НАЦІОНАЛЬНА ФАРМАЦЕВТИЧНА АКАДЕМІЯ УКРАЇНИ

ОККЕРТ ІРИНА ЛЕОНІДІВНА

УДК 615.322:615.07:547.458.65

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ РАПОНТИКУМУ САФЛОРОВИДНОГО ТА ОТРИМАННЯ РЕЧОВИН-СТАНДАРТІВ

15.00.02 –фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі фармакогнозії Національної фармацевтичної академії України Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник: кандидат фармацевтичних наук, доцент,

Попова Наталія В'ячеславівна

Національна фармацевтична академія України,

доцент кафедри фармакогнозії

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

СЕРБІН АНАТОЛІЙ ГАВРИЛОВИЧ

Національна фармацевтична академія України,

завідувач кафедри медичної ботаники

доктор фармацевтичних наук,

старший науковий співробітник

БЄЛІКОВ ВОЛОДИМИР ВОЛОДИМИРОВИЧ

Державний науковий центр лікарських засобів,

науковий редактор журналу “Фармаком”

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної

освіти ім.П.Л.Шупика, кафедра фармацевтичної

хімії та фармакогнозії

Захист відбудеться “ 22 ” листопада 2002 року о_1200 годині на засіданні спеціалізованої Вченої Ради Д64.605.01 при Національній фармацевтичній академії України за адресою 61002, м.Харків, вул.Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національної фармацевтичної академії України (61168, м. Харків, вул.Блюхера, 4)

Автореферат розісланий “18” жовтня 2002 року

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради Малоштан Л.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. З багатого арсеналу лікарської рослинної сировини особливий інтерес представляє сировина рослин родини айстрові - Asteraceae, до яких відноситься рід рапонтикум - Rhaponticum. Підземні органи рапонтикуму сафлоровидного - Rhaponticum carthamoides (Willd) Illiin. переробляються в ряд препаратів (рідкий і густий екстракти, таблетки сухого екстракту, препарат “Екдистен”). Фармакологічний ефект цих препаратів зумовлений не однією речовиною, а комплексом різних природних сполук, таких як вуглеводи, фенольні сполуки, у тому числі флавоноїди, фенолкарбонові кислоти, дубильні речовини, а також стероїдні сполуки й ін. Однак, хімічний склад кореневищ та коренів рапонтикуму вивчений недостатньо, відсутні об'єктивні методи оцінки якості сировини і препаратів. Існуюча технологія виробництва препаратів з кореневищ і коренів рапонтикуму недосконала. У шроті залишається значна кількість біологічно активних речовин, а трава рапонтикуму сафлоровидного взагалі не використовується.

Необхідність комплексного вивчення біологічно активних сполук трави та підземних органів рапонтикуму та проведення досліджень з розробки методів виділення й очищення стандартних речовин - стандартів, необхідних для контролю якості рослинної сировини та препаратів, є актуальною.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності до планів науково-дослідних робіт Національної фармацевтичної академії України (НФАУ) (№ державної реєстрації 0198U007008) і проблемної комісії “Фармація” МОЗ України.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи є комплексне вивчення біологічно активних сполук рапонтикуму сафлоровидного і розробка технології одержання стандартних речовин з екдизон- та лютеолін–вмісної рослинної сировини для оцінки якості сировини та препаратів.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

·

· розробити методи якісного аналізу основних груп біологічно активних речовин рапонтикуму сафлоровидного;

· виділити в індивідуальному стані та встановити структуру біологічно активних сполук рапонтикуму сафлоровидного;

· провести кількісне визначення різних груп сполук первинного та вторинного синтезу рапонтикуму;

· розробити метод виділення й аналізу “екдизону-стандарту”, необхідного для контролю якості сировини рапонтикуму сафлоровидного;

· провести пошук лютеолін–вмісної рослинної сировини та розробити метод виділення й очищення “лютеолін-стандарту”;

· провести морфолого-анатомічні дослідження підземних органів рапонтикуму сафлоровидного дикорослого і культивованого;

· розробити проекти аналітичної нормативної документації на сировину рапонтикуму та для речовин–стандартів.

Об'єктом дослідження стали фенольні сполуки - флавоноїди, кумарини, фенолкарбонові кислоти, а також екдистероїди, вуглеводи, амінокислоти та мікроелементи трави і підземних органів рапонтикуму сафлоровидного, та лютеолін–вмісна рослинна сировина - трава рапонтикуму, трава перцю стручкового і трава чебрецю.

Предметом дослідження є виявлення, виділення і встановлення структури фенольних сполук (флавоноїди, кумарини, фенолкарбонові кислоти) та екдистероїдів рапонтикуму сафлоровидного і флавоноїдів трави перцю стручкового, трави чебрецю, розробка методів виділення та очищення речовин стандартів – лютеоліну та екдизону, проведення морфолого-анатомічного вивчення підземних органів рапонтикуму сафлоровидного культивованого та дикорослого.

Методи дослідження. Якісний і кількісний аналіз біологічно-активних речовин (БАР) проводили за допомогою фармакопейних методів аналізу, із застосуванням специфічних якісних реакцій, методів хроматографії на папері та у тонкому шарі. Для виділення й очищення фенольних сполук і екдистероїдів використовували метод колонкової хроматографії на поліаміді та силікагелі. Будову виділених речовин встановлювали за допомогою якісних реакцій, УФ- і ІЧ-спектрометрії, визначення температури топлення і методів хімічних перетворень. Анатомічне вивчення і фотографування зрізів мікропрепаратів підземних органів рапонтикуму сафлоровидного проводили під мікроскопом МБІ-6 на плівці “Мікрам-200”, “Мікрам - 600”.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне фармакогностичне вивчення рапонтикуму сафлоровидного культивованого. Науковий інтерес представляють нові дані з вивчення якісного і кількісного вмісту екдистероїдів, флавоноїдів, кумаринів, фенолкарбонових кислот, вуглеводів, головним чином глюкофруктанів рапонтикуму сафлоровидного дикорослого і культивованого.

У індивідуальному стані виділено 30 речовин, які відносяться до флавоноїдних агліконів (12), флавоноїдних гликозидів (5), фенолкарбонових кислот (6), кумаринів (5), екдистероїдів (2).

