенціалу від –85 до +35 мв була практично лінійною ( рис. 4 ). ВПСС мали повільний спад, який добре апроксимувався за допомогою однієї експоненти. Розподіл постійних часу спаду був мономодальным і добре описувався розподілом Гаусса. Середнє значення цієї величини склало t = 20,94 ± 1,67 мс (n=167).

Рис. 3 Гістограмма розподілу часів до піку викликаних постсинаптичних струмів, зареєстрованих у нейронах спінальних гангліїв. n – число вимірів, в біні. Загальна кількість вимірів N=22.

При аплікації 20 мкМ селективного блокатора ГАМКА-рецепторів бікукулліна методом швидкої локальної суперфузії [Veselovsky et al., 1996] безпосередньо на область, яку займала досліджувана пара нейронів, у 10 клітинах з 14 досліджених спостерігалося практично повне й зворотне блокування вПСС.

Рис. 4 Залежність амплітуди викликаного постсинаптического струму в нейроні спінального ганглія від величини підтримуваного потенціалу на мембрані. Записи викликаних постсинаптичних струмів, зареєстрованих при значеннях підтримуваного потенціалу від –85 до +35 мв із кроком у 10 мВ і їхня вольт-амперна характеристика.

Кінетичні і фармакологічні властивості спонтанних постсинаптичних струмів в нейронах спінальних гангліїв. Для більш повного дослідження властивостей синаптичної передачі в змішаній культурі нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку були досліджені параметри спонтанних постсинаптичних струмів (сПСС) у первинних сенсорних нейронах (рис.5). Такі струми реєструвалися в 19 клітинах (11% досліджених).

Рис. 5 Приклади спонтанних постсинаптичних струмів, які зареєстровані в нейроні спінального ганглія в змішаній культурі.

При більш позитивних значеннях підтримуваного потенціалу, ніж рівноважний потенціал для іонів хлору (-19 мв), який розрахований за рівнянням Нернста для концентрацій цих іонів у наших позаклітинному і внутріпіпеточному розчинах, спостерігалася реверсія сПСС (рис. 6).

Рис. 6 Приклади спонтанних постсинаптичних струмів, які зареєстровані у нейроні спінального ганглія при різних значеннях мембранного потенціалу.

Час до піка таких струмів складав в середньому 3,3±0,06 мс (підраховано для 15 клітин) і був практично таким же, як і середнє значення цього параметра для вПСС. Розподіл значень часу до піка спонтанних струмів добре описувався унімодальним розподілом Гауса (рис. 7). СПСС демонстрували повільний спад, що міг бути аппроксимований за допомогою однієї експоненти із середньою постійною часу спаду t= 21,8±1,51 мс (Середнє значення полічене для 13 клітин).

Амплітуди сПСС іноді досягали 300 пА, але в основному не перевищували 100 пА. Для більшості постсинаптичних клітин амплітудні розподіли сПСС були полімодальними (рис. 8, А, Б). Статистична обробка таких розподілів була утрудненою через недостатню кількість вимірів. Проте візуально можна було добре визначити моди на значеннях 16, 32 і 61 пА для першої клітини (рис.8, А) і 16, 32 і 45 пА для другої (рис.8, Б). Зустрічалися також нейрони з унімодальным розподілом амплітуд сПСС (рис.8,В). Мода таких розподілів приблизно відповідала значенню 16пА.

Рис. 7 Гістограма розподілу часу до піка спонтанних постсинаптичних струмів, які зареєстровані у нейронах спінальних гангліїв, що культивуються разом з нейронами спинного мозку. Загальна кількість вимірів N=1019.

Аплікація 20 мкМ бикукуліна викликала у чотирьох досліджених нейронах практично повне й зворотнє блокування таких сПСС . Частота виникнення сПСС у нейронах спинальних гангліїв для культур віком 15 днів у середньому складала 1,23 с-1.

