ЛЬВІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО

НЕПОМНЯЩИЙ ВАЛЕНТИН МИКОЛАЙОВИЧ

УДК 616.61-006.6-091.8:614.876

ЕКОЛОГІЧНИЙ ПАТОМОРФОЗ ТА ОСОБЛИВОСТІ МОРФОГЕНЕЗУ

НИРКОВОКЛІТИННОГО РАКУ У ХВОРИХ ІЗ ЗАБРУДНЕНИХ

РАДІОНУКЛІДАМИ РЕГІОНІВ УКРАЇНИ

14.03.02 – патологічна анатомія

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Львів – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті урології та нефрології АМН України.

Науковий керівник

академік АМН України, член-кореспондент НАН України,

заслужений діяч науки і техніки України

Романенко Аліна Михайлівна,

Інститут урології та нефрології АМН України,

завідувач лабораторії патоморфології

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор Поспішіль Юрій Олексійович,

Львівський державний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України,

завідувач кафедри патологічної анатомії з курсом судово-медичної експертизи

Заслужений діяч науки і техніки України,

доктор медичних наук, професор Шутка Богдан Васильович,

Івано-Франківська державна медична академія МОЗ України,

завідувач кафедри нормальної анатомії

Провідна установа

Київська державна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України

Захист відбудеться “20” лютого 2002 р. о 10 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 35.600.03 при Львівському державному медичному університеті

імені Данила Галицького МОЗ України (79010, м. Львів, вул. Пекарська, 69)

З дисертацією можна ознайомитися у Науковій бібліотеці Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького (79000, м. Львів, вул. Січових Стрільців, 6)

Автореферат розісланий “15” лютого 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради |

Федорів Я.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Внаслідок Чорнобильської катастрофи до навколишнього середовища потрапило біля 300 MKi радіоактивних продуктів, що призвело до забруднення значних територій, переважно центральної частини України, Південно-Східних областей Білорусі та найближчих до місця аварії районів Європейської частини Росії. На цих територіях проживає понад 17,5 мільйонів осіб, які вже понад 15 років зазнають хронічного впливу низьких доз іонізуючого опромінення (Романенко А.Е., 2000).

Добре відомо, що іонізуюче випромінювання може призводити до індукції у людини пухлин практично будь-якого гістологічного типу із латентним періодом 10-30 років (Присяжнюк А.Е., 1999; Москалев Ю.И., 1991). Наприклад, через 12-20 років після атомного бомбардування Хіросіми спостерігалось виразне зростання захворюваності на солідні злоякісні пухлини, при цьому відносний ризик розвитку нирковоклітинного раку (НКР) на 1 Зв колективної дози – RR1Sv – складав 1,71, а провідними факторами внутрішнього опромінення у віддалені строки, також як і внаслідок Чорнобильської катастрофи, були радіонукліди цезію (Thompson D.E. et al., 1994).

У зв’язку з цим, викликають особливого занепокоєння дані щодо темпу приросту захворюваності на НКР в Україні за останнє десятиріччя. Так, в цілому по країні цей показник склав 59,6%, а у забруднених радіонуклідами областях – 95,0% (Возіанов О.Ф. та співавт., 2000). Наведені дані слугують вагомим аргументом щодо можливого зв’язку підвищення рівня захворюваності на НКР із пролонгованим впливом низькодозового іонізуючого, передусім внутрішнього, опромінення. До того ж, згідно з визначенням патоморфозу – як стійкої зміни в структурі захворюваності під впливом певних зовнішніх чинників, – наявна тенденція може бути охарактеризована й як екологічний патоморфоз НКР (Возианов А.Ф. и соавт., 2001).

Проте, патоморфоз – це не тільки стійка зміна захворюваності, а й суттєві, сталі зміни морфологічної картини хвороби під впливом різноманітних факторів довкілля (Серов В.В., 1997). Тому в умовах зростання захворюваності на НКР в Україні, особливо у забруднених радіонуклідами регіонах (ЗРР), можна очікувати прояви екологічного патоморфозу – відмінності цито- та гістологічних характеристик НКР, а також зміни імуногістохімічної реактивності пухлинних клітин, що простежуються при дослідженні маркерів проліферативної активності та завдяки вивченню експресії онкопротеїнів с-erbb-2 (hER-2/neu), K-ras (р21ras) та протеїну р53, які визначають біологічну поведінку НКР, у тому числі й чутливість до протипухлинної терапії (Girgin C. et al., 2001; Zisman A. et al., 2001; Seliger B. et al., 2000). Останнє є пріоритетним у формуванні сучасної стратегії щодо подолання наявної несприятливої тенденції (Возианов А.Ф. и соавт., 2001).

У той же час, розвиток новітніх підходів до консервативного лікування прогресуючого та метастатичного НКР із застосуванням моно- та комбінованої інтерферонотерапії також потребує свого вивчення, особливо в умовах, що склалися. Тому імуногістохімічне дослідження у тканині пухлини експресії рецептора інтерферону І типу (IFNR-I), з яким зв’язуються для реалізації біологічної дії інтерферони альфа та бета, має сприяти визначенню критеріїв відбору хворих для ефективної протипухлинної терапії НКР.