Новими для кореневищ та коренів рапонтикуму виявилися кумарини, такі як кумарин, умбеліферон, скополетин, ізоскополетин, ескулетин, а також флавоноїдні глікозиди – 7- О- b-D-глюкозид кверцетину, 7-О-b- D- глюкозид кемпферолу та 7-О-b- D- глюкозид ізорамнетину.

Розроблено новий метод отримання екдизону–стандарту, при цьому були виділені екдизон та екдистерон.

Розроблено новий метод виділення та очищення лютеоліну. При розробці цього методу були отримані нові речовини: 6-С-кофеїл-лютеоліну з трави перцю стручкового, а з трави чебрецю вперше були виділені С-глікозиди – вітексин і орієнтин.

Для об'єктивної оцінки якості сировини та препаратів розроблені методи контролю якості сировини по основним групам біологічно активних речовин. Так, вперше для рапонтикуму розроблена спектрофотометрична методика кількісної оцінки суми глюкофруктанів після кислотної трансформації.

Проведені морфолого-анатомічні дослідження та встановлені нові макро– та мікроскопічні ознаки кореневищ і коренів рапонтикуму сафлоровидного культивованого.

Отримані результати використані для розробки проектів АНД “Лютеолін- стандарт”, “Екдизон-стандарт” та “Кореневище з коренями рапонтикуму сафлоровидного”.

Практичне значення одержаних результатів. Показана можливість використання рапонтикуму сафлоровидного як джерела отримання вуглеводів, фенольних та екдистероїдних сполук. На підставі експериментальних даних розроблено проекти АНД “Лютеолін-стандарт”, “Екдизон-стандарт” та “Кореневище з коренями рапонтикуму сафлоровидного культивованого”.

Надземна частина рапонтикуму сафлоровидного, що містить значну кількість флавоноїдів, екдистероїдів, вуглеводів, рекомендується в якості нової рослинної сировини для створення препаратів з тонізуючою і гіпоглікемічною активністю.

Результати фітохімічних та морфолого-анатомічних досліджень кореневищ з коренями рапонтикуму сафлоровидного використовуються в навчальному процесі кафедр фармакогнозії і медичної ботаніки НФАУ, фармацевтичних факультетів Київського медичного університету ім. О.О. Богомольця, Тернопільської медичної академії ім. І.Я.Горбачевського, Ташкентського фармацевтичного інституту, а також апробовані на Дослідному заводі ДНЦЛЗ (м. Харків), в лабораторії хімії та технології фенольних сполук і лабораторії аналітичної хімії ДНЦЛЗ.

Особистий внесок здобувача. В наукових працях опублікованих зі співавторами Литвиненко В.І. Поповою Н.В., Трубніковим О.О, Дигаєм О.І, Гольдбергом Е.Д., Картмазовою Л.С., Кожух І.О. особисто автором зроблено :

- проведено аналіз літературних даних ботанічної характеристики рослин роду рапонтикум, його хімічного складу і застосування в медицині;

- розроблено метод виділення й очищення фенольних сполук рапонтикуму сафлоровидного, встановлена структура 19 фенольних сполук;

- розроблено метод кількісного вмісту глюкофруктанів в траві та підземних органах рапонтикуму;

- розроблено метод виділення й очищення екдистероїдів рапонтикуму сафлоровидного, підтверджена структура екдизону і екдистерону;

- розроблено методика виділення й очищення лютеоліну з трави рапонтикуму сафлоровидного, трави перцю стручкового і трави чебрецю;

- встановлено структура 7 фенольних сполук трави перцю і 8 фенольних сполук трави чебрецю;

- вивчено амінокислотний та елементний склад рапонтикуму;

- вивчено морфолого-анатомічні ознаки підземних органів рапонтикуму сафлоровидного культивованого;

- розроблено проекти АНД “Кореневище з коренями рапонтикуму сафлоровидного культивованого”, “Екдизон-стандарт”, “Лютеолін-стандарт”.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися й обговорювалися на науково-практичній конференції, присвяченій 15-річчю фармацевтичного факультету Ярославської державної медичної академії (м. Ярославль, 1997), науково-практичній конференції “Досягнення сучасної фармації в медичну практику” (м. Харків, 1996), на четвертій Міжнародній конференції з медичної ботаніки (м. Київ, 1997).

Публікації. Основний зміст дисертації викладений в 10 роботах, з яких 6 статей, 4 тези доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 146 сторінках, складається зі вступу, огляду літератури, експериментальних досліджень (4 розділи), загальних висновків, списку використаних джерел. Робота ілюстрована 36 таблицями, 13 рисунками, 3 схемами. Список використаної літератури містить 133 джерел, в тому числі - 22 іноземних.

Основний зміст роботи

Характеристика рослин роду рапонтикум та рапонтикуму сафлоровидного, ботанічний опис, ареал, культивування, хімічний склад і застосування

Проведений аналіз літературний даних свідчить, що у світовій флорі рослини роду рапонтикум Rhaponticum Willd. представлені 17 видами, 12 з яких зростають на території СНД, у тому числі і на Україні, і у зв'язку зі збільшенням потреби в препаратах рапонтикум сафлоровидний введений у культуру. Останнім часом ботаніками–систематиками проводиться розмежування між колишніми синонімами левзея і рапонтикум. Тому питання ідентифікації культивованої і дикорослої рослинної сировини виправдовує актуальність наших досліджень.

Кореневище з коренями рапонтикуму сафлоровидного переробляється промисловістю в рідкий і густий екстракти і препарат екдистен, використовується та у харчовій промисловості при виробництві тонізуючих напоїв.

Медичні препарати застосовуються як адаптогенні, тонізуючі засоби при розумовій і фізичній втомі. Основними діючими речовинами рослинної сировини є флавоноїди, екдистероїди та вуглеводи (глюкофруктани). Однак, слід зазначити, що відсутня об'єктивна якісна та кількісна оцінка рослинної сировини. Трава рапонтикуму є гарним білково-амінокислотним кормом, відрізняється високою врожайністю сировинної маси, містить значну кількість біологічно активних речовин, але не використовується в якості лікарської рослинної сировини для одержання аналогічних препаратів.

