АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

ОХРІМЕНКО Віктор Олексійович

УДК 615.9; 577.115.4; 615.917; 577.161.3; 612.6

РОЛЬ ПРОЦЕСІВ ПОЛ В МЕХАНІЗМІ ТОКСИЧНОЇ ДІЇ МЕТИЛ-БІС-(_ХЛОРЕТИЛ)-АМІНУ НА РЕПРОДУКТИВНУ СИСТЕМУ

(експериментальні дослідження)

14.03.06 — токсикологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в | Інституті фармакології та токсикології АМН України

Науковий керівник | - доктор біологічних наук КОВАЛЕНКО Валентина Миколаївна, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідуюча відділом загальної токсикології

Офіційні опоненти: | доктор медичних наук ОВСЯННІКОВА Людмила Михайлівна, Інститут клінічної радіології НЦМР АМН України, провідний науковий співробітник лабораторії молекулярної біології

кандидат медичних наук КРАВЧУК Олександр Павлович, Інститут екогігієни та токсикології ім. Л.І.Медведя, завідувач лабораторії мутагенезу

Провідна установа: |

Національний медичний університет ім. О. О. Богомольця, кафедра фармакології

Захист дисертації відбудеться 17.04.2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е.Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е.Потьє 14).

Автореферат розісланий 15.03.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д 26.550.01

к.б.н. Данова І. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Аналіз кількісних та якісних характеристик населення за останнє десятиріччя свідчить про те, що Україна перебуває у стані глибокої демографічної кризи, яка характеризується депопуляцією, старінням населення та зменшенням середньої тривалості життя (В. М. Корнацький, 2001). Особливе занепокоєння викликає стан репродуктивного здоров’я, що є невід’ємною складовою частиною здоров’я нації в цілому і має стратегічне значення для забезпечення сталого розвитку суспільства. Згідно Указу Президента від 26. .  р. № 203/2001, в нашій країні схвалено Національну програму “Репродуктивне здоров’я 2001-2005”. В ній зазначено, що, не дивлячись на досягнуті позитивні зрушення в охороні репродуктивного здоров’я, в Україні відбувається різке зниження народжуваності, підвищення загальної смертності, спостерігається високий рівень безпліддя, дитячої та материнської смертності. Погіршення стану здоров’я вагітних спричиняє зростання кількості патологічних пологів (72% у 2000 р.), і, як наслідок, кожна третя дитина має відхилення у фізичному та психічному розвитку.

Поряд з соціально-економічними та медичними аспектами важливим фактором, який впливає на репродуктивне здоров’я населення, є зовнішнє середовище (В. М. Случик, 1995; Д. А. Дмитриев, 1997). Серед органічних сполук, які широко використовуються в народному господарстві, найбільш токсичними щодо репродуктивної системи є алкілуючі сполуки (У. Росс, 1964). Реакції алкілування досить широко застосовуються в промисловості: при синтезі високооктанового пального та його окремих компонентів, ряду полімерних матеріалів (поліетилен, поліпропілен), для отримання гомологів бензолу, простих та складних ефірів, амінів, сульфонів та ін. Крім того виявлено глутатіонзалежну метаболічну активацію галоалканів (вінілхлорид, 1,2-дібром-3-хлорпропан, діхлоретан та ін.) з утворенням генотоксичних продуктів - напівіпритів та епісульфонієвого іону (J. A. Timbrell, 1996; P.et al., 1997; A. V. Rao et al., 2000). Вони, або їхні метаболіти, здатні безпосередньо взаємодіяти з нуклеїновими кислотами та білками, що призводить до мутагенної та цитотоксичної дії (Л. П. Сычева и соавт, 1985; И. Р. Бариляк и соавт., 1989; Ю. І. Губський, 1995). В першу чергу це стосується клітин з високою швидкістю проліферації (K. Hensley et al., 2000; C. A. Sklar et al., 2000), що зумовлює використання алкілуючих сполук в хіміотерапії пухлин.

