НАЦіональна академія наук україни

ІНститут молекулярної біології і генетики

НАЙдьонов валерій Георгійович

УДК 577.152.611:576.31

Вивчення методом сайт-направленого мутагенезу елементів впізнавання тирозинової тРНК

тирозил-тРНК синтетазою з вищих еукаріотів

03.00.03 – молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури і функції нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, академік НАН України

Мацука Геннадій Харлампійович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

директор інституту,

завідувач відділу структури і функції нуклеїнових кислот.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Виноградова Руфіна Петрівна,

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України,

провідний науковий співробітник відділу біохімії ліпідів;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Козлов Едуард Андрійович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

провідний науковий співробітник відділу механізмів

трансляції генетичної інформації.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса

Шевченка, біологічний факультет, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться “18” червня 2002 року о 10 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного,150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано “17” травня 2002 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О. В. Підпала

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Одним із ключових етапів процесу реалізації генетичної інформації є аміноацилювання тРНК аміноацил-тРНК синтетазами на дорибосомній стадії біосинтезу білка. Точність процесу трансляції значною мірою залежить від специфічності приєднання амінокислоти до 3ґ-кінця відповідної тРНК, що в кінцевому підсумку визначає відповідність амінокислотної послідовності білка нуклеотидній послідовності мРНК. Численні біохімічні та генетичні дослідження показують, що специфічність аміноацилювання пов’язана з наявністю в тРНК та аміноацил-тРНК синтетазах набору структурних елементів – детермінант впізнавання, які формують ряд строго визначених РНК-білкових контактів, забезпечуючи таким чином селекцію споріднених тРНК і дискримінацію проти решти тРНК. Ця проблема специфічного впізнавання в реакції аміноацилювання розглядається в літературі як проблема “identity” тРНК (McClain, 1993). Оскільки в українській мові термін “ідентичність” є не зовсім адекватним щодо процесу впізнавання, в даній роботі використано термін “відповідність тРНК”.

Детермінанти відповідності тирозинової тРНК прокаріотів та дріжджів вивчали протягом останніх років in vitro та in vivo (Bedouelle, 1990, Fechter et al., 2000, 2001), однак для вищих еукаріотів систематичні дослідження в цьому плані не проводились. При цьому варто зазначити, що особливістю тирозил-тРНК синтетази вищих еукаріотів є наявність у структурі ферменту, окрім типового для всіх аміноацил-тРНК синтетаз каталітичного модуля, додаткового С-кінцевого домену, який відсутній у тирозил-тРНК синтетаз прокаріотів та нижчих еукаріотів (Леванец и др.,1997). Функція цього домену в аміноацилюванні залишається не до кінця з’ясованою.

Зважаючи на вищезгадане, актуальним є дослідження ролі окремих структурних елементів тирозинової тРНК та тирозил-тРНК синтетази з печінки бика як детермінант відповідності в реакції аміноацилювання.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у рамках плану фундаментальних досліджень відділу структури і функції нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за бюджетною темою “Структурно-функціональне дослідження еукаріотичних аміноацил-тРНК синтетаз I та II класів”.

Мета та завдання роботи. Метою цієї роботи було вивчення із застосуванням методу сайт-направленого мутагенезу структурних елементів специфічного впізнавання тирозинової тРНК тирозил-тРНК синтетазою з печінки бика в реакції аміноацилювання.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Сконструювати і клонувати штучний ген тирозинової тРНК печінки бика.

2. Методом сайт-направленого мутагенезу внести нуклеотидні заміни в позиції штучного гена, що відповідають позиціям першої пари акцепторного стебла, антикодонового триплету та варіабельної петлі тирозинової тРНК.

3. Отримати in vitro транскрипти нормального та мутантних штучних генів тирозинової тРНК.

4. Отримати в бактеріальній системі експресії рекомбінантну повнорозмірну тирозил-тРНК синтетазу печінки бика, тирозил-тРНК синтетазу з делецією некаталітичного С-кінцевого домену та тирозил-тРНК синтетазу із замінами амінокислотних залишків Lys146 і Lys147.

5. Використовуючи методи стаціонарної кінетики, визначити вплив окремих мутацій тирозинової тРНК та тирозил-тРНК синтетази на каталітичну ефективність реакції аміноацилювання.

Для вирішенні поставлених завдань було використано такі основні методи дослідження: клонування фрагментів ДНК у плазміди, сайт-направлений мутагенез, бактеріальна експресія рекомбінантних білків, транскрипція in vitro.

Об’єктом проведеного дослідження були нормальні та мутантні форми тирозинової тРНК та тирозил-тРНК синтетази, а предметом дослідження – вплив сайт-направлених мутацій на кінетичні параметри реакції аміноацилювання.

Наукова новизна одержаних результатів. Використовуючи метод сайт-направленого мутагенезу вивчено роль окремих структурних елементів тирозинової тРНК та тирозил-тРНК синтетази печінки бика як детермінант відповідності в реакції аміноацилювання.

Вперше показано, що роль першої пари акцепторного стебла, як детермінанти відповідності тирозинової тРНК, пов’язана головним чином із нуклеотидом в позиції 72, в той час як значення нуклеотиду в позиції 1 є значно меншим. Досліджено вплив нуклеотидних замін у позиціях 34 і 35 антикодону та в ділянці варіабельної петлі на акцепторні властивості тРНКTyr-транскрипту.