Існуюча технологія виробництва препаратів з кореневищ і коренів рапонтикуму недосконала. У шроті залишається значна кількість біологічно активних речовин. Таким чином, вивчення біологічно активних сполук рапонтикуму сафлоровидного і розробка технології одержання стандартних речовин для оцінки якості сировини та препаратів - є актуальними.

Якісний аналіз і кількісне визначення речовин первинного синтезу рапонтикуму

Об'єктом дослідження служили підземні органи і трава рапонтикуму сафлоровидного культивованого, заготовлені на дослідний ділянці ДНЦЛЗ, НФАУ і на Білгородській ЗДС ВІЛР у травні – вересні місяцях 1994-1995 років.

Вивчення амінокислотного складу проводили за допомогою хроматографії на папері та амінокислотного аналізатора LK-4/51 “Альфа-плюс”. Амінокислоти містяться в усіх органах рапонтикуму сафлоровидного, виявлено 17 амінокислот.

У надземній частини дикорослого і культивованого рапонтикуму хроматографічними методами аналізу ідентифіковано 17 амінокислот, з них домінантними виявилися лізин, пролін, аланін, лейцин, гістидин, триптофан. У кореневищах і коренях рапонтикуму сафлоровидного культивованого ідентифіковано 17 амінокислот. У найбільшій кількості відзначений вміст таких кислот як: аспарагінова кислота, пролін, глютамінова кислота, лейцин, лізин, аргінін.

За кількісним вмістом суми амінокислот слід зазначити, що в траві міститься більше амінокислот (11,3%), ніж у кореневищі і коренях рапонтикуму сафлоровидного культивованого (8,9%) і кореневищі і коренях рапонтикуму дикорослого (8, 3%).

Вуглеводний склад підземних і надземних органів рапонтикуму сафлоровидного вивчали методами якісного і кількісного аналізу. При хроматографічному аналізі водяного екстракту (до і після гідролізу) рапонтикуму сафлоровидного ідентифікували фруктозу (домінантна речовина), глюкозу і ще 3 речовини, що є продуктами деструкції глюкофруктанів.

Для стандартизації сировини рапонтикуму нами використана методика визначення суми фруктозанів після їхньої кислотної трансформації, яка модифікована стосовно до об'єкта дослідження. В основі методики лежить спектрофотометричне визначення продуктів кислотної трансформації фруктози, що засновано на здатності цукрів (фруктози, сахарози) при нагріванні з концентрованими кислотами утворювати продукти - похідні фурфуролу, що мають поглинання в області 200-380 нм.

Через те, що вуглеводи утворюють продукти кислотної трансформації з різною швидкістю, нами вивчена динаміка їх гідролізу 5% хлористоводневою кислотою. Встановлено, що максимальна кількість 5-гідроксиметилфурфуролу утворюється через 2,0 години після початку гідролізу, а максимум поглинання для 5-гідроксиметилфурфуролу відзначається при 285 нм. Збіг спектрів поглинання фруктози і водяного екстракту з кореневищ і коренів рапонтикуму дозволяє використати фруктозу як стандартну речовину.

Для кількісного аналізу вмісту фруктозанів проведено визначення питомого показника поглинання розщепленої фруктози, який склав 280.

Вміст фруктозанів визначали в надземних та підземних органах рапонтикуму сафлоровидного та шроті. Для цього отримували водяний екстракт, з яким далі проводили кислотну трансформацію, а потім визначали оптичну густину розчину на спектрофотометрі СФ-46 при 285 нм. Вміст суми фруктозанів обчислювали з використанням питомого показника та за калібрувальним графіком. Одержані результати наведені у табл. 1. Встановлено, що максимальна кількість суми фруктозанів міститься в кореневищі та коренях рапонтикуму сафлоровидного культивованого (30,0%), мінімальна - в траві (20,0%).

Таблиця 1

Кількісний вміст суми фруктозанів

Вміст суми фруктозанів, %

По питомому показнику поглинання За калібрувальним графіком

В кореневищі і коренях рапонтикуму сафлоровидного дикорослого

23,9 24,4

В кореневищі і коренях рапонтикуму сафлоровидного культивованому

29,7 30,0

В траві рапонтикуму сафлоровидного

19,4 20,0

В шроті коренів та кореневищ після отримання екстракту

10,7 10,0

За допомогою атомно-емісійного методу проведений мікроелементний аналіз рапонтикуму сафлоровидного. Визначено в підземних органах 22 елементи. Підземні і надземні органи накопичують значну кількість таких елементів як залізо (3700-8900 мг/кг), алюміній (1700- 3900 мг/кг), цинк (1200-3200 мг/кг), марганець (55-82 мг/кг), магній та мідь (16-29 мг/кг).

Аналіз речовин вторинного синтезу рапонтикуму. Фенольні сполуки

За результатами проведеного аналізу літературного огляду та експериментальних даних, підібрані методики для хроматографічного і якісного аналізу, препаративного поділу фенольних сполук рапонтикуму сафлоровидного у тонких шарах і на колонках поліаміду. Попередніми фітохімічними дослідженнями встановлено наявність у підземних та надземних органах рапонтикуму таких класів фенольних сполук: флавоноїдні аглікони та гликозиди, кумарини, оксикоричні кислоти.

З використанням методів рідинної екстракції, колонкової хроматографії на поліаміді, препаративної хроматографії на папері та у тонкому шарі в індивідуальному стані було отримано 19 фенольних речовин: 8 флавоноїдних агліконів, 3 флавоноїдних глікозида, 5 кумарінів та 3 оксикоричні кислоти, які позначені нами як: речовини 1-17 з кореневищ і коренів рапонтикуму сафлоровидного; та 1-6, 15, 17, 21, 22 – з трави рапонтикуму сафлоровидного.

Структура фенольних сполук була встановлена по продуктах хімічних перетворень, на підставі фізичних та хімічних методів аналізу, а також у порівнянні з достовірними зразками. Серед них речовини 1-6 та 21, 22 можна віднести до флавоноїдних агліконів, речовини 7- 9 до флавоноїдних глікозидів, сполуки 15-17 - до похідних фенолкарбонових кислот, а сполуки 10-14 до кумаринів.