Рис. 8 Приклади гістограмм розподілу амплітуд спонтанних постсинаптичних струмів, які зареєстровані у нейронах спінальних гангліїв, що культивувалися разом з нейронами спинного мозку 12 днів.

А, Б – приклади полімодальних амплітудних розподілів. Візуально виділювані моди (відзначені зірочками) розташовані на 16, 32 та 62 пА (А) і 16, 32 та 46 пА (Б), відповідно.

В – приклад унімодального амплітудного розподілу. Мода розподілу відповідає 16 пА.

По осі абсцис – аплітуда постсинаптичного струму, пА; по осі ординат – кількість струмів, що мають відповідну амплітуду, у біні.

Синаптогенез у змішаній культурі нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку. Розробка методик дисоційованих культур нервової тканини дозволила досліджувати процес синаптогенеза на рівні однієї пари нейронів. Так, у дослідженнях, проведених на культурах нейронів гіппокампа та нейронів верхнього двогорбкового тіла щурів [ Ісаєва та ін., 1999, Warton et al., 1990], продемонстроване збільшення амплітуди і часу до піку викликаних гальмуючих постсинаптичних струмів. Був зроблений висновок про те, що ці зміни відбуваються в основному за рахунок збільшення загальної кількості елементарних синаптичних контактів.

Для вивчення синаптогенеза в змішаній культурі нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку ми дослідили властивості викликаних і спонтанних гальмуючих постсинаптичних струмів, що виникають у нейронах спінальних гангліїв у процесі спільного культивування цих типів клітин. Дослідження проводилися на 7-й, 10-й, 13-й і 15-й дні розвитку культури.

Для опису кінетичних характеристик постсинаптичних струмів у процесі розвитку культури оцінювалася зміна часу до піка (часовий інтервал від моменту виникнення струму до моменту досягнення його пікової амплітуди) і постійні часу спаду струмів.

Рис. 9 Значення постійних часу спаду викликаних (А) і спонтанних (Б) гальмуючих постсинаптичних струмів, зареєстрованих в нейронах спінальних гангліїв щурів при спільному культивуванні з нейронами спинного мозку. По осі абсцис – термін культивування (дні); по осі ординат – час, мс. (?) – середні значення постійних часу спаду при відповідному терміні культивування для різних нейронів; показані також стандартні відхилення від середньої величини.

Спад спонтанних і викликаних постсинаптичних струмів у культурах усіх віків добре апроксимувався моноекспоненціальною функцією. Середнє значення постійної часу спаду складало 21.8±5.4 мс (n=13) для спонтанних струмів і 17.4±6.5 мс (n=15) для викликаних. Постійні часу сПСС і вПСС при збільшенні віку культури залишалися незмінними в межах стандартної помилки (рис.9). Гістограми розподілу часу до піку для вПСС мали унімодальний характер (рис.10). Середні значення часу до піку для культур різних віків складали на 7-й день культивування 1.4±0.3 мс (n=14), на 10-й день – 2.7±0.6 мс (n=474), на 13-й день – 4.7±0.4 мс (n=171) і на 15-й день – 4.7±0.9 мс (n=372).

Рис. 10 Гістограми часів до піку викликаних гальмуючих постсинаптичних струмів, зареєстрованих в нейронах спінальних гангліїв, що культивувалися разом з нейронами спинного мозку 7 (А), 10 (Б), 13 (В) і 15 днів (Г). Апроксимація нормальним розподілом Гауса показана тонкою лінією. Кількість реєстрацій N=14, N=474, N=171 і N=372 для (А), (Б), (В) і (Г), відповідно. По осі абсцис – час наростання постсинаптичних струмів, мс; по осі ординат – кількість досліджених струмів, у біні.

Статистичний аналіз, проведений з використанням критерію Манна-Уітні, показав, що середні значення часу до піку для вибірок 7-го, 10-го і 13-го днів культивування різні, у той час як для вибірок 13-го і 15-го днів культивування вони не відрізняються.