Базуючись на порівнянні ферментативної активності повнорозмірної тирозил-тРНК синтетази і тирозил-тРНК синтетази з делецією С-кінцевого домену, виявлено роль С-кінцевого домену в підвищення каталітичної ефективності ферменту в реакції аміноацилювання транскрипту тирозинової тРНК. Вперше показано критичну роль амінокислотного залишку лізин-147 для ферментативної активності тирозил-тРНК синтетази печінки бика.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі результати стосовно ролі нуклеотидів першої пари акцепторного стебла, антикодонового триплету та варіабельної петлі тирозинової тРНК і амінокислотного залишку лізин-147 тирозил-тРНК синтетази печінки бика як детермінант відповідності в реакції аміноацилювання, а також впливу додаткового С-кінцевого домену тирозил-тРНК синтетази бика на її ферментативну активність, можуть бути використані для подальшого детального вивчення структурно-функціональних механізмів регуляції дорибосомного етапу біосинтезу білка в клітинах вищих еукаріотів.

Особистий внесок здобувача. Результати, які викладено в дисертації, отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі при виконанні експериментів. Дослідження, пов’язані з клонуванням і бактеріальною експресією повнорозмірної та позбавленої С-кінцевого домену тирозил-тРНК синтетази, проводились у співробітництві з к. б. н. М.І.Вудмаскою. Результати, які стосуються

сайт-направленого мутагенезу лізинових залишків 146 і 147 тирозил-тРНК синтетази печінки бика, отримано у співробітництві з к.б.н. М.І. Вудмаскою та д.б.н., професором О.І. Корнелюком. Результати обговорено і опубліковано у спільних наукових працях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації представлені на міжнародних конференціях “EMBO Workshop on Structure and Function of Aminoacyl synthetases” (Mittelwihr, Франція, 1998), “Asilomar conference on aminoacyl-tRNA synthetases in biology, medicine and evolution” (Pacific Grove, США, 2002) та на наукових семінарах відділу структури і функції нуклеїнових кислот ІМБіГ НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано три статті та тези двох доповідей, представлених на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, обговорення результатів досліджень, висновки, список використаної літератури. Дисертацію викладено на 122 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 25 рисунками та 3 таблицями. Список цитованої літератури охоплює 212 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження

Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК здійснювали у трис-боратному буфері в 15-20% процентному поліакриламідному гелі при напруженості електричного поля 20 В/см, а також в трис-ацетатному буфері в 1-2% агарозному гелі при напруженості електричного поля 5 В/см. Елюцію фрагментів ДНК з гелю здійснювали протягом 18 годин при кімнатній температурі буфером: 50 mМ трис-HCl, pН- 7.0; 300 mМ NaCl; 10 mМ ЕДТА. Клонування штучного гена в плазміду pUC119 проводили згідно стандартних методик (Маниатис и др., 1984) з використанням ферментів та буферних розчинів виробництва “Amersham Pharmacia Biotech” (Велика Британія) та “Fermentas” (Литва).

Сайт-направлений мутагенез першої пари акцепторного стебла тРНКTyr виконували методом ПЛР із використанням олігонуклеотидних праймерів, що були синтезовані фірмою “Genosys” (США).

Нуклеотидні заміни в ділянках штучного гена, які відповідають антикодону і варіабельній петлі тРНКTyr, проводили методом олігонуклеотидних гетеродуплексів (Kunkel, 1989).

Сайт-направлений мутагенез залишків лізин-146 і лізин-147 тирозил-тРНК синтетази з печінки бика здійснювали з використанням методу "мегапраймера" (Barik, 1997).

Для визначення нуклеотодної послідовності ДНК за методом Сенгера (Sanger et al., 1977) використовували б[35S]dATP (Amersham Pharmacia Biotech) і набір "T7 Seguenase v.2.0. DNA seguencing Kit" (USB, США).

Для бактеріальної експресії тирозил-тРНК синтетази дикого типу і мутантних варіантів ферменту були використані клітини E.coli штаму BL-21(DE3). Культивування клітин, індукцію, а також очищення експресованих білків афінною хроматографією на глутатіон-сефарозі (Amersham Pharmacia Biotech, Велика Британія) чи Ni-NTA агарозі (Qiagen, Німеччина) проводили згідно інструкцій виробників. Визначення концентрації білків проводили за (Bradford, 1976).

“Run-off” транскрипцію штучних генів TРНК Tyr іn vitro здійснювали, як описано Семпсоном і Уленбеком (Sampson, Uhlenbeck, 1988). Реакційна суміш містила: 40 мМ трис-HCl, рН 7,5; 50 мМ NaCl; 8 мМ MgCl2; 2 мМ спермідин; 30 мМ DTT; 1 мМ кожного з чотирьох рибонуклеозидтрифосфатів; 10000 од./мл Т7 РНК-полімерази; 0,2 мг/мл лінеаризованої плазміди. Реакційну суміш інкубували протягом 2 - 16 годин при 37оС. Очищували транскрипти препаративним електрофорезом у 15%-ному поліакриламідному гелі, з 8М сечовиною. Зони гелю, що містили повнорозмірні транскрипти, локалізували в ультрафіолетовому світлі на пластині "Silufol", вирізали та проводили елюцію транскриптів 5 - 8 об’ємами буферу: 10 мМ трис-HCl, pН 7,0; 300 мМ NaCl; 1 мМ ЕДТА протягом 16 - 24 годин при 37?С. Елюат екстрагували рівним об’ємом хлороформу і транскрипти з водної фази осаджували етанолом.