Глікозиди 7-9 та кумарини 10-14 вперше ідентифіковані у кореневищах з коренями рапонтикуму сафлоровидного. Фізико-хімічні властивості фенольних сполук рапонтикуму наведені у табл. 3.

Розробка методів виділення й очищення стандартних речовин

Розробка методу виділення й очищення екдизон-стандарту

Встановлено, що екдизони рапонтикуму сафлоровидного виявляють психостимулюючу, адаптогенну та анаболізуючу дію, тому їх варто розглядати як специфічні речовини цієї рослини.

Подрібнену сировину (схема 1) екстрагували петролейним ефіром для видалення супутніх ліпофільних речовин. Хроматографічний аналіз петролейного екстракту показав відсутність екдистероїдів. Далі сировину екстрагували ацетоном у співвідношенні 1:5 методом вакуум-фільтраційної екстракції. Отриманий екстракт упарювали до густого смолоподібного продукту. Екстракцію екдистероїдів зі смолоподібного продукту проводили в ділильній лійці триразово етилацетатом. Отриманий етилацетний витяг концентрували під вакуумом до густого залишку, наносили на колонку оксиду алюмінію і проводили елюювання екдистероїдів чистим хлороформом, а також сумішшю хлороформ - (9:1, 8:2 і т.п.). Збирали фракції з колонки по 40-50 мл, ідентичні фракції поєднували, концентрували під вакуумом і кристалізували з придатних розчинників (метанол).

Виділені за допомогою колонкової хроматографії речовини позначили як 29 і 30. Ідентифікацію виділених речовин проводили за допомогою фізико-хімічних методів аналізу, результати яких відображені в табл. 2.

Характеристика екдизону-стандарту

Екдизон (29) – біла кристалічна сполука, не розчинна у воді і петролейному ефірі, розчинна в етанолі, метанолі, ацетоні, етилацетаті, погано - у хлороформі. Виділена речовина не флюоресцирує у фільтрованому УФ світлі. Фізико-хімічні властивості її представлені в табл. 2.

Таблиця 2

Фізико-хімічні властивості екдистероїдів

№ речо-вини Назва Брутто - формула cmax, нм Т.топл., 0С [ a ]D М.м Величина Rf

29 a-екдизон С27Н 44О6 242 236-238 +63,6±20 464,00 0,57*

30 екдистерон С27Н 44О7 250 240- 241 +59,7±20 480,00 0,22*

*Величина Rf вказана для системи хлороформ – метанол 4:1 (пластинка сілуфол)

Визначено кількісний вміст екдистероїдів у перерахунку на екдизон–стандарт, який склав 0,44% (суцвіття) та 0,51% (кореневища та корені).

Схема 1

Виділення екдистероїдів з рапонтикуму сафлоровидного

Подрібнена рослинна сировина

Ї

Очищення від ліпофільних речовин

Ї

Екстракція ацетоном

Ї

Концентрування ацетонового екстракту

Ї

Екстракція екдистероїдів етилацетатом

Ї

Коцентрування етилацетатного екстракту

Ї

Виділення екдистероїдів методом колонкової хроматографії

Ї

Кристалізація та сушіння екдизону (29) та екдистерону (30)

Розробка методу виділення й очищення лютеолін–стандарту

У траві рапонтикуму сафлоровидного встановлена наявність флавонів – лютеоліну, апігеніну. Як відомо, ці сполуки мають протизапальну, противірусну, протипухлинну, сечогінну, детоксикаційну, антиалергічну, антиаритмічну, антигістамінну, фунгіцидну дію, а також знижують проникність і ламкість судинної стінки, виборче розширюють судини серця і підвищують їх еластичність.

Аналіз, проведений серед фармакопейних видів рослинної сировини підтвердив, що значна частка припадає на сировину багату вказаними флавонами. Тому питання розробки технології виділення, очищення флавонів–стандартів, і зокрема лютеоліну, є актуальним.

Для розробки методу виділення й очищення лютеолін-стандарту нами були обрані крім трави рапонтикуму сафлоровидного, трава перцю стручкового, котра є відходом у сільському господарстві, і трава чебрецю, сировинна база якого на Україні найбільш багата.

Для виділення лютеоліну з трави перцю стручкового, трави рапонтикуму і трави чебрецю проводили екстракцію 70%-ним етанолом сировини, попередньо очищеної петролейним ефіром від ліпофільних речовин (схема 2).

Отримані спиртові екстракти концентрували при нагріванні під вакуумом до густого водяного залишку. З густим, водним концентратом проводили жорсткий кислотний гідроліз з метою перетворення всіх флавонових (лютеолінових) глікозидів у їхню агліконову форму. Кінець і повноту гідролізу визначали хроматографічно за відсутністю на хроматограмах флавоноїдних глікозидів. Було встановлено, що повнота кислотного гідролізу 10%-вою хлористоводневою кислотою настає через 4 години. Після закінчення гідролізу флавоноїдні аглікони витягали з кислого розчину 4 рази порціями етилацетату по 100 мл. Кожну порцію промивали дистильованою водою до нейтральної реакції. Концентрований етилацетний розчин флавоноїдних агліконів, отриманий відповідно з трави перцю стручкового і трави чебрецю, змішували з порошком поліаміду, висушували на повітрі і наносили на колонку, підготовлену з ізопропаноловою суспензією поліаміду. Колонку промивали ізопропанолом і сумішшю ізопропанол – етанол (9:1) з наступним збільшенням концентрації етанолу. Елюати збирали по 30-50 мл, аналізували, ідентичні фракції поєднували, концентрували і кристалізували. У підсумку виділили лютеолін(22) і наступні речовини: з екстракту трави перцю стручкового – 15, 16, 21, 22, 25, 26; з екстракту трави чебрецю - 15, 16, 18- 24, 27, 28; з трави рапонтикуму сафлоровидного – 1- 6, 15 - 17, 21, 22 .