Рис. 11 Гістограми часів до піку спонтанних гальмуючих постсинаптичних струмів нейронів спінальних гангліїв для різних термінів спільного культивування з нейронами спинного мозку: 9 (А), 12 (Б) та 15 днів (В). Кількість реєстрацій N=22, N=241 і N=411 для (А), (Б) і (В), відповідно. По осі абсцис - час наростання постсинаптичних струмів, мс; по осі ординат – кількість досліджених струмів, у біні.

Для дослідження змін часу до піку сПСС у процесі розвитку культури ми використовували групи нейронів 9-, 12- і 15-го днів культивування. Середні значення часів до піку складали на 9-й день культивування 3.6±0.22 мс (n=22), на 12-й день культивування – 3.3±0.09 мс (n=241) і на 15 день – 3.7±0.05 мс (n=411). Статистичний аналіз гістограм розподілу цього параметра показав, що значення часів до піку сПСС зі збільшенням віку культури статистично вірогідно не змінювалися (рис. 11).

У процесі росту культури середня амплітуда вПСС зростала з 137±78 пА на 7-й-10-й дні культивування (полічено для 9 пар нейронів) до 258±102 пА на 13-15-й дні культивування (полічено для 10 пар нейронів), як це показано на діаграмах залежності усереднених амплітуд струмів від віку культури на рис.12.

Середня частота виникнення сПСС статистично вірогідно зростала в процесі диференціювання нейронів у культурі з 0.26±0.11 с-1 на 11-й день росту культури до 1.23±0.73 с-1 на 15-й день культивування (Таблиця 1.1).

Рис. 12 Зміна амплітуди викликаних гальмуючих постсинаптичних струмів зі збільшенням віку змішаної культури нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку.

Середнє значення синаптичної затримки для вПСС, яка вимірювалася як час, що пройшов від початку стимулюючого імпульсу до моменту виникнення вПСС, не перевищувало 4.6±0.33 мс (n=17). Значна варіабельність середнього значення синаптичної затримки для різних нейронів у межах одного віку не дозволила провести аналіз зміни цього параметра в процесі культивування.

Обговорення результатів

У роботі були досліджені кінетичні і фармакологічні властивості спонтанних і викликаних постсинаптичних струмів у нейронах спінальних гангліїв.

Для проведення експериментів ми розробили методику спільного культивування нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку. Морфологічний критерій для ідентифікації сенсорних і спинальних нейронів виявився досить адекватним, бо у фазовому контрасті нейрони цих класів значно відрізнялися один від одного і легко визначалися візуально. Використана нами модель – змішана культура дисоційованих нейронів – дозволила дослідити властивості гальмівної синаптичної передачі на рівні однієї пари нейронів, де нейрон спінального ганглія є постсинаптичною клітиною, а нейрон спинного мозку – пресинаптичною.

У змішаній культурі дисоційованих клітин спінальних гангліїв і спинного мозку були зареєстровані спонтанні і викликані постсинаптчні струми в нейронах спінальних гангліїв. Ці струми були ідентифіковані як гальмуючі постсинаптичні, які переносяться по хлорних каналах ГАМКА-рецепторів. Дійсно, реверсія вПСС і сПСС спостерігалася при підтримуваному потенціалі, близькому до рівноважного потенціалу для іонів хлору, який розрахований за рівнянням Нернста для концентрацій цього іона у розчинах, які ми використовували. Крім того, сПСС і вПСС цілком і зворотно блокувалися специфічним блокатором ГАМКА рецепторів бікукуліном. Ці струми також мали характерний для гальмуючих постсинаптичних струмів повільний спад.

Таким чином, отримані нами експериментальні дані свідчать про те, що на нейронах спінальних гангліїв нейрони спинного мозку в умовах спільної культури можуть формувати функціональні гальмівні синапси. Передача сигналів у цих синапсах здійснюється за допомогою гама-аміномасляної кислоти.