Необхідно зазначити, що алкілуючі речовини опосередковано діють на біологічно-активні структури в організмі шляхом активації процесів вільнорадикального окиснення (C. S. Moody et al., 1982; G. Bellomo, 1991; K.et al., 2000; В. М. Коваленко и соавт., 2000).

Активація радикалоутворення, як універсальний механізм, лежить в основі багатьох патологічних процесів (О. Ю. Дубініна, 2001; Ю. І. Губський, 2001).

Проте дані стосовно здатності алкілуючих сполук токсично впливати на репродуктивну систему шляхом активації радикалоутворення та перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) часто обмежені та суперечливі.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у відповідності з планом науково-дослідних робіт Інституту фармакології та токсикології АМН України в межах теми “Дослідження ролі вільнорадикального окиснення в патогенезі токсичної дії ксенобіотиків та її корекція похідними токоферолу” (№ державної реєстрації 0195U003201).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – визначення внеску процесів ПОЛ у репродуктивну токсичність метил-біс-(_хлоретил)-аміну (ембіхіну) та доцільність застосування антиоксидантів.

Для досягнення вищезазначеної мети були поставлені наступні завдання:

-

-

-

-

Об’єкт дослідження – токсичний вплив на репродуктивну систему ксенобіотиків алкілуючої дії.

Предмет дослідження – роль процесів ПОЛ в механізмі гено-, гонадо- та ембріотоксичної дії ембіхіну.

Методи дослідження - токсикологічні, біохімічні, цитогенетичні, морфологічні, фармакологічні, статистичні.

Наукова новизна досліджень.

В результаті проведених досліджень вперше експериментально доведено, що надмірна активація ПОЛ в результаті дії ембіхіну призводить до цитогенетичних змін в клітинах кісткового мозку, деструктивних порушень сперматогенного епітелію, а також негативно впливає на перебіг вагітності експериментальних тварин.

Встановлено, що застосування антиоксидантів, похідних -токоферолу, коригує токсичні прояви ембіхіну на репродуктивну систему тварин.

Вперше проведено вивчення антиоксидантної дії Евіту (ацетат_2,5,7,8-тетраметил-2-(4ґ-метилпентен-3ґ-ил)-6-оксихроману), нової біологічно активної сполуки, за умов токсичної дії алкілуючих сполук на репродуктивну систему й показано, що досліджувана речовина за ефективністю не поступається _токоферолацетату.

У дослідах in vivo отримані нові дані щодо залежності біологічної активності токоферолів від їх будови: підтверджено, що в механізмах антиоксидантної, а також гонадо- та ембріопротекторної дії вирішальну роль відіграє не довжина фітильного ланцюга, а оксихроманове ядро.

Практичне значення роботи. Експериментально обгрунтовано доцільність профілактичного застосування антиоксидантів за умов контакту з алкілуючими речовинами.

Експериментально доведено зростання активності ПОЛ за умов дії ембіхіну, як класичного представника алкілуючих речовин, що дозволило обгрунтувати доцільність дослідження процесів ПОЛ як критерію порушень з боку репродуктивної системи внаслідок дії ксенобіотиків даного класу.

Встановлено антиоксидантні, а також гено-, гонадо- та ембріопротекторні властивості ацетат_2,5,7,8-тетраметил-2-(4ґ-метилпентен-3ґ-ил)-6-оксихроману (Евіту) за умов токсичної дії алкілаторів на організм тварин, що обумовлює доцільність розробки препарату антиоксидантної дії на основі нового похідного -токоферолу - Евіту.