Таким чином, наведене обґрунтовує актуальність та доцільність вивчення проблеми екологічного патоморфозу та особливостей морфогенезу НКР у хворих, які тривалий час мешкають у забруднених радіонуклідами регіонах України (ЗРРУ) та зазнають хронічного впливу низькодозового іонізуючого опромінення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної наукової роботи, що виконується за планом науково-дослідної теми, затвердженої Академією медичних наук України, № 0196U013011 державної реєстрації, одним із виконавців якої є автор, а також за грантом Університету м. Валенсія та Міжнародної комісії Науки та Технології (SAF 97/0205). Тему дисертації затверджено на засіданні Вченої ради Інституту урології та нефрології АМН України (Протокол № 2 від 8 лютого 2000 р.), а також на засіданні РПК “Патологічна анатомія” МОЗ і АМН України (Протокол № 1 від 29 лютого 2000 р.).

Мета роботи: визначити біологічні основи екологічного патоморфозу та особливості морфогенезу НКР у хворих–мешканців ЗРРУ та м. Києва на підставі морфологічного та імуногістохімічних досліджень пухлини та перитуморальної тканини нирки.

Задачі дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

Об’єктом дослідження є первинна пухлина та перитуморальна тканина нирки, отримані у хворих на НКР шляхом радикальної нефректомії.

Предмет дослідження – морфологічні та імуногістохімічні характеристики НКР та особливості його морфогенезу у хворих–мешканців ЗРРУ та м. Києва.

Методи дослідження. Для визначення характеристик екологічного патоморфозу та особливостей морфогенезу НКР в роботі використовувались загальногістологічний, гістохімічні (PAS- та PAMS-реакції, трихроматичне забарвлення за Массоном), імуногістохімічний (імунопероксидазний АВС-метод), спектрорадіометричний та кількісні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в результаті комплексного морфологічного та імуногістохімічного дослідження отримані відомості щодо проявів екологічного патоморфозу та особливостей морфогенезу НКР у хворих–мешканців ЗРРУ та м. Києва. Встановлено, що екологічний патоморфоз НКР у хворих зазначених категорій характеризується істотним зростанням гістологічного ступеня злоякісності НКР, високою проліферативною активністю пухлинних клітин та підвищенням частоти експресії в них онкопротеїнів K-ras і с-erbb-2. Показано, що особливостями морфогенезу НКР у хворих із ЗРРУ та м. Києва є виразне зростання частоти осередків епітеліальної ядерної атипії (е.я.а.) та карциноми in situ з високою проліферативною активністю та експресією в них онкопротеїнів K-ras і с-erbb-2.

На підставі виявленої прямої кореляційної залежності між рівнем експресії PCNA, онкопротеїнів K-ras і с-erbb-2 у пухлинних клітинах та осередках е.я.а. у перитуморальній тканини нирки хворих на НКР доведено об’єктивний характер осередків е.я.а. (звивистих канальців, збиральних трубочок та сосочкових протоків) як передракового стану щодо НКР.

Визначений комплекс змін у перитуморальній тканині нирки хворих на НКР із ЗРРУ та м. Києва у вигляді виразного зростання частоти осередків е.я.а. та карциноми in situ (з високою проліферативною активністю цих осередків та експресією в них онкопротеїнів K-ras і с-erbb-2) на тлі інтерстиціального склерозу та змін клубочків (подібних до ранньої мембранозної нефропатії) запропоновано іменувати проліферативною атиповою склерозуючою нефропатією у зазначених категорій хворих.

Наукове та практичне значення одержаних результатів. Виявлені морфологічні та імуногістохімічні особливості пухлини та перитуморальної тканини нирки у хворих на НКР із ЗРРУ та м. Києва, що свідчать про наявні зміни біології НКР у бік зростання злоякісності фенотипу останнього, дозволяють віднести хворих цих категорій до групи підвищеного ризику щодо розвитку прогресуючого та метастатичного НКР.

Встановлено закономірності морфологічного дослідження, що полягають у кореляції між макроскопічною та мікроскопічною характеристикою НКР.

Зважаючи на виявлену виразну гетерогенність характеру експресії IFNR-I в клітинах НКР, вельми доцільними визнані подальші дослідження імуногістохімічної експресії цього маркера у первинній пухлині хворих на НКР з аналізом віддалених ефектів інтерферонотерапії, що має на меті доповнення існуючих клінічних критеріїв відбору хворих імуноморфологічними та сприятиме підвищенню ефективності інтерферонотерапії генералізованого НКР.

Відпрацьований протокол морфологічного та імуногістохімічного дослідження операційного матеріалу, що дозволяє виділяти хворих на НКР з підвищеним ризиком генералізації процесу, впроваджено в практичну роботу Інституту урології та нефрології АМН України.