Схема 2

Виділення та очищення лютеоліну

Подрібнена рослинна сировина

Ї

70%-вий спиртовий екстракт з рослинної сировини

Ї

Концентрування спиртового екстракту

Ї

Очищення від ліпофільних речовин

Ї

Кислотний гідроліз спиртового концентрату

Ї

Екстракція флавонових агліконів етилацетатом

Ї

Виділення флавонових агліконів методом колонкової хроматографії

Ї

Кристалізація та сушіння лютеоліну (22) та сполук, які виділили з:

Трава рапонтикуму 1-4, 15-17, 21, 22 Трава перцю стручкового 15, 16, 21, 22, 25, 26 Трава чебрецю 15, 16,18-24, 27, 28

Серед виділених агліконів, які містяться в гідролізаті трави перцю стручкового були виділені нові речовини, позначені нами як 25 і 26.

Речовини 25, 26 за УФ-спектральними даними нагадують лютеолін, але відрізняються від нього хроматографічною рухливістю і характерним жовто-бурим забарвлення плями на хроматограмах після прояву хлористим цирконілом.

В ІЧ-спектрі речовин 25 і 26 знаходиться смуга поглинання при 1715 см-1, яка спостерігається для кетогрупи в складних ефірах або у вільній карбоксильній групі. Це дало можливість визначити, що речовини 25, 26 є складними ефірами, але в продуктах лужного омилення не виявлено кислоти. Припускаючи, що це може бути кавова кислота, яка легко руйнується в лужному середовищі, був проведений ферментативний гідроліз, при цьому речовини 25, 26 не змінилися.

По батохромії максимумів 1-ої смуги в УФ-спектрі з діагностичними реактивами виявляються наступні чотири вільні оксигрупи в речовинах 25 і 26 : у С-7, С-3',4', С-5, тому вони можуть бути порівняні з лютеоліном. Утворення жовто-бурого фарбування з хлористим цирконілом на відмінність від жовтого для лютеоліну, може бути обумовлено заміщенням у С-6 чи С-8 флавону. Отже, додатковий замісник може знаходитись у С-6 чи С-8. Між собою речовина 25 відрізняється від речовини 26 за хроматографічною рухливістю.

Для підтвердження гіпотези про заміщення у С-6 чи С-8 провели реакцію з реактивом Гіббса в порівнянні з модельними зразками: байкалеїном, вогоніном, лютеоліном. Знайшли, що речовина 25 дає червоно-буре забарвлення, подібне до забарвлення з вогоніном (8-метоксихризином), у той час як лютеолін дає зелену, а речовина 26 як і байкалеїн (6-оксихризин) - синє фарбування. Тому припустили, що кислотний залишок у речовини 25 знаходиться у С-8, а речовини 26- у С-6.

Рис. 1. Схема синтезу по Джею 8- і 6-С-кофеіл-лютеоліна (25,26)

Для підтвердження структури цієї речовини провели реакцію конденсації по Джею (див. схему. 1). Реакція проходить по С-8 або С-6 лютеоліну та по b-вуглецю кавової кислоти. У результаті реакції конденсації лютеоліну з кавовою кислотою одержали 2 продукти, які по якісним реакціям, хроматографічній рухливості, УФ- і ІЧ-спектрам близькі до досліджуваних речовин 25 і 26. Ці речовини названі нами: 25 - як 8-С—кофеїл- лютеолін і 26 – як 6-С-кофеїл-лютеолін та являють собою продукт конденсації лютеоліну з кавовою кислотою.

Можна припустити, що речовини 25 і 26 є артефактами, тому що препаративно були виділені з продуктів гідролізу суми флавоноїдних глікозидів листів перцю стручкового. Фракціонування фенольних сполук екстрактів з листків перцю стручкового показує, що речовини 25 і 26 містяться у нативному стані. Отже, речовина 26 є новою природною сполукою, а речовина 25 раніш була вже виділена з цієї сировини.

Серед виділених сполук, які містяться в гідролізаті трави чебрецю, виділені нові речовини, позначені нами як 27 і 28. Ці сполуки відрізнялися від відомих флавонових сполук більшою хроматографічною рухливістю в таких системах розчинників як 15, 30%-ва оцтова кислота (табл.3.) По червоно-жовтогарячому фарбуванню в ціанідиновій реакції і не розчинності в середовищі октанолу речовини 27 і 28 можна віднести до флавонових глікозидів.

За характером УФ - спектру речовин та УФ-спектру з іонізуючими добавками з максимумами при 275 і 350 нм речовини 27 і 28 можуть бути віднесені до флавонових похідних, тому що в них були виявлені вільні оксигруппи у С-7, С-5, С-3ў, С-4ў.

Таким чином, речовини 27 і 28 дуже схожі відповідно на апігенін і лютеолін, але відрізняються хроматографічною рухливістю, більш схожу на рухливість флавонових глікозидів. Для визначення місця розташування вуглеводного залишку проведений кислотний гідроліз речовин 27 і 28. За результатами кислотного, а також лужного і ферментативного гідролізу виявилося, що вони стійкі в цих умовах. Було встановлено, що речовини 27 і 28 стійкі до кислотного гідролізу 8-10%-вою сірчаною кислотою і ферментами виноградного равлика та ізомеризуються з утворенням суміші ізомерів у співвідношенні 2:1 (вихідна речовина – ізомер).(рис 2), що дало можливість припустити, що ці речовини є С-глікозидами.

Вітексін (8-С-b-D-глюкопіранозид апігеніну), син –ізомер Ізовітексін (8-С-b-D-глюкопіранозид апігеніну), анти ізомер

Рис.2. Ізомеризація вітексіну

Таким чином, на підставі проведених фізико–хімічних досліджень та в порівнянні з достовірними зразками удалося ідентифікувати речовину 27 як вітексін або 8-С-глюкозид апігенину, речовину 28 - як орієнтин або 8-С-глюкозид лютеоліну. Ці сполуки вперше знайдені у траві чебрецю. Фізико-хімічні властивості виділених фенольних сполук наведені у табл.3.