Результати проведених досліджень впроваджено в учбовий процес на кафедрах фармакології Національного медичного університету, Одеського державного медичного університету, Луганського державного медичного університету, Вінницького державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено патентно-інформаційний пошук, проведено аналіз даних літератури за темою дисертації з використанням пошукових серверів “MEDLIENE” та “PUBMED”, відпрацьовано моделі та виконано експериментальні дослідження, аналіз, систематизацію та статистичну обробку одержаних результатів, оформлено їх у вигляді таблиць та рисунків, сформульовано основні положення та висновки роботи. Аналіз впливу ембіхіну та похідних -токоферолу на процеси ПОЛ у фракціях ядерного хроматину печінки проведено за консультації чл.-кор. АМН України, проф. Ю. І. Губського та д.б.н. Є. Л. Левицького.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на І Українській конференції молодих вчених, присвяченій пам’яті В. В. Фролькіса (Київ, 2000), науково-практичній конференції “Вчені України – вітчизняній фармації” (Харків, 2000), Європейському токсикологічному конгресі “EUROTOX-2001” (Стамбул, 2001), ІІ Національному з’їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001), І з’їзді токсикологів України (Київ, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано десять наукових праць, з них – чотири статті у фахових журналах та шість тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 145 сторінках машинопису. Дисертація включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів досліджень, 3 глави власних досліджень, заключення, висновки, список використаних джерел. Роботу ілюстровано 7 рисунками та 19 таблицями. Бібліографія включає 184 вітчизняних та 166 іноземних джерел.ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. В роботі використано: субстанцію метил-біс-(_хлоретил)-аміну гідрохлорид (Embichinum, Antimit, Azotmustarda, Caryolysin, Chlormetine, Mustargen) - протипухлинний засіб алкілуючої дії, синтезований у відділі синтезу та аналізу лікарських засобів Інституту фармакології та токсикології АМН України (серія ). Як антиоксиданти використано вітамін Е (ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4,8,12-триметилтридецил)-6-оксихроман) та Евіт (ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4-метилпентен-3-ил)-6-оксихроман). Обидві сполуки синтезовано АТ “Київський вітамінний завод”.

Експерименти проведено на мишах-самцях масою тіла 18-22 г та щурах масою тіла 180-220 г розведення віварію Інституту фармакології та токсикології АМН України.

Водний розчин ембіхіну (метил-біс-(-хлоретил)-аміну) готували ex, вводили внутрішньовенно, одноразово, в бічну хвостову вену тварин. Олійні розчини вітаміну Е та Евіту вводили внутрішньошлунково один раз на добу за допомогою металевого зонду в дозі ЕД50, що складає відповідно 15 і 10 мг/кг маси тіла (Г. М. Шаяхметова, 2000).

Дослідження генотоксичної дії ембіхіну проводили за методом С. Е.та J.(1965), в основі якого лежить реєстрація структурних пошкоджень хромосом (хромосомних аберацій) та геномних змін в клітинах кісткового мозку на стадії метафази. З метою зупинки поділу клітин на стадії метафази за 2 год до знеживлення тваринам внутрішньочеревинно вводили колхіцин фірми Roussel Uclaf (марка IVO139 BA, Франція) у фізіологічному розчині у дозі 2,5 мг/кг маси тіла. Знеживлювали тварин методом цервікальної дислокації хребців через 20 год після введення ембіхіну, що відповідає періоду першого мітотичного поділу клітин кісткового мозку. Хромосомні та геномні порушення в клітинах кісткового мозку вивчали відповідно до вимог метафазного аналізу (Н. П. Бочков и соавт., 1972). При вивченні генопротекторної дії вітамін Е та Евіт вводили профілактично протягом 14 днів до введення ембіхіну (час, протягом якого ксенобіотики коригують або потенціюють мутагенні властивості (D.et al. 1981)).

Гонадотоксичну дію ембіхіну вивчали через 24 год після його введення щурам-самцям, запліднюючу здатність самців досліджували при спарюванні їх протягом двох естральних циклів з інтактними самками (М. А Базарнова и соавт., 1985; І. Р. Бариляк та співавт., ). Гонадопротекторну ефективність похідних _токоферолу визначали за умов профілактичного введення їх протягом 30 днів, що відповідає напівперіоду розвитку зрілих статевих клітин (В. К. Милованов, 1962).

Дослідження ембріотоксичної дії ембіхіну при введенні його на 10-й день вагітності (період органогенезу та плацентації у щурів), проводили за методом А. П. Дибана та співавт. (1970), а також згідно методичних рекомендацій ВООЗ (1986). Антиоксиданти вводили профілактично - з 1 по 10-й день вагітності, в лікувальному режимі - з 10 по 20-й день вагітності та протягом всього періоду вагітності з 1 по 20-й день (J. G. Wilson, 1965).

Кров у тварин брали під легким ефірним наркозом із стегнової вени, після чого їх знеживлювали методом цервікальної дислокації.

Печінку перфузували через воротну вену охолодженим до +4о С 1%-ним розчином КСl та гомогенізували з використанням 0,05 М трис-НСl буферу рН ,4.

Мітохондріальну та мікросомну фракції печінки отримували за методом диференційного центрифугування (V.C. Schneider, 1948). Усі процедури виконували при температурі не вище 40С.

Визначали рівень гідропероксидів (Л. А Романова и соавт., 1977) у мітохондріальній фракції печінки, вміст дієнових кон’югатів (И. Д. Стальная, 1977), швидкість накопичення продуктів реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) за методом І. Д. Стальної та співавт. (1977), визначали вміст глутатіону (J. Sedlak et al., 1968).

Ліпідні екстракти органел одержували згідно В. Г. Колб та співавт.). Вміст холестерину в сироватці крові, мітохондріальній та мікросомній фракціях досліджували згідно В. Г. Колб та співавт.), вміст загальних фосфоліпідів у мітохондріальній та мікросомній фракціях печінки - згідно C.Fiske, Y.arow (1925).

Вміст цитохрому P-450 визначали за методом T. Omura і R. Sato, (1964).

Білок у гомогенаті та субклітинних структурах печінки визначали за методом O. H. Lowry та співавт. (1951).

Статистичну обробку одержаних даних проводили з використанням пакету програм (С. Н. Лапач и соавт., 2000).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проведені дослідження свідчать, що рівень аберацій хромосом під впливом ембіхіну має дозозалежний характер. Так, внутрішньовенне одноразове введення його щурам у дозі 0,8 мг/кг (1/2 ЛД50) повністю пригнічувало мітотичний поділ клітин кісткового мозку. Доза 0,16 мг/кг (1/10 ЛД50) викликала як кількісні, так і структурні зміни хромосом. Збільшення дози до 0,4 мг/кг (1/4 ЛД50) призводило до підвищення рівня анеуплоїдних клітин, як за рахунок гіпоплоїдії, так і поліплоїдії, при цьому зростала кількість метафаз з пульверизацією всього хромосомного набору (табл. 1).

Отже, введення ембіхіну в дозі 0,4 мг/кг маси тіла призводить до зростання більшості цитогенетичних порушень в клітинах кісткового мозку щурів, не впливаючи при цьому на їх мітотичну активність. Виходячи з цього, саме цю дозу ми обрали для подальшого використання в дослідженнях.

Таблиця 1

Основні кількісні цитогенетичні показники в клітинах кісткового мозку щурів в залежності від дози ембіхіну (%, Mm)

Показники | Експериментальні групи тварин

інтактна | ембіхін

1/10 ЛД50

(0,16 мг/кг) | ембіхін

1/4 ЛД50

(0,4 мг/кг) | ембіхін

1/2 ЛД50

(0,8 мг/кг)

Аберації хроматидного типу (одиночні фрагменти) | - | 8,6 1,8 * | 10,4 2,4 * | Пригнічує мітотичну активність клітин кісткового мозку

Аберації хромосомного типу (парні фрагменти) | - | 0,94 0,02 | 2,0 0,7

Пульверизація хромосом | - | - | 2,0 0,7

Загальна кількість клітин з абераціями хромосом | - | 9,6 2,16 * | 15,9 1,8 *

Хроматидні щілини | - | 1,19 0,8 | 1,86 0,6

Гіпоплоїдні клітини | 13,9 1,5 | 28,6 3,3 * | 33,8 2,3 *

Поліплоїдні клітини | 2,9 0,7 | - | 3,1 0,8

Загальна кількість клітин з геномними змінами | 16,8 1,6 | 28,5 3,3 * | 36,9 2,4*

Примітка в цій табл. та 2, 3. * р0,05 в порівнянні з інтактними тваринами

Через 20 год після одноразового внутрішньовенного введення щурам ембіхіну в дозі 0,4 мг/кг маси тіла виявлено збільшення швидкості індукованого аскорбатом утворення ТБК_продуктів у сироватці крові на 47%, у мікросомній фракції печінки цей показник в 1,7 рази перевищив його рівень відносно інтактних тварин (табл. 2). Аналогічні зміни спостерігались і у сім’яниках. У гомогенаті печінки самок та їх плодів на 20-й день вагітності (при введенні ембіхіну на 10-й день вагітності - період плацентації та органогенезу) відбувалось збільшення досліджуваного показника відповідно в 3,6 та у 2,66 рази.

Таблиця 2

Швидкість аскорбатзалежного утворення ТБК-активних продуктів (мкмоль/хв 1мг білка) у тканинах та органах щурів при однократному внутрішньовенному введенні ембіхіну в дозі 0,4 мг/кг маси тіла (Mm, n6)

Тканини та органи | Експериментальні групи тварин

інтактна | ембіхін

Сироватка крові | 57,0 6,0 | 84,0 3,0 *

Мікросомна фракція печінки | 874,0 104,0 | 1468,0 76,0*

Гомогенат сім’яників | 0,331 0,015 | 0,375 0,01 *

Гомогенат печінки вагітних самок | 0,122 0,015 | 0,438 0,028 *

Гомогенат плодів | 0,044 0,004 | 0,117 0,013 *

Результати проведених досліджень (рис. 1) показали, що після введення алкілуючої речовини в печінці щурів самців та вагітних самок відбувалось зниження рівня відновленого глутатіону відповідно на 50% та 75%, в той час як у плодах відбувалось його збільшення в 2,4 рази.

Рис.1 Вміст відновленого глутатіону у гомогенатах печінки самців-щурів, вагітних самок-щурів та їх плодів 20-го дня антенатального розвитку при однократному введенні ембіхіну на 10-й день вагітності

Під впливом ембіхіну у гомогенатах сім’яників, печінки вагітних щурів та їх ембріонів (табл. 3) відбувалось зниження вмісту фосфоліпідів на 24,8%, 53,8% та 41,7%, відповідно, в порівнянні з інтактними тваринами. При цьому вміст вільного холестерину у гомогенаті сім’яників знижувався в 2 рази, а в гомогенаті печінки вагітних самок та гомогенаті плодів - у 5 разів.

Таблиця 3

Вплив ембіхіну на вміст ліпідів у гомогенатах сім’яників щурів, печінки вагітних самок та гомогенаті плодів, мкмоль/мг білка (n6, Мm)

Тканини та органи | Фосфоліпіди | Вільний холестерин

експериментальні групи тварин

інтактна | ембіхін | інтактна | ембіхін

Гомогенат сім’яників | 2,86 0,13 | 2,15 0,14* | 3,24 0,40 | 1,58 0,10 *

Гомогенат печінки вагітних самок | 4,70 0,26 | 2,17 0,03 * | 1,37 0,21 | 0,25 0,02 *

Гомогенат плодів | 4,29 0,35 | 2,50 0,24 * | 1,17 0,22 | 0,23 0,01 *

Підтверджена в нашій роботі здатність алкілуючих сполук справляти токсичну дію на репродуктивну систему за рахунок надмірної активації процесів вільнорадикального окиснення ліпідів свідчить про можливість використання інгібіторів цих процесів, в тому числі й речовин з антиоксидантною дією.

Профілактичне внутрішньошлункове застосування вітаміну Е та Евіту в еквімолярних дозах 15 та 10 мг/кг маси тіла тварин протягом 14 днів проявило генопротекторний ефект щодо виникнення структурних аберацій, кількість яких зменшилась до 4,6% та 7,4% відповідно, а введення Евіту призводило до зниження й геномних змін на 24,9% (табл. 4).

Таблиця 4

Основні кількісні цитогенетичні показники в клітинах кісткового мозку щурів під впливом ембіхіну (0,4 мг/кг) та за умов профілактичного введення вітаміну Е та Евіту (%, Mm)

Показники | Експериментальні групи тварин

вітамін Е + ембіхін | Евіт + ембіхін

Аберації хроматидного типу (одиночні фрагменти) | 2,9 0,7 * | 5,4 1,5 *

Аберації хромосомного типу (парні фрагменти) | - | 1,0 0,5

Пульверизація хромосом | 1,7 0,6 | 1,0 0,5

Загальна кількість клітин з абераціями хромосом | 4,6 1,3 * | 7,4 1,3 *

Хроматидні щілини | 1,63 0,4 | 1,68 0,6

Гіпоплоїдні клітини | 34,0 3,0 | 26,4 2,2 *

Поліплоїдні клітини | 1,8 0,8 | 1,4 0,6

Загальна кількість клітин з геномними змінами | 35,9 3,0 | 27,7 2,3 *

Примітка. * р0,05 в порівнянні з тваринами, яким вводили ембіхін в дозі 0,4 мг/кг маси тіла (див. табл.1)

Профілактичне застосування похідних вітаміну Е та Евіту протягом 30 днів зменшувало вміст гідропероксидів ліпідів на 27 – 28,4% (рис. 2) та нормалізувало швидкість індукованого аскорбатом утворення ТБК-продуктів в сім’яниках щурів.

Біохімічні дані узгоджувались з результатами морфометричних досліджень сім’яників. Так, профілактичне введення вітаміну Е сприяло зменшенню кількості канальців з деструктивними порушеннями сперматогенного епітелію в 1,97 – 3,1 рази, збільшенню індексу сперматогенезу та числа сперматогоній. Введення Евіту також коригувало вказані деструктивні зміни в канальцях, крім того сприяло збільшенню кількості статевих клітин в епідидимісі у 2,5 рази (табл. ).

Таблиця 5

Морфофункціональні показники гонад самців щурів при введенні ембіхіну та профілактичному застосуванні вітаміну Е та Евіту (M  m, n8)

Показники | Експериментальні групи тварин

інтактна | ембіхін | вітамін Е

+ ембіхін | Евіт

+ ембіхін

Канальці зі злущеним епітелієм, % | 6,33 0,5 | 22,6 1,76 | 7,3 0,55 * | 5,3 0,9 *

Канальці з відшаруван-ням епітелію, % | 4,7 1,1 | 19,7 2,66 | 10,0 1,0 * | 1,3 1,0 *

Канальці з “вікнами”, % | 6,7 0,9 | 34,3 3,9 | 15,3 3,9 * | 5,3 0,7 *

Індекс сперматогенезу | 3,66 0,01 | 3,45 0,02 | 3,62 0,01 * | 3,63 0,02 *

Число сперматогоній | 53,3 3,5 | 29,4 0,7 | 50,2 1,6 * | 49,0 1,5 *

Кількість сперматозої-дів, млн/мл суспензії | 12,43 0,95 | 7,2 1,3 | 9,3 1,1 | 17,8 1,7 *

Осморезистентність сперматозоїдів, (% КСl) | 3,15 | 2,36 | 3,2 * | 3,4 *

Примітка. * р0,05 в порівнянні з тваринами, яким вводили ембіхін

Використання похідних -токоферолу в період вагітності показало, що найбільш ефективним є застосування їх в профілактично-лікувальному режимі при введенні ембіхіну на 10-й день антенатального розвитку плода. При цьому відбувалось зменшення швидкості аскорбатзалежного утворення ТБК-активних продуктів у гомогенаті печінки самок при введенні вітаміну Е у 2,0, а Евіту - у 1,6 рази, в гомогенаті плодів цей показник зменшувався у 1,8 рази (рис. 3).

Рис. 3 Вплив вітаміну Е та Евіту, введених в профілактичному (А), лікувальному (В), профілактично-лікувальному (С) режимах на швидкість аскорбатзалежного утворення ТБК-продуктів в гомогенаті печінки самок та гомогенаті плодів 20-го дня антенатального розвитку за умов введення ембіхіну в дозі 0,4 мг/кг (за 100% взято рівень інтактних тварин).

Лікувально-профілактичне застосування вітаміну Е та Евіту зменшувало такий інтегральний показник протікання вагітності, як загальну ембріональну смертність на 53,8 і 37,8%, відповідно, та сприяло збільшенню маси та розмірів плацент, і, як наслідок, збільшенню маси та розмірів плодів (табл. 6).

Таблиця 6

Вплив профілактично-лікувального застосування вітаміну Е та Евіту на ембріональну загибель, масу та розміри плодів і плацент при введенні ембіхіну на 10-ту добу вагітності (n6, Mm)

Показники | Експериментальні групи тварин

інтактна | ембіхін | вітамін Е | Евіт

Післяімплантаційна загибель ембріонів, % | 6,7 1,4 | 29,7 3,4 * | 11,7 1,8 * ** | 16,5 1,9 **

Загальна загибель ембріонів, % | 14,8 1,1 | 35,7 3,3 * | 14,6 1,5 * ** | 22,2 7,5 * **

Маса плодів, г | 2,36 0,04 | 2,20 0,05 * | 2,30 0,04 | 2,10 0,03 *

Розміри плодів, мм | 32,4 0,2 | 30,8 0,4 * | 33,9 0,3 * ** | 31,8 0,3

Маса плацент, г | 0,51 0,01 | 0,38 0,01 * | 0,47 0,01 * ** | 0,45 0,01 * **

Розміри плацент, мм | 14,4 0,2 | 13,0 0,1 * | 13,8 0,2 * ** | 14,1 0,1 **

Примітки:

1.

2.

Таким чином, на прикладі ембіхіну продемонстровано, що ксенобіотики-алкілатори поряд з прямою (алкілуючою) дією на біологічні об’єкти здатні активувати процеси ПОЛ, що призводить до хромосомних та геномних порушень спадкового апарату клітин, деструктивних змін сперматогенного епітелію, збільшення ембріональної смертності та зниження морфометричних показників стану живих плодів. Надмірна індукція процесів ПОЛ під впливом ембіхіну та проявлена гено-, гонадо- та ембріопротекторна ефективність вітаміну Е та його коротколанцюгового аналогу Евіту свідчать про доцільність застосування фармакологічних препаратів антиоксидантної дії з метою профілактики та лікування токсичної дії ксенобіотиків-алкілаторів на репродуктивну систему.-

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

АНОТАЦІI

Охріменко В. О. Роль процесів перекисного окиснення ліпідів в механізмі токсичної дії метил-біс-(-хлоретил)-аміну на репродуктивну систему (експериментальні дослідження). – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.06 - токсикологія. - Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2002.

Дисертаційна робота присвячена експериментальному обґрунтуванню ролі процесів перекисного окиснення ліпідів, що викликане дією алкілуючого агента на прикладі метил-біс-(-хлоретил)-аміну (ембіхін), в гено- гонадо- та ембріотоксичних ефектах у організмі експериментальних тварин.

У результаті проведених досліджень показано, що одноразове внутрішньовенне введення ембіхіну призводить до активації процесів ПОЛ в сироватці крові, печінці, хроматиновій фракції печінки та печінці вагітних самок і плодів. Вітамін Е та його коротоколанцюгове похідне при внутрішньошлунковому введенні проявляє антиоксидантну ефективність та коригує викликані дією ембіхіну порушення хромосом клітин кісткового мозку, деструктивні зміни сперматогенного епітелію і має ембріопротекторні властивості.

Ключові слова: перекисне окиснення ліпідів, метил-біс(-хлоретил)-амін, вітамін Е, ацетат_2,5,7,8-тетраметил-2-(4ґ-метилпентен-3ґ-ил)-6-оксихроман (робоча назва Евіт), генотоксичність, гонадотоксичність, ембріотоксичність.

Охрименко В. А. Роль процессов перекисного окисления липидов в механизме токсического действия метил-бис-(-хлорэтил)-амина на репродуктивную систему (экспериментальные исследования) – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.06 – токсикология. – Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2002.

Диссертационная работа содержит данные о роли процессов перекисного окисления липидов в организме экспериментальных животных при введении метил-бис-(-хлорэтил)-амина (эмбихин) и возможности коррекции прооксидантного компонента витамином Е и его оригинальным короткоцепочечным производным ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4-метилпентен-3-ил)-6-оксихроманом (рабочее название Евит).

В результате проведенных исследований показано, что уровень аберраций хромосом костного мозга крыс, индуцированных однократным введением эмбихина, имел дозозависимый характер.

Введение эмбихина в дозе 0,4 мг/кг (1/4 ЛД50) вызывало как геномные, так структурные изменения хромосом клеток костного мозга крыс. В результате действия эмбихина происходило увеличение скорости аскорбатзависимого образования ТБК-активных продуктов в сыворотке крови, печени на 47 и 68%, а также содержания диэновых конъюгатов в изопропанольных экстрактах репрессированного и транскрипционно-активного хроматина печени в 3 и 1,48 раза. Профилактическое введение витамина Е и Евита в эквимолярных дозах 15 и 10 мг/кг, соответственно, корригирует цитогенетические нарушения и процессы ПОЛ в сыворотке и печени.

В результате однократного введения эмбихина через 24 ч в гомогенате семенников крыс увеличивался уровень гидроперекисей липидов в 1,5 раза, скорость аскорбатзависимого образования ТБК-активных продуктов на 13,3%. При морфометрическом исследовании гонад крыс наблюдались деструктивные изменения сперматогенного эпителия канальцев, уменьшение числа сперматогоний на 44,8%. Профилактическое введение изучаемых антиоксидантов приводило к нормализации вышеперечисленных показателей и повышало оплодотворяющую способность самцов на 20% после введения алкилатора.

При введении эмбихина на 10-й день беременности отмечалась активация скорости образования ТБК-активных продуктов и у самок, и у плодов на 20-й день антенатального развития. При этом наблюдалось снижение уровня глутатиона в печени самок и его увеличение в тканях плодов. В результате проведенных исследований показано, что наиболее эффективным является применение витамина Е и Евита в лечебно-профилактическом режиме, в результате которого происходит снижение общей эмбриональной смертности на 40-50%.

Совокупность полученых данных свидетельствует о том, что, наряду с прямым алкилирующим действием на биополимеры, эмбихин активирует процессы перекисного окисления липидов в репродуктивной системе. Это дает возможность примененять вещества с антиоксидантным типом действия для профилактики и коррекции токсического действия ксенобиотиков-аликилаторов на репродуктивную систему.

Ключевые слова: перекисное окисление липидов, метил-бис-(-хлорэтил)-амин, витамин Е, ацетат_2,5,7,8-тетраметил-2-(4ґ-метилпентен-3ґ-ил)-6-оксихроман (робочее название “Евит”), генотоксичность, гонадотоксичность, эмбриотоксичность.

Okhrimenko V. O. The effects of lipid peroxidation caused by methyl-bis-(-chloroethyl)-amine toxicity on reproductive system (experimental studies). – Manuscript.

A dissertation for obtaining a scientific degree "Candidate of medical sciences" in speciality 14.03.06 - toxicology. - Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

The dissertation aims to study the effects of lipid peroxidation caused by alkylating agent methyl-bis-(-chloroethyl)-amine (embihine) on geno-, gonado- and embryotoxic effects in animals.

It was shown that the single intravenous administration of embihine led to activation of lipid peroxidation in blood serum, liver, liver chromatine fraction and liver of pregnant females and foetuses thereof. Vitamin Е and its truncated chain derivative being administered intragastrically demonstrate antioxidative effects and reduce chromosoms mutations caused by embihine in bone marrow cells, destructions of spermatogenic epithelium and turned to be embryoprotective.

Key words: lipid peroxidation, methyl-bis-(-chloroethyl)-amine, vitamin Е, acetate_,5,7,8-tetramethyl-2-(4'-methylpenten-3'-yl)-6-oxychroman (Evit), genotoxicity, gonadotoxicity, embryotoxicity.