Перед аміноацилюванням транскрипти прогрівали при 80оС у буфері: 30 мМ НЕРЕS-KOH, pН 7,6; 5 мМ MgCl2 протягом 2 хвилин, і повільно (впродовж 30 хвилин) охолоджували до кімнатної температури. Реакцію аміноацилювання проводили в буферному розчині, який містив 30мМ HEPES-KOH, pН 7,4; 2,5 мМ MgCl2; 20 мМ KCl; 2 мМ DTT; 2мМ АТР; 30 мкМ [14C] тирозину (13320 МБк/ммоль), 0,05 – 3 мкМ тРНКTyr-транскрипту (або 10 – 300 мкМ сумарної тРНК із дріжджів) і 0,03 – 2,5 мкМ тирозил-тРНК синтетази. Реакцію зупиняли, додаючи 10 об’ємів охолодженої 7%-ної трихлороцтової кислоти, фільтрували через скловолокнисті фільтри GF-C і вимірювали радіоактивність у сцинтиляційному лічильнику "RACK - BETA" (LKB, Швеція). Кінетичні константи реакції аміноацилювання визначали методом Лайнуівера і Берка або методом прямих лінійних графіків (Eisenthal, Cornish-Bowden, 1974).

Результати дослідження та їх обговорення

Конструювання та клонування штучного гена тРНКTyr бика

Для конструювання штучного гена тРНКTyr бика використано шість синтетичних олігодезоксирибонуклеотидів (рис.1). Олігонуклеотиди Y1, Y3, Y5 являють собою (+)ланцюг штучного гена і складають повну послідовність тРНКTyr бика. Олігонуклеотид Y1, крім того, містить послідовність промотору Т7 РНК-полімерази. Вище промотору розташовано липкий кінець сайта рестрикції EcoRI, що спрощує клонування штучного гена в плазміду. Оскільки початок структурної частини штучного гена тРНКTyr бика: 5’-ССТТCGA… є несприятливим для транскрипції Т7 РНК-полімеразою (Milligan et al., 1987), на 5'-кінець структурної частини було введено додатковий гуанозин – G(-1).

Олігонуклеотиди Y2, Y4, Y6 являють собою (-)ланцюг штучного гена тРНКTyr бика з липким кінцем сайта рестрикції BamHI на 3’-кінці. Акцепторний ССА-кінець тРНК, перекриваючись із сайтом BamHI, утворює сайт рестрикції BstNI. Лінеаризація плазмиди рестриктазою BstNI призводить до утворення двоспіральної ДНК-матриці, що закінчується тимідином, комплементарним 3?-кінцевому аденозину тРНКTyr.

Шість олігонуклеотидів попарно комплементарні таким чином, що гібридизація олігонуклеотидів Y1+Y2, Y3+Y4, Y5+Y6 призводить до утворення частково двоспіральних фрагментів ДНК з односпіральними кінцями, причому односпіральні кінці дуплексівY1+Y2 і Y5+Y6 комплементарні односпіральним кінцям дуплексу Y3+Y4. Лігування цих трьох дуплексів дозволило одержати двоспіральний фрагмент ДНК довжиною у 104 пари основ, що включає повну послідовність тРНКTyr бика, з 5’-кінця якої знаходиться промотор Т7 РНК-полімерази. Даний фрагмент ДНК було клоновано у плазміду pUC119 між сайтами рестрикції EcoRI і BamHI. Відповідність нуклеотидної послідовності вставки в отриманій плазміді pBY1.3 очікуваній нуклеотидній послідовності штучного гена тРНКTyr бика було підтверджено секвенуванням плазміди.

Сайт-направлений мутагенез штучного гена тРНКTyr

Нуклеотидну послідовність тРНКTyr-транскрипту дикого типу і варіанти досліджених у роботі мутацій наведено на рис. 2. Для введення нуклеотидних замін у позиції 1 і 72 штучного гена тРНКTyr бика методом ПЛР як матрицю використовували плазміду pBY 1.3, що несе штучний ген тРНКTyr дикого типу. Для заміни цитозину на гуанозин у позиції 1 тРНКTyr використовували 5?-мутантний праймер: 5ґ-Gaattctaatacgactcactatagcttcgatagc-3ґ, ?омплементарний (-) ланцюгу штучного гена дикого типу в ділянці Т7 промотору і 5ґ- частини акцепторного стебла тРНКTyr, за винятком позицій -1 і +1.

Для введення мутацій у позицію 72 використовували набір 3?-мутантних праймерів: 5ґ-ggatcctggt(g,a,t)cttccagccg-3ґ, ?омплементарних (+)-ланцюгу штучного гена дикого типу в 3'-кінцевій ділянці за винятком заміни цитозину в позиції праймера, що відповідає позиції 72 у гені дикого типу, на гуанозин, аденозин чи тимідин.

Разом з мутантними праймерами в ПЛР використовувалися також універсальні

для плазмід серії pUC M13 прямий і M13 зворотній праймери. M13 зворотній праймер гібридизується з плазмідою в ділянці полілінкера вище початку штучного гена, а М13 прямий праймер - в ділянці полілінкера нижче 3'-кінця штучного гена.