Таблиця 3

Фізико–хімічні властивості фенольних речовин, виділених з рапонтикуму сафлоровидного, трави перцю стручкового та трави чебрецю

№ Речовина, хімічна структура Т топл., Co УФ –спектр, l max Величина Rf *

Флавоноїдні аглікони

1 Кверцетин, C 15H 10O7 310-312 255, 270, 375 0,77-А, 0,07- Б, 0,40- В 1,2

2 Kемпферол, C 15H 10O6 274 -276 265, 370 0,90-А, 0,10- Б, 0,50- В 1,2

3 Кверцетагетин, C 15H 10O8 324-325 260, 275, 360 0,45-А, 0,19- Б, 0,63-В 1,2

4 Госипетин, C 15H 10O8 320-322 261, 276 , 309, 339, 385 0,42-А, 0,12- Б, 0,43- В 1,2

5 Ізорамнетин C 16H 12O7 305-307 253, 267 306 , 326 ,370 0,73-А, 0,38-Д 1,2

6 Патулетин C 16H 12O8 298 – 300 258, 272 293, 371 0,78-А, 0,10- Б, 0,50- В 1,2

21 Апігенін C 15H 10O5 256 - 258 256-258 270, 340 0,91-А, 0,28-Д 2,3.4

22 Лютеолін C 15H 10O6 228-230 350, 265, 255 0,84-А, 0,22-Д 2,3,4

23 Скутелареїн , С15Н10О6 340-343 286, 339 0,20-Б, 0,65-А1 4

24 Ізоскутелареїн, С24Н19О10 252-256 364, 328, 405, 281 0,22-Б, 0,68-А1 4

25 8-С-кофеїл-лютеолін С24Н19О10 Аморф. 350, 265, 255 0,29 - Б, 0,57-Д 3

26 6-С-кофеїл-лютеолін С24Н19О10 Аморф. 350, 265, 255 0,31-Б, 0,60- Д 3

Флавоноїдні глікозиди

7 7-0- глюкозид кверцетину C 21H 22O13 248-250 255, 265, 370 0,45 -Г, 0,30 -Д 1

8 7-0-глюкозид ізорамнетину C 22H 24O13 255 – 57 255, 265 , 370 0,60-Г, 0,40-Д 1

9 7-0-глюкозид кемпферолу C 21H 22O12 Аморф. 265, 370 0,80-Г, 0,50 -Д 1

27 Орієнтин, С21Н20О11 263-265 350, 275 0,22-Б, 0,45- А1 4

28 Вітексин, С21Н20О10 264 -265 350, 275 0,15- Б, 0,25- А1 4

Кумарини

10 Кумарин C 9Н 5О2, 67-68 275, 310 0,13 –Г 1

11 Умбеліферон, C 9Н 6О3 228-230 250, 328 0,90- А1, 0,64-Б 1

12 Скополетин, C 10Н 8О4 204-205 230, 256, 298, 343 0,85- А1, 0,50-Б, 0,24-Г 1

13 Ізоскополетин, C 10Н 8О4 185-187 230, 255, 245,.345 0,83- А1, 0,60-Б, 0,64-Г 1

14 Ескулетин, C 9Н 6О4 269-270 230, 258, 271, 316 0,80- А1, 0,51- Б, 0,02 –Г 1

Оксикоричні кислоти

15 Кавова кислота C 9H 8O7 193-195 325, 245 0,80-Д, 0,38-А1, 0,82-А 1,2, 3,4

№ Речовина, хімічна структура Т топл., Co УФ –спектр, l max Величина Rf *

16 Хлорогенова кислота C 16H 18O9 203-205 325, 240 0,52-А1,0,63-А, 1,2, 3,4

17 Неохлорогенова кислота С16Н 18О 9 Аморф 325, 300 245 0,67-А, 0,75- Б, 0,70-Г 1,2

18 П- кумарова кислота С9Н6О3 212-214 310, 228 0,90-А1, 0-60-Б 4

19 Ферулова кислота C 10H 10O4 234-236 320, 290 234 0,87-А 4

20 Розмаринова кислота C18H16O8 203-204 327, 287 245 0,50-А1, 057-Б 4

Системи для хроматографування: А - БОВ 4:1:5; А1 - БОВ 4:1:2; Б - 15%-ва оцтова кислота; В - 0,1н НСl; Г – петролейний ефір; Д - 30%-ва оцтова кислота

*- Рослинні джерела: 1- кореневища та корені рапонтикуму, 2- трава рапонтикуму, 3- трава перцю, 4- трава чебрецю

Характеристика лютеоліну–стандарту

Лютеолін або 5,7,3ў,4ў-тетраоксифлавон являє собою мікрокристалічний порошок світло-жовтого із зеленуватим відтінком кольору, при розтиранні електризується. Лютеолін повільно розчинний у 95%-вому спирті, практично не розчинний у воді і хлороформі. Ультрафіолетовий спектр лютеоліну в підкисленому спирті в області від 200 до 360 нм має максимуми поглинання при 255нм ± 2нм і 353 ± 3нм. Температура плавлення 228-230ОС.

Морфолого–анатомічний аналіз рапонтикуму сафлоровидного культивованого

Культивована сировина виявляла собою цілі, дерев'янисті, циліндричні, горизонтальні кореневища завдовжки до 1 см та 1-2 см у діаметрі. Кореневища багатоголові, іноді розгалужені, іноді з залишками основ прикореневих листків, зовні нерівномірно зморшкуваті, на зламі нерівні. Від кореневищ відходять придаткові корені, завдовжки від 5 до 15 см, 1-5 мм у діаметрі. Головний корінь, що становить 30-65% усієї підземної сировини, завдовжки 8-18 см та 8-15 мм у діаметрі. Він вкритий залишками первинної кори, яка легко відлущується, тому колір кореневища та кореня може бути від буро-коричневого до блідо-жовтого. Численні бічні корені можуть бути першого, другого та ін. порядку, ниткоподібні, завдовжки до 10 см та 1-1,5 мм у діаметрі. Запах слабкий, своєрідний. Смак солодкуватий, смолянистий.

Встановлені загальні та відмінні діагностичні ознаки сировини рапонтикуму культивованого. Вперше проведена диференціація коренів (головний корінь, бічні та придаткові корені), а також їх анатомічне дослідження. Для кожного з них установлені діагностичні ознаки.