Відомо, що ГАМК не є основним гальмівним медіатором у нейронних системах спинного мозку. Проте вважають [Eccles et al., 1961], що на пресинаптичних терміналях первинних аферентних волокон знаходяться аксо-аксонні ГАМК-ергічні синапси, які беруть участь у здійсненні пресинаптичного гальмування. Таке гальмування полягає в тривалому зниженні ефективності синаптичної передачі, яке не пов`язане з якими-небудь змінами потенціалу на постсинаптичній мембрані. У більшості збуджуючих синапсів первинних аферентних волокон пресинаптичне гальмування може здійснювати ефективне зниження амплітуди постсинаптичних струмів. Дослідження, які проведені за допомогою імунологічних і електрономікроскопічних методів, показали, що на пресинаптичних терміналях первинних аферентних нейронів у дорсальному розі спинного мозку формуються синаптичні структури, що мають, швидше за все, ГАМК-ергічну природу [ Barker, Owen, 1986, Culp et al., 1993].

Для того, щоб дослідити розвиток гальмівних синапсів у процесі росту змішаної культури нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку, був проведений аналіз зміни властивостей спонтанних і викликаних гальмуючих постсинаптичних струмів. Виявилося, що в процесі розвитку нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку амплітуда гальмуючих вПСС у нейронах спінальних гангліїв статистично вірогідно збільшувалася. Можна зробити припущення, що цей ріст амплітуди пояснюється збільшенням загальної кількості елементарних синаптичних контактів. Однак це може бути зв`язане також з підвищенням щільності ГАМКА-рецепторів на постсинаптичній клітині. Як було зазначено, збільшення амплітуди гальмівних вПСС спостерігалося також у нейронах гіпокампу і двогорбкового тіла щура в процесі розвитку їх у первинних дисоційованих культурах [Ісаєва та ін., 1999, Warton et al., 1990].

Збільшення значень часу до піка вПСС, очевидно, має пресинаптичну природу. Ми виходимо з припущення, що в змішаній культурі первинних сенсорних і спинальних нейронів, аналогічно іншим дисоційованим культурам різних відділів ЦНС, у процесі розвитку культури відбувається утворення нових синаптичних контактів. У цьому випадку зростання значень часу до піка вПСС у процесі розвитку нейронів у культурі може бути обумовлене зростанням загальної кількості синапсів. При збільшенні кількості окремих пресинаптичних терминалей аксона пресинаптичного нейрона, що мають різну довжину і товщину, збільшується дисперсія часів проведення по цих терміналях. Несинхронність приходу збудження до синапсів, які утворені тим самим аксоном на одній постсинаптичній клітині, призводить до несинхронності вивільнення медіатора з різних терминалей і, як наслідок, до збільшення тривалості часу до піку постсинаптичного струму. Очевидним є те, що зі збільшенням загальної кількості синаптичних контактів на постсинаптичному нейроні підвищується ймовірність викиду медіатора і виникнення постсинаптичної відповіді. Тому в культурі, що розвивається, при збільшенні термінів культивування спостерігається збільшення частоти виникнення гальмуючих сПСС.

У наших дослідженнях постійні часу спаду викликаних і спонтанних гальмівних постсинаптичних струмів у клітинах кожної окремої вікової групи демонстрували значний рівень варіативності. Така дисперсія могла маскувати можливу зміну постійної часу спаду в процесі росту культури. Цей факт узгоджується з даними, які отримані на культивованих нейронах гіпокампа, де зміни постійної часу спаду під час розвитку нейронів in vitro були незначними [Grantin et al, 1995].

У нашій роботі доведено, що в умовах змішаної культури нейрони спинного мозку можуть утворювати функціональні гальмівні синапси на нейронах спінальних гангліїв. Як і в інших дисоційованих культурах різних відділів центральної нервової системи, у яких наявність функціональних синапсів показана in vivo, розвиток нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку в змішаній культурі супроводжується збільшенням загальної кількості синаптичних контактів. Цей факт свідчить на користь того, що в змішаній культурі дисоційованих клітин моделюється реально існуючий in vivo фізіологічний процес утворення гальмівних синапсів на нейронах спінальних гангліїв.