Особистий внесок здобувача. Розробку завдань дослідження, відбір хворих, морфологічну діагностику, аналіз та фотодокументування усіх гістологічних препаратів, кількісний аналіз й статистичну обробку отриманих результатів, підготовку наукових даних до 12 публікацій проведено автором самостійно, 4 публікації у закордонних виданнях підготовлено академіком АМН України, член-кореспондентом НАН України, професором А.М. Романенко. Визначення рівня питомої активності 137Cs у добовій сечі хворих здійснено дисертантом спільно зі старшим інженером О.В. Михайловим (НЦРМ АМН України). Проведення гістохімічних досліджень здійснено за допомогою професора Т.М. Антонович (Інститут патології Збройних сил США – AFIP, м. Вашингтон, США). Визначення експресії протеїнів PCNA та р53, онкопротеїнів с-erbb-2 та K-ras, а також IFNR-I здійснено спільно зі співробітниками Відділу Патології Університету м. Валенсія, Іспанія (керівник – професор А. Лломбарт-Бош)) Автор висловлює щиру подяку співробітникам вищеназваних наукових установ за допомогу в роботі., кількісний аналіз та статистичну обробку отриманих даних проведено автором самостійно. Узагальнення отриманих результатів, обґрунтування висновків та практичних рекомендацій проведено разом із науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися й обговорювалися на науково-практичній конференції "Новое в патологии: теория и практика" (м. Стамбул, Туреччина, 1999), XVII Європейському Конгресі Патології та XIX Іспанському Конгресі Патології (м. Барселона, Іспанія, 1999), на III науковій конференції молодих вчених “Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (м. Київ, 2000), на І Міжконтинентальному Конгресі Патології (о. Мадейра, Португалія, 2000), на II Конгресі онкологів країн СНД за участю вчених Європи, Америки та Азії “Онкологія – 2000” (м. Київ, 2000), на конференції молодих вчених “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (м. Київ, 2000), на I та ІІ Українських конференціях молодих вчених присвячених пам’яті академіка В.В. Фролькіса (м. Київ, 2000, 2001), та на VIII науковій конференції “Новые методы и разработки в онкоморфологии” (м. Москва, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 робіт, серед них 5 статей у фахових наукових виданнях України, 2 статті в іноземних журналах та 9 робіт у матеріалах і тезах конференцій та конгресів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, 6 розділів власних досліджень, висновків, списку використаних джерел та додатку. Робота викладена на 160 сторінках (основна частина 120 сторінок), ілюстрована 50 рисунками та 22 таблицями. Список літератури викладено на 24 сторінках, він складається з 218 інформаційних джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Дисертаційна робота ґрунтується на результатах комплексного гістологічного, гістохімічного та імуногістохімічного дослідження пухлини та перитуморальної тканини нирки 417 хворих на НКР. Операційний матеріал було отримано від хворих на НКР, прооперованих в Інституті урології та нефрології АМН України протягом 1993-2000 років. (операція – радикальна нефректомія), а також від аналогічних хворих з м. Валенсія. Вік хворих від 18 до 79 років (середній – 56 років). Українські пацієнти були розподілені на три групи: з “чистих” регіонів (контрольна), ЗРРУ та м. Києва. Хворі на НКР з м. Валенсії склали окрему групу, контрольну щодо групи хворих з м. Києва. Розподіл та характеристика хворих за групами подано в табл. 1.

Таблиця 1

Розподіл хворих на НКР за групами дослідження

Характеристика | Групи хворих

“чисті”

регіони | ЗРРУ | м. Київ | м. Валенсія

Рівень територіального забруднення за 137Cs, Kі/км2 | 0,44-4,67) Загальнодозиметрична паспортизація населених пунктів України, які підпали під радіаційне забруднення після Чорнобильської аварії. Збірник 6. – К.: Медэкол, 1997. – 103 с.

2) Raes F., De Cort M., Graziani G. Multi-fractal nature of radioactivity deposition on soil after the Chernobyl accident // Health Phys. - 1991. - V. 61. - P. 271-273. | 0,5-5,02

Кількість хворих:

всього (n= 417)

за статтю:

жінок (n= 161)

чоловіків (n= 256) | 94

37

57 | 90

34

56 | 133

56

77 | 100

34

66

Співвідношення за статтю | 1:1,5 | 1:1,7 | 1:1,4 | 1:1,9

Середній вік (віковий діапазон) | 55 (21-79) | 53 (21-75) | 56 (18-77) | 57 (26-77)

Для ідентифікації випадків НКР за клініко-анатомічною стадією було застосовано п’яте видання класифікації TNM пухлин нирки Міжнародного протиракового Союзу (Bostwick D. et al., 1998). Гістологічна форма НКР визначалася згідно з міжнародною гейдельберзькою класифікацією нирковоклітинних пухлин (Kovacs G. et al., 1997). Ступінь злоякісності НКР встановлювався за системою ядерної градації Фурмана (Montironi R. et al., 2000; Usubutun A. et al., 1998; Dupre F. et al., 1998; Fuhrman S.A. et al., 1982).

Операційний матеріал, отриманий шляхом радикальної нефректомії, попередньо вивчався макроскопічно. Для цього його розрізали вздовж через тканину пухлини та перитуморальну тканину нирки на паралельні пластини завтовшки до 0,5 см, після чого фіксували протягом доби у 10% водному розчині нейтрального формаліну. Вирізку матеріалу проводили після фіксації. У кожному випадку отримували 4-8 шматочків тканини пухлини, 3-4 шматочки на межі пухлини з навколишніми тканинами та 3-4 шматочки з перитуморальної тканини нирки. Отриманий матеріал зневоднювали у спиртах висхідної концентрації та заливали у парафін за звичайною методикою. З метою діагностики патологічного процесу та морфологічного вивчення операційного матеріалу, всі мікротомні зрізи завтовшки 4-5 мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином, а перитуморальну тканину нирки, до того ж, із застосуванням трихроматичного методу Массона, PAMS – перйодного кислого метенамінового срібного забарвлення за методом Джонса-Моурі та PAS – перйодного кислого забарвлення за методом Шиффа (Heptinstall R. H., 1992; Churg J. et al., 1982; Antonovych T., 1980).

Згідно з задачами роботи, із застосуванням стандартного авидин-біотинового методу проводились дослідження експресії протеїнів PCNA та p53, онкопротеїнів K-ras та с-erbb-2, а також IFNR-I. Визначення експресії PCNA застосовували з метою оцінки проліферативної активності пухлинних клітин та епітелію канальців, збиральних трубочок й сосочкових протоків перитуморальної тканини нирки. Дослідження експресії онкопротеїнів K-ras та с-erbb-2, а також протеїнів p53 та IFNR-I було проведено для вивчення біологічних особливостей клітин НКР та епітелію перитуморальної тканини нирки. Використовувалися моноклональні антитіла миші до протеїнів p53 та PCNA фірми "DAKO" (Glostrup, Данія), поліклональні антитіла щура до онкопротеїнів K-ras (Santa Cruz Biotechnology, CШA) та с-erbb-2 (Triton Biosciences, CШA), а також моноклональні антитіла миші проти IFNR-I – IFN-R3 в робочому розведенні 1:200, 1:50, 1:100, 1:40 та 1:200 відповідно. Для проведення дослідження також використовувались універсальні Kit-набори фірми “Vector” (Vector Laboratories, США). Всі реакції були проявлені у розчині 3'-3'-діамінобензидина тетрахлориду (DAB) та дозабарвлені гематоксиліном Майера. Кожного разу застосовувався позитивний та негативний контроль.

Позитивним результатом імуногістохімічного дослідження експресії р53 та PCNA вважалось виразне, темно-коричневе рівномірно-гранулярне забарвлення ядер клітин без забарвлення цитоплазми. Результати дослідження експресії р53 та PCNA оцінювались за індексом експресії – відсотком клітин із позитивним забарвленням ядер. При цьому переглядались декілька ділянок, які складалися не менш, ніж із 2000 клітин. Виводились середні значення показника з довірчими інтервалами для кожної групи спостережень. Позитивним результатом дослідження експресії онкопротеїнів K-ras та с-erbb-2, а також протеїну IFNR-I вважалось мембранне або цитоплазматичне коричневе забарвлення, без забарвлення ядер клітин.

У 36 хворих із різних регіонів України (“чистих” регіонів, ЗРР та мешканців м. Києва) визначена активність 137Cs у добовій сечі. Дослідження проводилися на протязі 1999-2000 рр. Визначення питомої активності 137Cs у зразках сечі проводилось методом гамма-спектрометрії в посудинах типу Марінеллі об’ємом 1 дм3 із використанням спектрометричної системи “ADCAM-100” (виробництва фірми ORTEC, США) протягом 7200 секунд. Мінімальна детектована активність при вимірюванні в посудині Марінеллі об’ємом 1 дм3 протягом 3600 секунд за енергетичною лінією 661,66 кеВ (137Cs) – 0,3 Бкл-1. У випадках, коли об’єм добового діурезу був менший, ніж 1 дм3, решту об’єму посудини заповнювали дистильованою водою. Для визначення активності 137Cs у добовій сечі отриманий показник питомої активності помножувався на добовий діурез (у літрах).

Отримані в роботі результати спектрорадіометричного, морфологічних та імуногістохімічних досліджень було оброблено за допомогою ПЕОМ варіаційно-статистичними методами з використанням статистичного пакету Microsoft Excel-2000 (Лапач С.Н. и соавт., 2000).

Результати досліджень, їх аналіз та обговорення. Проведене морфологічне дослідження, в якому основна увага приділялась вивченню прогностично значущих характеристик НКР, показало істотне переважання частоти НКР високого гістологічного ступеня злоякісності серед хворих із ЗРРУ та м. Києва на тлі маловиразного зменшення серед них частоти пізніх за категорією T системи TNM випадків НКР (Т3+Т4) й сталого співвідношення за клітинним варіантом НКР (табл. 2). Зважаючи на особливе значення серед морфологічних прогностичних факторів НКР гістологічного ступеня злоякісності, прогностична цінність якого, переважає таку ж інших морфологічних ознак, у тому числі й системи TNM (Magyarlaki T. et al., 2001; Dupre F., 1998), отримані дані слугують вагомим свідченням несприятливої прогностичної тенденції у хворих із ЗРРУ та м. Києва.

Таблиця 2

Морфологічна характеристика НКР у хворих досліджуваних груп

Показники | Групи хворих | Прим.