Загальні анатомічні ознаки кореневищ з коренями рапонтикуму сафлоровидного: присутність в усіх тканинах коренів та кореневищ інуліну; наявність переривчастого кільця схизогених вмістищ понад ендодермою та окремих вмістищ серед елементів вторинної флоеми; широкі серцевинні промені, які поділяють вторинну флоему та ксилему на окремі стрічкоподібні ділянки; віялоподібне поширення серцевинних променів; переважання у вторинній ксилемі склеренхіми, серед якої розташовані малочислені групи драбинчасто-пористих судин.

Ознаки для коренів: протягом усього життя зберігається ендодерма та мезодерма первинної кори; для ендодерми специфічна наявність смужок (поясків) Каспарі; наявність молочників з жовто-коричневим вмістом у первинної корі; наявність радіального 4-6 променевого пучка; утворення в придаткових коренях склеренхімних кілець; у центрі головного кореня утворюються центральна паренхіма, яка накопичує інулін; наявність розколини та порожнини в придаткових коренів.

Ознаки для кореневища: наявність покривної тканини – перидерми; наявність розколин у серцевині; наявність схизогенних вмістищ.

ВИСНОВКИ

1. Вперше проведено комплексне вивчення рапонтикуму сафлоровидного з таких класів біологічно активних речовин: фенольних сполук, амінокислот, екдистероїдів, полісахаридів, мікроелементів з встановленням структури основних компонентів кожної з груп БАР.

2. Серед речовин первинного синтезу ідентифіковано 17 амінокислот, два моносахариди. У найбільшій кількості накопичуються кислоти – пролін, глютамінова, аспарагінова, лейцин. Встановлено, що підземні та надземні органи рапонтикуму сафлоровидного накопичують 22 елементи, в значній кількості серед яких – залізо, магній, марганець, мідь, алюміній та цинк.

3. Вперше розроблена спектрофотометрична методика визначення суми фруктозанів рапонтикума сафлоровидного. Визначено вміст суми фруктозанів у культивованій та дикорослій рослинній сировині рапонтикуму сафлоровидного.

4. З використанням препаративної паперової та адсорбційної колонкової хроматографії на поліамідному сорбенті виділено в індивідуальному стані у підземних та надземних органах рапонтикуму, а також трави перцю та трави чабрецю наступні класи природних сполук: 12 флавоноїдних агліконів, 5 флавоноїдних глікозидів, 6 оксикоричних кислот, 5 кумаринів, 2 екдистероїди. У рапонтикуму група флавоноїдів представлена вперше виділеними : 7-глюкозидом кверцетину, 7-глюкозидом кемпферолу і 7-глюкозидом ізорамнетину та агліконами: кверцетином, кемпферолом, кверцетагетином, патулетином, ізорамнетином, госипетином, апігеніном та лютеоліном.

5. Вперше виділені з підземних органів рапонтикуму сафлоровидного кумарини які представлені кумарином, скополетином, умбеліфероном, ізоскополетином, ескулетином, а серед фенольних карбонових кислот виділені та встановлено структуру наступних речовин: кавова, хлорогенова, неохлорогенова.

6. За допомогою методу препаративної паперової, тонкошарової і адсорбційної колонкової хроматографії розроблений метод виділення екдизону, який запропонований як стандарт для розробленого проекту АНД” Кореневище з коренями рапонтикуму сафлоровидного культивованого”.

7. Розроблений метод виділення й очищення лютеолін-стандарту з рослинної сировини з розробкою проекту АНД “Лютеолін–стандарт”.

8. При виділенні й очищенні флавоноїдних агліконів із трави перцю стручкового була виділена нова природна сполука – 6-С-кофеїл-лютеоліну, структуру якої встановлювали за допомогою методів хімічного напівсинтезу, а також спектральними методами аналізу, а з трави чебрецю були виділені нові флавонові глікозиди – вітексин і орієнтін, структура яких була підтверджена за допомогою хімічних перетворень і спектральних методів аналізу.

9. Проведені морфолого-анатомічні дослідження підземних органів рапонтикуму сафлоровидного культивованого. Встановлений ряд раніше не описаних анатомічних ознак для культивованої сировини: для ендодерми специфічна наявність смужок (поясків) Каспарі, наявність молочників з жовто-коричневим вмістом у первинній корі, утворення в придаткових коренях склеренхімних кілець, наявність розколини та порожнині в придаткових коренів, наявність розколин у серцевині. Вперше розділені корені рапонтикуму на: головний стрижневий корінь, корені першого порядку, другого порядку, третього порядку.

10. Розроблені проекти АНД ”Кореневище з коренями рапонтикуму сафлоровидного культивованого”, “Екдизон – стандарат”, “Лютеолін–стандарт”. Результати роботи впроваджені в навчальний процес кафедр фармакогнозії і медичної ботаніки НФАУ та фармацевтичних факультетів Київського медичного університету ім.О.О.Богомольця, Тернопільської медичної академії ім. І.Я.Горбачевського, Ташкентського фармацевтичного інституту, а також апробовані на Дослідному заводі ДНЦЛЗ (м. Харків), в лабораторії хімії та технології фенольних сполук і лабораторії аналітичної хімії ДНЦЛЗ.

основний зміст дисертації викладено в публікаціях

1. Литвиненко В.І., Попова Н.В., Оккерт І.Л. Біологічно активні сполуки левзеї та методи їх виявлення // Фармац. журн. – 1997. - № 6. – С.86-88. (особистий внесок - розроблені методи якісної стандартизації кореневищ та коренів левзеї).

2. Литвиненко В.И., Попова Н.В., Оккерт И.Л. Растительные источники флавоновых гликозидов // Фітотерапія в Україні. – 1998. - № 1. – С.18. (особистий внесок - вивчення нових флавонових сполук чебрецю).

3. Литвиненко В.И., Попова Н.В., Оккерт И.Л. Химический состав и биологическая активность левзеи сафлоровидной // Вестник проблем биологии и медицины. – 1997. - № 12. – С.134-142. (особистий внесок - проведено огляд літератури та наведені експериментальні дані про біологічно активні сполуки левзеї).