Точний візуальний контроль розташування таких синапсів у наших умовах був неможливим. Проте варто зазначити, що потенціал реверсії зареєстрованих постсинаптичних струмів був близьким до розрахованого за рівнянням Нерста рівноважного потенціалу для іонів хлору. Крім того, середній час до піка викликаних струмів був відносно невеликим. Це, швидше за все, свідчить на користь того, що принаймні значна частина ГАМК-ергічних синапсів знаходилася безпосередньо на сомі чи досить близько до неї.

Як згадувалося вище, інтернейрони спинного мозку формують синапси на збуджуючих пресинаптичних терміналях нейронів спінальних гангліїв. Оскільки in vivo соми нейронів спінальних гангліїв знаходяться поза спинним мозком, а закінчення аферентних терміналей у дорсальному розі спинного мозку, не можна не враховувати, що можлива специфічність іонного складу міжклітинних середовищ у цих утвореннях може перешкоджати утворенню синапсів безпосередньо на сомах нейронів спінальних гангліїв. Однак, існують дані морфологічних електрономікроскопічних досліджень, які показують, що на сомі нейронів спінальних гангліїв in vivo виявляються структури, що можуть бути ідентифіковані як синапси [Kayahara, 1986]. Крім того, є дані про те, що в аферентних волоконних шляхах існують нервові відростки, які мають напрямок росту від спинного мозку до спінальних гангліїв [Берсенев, 1980]. Імуноцитохімічні дослідження також підтверджують наявність синапсоподібних структур на сомах нейронів спінальних гангліїв. Крім того, в наших дослідженнях непрямі дані дозволили припустити, що, принаймні, значна частина синапсів розташовувалися на сомі чи поблизу неї. Тому, цілком імовірно, що гальмівні синапси in vivo можуть утворюватися як на пресинаптичних терміналях нейронів спинальних гангліїв, так і на сомі деяких з цих нейронів чи біля неї. Кількість таких аксо-соматичних синапсів in vivo імовірно невелика.

Обговорюючи фізіологічну роль можливих синапсів на сомах нейронів спінальних гангліїв, можна припустити, що за допомогою цих гальмівних синапсів нейрони спинного мозку модулюють проведення імпульсів у нейронах спінальних гангліїв, а, також можуть впливати на деякі довгострокові процеси трофічного типу в сомі цих нейронів.

ВИСНОВКИ

1. У диссоційованій змішаній культурі нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку з використанням методики “петч-клемп” у конфігурації “ціла клітина”, методу позаклітинної локальної стимуляції пресинаптичної клітини і методу швидкої локальної суперфузії зареєстровані та досліджені спонтанні і викликані постсинаптичні струми в нейронах спінальних гангліїв.

2. Спонтанні і викликані постсинаптичні струми, що реєструвалися в нейронах спінальних гангліїв при електричній стимуляції нейронів спинного мозку, мали повільну кінетику спаду і реверсували при мембранному потенціалі близькому до рівноважного потенціалу для Сl-. Струми зворотньо блокувалися селективним блокатором ГАМКА-рецепторів бикукуліном. Досліджені постсинаптичні струми ідентифіковані як струми іонів Сl-, викликані активацією ГАМКА-рецепторів.

3. Отримані дані показали, що в змішаній дисоційованій культурі нейрони спинного мозку можуть утворювати функціональні гальмівні синапси на нейронах спінальних гангліїв.

4. У процесі розвитку нейронів у культурі збільшувалася частота виникнення спонтанних гальмівних постсинаптичних струмів при незмінному часі їхнього наростання. Середня амплітуда викликаних гальмівних струмів і час їхнього наростання збільшувалися при збільшенні термінів культивування.