“Чисті”

регіони,

n= 94 | ЗРРУ,

n= 90 | м. Київ,

n= 133 | м. Валенсія, n= 100

Категорія T системи TNM: | 2 = 14,5

(р= 0,11)

T1 | 45 (48%) | 49 (54%) | 68 (51%) | 39 (39%)

T2 | 26 (28%) | 28 (31%) | 45 (34%) | 34 (34%)

T3 | 15 (16%) | 8 (9%) | 14 (10%) | 12 (12%)

Т4 | 8 (8%) | 5 (6%) | 6 (5%) | 15 (15%)

Клітинний варіант: | 2 = 6,9

(р= 0,86)

Конвенційний | 67 (72%) | 61 (68%) | 89 (67%) | 67 (67%)

Папілярний | 16 (17%) | 13 (14%) | 21 (16%) | 16 (16%)

Хромофобний | 5 (5%) | 7 (8%) | 10 (7%) | 3 (3%)

Збиральних протоків | 2 (2%) | 3 (3%) | 5 (4%) | 3 (3%)

Недиференційований | 4 (4%) | 6 (7%) | 8 (6%) | 11 (11%)

Ступінь злоякісності: | 2 = 29,4

(р< 110-4)

1 | 15 (16%) | 17 (19%) | 22 (17%) | 19 (19%)

2 | 61 (65%) | 41 (46%) | 45 (34%) | 54 (54%)

3/4 | 18 (19%) | 32 (35%) | 66 (50%) | 27 (27%)

Наявність осередків саркомоподібного росту | 16 (17%) | 25 (28%) | 38 (29%) | 11 (11%) | 2 = 13,7

(р< 0,005)

Як відомо, зміна концепції класифікації гістологічних варіантів НКР призвела до втрати самостійності такої форми як саркомоподібний НКР, що зумовлено неоднорідністю його гістогенетичних характеристик та можливістю розвитку на тлі будь-якого варіанту НКР внаслідок прогресуючої катаплазії (Peralta-Venturina M. et al., 2001; Redondo-Martinez E. et al., 2000; Delahunt B. et al., 1999). Однак, надзвичайно важливим у прогностичному відношенні вважається наявність зон саркомоподібного росту (веретеноподібної метаплазії) за будь-якого варіанту НКР (Peralta-Venturina M. et al., 2001; Redondo-Martinez E. et al., 2000; Cangiano T. et al., 1999). Тому ми вважали за доцільне самостійне вивчення частоти веретеноподібної метаплазії НКР серед хворих досліджуваних груп, в результаті якого виявлено закономірність (табл. 2), аналогічну до розподілу частоти високих гістологічних ступенів злоякісності НКР (3/4), що, з одного боку, вочевидь відображає залежність інтегральної оцінки останнього від наявності осередків саркомоподібного росту (r= +0,76 0,11; р 0,001), а з іншого – є самостійним свідченням прогностично несприятливої тенденції серед хворих на НКР із ЗРРУ та м. Києва.

Отримані в процесі нашої роботи дані щодо частоти е.я.а. у перитуморальній тканині нирки хворих на НКР із різних груп в середньому були близькими до даних літератури (Tulunay O. et al., 2001; Prati G. et al., 1998; Lai R. and Mourad W., 1996; Mourad W. et al., 1994). Проте, відмічалось значне коливання показника частоти е.я.а. за групами, що зумовлено виразним його зростанням серед хворих із ЗРРУ та м. Києва (65 та 46%, відповідно, проти 34 та 12% у контрольних групах, р< 110-6). Аналогічні дані отримано й при окремому дослідженні частоти карциноми in situ – як крайнього ступеня виразності е.я.а. (36 та 28%, відповідно, проти 18 та 6% у контрольних групах, р<110-5). Крім того, виявлено інверсію вікової залежності частоти е.я.а. серед хворих із ЗРРУ. При цьому, якщо наявність такої вікової залежності (в контрольній групі) узгоджується з уявленнями про передрак та рак як вікової патології, що ґрунтується, зокрема, на генно-регуляторних зв’язках старіння та пухлинного росту, а також, виходячи з принципу “чим старші, тим триваліші” по відношенню до дії численних канцерогенів (Фролькис В.В., 1999), то інверсія її у хворих із ЗРРУ – свідчення вагомішого генотоксичного впливу переважно серед пацієнтів більш молодого віку.

Таким чином, виявлене зростання частоти е.я.а., а також карциноми in situ в епітелії звивистих канальців, збиральних трубочок та сосочкових протоків серед хворих на НКР із ЗРРУ і м. Києва слід визнати свідченням розвитку несприятливих морфологічних змін у перитуморальній тканині нирки хворих зазначених категорій.

Проблемою, що потребує додаткового дослідження, є виявлені зміни клубочків у перитуморальній тканині нирки хворих на НКР, переважно із ЗРРУ та м. Києва, у вигляді вогнищевого або дифузного потовщення гломерулярної капілярної стінки зі зменшенням просвіту капілярних петель, особливо зі згрубленням гломерулярної базальної мембрани, які нагадують ранню мембранозну трансформацію (2 = 11,3; р< 0,01). Проблема полягає в тому, що, з одного боку, за будь-якого злоякісного новоутворення, включаючи НКР, можливий розвиток паранеопластичної нефропатії, основною морфологічною формою якої найчастіше виступає мембранозна нефропатія – до 80-89% випадків (Wagrowska-Danilewicz M. et al., 1995; Nishibara G. et al., 1996; Schwartz M. et al., 1992). За таких умов, у хворих зазвичай розвиваються нефротичний, рідше сечовий, синдроми (Nishibara G. et al., 1996; Olson J. et al., 1992; Wagrowska-Danilewicz M. et al., 1995), що в переважній більшості досліджених нами випадків клінічно не підтверджено. З іншого боку, вплив іонізуючого випромінювання здатний викликати радіаційну нефропатію, в тому числі з охарактеризованими вище ознаками, проте – за високих доз та також із розвитком більш виразної нефрологічної симптоматики (Heptinstall R., 1992). У той же час, існуючі дотепер дані з клініко-морфологічного дослідження стану нирок в учасників ліквідації аварії на ЧАЕС, свідчать про наявність ушкоджень клубочків та дрібних артерій нирки, подібних до виявлених нами у перитуморальній тканині хворих на НКР із ЗРРУ та м. Києва, як за наявності виразних гіперкреатинінемії, протеїнурії та артеріальної гіпертензії, так і стертої клініки (Романенко А.М. та співавт., 1999; Непомнящий В.М. та співавт., 1999; Мельник Т.В., 1996).

Протягом останніх двох десятиріч в онкоморфології докорінно змінилася ситуація з виявлення прогностичних факторів, головним чином завдяки широкому впровадженню імуногістохімічних методів. У зв’язку з цим, серед численних прогностичних критеріїв щодо НКР великого значення надається ряду імуногістохімічних прогностичних маркерних білків, серед яких – PCNA, с-erbb-2, K-ras та р53 (Girgin C. et al., 2001; Seliger B. et al., 2000; Haitel A. et al., 2000; Delahunt B. et al., 1998; Morell-Quadreny L. et al., 1998; Roth S. et al., 1997).

Отримані нами дані про значне переважання середніх показників індексу експресії PCNA у хворих із ЗРРУ та м. Києва, порівняно до хворих контрольних груп (табл. 3), стало ще одним свідченням несприятливої прогностичної тенденції серед хворих названих груп. Це підтверджується й за наявності прямої залежності індексу експресії PCNA від гістологічного ступеня злоякісності (Delahunt B. et al., 1999; Sejima T. et al., 1999; Morell-Quadreny L. et al., 1998). Так, проведений порівняльний аналіз експресії PCNA у досліджуваних групах показав аналогічну різницю поміж групами при низьких ступенях злоякісності (1+2), але не при високих (3+4), що свідчить про зростання середніх показників індексу PCNA у хворих на НКР із ЗРРУ та м. Києва саме за рахунок підвищення проліферативної активності клітин пухлини низьких ступенів злоякісності.

До теперішнього часу відомо, що мутації, як правило, ампліфікації гену K-ras та гіперекспресія його протеїну в клітинах пухлини, зокрема НКР, корелюють з гіршим прогнозом, оскільки сприяють швидкій прогресії та агресивності НКР (Kozma L. et al., 1997; Roth S. et al., 1997; Waldmann V. et al., 1996). При чому, передбачається, що такий ефект є наслідком не тільки позитивного впливу ras-протеїнів на проліферацію (Kozma L. et al., 1997; Shinohara N. et al., 1997), а й результатом інгібіції процесів міжклітинної комунікації внаслідок фосфориляції молекул міжклітинної адгезії (Brownell H. et al., 1996). Відомо, що мутації протоонкогену ras нерідко спостерігаються у радіаційно-індукованих пухлинах (Nakao A. et al., 2000), хоча, загалом, частка ras-мутацій при НКР не є високою – до 16% (Kozma L. et al., 1997; Volm M. et al., 1993). Тому, отримані нами дані про статистично вірогідне підвищення частоти експресії K-ras у хворих на НКР із ЗРРУ та м. Києва (табл. 3), особливо, зважаючи на наявність позитивної кореляції між експресією K-ras у пухлині та осередках е.я.а. в перитуморальній тканині нирки, свідчать про зростання ролі онкогена ras в канцерогенезі НКР у зазначених категорій хворих. Крім того, виявлене вірогідне збільшення частоти експресії K-ras серед хворих старших вікових груп та мешканців територій з більш високим рівнем забруднення радіоцезієм (понад 1 Кі/km2), в першому випадку може бути наслідком вищого сумарного канцерогенного навантаження з віком (Фролькис В.В., 1999), в другому – незалежним свідченням K-ras-активації у хворих-мешканців ЗРРУ.

Таблиця 3

Результати імуногістохімічних досліджень НКР у хворих досліджуваних груп

Показники | Групи хворих | Прим.

“Чисті”

регіони | ЗРРУ | м. Київ | м. Валенсія

Індекс PCNA, %

CI95, % |

14,1

6,8-21,4

n= 26 | 21,8

15,7-27,9

n= 34 | 27,6

23,2-32,0

n= 120 | 6

3,3-8,7

n= 100 | F= 7,7

(р< 110-4)

K-ras (+) | 10/26) Тут і далі: у числівнику – кількість позитивних, у знаменнику – кількість усіх випадків. (38%) | 20/34 (59%) | 71/120 (59%) | 38/100 (38%) | 2 = 12,2

(р< 0,01)

c-erb-b2 (+) | 5/17 (29%) | 25/38 (66%) | 17/52 (33%) | не досл. | 2 = 11,5

(р< 0,005)

Індекс р53, %

CI95, % | 10,7

2,9-18,5

n= 18 | 15,1

6,7-23,5

n= 18 | 7,7

2,5-12,9

n= 18 | не досл. | F= 1,0

(р= 0,37)

Вагомим фактором агресивності пухлини, її метастатичного потенціалу та негативного прогнозу, зокрема при НКР, є онкопротеїн с-erbb-2, ампліфікація та гіперекспресія якого спостерігається у понад 30% випадків НКР (Seliger B. et al., 2000; Zhang X. et al., 1997).

Отримані нами результати свідчать про наявність виразної експресії с-erbb-2 у понад 40% випадків НКР зі значним коливанням за групами, що обумовлено статистично вірогідним підвищенням с-erbb-2-імунореактивності саме серед хворих із ЗРРУ (табл. 3). До того ж, як і у випадках з експресією K-ras та PCNA, спостерігається наявність позитивної кореляції між експресією с-erbb-2 у пухлині та осередках е.я.а., що вказує на спадкоємність змін у пухлині та перитуморальній тканині нирки.

Вагомого значення у канцерогенезі людини надається одному з найважливіших пухлинно-супресорних генів – р53, з мутаціями якого пов’язаний розвиток понад половини всіх новоутворень (Greenblatt M. et al., 1994). Проте, щодо значної ролі пошкодження механізму р53 при НКР у літературі немає єдиної думки (Haitel A. et al., 2000; Vasavada S. et al., 1998).

Отримані нами дані щодо індексу експресії р53 у пухлинних клітинах НКР виявилися подібними до даних літератури (Haitel A. et al., 2000; Zhang X. et al., 1997) та характеризувалися помірним коливанням показників за групами із переважанням серед хворих із ЗРРУ, проте різниця статистично не значима (табл. 3). Співпала з даними літератури (Moch H. et al., 1997) й виявлена нами позитивна кореляція між індексом експресії р53 та проліферативною активністю клітин НКР (r= +0,30 0,17; р 0,05). Водночас, ані в жодному випадку (n= 25) не показано позитивної р53-експресії в осередках е.я.а. та карциноми in situ у перитуморальній тканині нирки, що дозволяє погодитись з думкою ряду авторів про вагоме значення епігенетичних змін р53 в розвитку НКР лише на досить пізньому етапі пухлинної прогресії (Haitel A. et al., 2000; Zhang X. et al., 1997).

Наведені вище результати морфологічних та імуногістохімічних досліджень тканини пухлини у хворих на НКР із різних регіонів України та м. Валенсії демонструють виразне зростання частоти виявлення серед хворих із ЗРРУ та м. Києва цілого ряду несприятливих у прогностичному відношенні ознак, які свідчать про наявні зміни біологічних властивостей НКР. Причому, роль останніх щодо погіршення прогнозу, передусім, пов’язана із підвищеним ризиком генералізації НКР (Girgin C. et al., 2001; Zisman A. et al., 2001; Pantuck A. et al., 2001; Onodera Y. et al., 2000; Minervini R. et al., 2000). За таких умов, ще актуальнішою постає проблема протипухлинної терапії НКР, насамперед, серед критичних груп хворих – із ЗРРУ та м. Києва.

За даними різних авторів 50 – 60% хворих на НКР із вперше встановленим діагнозом мають прогресуючий або метастатичний НКР, а п’ятирічне виживання серед них не перевищує 20% (Magyarlaki T. et al., 2001; Tate J. et al., 2001). До того ж, НКР відрізняється виразною резистентністю до системної цитотоксичної хіміотерапії та променевої терапії (Vuky J. et al., 2000; Bukowski R. et al., 2000). Також не є вагомим самостійне значення циторедуктивної хірургії щодо збільшення тривалості життя хворих на метастатичний НКР (Flanigan R. et al., 2001). Тому, протягом останніх років значна увага при розробці ефективної протипухлинної терапії генералізованого НКР зосереджується на цитокіновій терапії, зокрема із застосуванням інтерферонів (IFN) та інтерлейкінів (ІL) (Flanigan R. et al., 2001; Pavone L. et al., 2001; Tate J. et al., 2001; Pizzocaro G. et al., 2001; Tamura T. et al., 2001; Schmidinger M. et al., 2001).

Використання різних класів інтерферонів для лікування метастатичного НКР визнано перспективним ще на початку 80-х років XX сторіччя (Pizzocaro G. et al., 2001). Взаємодія інтерферонів з клітинами-мішенями здійснюється за допомогою мембранних рецепторів, при цьому певну роль можуть відігравати й розчинні сироваткові рецептори (Kanayama H. et al., 2000; Возианов А.Ф. и соавт., 1998). IFN-альфа, IFN-бета та IFN-омега зв’язуються зі спільними рецепторами, які частіше іменуються рецепторами інтерферону першого типу (type I IFNR) – IFNR-I. Проте, роль експресії IFNR-I, зокрема у пухлинних клітинах НКР, щодо ефективності лікування метастатичного НКР рекомбінантними людськими інтерферонами-альфа лишається невідомою (Vuky J. et al., 2000; Morell-Quadreny L. et al., 1999).

Отримані у процесі нашої роботи дані, щодо експресії IFNR-I у первинній пухлинній тканині хворих на НКР, показують, що частота позитивних випадків загалом складає біля 80%, проте з розповсюдженістю понад 50% пухлинних клітин – лише у 40% випадків. У хворих із ЗРРУ та м. Києва частота IFNR-I-позитивних випадків була дещо вищою, порівняно до контрольної групи з “чистих” регіонів (86%, 81% та 69% відповідно, проте р 0,05). Поряд із тим, наявність експресії IFNR-I у тканині пухлини, ще не є свідченням прямої чутливості останньої до IFN І типу, оскільки при цьому не відома здатність лігандів рецепторів до зв’язування IFN (Morell-Quadreny L. et al., 1999; Navarro S. et al., 1996). Проте, за даними літератури (Bukowski R. et al., 2001; Jonasch E. et al., 2001; Возианов А.Ф. и соавт., 1998) тільки за рахунок прямого дозозалежного цитотоксичного впливу IFN на пухлинні клітини НКР майже на 70% гальмується їх проліферація та ріст, що у певній міри співпадає з отриманими нами даними та свідчить про наявність чималого резерву для підвищення ефективності інтерферонотерапії НКР.

Важливим свідченням можливості застосування оцінки експресії IFNR-I у первинній пухлинній тканині хворих на НКР для прогнозування ефективності інтерферонотерапії при метастатичному раку слід визнати дотримання характеру експресії IFNR-I первинної пухлини і в пухлинних клітинах метастазів (Morell-Quadreny L. et al., 1999). Водночас, ефективність лікування IFN-альфа не перевищує частки позитивних зрушень більше третини випадків метастатичного НКР, що, у свою чергу, може бути наслідком подальшої прогресії пухлинного процесу, у тому числі зі зміною характеру експресії IFNR-I у пухлинних клітинах (Magyarlaki T. et al., 2001; Jonasch E. et al., 2001; Morell-Quadreny L. et al., 1999). Так, навіть у пухлинних клітинах первинної пухлини спостерігається виразна гетерогенність локалізації експресії IFNR-I, що показують отримані нами дані: гранулярне цитоплазматичне забарвлення – у 54,5 16,6% випадків, у 32,4 10,5% випадків – дифузне цитоплазматичне забарвлення та тільки мембранне – у 13,1 7,1% випадків.

З іншого боку, й дотепер відбір хворих з генералізованим НКР для інтенсивної терапії цитокінами проводиться з використанням лише ряду клінічних ознак, таких як збереження фізичної активності хворого, якомога менша кількість метастазів, строк від первинної діагностики НКР до початку лікування цитокінами не більше 24-х місяців, чоловіча стать і т.п. (Bukowski R. et al., 2001; Jonasch E. et al., 2001; Fossa S. et al., 2000; Pizzocaro G. et al., 2001; Возианов А.Ф. и соавт., 1998). Таке становище, передусім, пояснюється низькою специфічністю морфологічних, а також багатьох імуноморфологічних критеріїв щодо прогнозу ефективності цитокінової терапії генералізованого НКР (Magyarlaki T. et al., 2000). Підтвердженням тому можуть слугувати отримані нами дані про незалежність експресії IFNR-I у тканині НКР від таких відомих прогностичних факторів як категорія Т системи TNM, клітинний варіант НКР та гістологічний ступінь злоякісності. При цьому, варто відмітити, що частота експресії IFNR-I й, відповідно, можливість прямого цитотоксичного впливу IFN І типу на клітини НКР у чоловіків виявилася вищою, ніж у жінок (проте р= 0,08; n= 77). Можливо зі збільшенням кількості спостережень різниця частоти експресії IFNR-I за статтю досягатиме статистичної значимості, що дозволить стверджувати про об’єктивність критерію відбору хворих для цитокінотерапії за ознакою статі.

З огляду на вищенаведене, вельми доцільними слід визнати подальші дослідження експресії IFNR-I у пухлинній тканині при НКР, за умов лікування інтерферонами І типу, та аналізу його віддалених ефектів з метою доповнення вищеназваних клінічних критеріїв відбору хворих імуноморфологічними, що має сприяти підвищенню ефективності інтерферонотерапії прогресуючого та метастатичного НКР.

Таким чином, результати представленої роботи свідчать, що у хворих на НКР, які тривалий час проживають на забруднених радіонуклідами внаслідок аварії на ЧАЕС територіях України, спостерігається комплекс прогностично несприятливих ознак. Останні складаються з підвищеної частоти випадків НКР високого гістологічного ступеня злоякісності, збільшеної проліферативної активності клітин пухлини, а також високої частоти експресії онкопротеїнів K-ras та с-erbb-2.

Добре відомо, що в умовах пролонгованого впливу низькодозового іонізуючого опромінення у мешканців ЗРРУ найбільшу небезпеку становить внутрішнє опромінення, що на 90-98% обумовлене інкорпорацією 137Cs, головним шляхом екскреції якого є нирковий (понад 90%) (Перевозников О.Н., 1995; Piechwoski J. et al., 1987). У зв’язку з цим, враховуючи дані проведеного нами у ході цього дослідження спектрорадіометричного визначення активності 137Cs у добовій сечі хворих на НКР, показано правомірність запропонованого способу розподілу пацієнтів на групи (з вірогідно відмінним рівнем екскреції 137Cs: “чисті” регіони – 0,37 0,03; ЗРРУ – 2,14 0,77; м. Київ – 0,91 0,19 Бк; р 0,05). Наведене тим більш важливе, оскільки іонізуюче випромінювання, в тому числі низькодозове, є діючим фактором на всіх етапах канцерогенезу – ініціації, промоції та прогресії (Little B., 2000; Trosko J., 1996), а