При використанні 5'-мутантного праймера в парі з М13 прямим праймером отримано варіант штучного гена з першою парою акцепторного стебла тРНКTyr G1:G72. При використанні 5'-мутантного праймера в парі з кожним із 3'-мутантних праймерів були отримані варіанти штучного гена з першою парою акцепторного стебла: G1:C72, G1:A72 та G1:U72. Нарешті, при використанні 3'-мутантних праймерів у парі з М13 зворотнім праймером отримано варіанти штучного гена з першою парою акцепторного стебла C1:C72, C1:A72 та C1:U72. Оскільки цитозин у першій позиції штучного гена несприятливий для транскрипції Т7 РНК-полімеразою, останні три варіанти мутантних генів (як і ген дикого типу) містили додатковий 5?-кінцевий гуанозин.

Для нуклеотидних замін за методом олігонуклеотидних гетеродуплексів у позиціях штучного гена, що відповідають антикодоновому триплету тРНКTyr бика використовували мутантний праймер: 5'-CTAAGGATCТGGAGTCCTCCGCTC-3', комплементарний ділянці антикодонової петлі (позиції 22-45 тРНКTyr) за винятком позицій 34 і 35 антикодону. В 11-у і 12-у позиції праймера, що відповідають 34-й і 35-й позиціям антикодону, замість цитозину і аденозину було введено два гуанозини, що призвело до заміни в тРНК тирозинового антикодону GUA на триптофановий антикодон CCA (рис. 2). Для заміни в тРНКTyr бика короткої варіабельної петлі (характерної для еукаріотичних тирозинових тРНК) на довгу (характерну для прокаріотичних тирозинових тРНК) використовували синтетичний мутантний праймер: 5'-CGAACCAGCGACGTCTАTGACCTAAGGATCTACA-3',

комплементарний послідовності штучного гена в ділянці 3?-частини антикодонового стебла, варіабельної петлі та 5?-частини Т-петлі. У цьому праймері між позиціями, комплементарними G44 та G45 тРНКTyr бика, вставлено послідовність

5'-GTCTАTGAC-3’, що комплементарна послідовності додаткової петлі тРНКTyr E. сoli (рис. 2).

Комбінація двох описаних вище методів (ПЛР-мутагенезу і методу олігонуклеотидних гетеродуплексів) дозволила одержати варіант штучного гена тРНКTyr з подвійною мутацією: заміною тирозинового антикодону на триптофановий і заміною першої пари C1:G72 на G1:C72. При цьому плазміду, що несе штучний ген тРНКTyr із триптофановим антикодоном використовували як матрицю для введення заміни в першу пару акцепторного стебла методом ПЛР.

Таким чином, поряд із штучним гена дикого типу, було створено ряд мутантних варіантів гена тРНКTyr печінки бика. Транскрипція штучних генів in vitro Т7 РНК-полімеразою дозволила отримати як тРНКTyr- транскрипт дикого типу, так і тРНКTyr- транскрипти з нуклеотидними замінами в першій парі акцепторного стебла, антикодоновому триплеті та варіабельній петлі у препаративних кількостях, достатніх для вивчення їх акцепторних властивостей в реакції аміноацилювання.

Вивчення акцепторних властивостей транскрипту тРНКTyr дикого типу і мутантних транскриптів тРНКTyr у реакції аміноацилювання рекомбінантною тирозил-тРНК синтетазою з печінки бика

Кінетичні параметри реакції аміноацилювання транскрипту TРНК Tyr дикого типу тирозил-TРНК синтетазою з печінки бика. Клонована нами раніше (Леванец и др., 1996,1997) тирозил-тРНК синтетаза з печінки бика є димером б2-типу і, окрім типового для аміноацил-тРНК синтетаз першого класу каталітичного модуля, містить на С-кінці поліпептидного ланцюга додатковий домен, який відсутній у відповідних ферментів прокаріотів та нижчих еукаріотів. Аналіз амінокислотної послідовності С-кінцевого домену (Леванец и др.,1997) показав наявність гомології з некаталітичними доменами метионіл-тРНК синтетази і ?-субодиниці фенілаланіл-тРНК синтетази, а також із С-кінцевою ділянкою білка Arc1p із дріжджів, функція якого (Simos et al., 1996) полягає в неспецифічному зв’язуванні тРНК і спрямуванні їх в активні центри асоційованих з ним аміноацил-тРНК синтетаз.

З метою з’ясування ролі С-кінцевого домену тирозил-TРНК синтетази печінки бика в реакції аміноацилювання повнорозмірний фермент (ТирРС) та фермент, позбавлений С-кінцевого домену (ТирРСДC) були клоновані в плазміду pET23d (Novagen, США). Рекомбінантний повнорозмірний фермент з урахуванням нуклеотидної послідовності вектора має амінокислотну послідовність Met1-Ile527Arg(His)6 і розраховану молекулярну масу 60 кДа, фермент з делецією С-кінцевого домена має амінокислотну послідовність Met1-Ser338AspLysLeuAlaAlaLeuGlu(His)6 і розраховану молекулярну масу 39,9 кДа (рис.3 А). Експресовані в бактеріальній системі ферменти були афінно очищені хроматографією на Ni-NTA агарозі (рис. 3 Б). Як видно із наведених результатів, електрофоретична рухливість отриманих білків відповідає розрахованим молекулярним масам.

Визначення оптимальних для ферментативної активності ТирРС і ТирРСД? концентрацій одно- та двовалентних йонів показало, що обидва ферменти демонструють однакову залежність початкової швидкості реакції аміноацилювання тРНКTyr-транскрипту дикого типу від концентрації йонів Mg2+ у реакційній суміші (рис .4А). Найбільша початкова швидкість аміноацилювання досягається при 2 - 2,5 мМ MgCl2 як для ТирРС, так і для ТирРСДC.

У той же час оптимальні концентрації йонів К+ для двох ферментів різні (рис.4Б). Для ТирРСДC вона складає 15 мМ, у той час як повнорозмірний фермент виявляє максимальну активність при 60 мМ КCl. Така різниця в оптимальних концентраціях K+ може свідчити про участь С-кінцевого домену в йонних взаємодіях із тРНК.

Для того, щоб перевірити, чи не порушує видалення С-кінцевого домену специфічність ферменту, ми порівняли активність повнорозмірної тирозил-тРНК синтетази і тирозил-тРНК синтетази з делецією С-кінцевого домену в реакції вичерпного аміноацилювання сумарної тРНК із дріжджів.

Наведені на рис.5 криві залежності в часі реакції утворення тирозил-тРНК, що каталізує ТирРС і ТирРСД? при концентраціях ферментів, які не лімітують швидкість реакції, показують, що ТирРСД? здатна аміноацилювати тирозином таку ж кількість тРНК з пулу сумарної тРНК, що і ТирРС. Це свідчить про збереження ТирРСД? специфічності до тирозинової тРНК.

Дослідження активності обох ферментів за методами стаціонарної кінетики дали можливість розрахувати основні кінетичні параметри реакції аміноацилювання природної тРНК з дріжджів та транскрипту дикого типу ТРНКTyr бика, а саме: каталітичну константу kcat, константу Міхаеліса КМ і каталітичну ефективність kcat/КМ. Отримані результати наведені в таблиці 1.

З таблиці 1 видно, що каталітична ефективність реакції аміноацилювання як природньої тРНКTyr, так і транскрипту тРНКTyr дикого типу тирозил-тРНК синтетазою, позбавленою С-кінцевого домену, нижча порівняно з ефективністю реакції, що каталізує повнорозмірний фермент. Незалежно від субстрату, ТирРСДC демонструє триразове зниження kcat порівняно з ТирРС. У той же час, делеція С-кінцевого домена по-різному впливає на KM для природньої тРНК і для тРНК - транскрипту.

Якщо KM для природньої тРНК практично однакова при аміноацилюванні обома ферментами, то KM для тРНК-транскрипту при аміноацилюванні ТирРСДC майже на порядок більша, ніж у випадку, коли реакцію каталізує ТирРС. Відповідно і загальна різниця в каталітичній ефективності аміноацилювання тирозил-тРНК синтетазою з делецією С-кінцевого домену порівняно з повнорозмірним ферментом у випадку, коли субстратом є тРНКTyr-транскрипт, виявляється більш значною (у 18 разів), ніж коли субстратом є природна тРНК (у 4 рази).

Наведені результати вказують на те, що додатковий С-кінцевий домен тирозил-тРНК синтетази бика підвищує каталітичну ефективність ферменту. З огляду на той факт, що С-кінцевий домен має РНК-зв’язувальні властивості (Курочкин и др., 1991) можна припустити, що його роль полягає в збільшенні міцності зв’язування тРНК-транскрипту з ферментом. Менш виражений ефект С-домену в аміноацилюванні природньої тРНК порівняно з тРНКTyr-транскриптом, можливо, пояснюється тим, що природна тРНКTyr на відміну від транскрипту містить модифіковані нуклеотиди, які можуть вносити свій вклад у посилення зв’язування (як за рахунок безпосередніх контактів так і опосередковано, через підтримання нативної конформації тРНК), тим самим певною мірою компенсуючи відсутність С-кінцевого домену в ТирРСДC.

Вивчення впливу сайт-направлених мутацій в транскриптах TРНКTyr на їхні акцепторні властивості. З метою з’ясування ролі окремих нуклеотидів тирозинової тРНК печінки бика як детермінант відповідності, було вивчено вплив сайт-направлених нуклеотидних замін на кінетичні параметри реакції аміноацилювання мутантних транскриптів порівняно з транскриптом дикого типу.

У таблиці 2 підсумовано результати визначення кінетичних параметрів реакції аміноацилювання транскриптів тРНКTyr повнорозмірною рекомбінантною тирозил-тРНК синтетазою печінки бика.

Наведені в таблиці 2 дані свідчать про те, що коротка варіабельна петля тРНКTyr не є істотним елементом відповідності для еукаріотичної тирозил-тРНК синтетази, оскільки заміна короткої варіабельної петлі, характерної для еукаріотичних тРНКTyr, на довгу, характерну для прокаріотичних тРНКTyr, не призводить до помітного зменшення ефективності аміноацилювання такого транскрипту. Це узгоджується з даними для дріжджової й архебактеріальної тРНКTyr (Fechter et al., 2000, 2001), отриманими в експериментах із трансплантації набору елементів відповідності тРНКTyr у гетерологічні тРНК.

Нуклеотиди першої пари акцепторного стебла – важливий елемент відповідності транскрипту тРНКTyr. Заміна першої пари C1:G72 (характерної для еукаріотичних тРНКTyr) на G1:C72 (яка є типовою для прокаріотичних тРНКTyr) повністю блокує аміноацилювання мутантного транскрипту еукаріотичним ферментом. Це також збігається з відомими даними, отриманими для тРНКTyr E. coli, архебактерій, дріжджів та мініспіралей еукаріотичної тРНКTyr.

Однак, як випливає з таблиці 2, відносний внесок кожного з нуклеотидів першої пари у відповідність транскрипту в реакції аміноацилювання значно різниться. Основний внесок дає нуклеотид у позиції 72. Якщо в цій позиції знаходиться гуанін, транскрипт є активним субстратом для тирозил-тРНК синтетази бика незалежно від того, цитозин чи гуанін знаходиться в позиції 1.

З іншого боку, якщо в позиції 72 знаходиться цитозин, транскрипт цілком втрачає акцепторну активність, незалежно від нуклеотиду в позиції 1.

Заміна гуаніну-72 на урацил знижує акцепторну активність транскрипту більшою мірою, ніж заміна його на аденін, що видно з порівняння каталітичної ефективності реакції аміноацилювання транскриптів з першими парами акцепторного стебла C1:A72 і C1:U72, а також G1:A72 і G1:U72. При цьому внесок нуклеотиду в позиції 1 залишається помітно меншим, порівняно із внеском нуклеотиду в позиції 72. Наприклад, заміна G72 на U72 призводить до 69-кратного зниження каталітичної ефективності реакції аміноацилювання, а різниця у каталітичній єфективності реакції аміноацилювання транскриптів з першими парами C1:U72 та G1:U72 менш, ніж двократна.

Результати визначення основних кінетичних параметрів реакції аміноацилювання мутантних тРНКTyr-транскриптів рекомбінантною тирозил-тРНК синтетазою, позбавленою додаткового С-кінцевого домену, наведено в таблиці 3.

З таблиці 3 видно, що на якісному рівні розподіл і відносна сила елементів відповідності транскриптів тРНКTyr для ТирРСД? у цілому збігаються з такими для ТирРС.

У той же час, ТирРСД? порівняно з повнорозмірним ферментом виявляє більш високу “чутливість” до нуклеотидних замін у транскриптах. Наприклад, транскрипт із першою парою G1:U72 аміноацилюється повнорозмірною ТирРС у 69 разів менш ефективно, ніж транскрипт дикого типу, у той час як при аміноацилюванні того ж транскрипту ТирРСД? спостерігається 380-кратне зниження каталітичної ефективності реакції.

При цьому для ТирРСД? порівняно з ТирРС стає більш помітним зниження спорідненості мутантних транскриптів до ферменту, про що свідчить збільшення внеску КМ в сумарну втрату каталітичної ефективності реакції аміноацилювання. Це спостереження узгоджується з відзначеною вище здатністю додаткового С-кінцевого домену рекомбінантної тирозил-тРНК синтетази бика підвищувати каталітичну ефективність реакції аміноацилювання тРНКTyr-транскрипту дикого типу саме за рахунок зменшення КМ.

Внесок нуклеотидів у позиціях 34 і 35 антикодону в відповідність тРНКTyr-транскрипту при аміноацилюванні ТирРСД? досить суттєвий, про що свідчить 190-кратне зниження каталітичної ефективності реакції аміноацилювання мутантного в цих позиціях транскрипту порівняно із транскриптом дикого типу. Ці дані вказують також на те, що антикодоновий триплет тРНКTyr впізнається в межах каталітичного 39 кДа модуля ТирРС. Однак, ефект заміни тирозинового антикодону на триптофановий все ж менший, ніж ефект від заміни гуаніну в позиції 72 акцепторного стебла на цитозин або урацил.

Акцепторна активність мутантних транскриптів корелює з їхньою здатністю конкурентно інгібувати аміноацилювання транскрипту дикого типу (рис. 6). Із наведених даних видно, що транскрипт із подвійною заміною: “прокаріотичною” першою парою і триптофановим антикодоном є слабким інгібітором аміноацилювання транскрипту дикого типу. Це вказує на те, що перша пара акцепторного стебла і антикодон – два головні елементи відповідності тРНКTyr- транскрипту, що забезпечують його специфічне впізнавання і зв'язування з ферментом. Порівняння впливу транскрипту з “нормальною” першою парою але мутантним антикодоном і транскрипту з “нормальним” антикодоном, але мутантною першою парою на початкову швидкість реакції аміноацилювання свідчить про те, що здатність конкурувати з транскриптом дикого типу за зв'язування з ферментом пов’язана більшою мірою з першою парою акцепторного стебла і меншою мірою з антикодоном.

Роль амінокислотних залишку Lys147 тирозил-тРНК синтетази бика в реакціх аміноацилювання

У роботі із застосуванням методу сайт-направленого мутагенезу було зроблено спробу ідентифікувати амінокислотні залишки тирозил-тРНК синтетази бика, суттєві для впізнавання нуклеотидів першої пари акцепторного стебла тРНКTyr-транскрипту та дискримінації між “прокаріотичною” та “еукаріотичною” першими парами тРНК. Вибір локалізації і типу амінокислотних залишків для мутагенезу базувався, по-перше, на даних (Wakasugi et al., 1998), які свідчать про важливу роль сполучного пептиду згортки Россмана у впізнаванні акцепторного кінця тРНКTyr тирозил-тРНК синтетазою людини і, по-друге, на результатах експериментів із хімічної модифікації лізинових залишків природної тирозил-тРНК синтетази з печінки бика піридоксаль-5-фосфатом (Гнатенко и др., 1991), які показали, що критичним для активності в реакції аміноацилювання еукаріотичної тРНКTyr є один залишок лізину на молекулу ферменту. Аналіз амінокислотної послідовності тирозил-тРНК синтетази бика у ділянці сполучного пептиду згортки Россмана (амінокислотні залишки 127-162), а також порівняння її з амінокислотною послідовністю сполучного пептиду тирозил-тРНК синтетази E. coli дозволив припустити, що таким критичним лізиновим залишком може бути Lys146 або Lys147. Для перевірки припущення про можливе залучення цих амінокислотних залишків до впізнавання першої пари акцепторного стебла тРНК було отримано два мутантних варіанти тирозил-тРНК синтетази бика: з одинарною заміною Lys147Tyr та з подвійною заміною Lys146Asn, Lys147Tyr.

Мутантні білки було експресовано в бактеріальній системі і тестовано за їхньою здатністю аміноацилювати дріжджову тРНКTyr та тРНКTyr –транскрипти, мутантні в позиціях першої пари акцепторного стебла.

Як показано на рис. 7, заміна вже одного Lys147 призводить до значної втрати мутантною тирозил-тРНК синтетазою ферментативної активності в рекції аміноацилювання природної дріжджової тРНКTyr, що виражається в 28-кратному зниженні початкової швидкості реакції порівняно з ферментом дикого типу. Проте, мутантні ферменти не набули здатності аміноацилювати тРНКTyr-транскрипт з “прокаріотичною”першою парою акцепторного стебла G1:C72 або будь-який інший мутантний в позиціях першої пари тРНКTyr-транскрипт. Вірогідно, ці амінокислотні залишки більшою мірою задіяно в механізмах власне каталізу, аніж у впізнавання першої пари тРНКTyr. Можливо, Lys147 є аналогом амінокислотного залишку Lys151 тирозил-тРНК синтетази Bacillus stearothermophilus (Bedouelle, Winter, 1986), для якого показано участь в утворенні додаткового контакту з нуклеотидом А73 гомологічної тРНК на етапі перенесення активованої амінокислоти на тРНК.

ВИСНОВКИ

1. У дисертаційній роботі досліджено роль окремих структурних елементів тирозинової тРНК та тирозил-тРНК синтетази печінки бика в реакції аміноацілювання. Сконструйовано та клоновано штучний ген тирозинової тРНК печінки бика. Із застосуванням сайт-направленого мутагенезу отримано гени тРНКTyr бика з нуклеотидними замінами в першій парі акцепторного стебла, в антикодоновому триплеті та ділянці варіабельної петлі.

Методами стаціонарної кінетики проведено дослідження впливу нуклеотидних замін на кінетичні параметри реакції аміноацилювання мутантних тРНКTyr-транскриптів рекомбінантною тирозил-тРНК синтетазою печінки бика.

2. Показано, що основною структурною детермінантою відповідності тРНКTyr-транскрипту в ділянці першої пари акцепторного стебла є нуклеотид в позиції 72, в той час як роль нуклеотиду в позиції 1 є значно меншою.

3. Визначено, що нуклеотиди 34 і 35 антикодону є важливими детермінантами відповідності тРНКTyr-транскрипту. Отримані результати свідчать про те, що в реакції аміноацилювання еукаріотичною тирозил-тРНК синтетазою антикодоновий триплет тРНКTyr-транскрипту впізнається в межах 39 кДа каталітичного модуля ферменту.

4. Продемонстровано, що довжина варіабельної петлі тРНКTyr-транскрипту несуттєва для впізнавання еукаріотичною тирозил-тРНК синтетазою в реакції аміноацилювання.

5. Встановлено, що додатковий С-кінцевий домен тирозил-тРНК синтетази бика збільшує каталітичну ефективність реакції аміноацилювання тРНКTyr-транскрипту за рахунок підвищення спорідненості останнього до ферменту.

6. Показано, що амінокислотний залишок Lys147, який локалізований у сполучному пептиді нуклеотидзв’язувального домену є критичним для активності тирозил-тРНК синтетази бика в реакції аміноацилювання гомологічної тРНКTyr.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертаціЇ

1. Найденов В.Г., Вудмаска М.И., Koрнелюк A.И., Maцукa Г.Х. Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК синтетазы из печени быка // Биополимеры и клетка. – 2000. – Т.16, №4. – С. 275-279.

2. Найденов В.Г., Вудмаска М.И., Мацука Г.Х. Кинетические параметры аминоацилирования тРНКTyr транскрипта тирозил-тРНК синтетазой из печени быка // Біополімери і клітина. – 2001. – Т.17, №6. – С. 534-539.

3. Найденов В.Г., Вудмаска М.И., Мацука Г.Х. Роль нуклеотидов в позициях 1 и 72 акцепторного стебля тРНКTyr в аминоацилировании тирозил-тРНК синтетазой печени быка // Біополімери і клітина. – 2002. – Т.18, №1. – C. 71-75.

4. Levanets O.V., Naidenov V.G.,Odynets K.A., Vudmaska M.I., Matsuka G.Kh., Wientjes F. J., Gassen H.G., Kornelyuk A.I. Cloning, seguensing and bacterial expression of bovine tyrosyl-tRNA synthetase // Abstracts of EMBO Workshop on Structure and Function of Aminoacyl synthetases. – Mittelwihr (France). – 1998. – Р.100.

5. Naidenov V.G., Vudmaska M.I., Matsuka G.Kh. The role of G72 for tRNATyr identity //Abstracts of Asilomar Conference on Aminoacyl-tRNA synthetases in Biology, Medicine and Evolution. – Pacific Grove (USA). – 2002. – P.109.

Анотації

Найдьонов В.Г. Вивчення методом сайт-направленого мутагенезу елементів впізнавання тирозинової тРНК тирозил-тРНК синтетазою з вищих еукаріотів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. – Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2002.

Дисертаційна робота присвячена вивченню структурних елементів впізнавання тирозинової тРНК печінки бика гомологічною тирозил-тРНК синтетазою в реакції аміноацилювання з використанням методу сайт-направленого мутагенезу. Показано, що роль першої пари акцепторного стебла як детермінанти відповідності тирозинової тРНК, пов’язана головним чином з нуклеотидом у позиції 72.

З’ясовано, що нуклеотиди 34 и 35 антикодону вносять вклад у відповідність тирозинової тРНК, але менший, ніж нуклеотиди першої пари, в той час як довжина варіабельної петлі не впливає на акцепторні властивості транскрипту. Встановлено, що додатковий С-кінцевий домен тирозил-тРНК синтетази покращує каталітичну ефективність аміноацилювання тРНК-транскрипту, вірогідно за рахунок підсилювання зв’язування останнього з ферментом. Виявлено критичне значення амінокислотного залишку лізин-147 для активності тирозил-тРНК синтетази печінки бика в аміноацилюванні гомологічної тРНК.

Ключові слова: аміноацилювання, тирозил-тРНК синтетаза, РНК-білкова взаємодія.

Найдёнов В.Г. Изучение методом сайт-направленного мутагенеза елементов узнавания тирозиновой тРНК тирозил-тРНК синтетазой из высших эукариотов. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 – молекулярная биология. – Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2002.

Дисcертационная работа посвящена изучению структурных элементов узнавания тирозиновой тРНК печени быка гомологичной тирозил-тРНК синтетазой в реакции аминоацилирования. Был сконструирован и клонирован искусственный ген тирозиновой тРНК печени быка. С использованием сайт-направленного мутагенеза получены мутантные варианты искусственного гена с нуклеотидными заменами, в позициях первой пары акцепторного стебля, антикодонового триплета и вариабельной петли тРНКTyr. В бактериальной системе экспрессии получены рекомбинантные полноразмерная тирозил-тРНК синтетаза печени быка, тирозил-тРНК синтетаза с делецией дополнительного некаталитического С-концевого домена, а также мутантные варианты тирозил-тРНК синтетазы с аминокислотными заменами лизиновых остатков 146 и 147 в соединительном пептиде нуклеотид-связывающего центра фермента. Методами стационарной кинетики проведено сравнение кинетических параметров реакции аминоацилирования мутантных вариантов тРНКTyr-транскриптов с таковыми для транскрипта дикого типа.

Показано, что роль первой пары акцепторного стебля, как сруктурного элемента узнавания транскрипта тирозиновой тРНК, связана главным образом с нуклеотидом в позиции 72, в то время как значение нуклеотида в позиции 1 значительно менее выражена.

Установлено, что нуклеотиды 34 и 35 антикодона вносят существенный вклад в узнавание транскрипта тирозиновой тРНК, хотя и меньший, чем нуклеотиды первой пары акцепторного стебля. Полученные результаты указывают на то, что антикодоновый триплет узнается в пределах 39 кДа каталитического модуля тирозил-тРНК синтетазы.

Показано, что замена в транскрипте тирозиновой тРНК короткой вариабельной петли (эукариотического типа) на длинную (прокариотического типа) не влияет на акцепторные свойства транскрипта в реакции аминоацилирования эукариотической тирозил-тРНК синтетазой.

Установлено, что дополнительный С-концевой домен тирозил-тРНК синтетазы улучшает каталитическую эффективность аминоацилирования тРНК-транскрипта, вероятно за счет усиления связывания последнего с ферментом. Выявлена критическая роль аминокислотного остатка лизин-147 для активности тирозил-тРНК синтетазы печени быка в аминоацилировании гомологичной тРНК.

Ключевые слова: аминоацилирование, тирозил-тРНК синтетаза, РНК-белковое взаимодействие.

Naidenov V.G. Study of elements of tyrosine tRNA recognition by tyrosyl-tRNA synthetase from higher eukaryotes using site-directed mutagenesis. – Manuscript.

Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D) in Biology, speciality 03.00.03 – molecular biology.- Institute of Molecular Biology and Genetics, Natilonal Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

Dissertation is devoted to the study of structure elements of recognition of tyrosine tRNA by eukaryotic tyrosyl-tRNA synthetase using saite-directed mutagenesis as experimental approach. It has been shown that the role of first base-pair of acceptor stem relies mainly on nucleotide in position 72. Nucleotides 34 and 35 of anticodone loop also contribute in tRNA identity but to the lesser extent then nucleotides of first base-pair, whereas the variable loop length does not affect acceptor activity of tRNA-transcript.

It was find out that an additional C-terminal domain of bovine tyrosyl-tRNA synthetase improve the catalytic efficiency of aminoacylation most probably due to the strengthening of tRNA-transcript binding to the enzyme. The critical role of Lys147 residue for aminoacylation activity of bovine tyrosyl-tRNA synthetase has been revealed.

Key words: aminoacylation, tyrosyl-tRNA synthetase, RNA-protein interaction.