5. Отримані дані показали, що в процесі розвитку змішаної культури збільшувалася загальна кількість функціональних гальмівних синапсів між нейронами спинного мозку і нейронами спінальних гангліїв.

6. Результати роботи підтверджують уявлення про те, що первинні сенсорні нейрони дорсальних гангліїв можуть мати на своїй мембрані гальмівні синапси, що беруть участь у контролі проведення інформації.

Перелік опублікованних праць здобувача за темою дисертації.

Статті:

·

· Медведева Ю.В., Веселовский Н.С., Федулова С.А., Костюк П.Г. Постсинаптические токи в нейронах спинальных ганглиев, культивируемых совместно с нейронами спинного мозга. Нейрофизиология, 2001, Т.33, №1, с. 3-7.

· Медведева Ю.В., Федулова С.А., Веселовский Н.С. Синаптогенез в совместной культуре нейронов спинальных ганглиев и спинного мозга. Нейрофизиология, 2001, Т.33, №6, с. 399-406.

Тези доповідей:

·

Анотації:

Медведєва Ю.В. Гальмівні постсинаптичні струми в нейронах спінальних гангліїв, культивованих разом з нейронами спинного мозку. – Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини та тварин. – Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України. Київ – 2002.

Дисертація присвячена дослідженню гальмівних синапсів на нейронах спінальних гангліїв, культивованих разом з нейронами спинного мозку. Для проведення експериментів була розроблена методика спільного культивування диссоційованих нейронів спінальних гангліїв і спинного мозку. Досліджено кінетичні і фармакологічні властивості викликаних і спонтанних постсинаптичних струмів, які були зареєстровані у нейронах спінальних гангліїв. Показано, що спонтанні і викликані постсинаптичні струми демонструють усі властивості гальмуючих постсинаптичних струмів, опосередкованих ГАМКА-рецепторами. Таким чином, отримані дані показали, що в змішаній диссоційованій культурі нейрони спінальних гангліїв можуть формувати функціональні гальмівні синапси на нейронах спинного мозку.

У процесі розвитку нейронів у культурі збільшувалася середня амплітуда і час до піка викликаних струмів і частота виникнення спонтанних, що свідчить про збільшення загальної кількості синаптичних контактів.

Результати роботи підтверджують уявлення про те, що первинні сенсорні нейрони дорсальних гангліїв можуть мати на своїй мембрані гальмівні синапси, що беруть участь у контролі проведення інформації.

Ключові слова: гальмівні синапси, спінальні ганглії, спинний мозок, ГАМКА рецептори.

Медведева Ю.В. Тормозящие постсинаптические токи в нейронах спинальных ганглиев, культивируемых совместно с нейронами спинного мозга. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. – Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины. Киев – 2002.

Диссертация посвящена исследованию тормозных синапсов на нейронах спинальных ганглиев, культивируемых совместно с нейронами спинного мозга. Для проведения экспериментов была разработана методика совместного культивирования диссоциированных клеток спинальных ганглиев и спинного мозга. Регистрация данных производилась с помощью методики “пэтч-клэмп” в конфигурации “целая клетка”, метода внеклеточной локальной стимуляции пресинаптической клетки – нейрона спинного мозга, и метода быстрой локальной суперфузии области, занимаемой исследуемой парой нейронов.

Культура диссоциированных клеток позволила нам исследовать свойства тормозной синаптической передачи на уровне одной пары нейронов, где нейрон спинного мозга представлял собой пресинаптическую клетку, а нейрон спинального ганглия – постсинаптическую. Идентификация исследуемых клеток осуществлялась визуально с использованием фазово-контрастного микроскопа (увеличение 320). Нейроны спинальных ганглиев имели округлую, опалесцирующую сому и один псевдоуниполярный отросток или (реже) несколько отростков. Нейроны спинного мозга были веретеновидными, треугольными или мультиполярными. Их более уплощённая сома гораздо слабее опалесцировала в фазовом контрасте.

При выполнении диссертационной работы были исследованы кинетические и фармакологические свойства вызванных и спонтанных постсинаптических токов, зарегистрированных в нейронах спинальных ганглиев. Показано, что спонтанные и вызванные постсинаптические токи демонстрируют все свойства тормозящих постсинаптических токов, опосредуемых ГАМКА-рецепторами. Действительно, реверсия вызванных и спонтанных постсинаптических токов наблюдалась при поддерживаемом потенциале, который был близок к равновесному потенциалу для ионов хлора, рассчитанному по уравнению Нернста для концентраций этого иона в использованных нами растворах (-19 мВ) и в среднем составлял

-15мВ. Кроме того, спонтанные и вызванные постсинаптические токи полностью и обратимо блокировались при приложении 20 мкМ специфического блокатора ГАМКА-рецепторов бикукуллина. Также эти токи имели характерный для тормозящих постсинаптических токов медленный спад. При аппроксимации спада токов моноэкспоненциальной функцией средние постоянные времени спада составили 21.8±5.4 мс (n=13) для спонтанних токов и 17.4±6.5 мс (n=15) для вызванных. Таким образом, полученные данные показали, что в смешанной культуре нейроны спинного мозга могут формировать функциональные тормозные синапсы на нейронах спинальных ганглиев.

Для изучения синаптогенеза в смешанной культуре нейронов спинальных ганглиев и спиннного мозга были исследованы изменения кинетических характеристик вызванных и спонтанных тормозящих постсинаптических токов, возникающих в нейронах спинальных ганглиев в процессе совместного культивирования этих типов клеток. Показано, что в процессе развития нейронов в культуре средняя амплитуда вызванных токов возрастала с 137±78 пА на 7-10-й дни культивирования (9 пар нейронов) до 258±102 пА на 13-15-й дни культивирования (10 пар нейронов). Среднее значение времени до пика вызванных токов возрастало с 1.4±0.3 мс на 7-й день роста нейронов в культуре (n=14) до 4.7±0.4 мс на 13-й день (n=171). Среднее значение времени до пика спонтанных постстнаптических токов в процессе развития культуры статистически достоверно не изменялось. Средняя частота возникновения спонтанных токов статистически достоверно возрастала в процессе дифференцировки нейронов в культуре с 0.26±0.11 с-1 на 11-й день роста культуры до 1.23±0.73 с-1 на 15-й день культивирования. Результаты исследований свидетельствует о том, что в процессе развития совместной культуры увеличивается общее количество синаптических контактов между нейронами спинного мозга и спинальных ганглиев.

Полученые данные подтверждают представления о том, что первичные сенсорные нейроны дорсальных ганглиев могут иметь на своей мембране тормозные синапсы, которые принимают участие в контроле проведения информации

Ключевые слова: тормозные синапсы, спинальные ганглии, спинной мозг, ГАМКА рецепторы.

Medvedeva Yu.V. Inhibitory postsynaptic currents in dorsal root ganglion neurons co-cultured with spinal cord neurons. – Manuscript.

Thesis for PhD degree by specialty 03.00.13. – human and animal physiology. – Bogomoletz institute of Physiology NASc of Ukraine. Kiev. – 2002

The dissertation is devoted to investigation of inhibitory synapses on dorsal root ganglia neurons (DRG). In our experiments, rat DRG and spinal cord (SC) neurons were co-cultured. We recorded evoked and spontaneous postsynaptic currents in DRG neurons. The kinetic and pharmacological properties of these currents were investigated. It was shown that evoked and spontaneous postsynaptic currents demonstrate all properties of the GABAA-ergic inhibitory postsynaptic currents. These results gave direct proof that spinal cord neurons may form inhibitory synapses on dorsal root ganglion neurons. The obtained results indicate that extension of the cultivation term causes an increase in the mean amplitude and time-to-peak of evoked postsynaptic currents and an increase in the frequency of spontaneous postsynaptic currents. Prolongation of the cultivation term resulted in an increase in the number of synaptic contacts.