4. Растительные адаптогены / Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д., Литвиненко В.И., Попова Н.В., Оккерт И.Л., Кожух И.А. // Вестник проблем биологии и медицины. – 1998. - № 3. – С.24-32. (особистий внесок - проведений огляд літератури рослинних адаптогенів, зокрема левзеї).

5. Литвиненко В.І., Попова Н.В., Картамазова Л.С., Оккерт І.Л. Фармакогностичне дослідження культивованого рапонтикума сафлоровидного (Rhaponticum carthamoides (Willd.) Dc.) // Фармац. журн. - 2000. - № 4. - С. 90-95 (особистий внесок - розроблені анатомічні діагностичні ознаки кореневищ та коренів культивованого рапонтикуму).

6. Литвиненко В.І., Трубников О.О., Оккерт І.Л., Попова Н.В. Стандартизація рослинної сировини, що містить глюкофруктани // Фармацевтичний журнал. – 2001. - №.3 – С.87-91 (особистий внесок - розробка методів стандартізації рапонтикуму на вміст глюкофруктанів).

7. Літвіненко В.І., Попова Н.В., Дегтярьова І.Л. Фітохімічне дослідження великоголовника сафлоровидного // Досягнення сучасної фармації в медичну практику: Матеріали наук.-практ. конф., присвяченої 75-річчю УкрФА. – Харків, 1996. – С.220. (особистий внесок - проведено визначення фармакопейних показників та кількісний аналіз діючих речовин).

8. Литвиненко В.И., Попова Н.В., Дегтярева И.Л. Выделение флавоновых соединений из лекарственных растений // Материалы науч-практ.конф., посвященной 15-летию фарм. факультета Ярославcкой гос. мед.академии. – Ярославль, 1997. – С.64. (особистий внесок - проведено вивчення рослинних джерел флавонових агликонів та глікозидів).

9. Попова Н.В., Литвиненко В.И., Дегтярева И.Л. Левзея сафлоровидная – источник получения биологически активных веществ // Материалы науч-практ. конф., посвященной 15-летию фарм. факультета Ярославской мед.академии. – Ярославль, 1997. – С.77. (особистий внесок - проведено дослідження ряду біологічно активних сполук левзеї).

10. Литвиненко В.И., Попова Н.В., Дегтярева И.Л. Фитоэкдизоны левзеи сафлоровидной // Четверта міжнародна конф. з медичної ботаніки: Тез.доп.– Київ, 1997, С.407- 408 (особистий внесок - розробка методів якісного аналізу екдизонів у сировині левзеї).

Оккерт І.Л. Фармакогностичне вивчення рапонтикуму сафлоровидного та одержання сполук-стандартів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія. – Національна фармацевтична академія України, Харків, 2002.

Робота присвячена фармакогностичному вивченню рапонтикуму сафлоровидного (Rhaponticum carthamoides) культивованого та дикорослого та розробці методів виділення та очищення речовин – стандартів.

У надземних та підземних органах рапонтикуму встановлена наявність різних груп БАР: флавоноїдів, амінокислот, оксикоричних кислот, екдистероїдів, вуглеводів. Розроблена методика кількісного визначення у сировині рапонтикуму суми фруктозанів після їх кислотної трансформації.

Уперше встановлений амінокислотний, мікроелементний склад. Виділено та встановлено структуру 30 речовин: 17 флавоноїдів (12 агліконів та 5 глікозидів), 5 кумаринів, 6 оксикоричних кислот, 2 екдистероїда.

З кореневищ та коренів рапонтикуму вперше виділені гликозіди 7-глюкозид кверцетину, 7-глюкозид кемпферолу і 7-глюкозидом ізорамнетину, а також кумарини, які представлені кумарином, скополетином, умбеліфероном, ізоскополетином. Із трави перцю стручкового була виділена та встановлена структура нової природної сполуки – 6-С-кофеїл-лютеоліну, а з трави чебрецю були виділені нові флавонові глікозиди – вітексин і орієнтін.

Розроблено нові способи одержання сполук-стандартів, таких як лютеолін-стандарт та екдизон-стандарт.

Уперше проведений порівняльний морфолого-анатомічний аналіз рапонтикуму сафлоровидного культивованого в порівняні з дикорослими зразками. Встановлені нові діагностичні морфологічні та анатомічні ознаки кореневищ та коренів рапонтикуму. Розроблені проекти АНД “Кореневище з коренями рапонтикуму сафлоровидного культивованого”, “Лютеолін- стандарт”, “Екдистерон- стандарт”.

Ключові слова: рапонтикум сафлоровидний (Rhaponticum carthamoides Willd.), перець однорічний (Caspicum annuum L.), чебрець плазкий (Thymus serpyllum L.), фармакогностичне вивчення, флавоноїди, екдистероїди, оксикоричні кислоти, кумарини, фруктозани, мікроелементи, амінокислоти.

Оккерт И.Л. Фармакогностическое изучение рапонтикума сафлоровидного и получение веществ-стандартов. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 – фармацевтическая химия и фармакогнозия. Национальная фармацевтическая академия Украины, Харьков, 2002.

Работа посвящена фармакогностическому изучению рапонтикума сафлоровидного (Rhaponticum carthamoides Willd.) дикорастущего и культивируемого и разработке методов выделения и очистки веществ - стандартов. Исследованы различные группы биологически активных веществ: флавоноиды, оксикоричные кислоты, аминокислоты, углеводы (глюкофруктаны). Разработана методика количественного определения суммы фруктозанов после их кислотной трансформации и проведен количественный анализ содержание глюкофруктанов в подземных и надземных частях рапонтикума.

При помощи аминокислотного анализатора “Альфа +” было идентифицировано в корнях и корневищах рапонтикума сафлоровидного 17 аминокислот, доминантными из которых являются аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота, лейцин, лизин и аргинин. Изучен элементного состава золы рапонтикума, установлено, что в наибольшем количестве содержатся такие элементы как железо, цинк, медь, марганец, алюминий.

Методами жидкостной экстракции, препаративной и колоночной хроматографии из разных органов рапонтикума сафлоровидного, травы перца стручкового и травы чабреца выделено 30 индивидуальных веществ: