НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології і генетики

Потягайло Андрій Любомирович

УДК 577.323

577.324

Протонна рухливість у модельних

білково-нуклеїнових і нуклеїново-нуклеїнових комплексах та її можливе біологічне значення

03.00.03 – молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі молекулярної біофізики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Говорун Дмитро Миколайович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу молекулярної біофізики.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Зима Валентин Леонідович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біофізики біологічного факультету;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Козлов Едуард Андрійович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

провідний науковий співробітник відділу механізмів трансляції генетичної інформації.

Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 28 січня 2003 року о 10 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01

в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України

за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150).

Автореферат розіслано 25 грудня 2002 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О. В. Підпала

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Фундаментальною властивістю молекулярно-біологічних процесів є перенесення заряду, маси, енергії та інформації (Шайтан, 1994). Аналіз літератури засвідчує, що перенесення заряду переміщенням протона, наприклад вздовж міжмолекулярних водневих (Н) зв'язків, є недостатньо вивченим явищем навіть на рівні низькомолекулярних комплексів, що моделюють елементарні акти білково-нуклеїнового та нуклеїново-нуклеїнового впізнавання, попри його важливе функціональне значення. Привабливість цих явищ із функціонально-біологічної точки зору зумовлена їхніми унікальними фізико-хімічними властивостями:

- процеси міжмолекулярного перенесення протона характеризуються чи не найменшими стеричними ускладненнями, оскільки вони суттєво не збурюють зв'язувальних електронів (Гольданский и др., 1986);

- міжмолекулярні Н-зв'язки з полегшеним перенесенням протона мають велику поляризовність (її зазвичай називають гіперполяризовністю) внаслідок чого міграція протонів легко піддається дистанційному управлінню направленим електричним полем відносно невеликої напруженості (Zundel, 2000);

- вважається, що перенесення протона вздовж сильних (низькобар'єрних) Н-зв'язків є характерним атрибутом елементарного ферментативного акту (Карасев и др., 1989; Cleland et al., 1998);

- нарешті, протон, що переміщується, може бути носієм біомолекулярної взаєморегуляції, оскільки його перенесення легко ініціюється і адресно сприймається на відстані, локально збурюючи у той чи інший спосіб конформацію біополімерів (Зарудна та ін., 1999); дуже важливо, що акт перенесення протона може супроводжуватися конформаційними збуреннями, зокрема солітонного типу (Золотарюк та ін., 1999).

З-поміж фізико-хімічних явищ, пов'язаних із протонною рухливістю, що мають біологічний сенс, чи не найкраще вивчено прототропну таутомерію нуклеотидних основ (Leszczynski, 2000; Говорун та ін., 1999). Вотсон і Крик (Watson, Crick, 1953) були першими, хто розгледіли у ній джерело спонтанних точкових мутацій, що виникають при реплікації ДНК. Проте нині це питання тлумачиться неоднозначно – все більше переваг дослідники віддають, зокрема, таким процесам (знову ж таки пов'язаним із протонною рухливістю) як іонізація основ протонуванням чи депротонуванням. Найвагоміший контраргумент, який при цьому висувається, – Н-зв'язані пари нуклеотидних основ за участі рідкісних таутомерів не зафіксовані експериментально ні у водному розчині, ні в модельних нуклеїново-нуклеїнових чи білково-нуклеїнових комплексах (Goodman, 1995) попри те, що енольний та імінний таутомери Gua і Cyt надійно реєструють у вільному стані (Благий, Шеїна, Радченко, Степанян, 1994).

Недавно проблема біологічної значущості прототропної таутомерії нуклеотидних основ отримала "друге дихання": експериментально зафіксовано як неправильну пару основ Gua(енол):Thy у складі додекамера ДНК у воді (Allawi et al., 1998), так і таутомеризацію Н-зв'язаної пари модельних основ (Zewail et al., 1995). Окрім того, у загальних рисах стало зрозуміло як ДНК-полімераза "відбраковує" неправильні пари від правильних: вважається, що наріжним структурним чинником є електронна і геометрична ізоморфність пар, що утворюються в її активному центрі (Полтев и др., 1998; Kool, 2001). Оскільки пари нуклеотидних основ за участі неканонічних таутомерів квазіізоморфні Вотсон-Криківським, а енергія міжнуклеотидної взаємодії у них ненабагато відрізняється від комплементарної (Pullman et al., 1967), то це може свідчити на користь прототропної таутомерії як одного із джерел спонтанних точкових мутацій.

Це далеко не повний перелік причин, які стимулюють дослідників до вивчення під кутом зору можливої біологічної значущості ефектів, пов'язаних з протонною рухливістю у модельних білково-нуклеїнових та нуклеїново-нуклеїнових комплексах, у якомога ширшій царині їх фізико-хімічних проявів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота відповідає планові наукових досліджень відділу молекулярної біофізики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України. Її виконано в рамках бюджетних тем "Вивчення фізико-хімічної природи перебігу елементарних процесів білково-нуклеїнового впізнавання в модельних системах типу "мономер-мономер" та "мономер-полімер" (№ держ. реєстрації 0198U005247, 1996-2000 р.р.) та "Дослідження глибинних фізико-хімічних механізмів елементарних процесів білково-нуклеїнового впізнавання" (№ держ. реєстрації 0101U000603, 2001-2005 р.р.). Частково роботу виконували в рамках кількох грантів, зокрема "Прототропна таутомерія нуклеотидних основ: нові підходи до старої проблеми" (програма "Фонд фундаментальних досліджень" ДКНТ України, шифр 5.4/77, 1996 – 2000 р.р.) і "Дослідження таутомерних перетворень нуклеотидних основ, що опосередковують високоспецифічні процеси білково-нуклеїнового впізнавання" (програма "Фонд фундаментальних досліджень" ДКНТ України, шифр 05.07/00130, 2001-2005 р.р.).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи – дослідити у максимально широкому форматі за одних і тих же методичних підходів фізико-хімічні властивості модельних білково-нуклеїнових та нуклеїново-нуклеїнових комплексів, пов'язані з протонною рухливістю, і окреслити їхню можливу біологічну значущість.

Для її досягнення вирішували такі комплексні завдання:

1. Використовуючи низькомолекулярні моделі, встановити елементарні фізико-хімічні механізми і засоби молекулярного управління таутомерним статусом нуклеотидних основ, які, зокрема, дозволяють мінімізувати рівень спонтанних точкових мутацій, спричинених переходами основ у неканонічну таутомерну форму, при біосинтезі нуклеїнових кислот.

2. Вивчити вплив протонування Вотсон-Криківських пар основ у місцях, не задіяних у комплементарному спарюванні, на їхню термодинамічну стабільність та окреслити його можливе біологічне значення.

3. Отримати повну множину точкових контактів електронейтральної і депротонованої карбоксильної групи амінокислот з деякими канонічними і модифікованими основами.

4. Вивчити молекулярні механізми структурних переходів поліцитидилової та дезоксиполіцитидилової кислот, спричинених приєднанням протонів, і дати їм належне квантово-хімічне обґрунтування.

5. Дослідити 6-азацитидин (6azaCyd) та одноланцюгові поліаденілову (полі(А)), поліцитидилову (полі(С)) і дезоксиполіцитидилову (полі(dC)) кислоти на наявність у них неканонічних внутрішньомолекулярних Н- зв'язків.

6. Вивчити протонодонорні-протоноакцепторні властивості низки модифікованих нуклеотидних основ і порівняти їх із аналогічними властивостями канонічних основ та найпростіших моделей нуклеозидів.

7. Встановити структуру найстабільніших протонних пасток, утворених напівпротонованими Н-зв'язаними гомо- і гетеропарами нуклеотидних основ, та комплексів деяких канонічних і модифікованих основ із карбоксильною групою амінокислот, що характеризуються перенесенням протона.

Об'єкт дослідження: модельні низькомолекулярні білково-нуклеїнові та нуклеїново-нуклеїнові комплекси типу "нуклеотидна основа – бічний радикал амінокислоти" та "нуклеотидна основа – нуклеотидна основа"; канонічні нуклеотидні основи; низка модифікованих нуклеотидних основ, зокрема найпростіші моделі нуклеозидів – основи, метильовані по 9 або 1 положенню пуринового чи піримідинового кільця відповідно; 6azaCyd; полі(С) і полі(dC); полі(А).

Предмет дослідження: фізико-хімічні властивості модельних білково-нуклеїнових і нуклеїново-нуклеїнових комплексів, пов'язані з протонною рухливістю, зокрема: фізико-хімічні механізми та елементарні молекулярні засоби управління таутомерним статусом нуклеотидних основ і термодинамічною стабільністю їхніх Вотсон-Криківських пар; природа структурних переходів полі(С) та полі(dC), спричинених протонуванням; неканонічні внутрішньомолекулярні Н-зв'язки в 6azaCyd та одноланцюгових полі(А), полі(С) і полі(dC); кислотно-лужні властивості модифікованих нуклеотидних основ; геометричні властивості найсильніших протонних пасток, утворених гомо- та гетероасоціатами модифікованих нуклеотидних основ; можлива біологічна значущість зафіксованих фізико-хімічних ефектів.

Методи дослідження: напівемпіричні (AM1, MNDO/H) і неемпіричні (MP2/6-31G(d,p)//HF/6-31G(d,p)) квантово-хімічні методи (аналіз структурних та енергетичних характерних об'єктів дослідження); УФ та 1H ЯМР-спектроскопія (дослідження молекулярної гомо- і гетероасоціації); метод протонної буферної ємності (вивчення природи структурних переходів полі(С) і полі(dC), спричинених протонуванням), а також якісне прогнозування (аналіз можливої біологічної значущості отриманих числових результатів).

Наукова новизна одержаних результатів полягає у тому, що вони істотно розширюють і поглиблюють існуючі уявлення про можливу біологічну роль та фізико-хімічні прояви ефектів, пов'язаних із феноменом протонної рухливості нуклеїнових кислот та їхніх комплексів із білками. Так, із залученням сучасних розрахункових методів і, почасти, експериментальних вперше виявлено і охарактеризовано елементарні молекулярні засоби управління як таутомерним статусом нуклеотидних основ, так і термодинамічною стабільністю їхніх Вотсон-Криківських пар. Вперше запропоновано нові молекулярні механізми точкового мутагенезу, спричиненого прототропною таутомерією нуклеотидних основ, які, на відміну від існуючих підходів, включають білки як рівноправні учасники подій. На прикладі полі(С) і полі(dC) вперше встановлено на квантово-хімічному рівні природу структурних переходів, спричинених протонуванням. Вперше зафіксовано "павутину" неканонічних внутрішньомолекулярних Н-зв'язків у 6-azaCyd та в одноланцюгових полі(А), полі(С) і полі(dC). Вперше отримано ряди кислотності та лужності низки модифікованих нуклеотидних основ, що налічує 42 молекули.

Практичне значення одержаних результатів. Уявлення про елементарні молекулярні засоби управління таутомерним статусом нуклеотидних основ і термодинамічною стабільністю Вотсон-Криківських пар можуть виявитися корисними для планування експериментів щодо сайт-спрямованого мутагенезу ДНК-полімераз. Отримані в роботі результати можуть бути також використані в науково-дослідній практиці для розробки кількісних моделей біомолекулярного впізнавання. Встановлені геометричні характеристики точкових контактів, зокрема протонних пасток, можуть знадобитися для зменшення неоднозначності в інтерпретації рентгеноструктурних і ЯМР-даних щодо просторової організації як нуклеїнових кислот, так і нуклеопротеїдних комплексів.

Особистий внесок здобувача. У всіх опублікованих у співавторстві наукових працях за темою дисертації особистий внесок здобувача полягає у власноруч проведених квантово-хімічних обчисленнях та безпосередній участі у реальному фізико-хімічному експерименті, аналізі отриманих результатів та зіставленні їх із літературними даними, обговоренні результатів, написанні наукових праць та оприлюдненні отриманих результатів на наукових конференціях і з'їздах.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були представлені на ІІ з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, Україна, 1998), Конференції (за участі міжнародних учасників) з фізики біологічних систем (Пуща-Водиця, Україна, 1998), XIV міжнародній школі-семінарі "Спектроскопія молекул та кристалів" (Одеса, Україна, 1999), ІІ з'їзді біофізиків Росії (Москва, Росія, 1999), XIV міжнародному круглому столі "Нуклеозиди, нуклеотиди та їхнє біологічне застосування" (Сан-Франциско, США, 2000), Першій Російсько-Українсько-Польській конференції з молекулярних взаємодій (Гданськ, Польща, 2001), XV міжнародній школі-семінарі "Спектроскопія молекул та кристалів" (Чернігів, Україна, 2001) і наукових семінарах відділу молекулярної біофізики ІМБіГ НАН України (1998 – 2002).

Публікації. Матеріали дисертації оприлюднено у 18 наукових працях, в тому числі – в 10 статтях у наукових фахових виданнях і у тезах 8 доповідей на наукових конференціях, з'їздах, школах-семінарах тощо.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 150 сторінках; вона складається із вступу, огляду літератури, розділу, присвяченому матеріалам та методам, розділу власних досліджень, розділу узагальнення результатів, висновків, переліку використаної літератури, що нараховує 166 найменувань. Вона містить 17 таблиць і 37 рисунків.

Основний зміст РОБОТИ

Матеріали і методи

Матеріалом для теоретико-розрахункових досліджень слугували такі сполуки: канонічні нуклеотидні основи – Ade, Gua, Cyt, Thy та їхні Вотсон-Криківські пари; низка модифікованих основ – m9Ade, m1Ade, mAde, m3Ade, mAde, mAde, m9Gua, mGua, mGua, m3Gua, mGua, m7Gua, mGua, isoGua, Pur, m6Pur, Hyp, mHyp, m9Hyp, Xan, m1Xan, m3Xan, mXan, m9Xan, m3Thy, m1Thy, m3Ura, m1Ura, mUra, 5HOmUra, m3Cyt, isoCyt, m1Cyt, mCyt, 5azaCyt, 5HOmCyt, 6azaCyt, mCyt; деякі їхні гомо- і гетероасоціати – mGua:mGua+, m1Cyt:m1Cyt+, mHyp:mHyp+, mGua+:m1Cyt, mXan:mXan+, Cyt:Cyt+; комплекси Cyt з молекулою води; всеможливі Н-зв'язані комплекси електронейтральної та депротонованої карбоксильної групи амінокислот (CH3COOH та CH3COO–) з нуклеотидними основами – Ura, Thy, Gua, Xan, isoGua і 2-amino-Pur; модифікований нуклеозид 6azaCyd та полінуклеотиди – полі(A), полі(C) і полі(dC).

Дослідження проводили напівемпіричними (AM1, MNDO/H) та неемпіричними методами (ab initio на рівні теорії HF/6-31G(d,p) і MP2/6-31G(d,p)//HF/6-31G(d,p)), використовуючи програмний пакет PC-GAMESS (Granovsky, 1997).

Структурні переходи полі(С) і полі(dC) вивчали, розкладаючи криві протонної буферної ємності, отримані з літературних даних (Hartman, Rich, 1965; Klump, 1975; Inman, 1964), на базисні функції, які відповідають іонізації атомних груп з однаковим значенням pK.

Специфічну взаємодію ацетату натрію (Na+CH3COO–) з основами – Ade, Ura, m1Ura, m3Ura, Thy, m1Thy, Xan і m9Xan у зневодненому ДМСО (від фірм "Sigma", "Calbiochem", "Fluka" і "Реахим") вивчали методом 1Н ЯМР-спектроскопії (спектрометр "Varian" Gemini-200, внутрішній стандарт – TMS, ампули діаметром 5 мм) та УФ спектроскопії (спектрометр "Shimadzu" MPS-2000, кювети товщиною 1 мм).

Результати досліджень та їх обговорення

Елементарні молекулярні механізми управління прототропною таутомерією нуклеотидних основ

1. Регуляція прототропної таутомерії нуклеотидних основ протонуванням

Вперше встановлено (AM1), що одноразове протонування основ ДНК, яке не заважає їхньому Вотсон-Криківському спарюванню, суттєво змінює в той чи інший бік залежно від його місця прототропну таутомерну рівновагу останніх (табл. 1, рис. 1).

Так, протонування атомів N3 Ade, O6 і N7 Gua, O2 Cyt і O4 Thy стабілізує канонічну таутомерну форму; високоенергетичні неканонічні таутомери – імінний Ade та енольні Gua і Thy – стабілізуються протонуванням атомів N7 Ade, N3 Gua і O2 Thy.

Таблиця 1 Рис. 1. Канонічні (ліворуч) та рідкісні (праворуч) таутомери основ ДНК, що можуть спричиняти точкові мутації при реплікації (місця одноразового протонування вказано стрілками)

Відносна енергія неканонічних таутомерів (імінних Ade і Cyt та енольних Gua і Thy) (див. рис. ) електронейтральних і протонованих (місце протонування наведено в дужках) основ ДНК, розрахована методом AM1 у вакуумі

Основа Відносна енергія (ккал/моль)

Ade 13,6

Ade+ (N3) 25,5

Ade+ (N7) 12,1

Thy 16,3

Thy+ (O4) 56,1

Thy+ (O2) 3,5

Gua 3,4

Gua+ (O6) 48,3

Gua+ (N7) 4,6

Gua+ (N3) -3,0

Cyt 3,5

Cyt+ (O2) 18,2

Висловлено і обгрунтовано припущення, що фіксація канонічних таутомерів основ ДНК вибірковим протонуванням бічними залишками лізину, аргиніну і гістидину може використовуватися ДНК-полімеразою для мінімізації спонтанних помилок біосинтезу ДНК, спричинених прототропною таутомерією основ, на стадії, що передує їхньому спарюванню у центрі розпізнавання правильних пар полімерази.

2. Управління стабільністю Вотсон-Криківських пар основ ДНК зовнішнім протонуванням

Показано (AM1), що одноразове протонування Вотсон-Криківських пар основ ДНК у позиціях, які не беруть участі у Н-зв'язуванні, підвищує їхню стабільність (табл. 2, рис. 2). Найбільший енергетичний ефект спостерігається при протонуванні атомів O2 і O4 Thy пари Ade:Thy – він супроводжується перенесенням протона від атома N3 Thy до атома N1 Ade і суттєвою зміною геометричної структури пари. Найбільші геометричні збурення мають місце у парі Gua:Cyt+(O2), яка розкривається і стабілізується лише одним Н-зв'язком N4H…O6; два інших Н-зв'язки при цьому розриваються.

Таблиця 2 Рис. 2. Місця одноразового зовнішнього протонування (показано стрілками) Вотсон-Криківських пар основ ДНК (протони, що приєдналися, не беруть участі у Н-зв'язуванні основ)

Зростання енергії міжмолекулярної взаємодії ДE у Вотсон-Криківських парах основ ДНК при їхньому одноразовому зовнішньому протонуванні. У дужках наведено експериментальні значення енергії Вотсон-Криківської взаємодії основ у вакуумі (Суходуб та ін., 1978)

Пари основ ДE, ккал/моль

Ade:Thy 0 (13,0)

Ade+(N7):Thy 4,7

Ade+(N3):Thy 5,2

Ade:Thy+(O4) 20,9

Ade:Thy+(O2) 23,5

Gua: Cyt 0 (21,0)

Gua: Cyt +(O2) 6,7

Gua +(N7): Cyt 9,1

Gua +(O6): Cyt 12,1

Gua +(N3): Cyt 15,0

Вперше висловлено і обгрунтовано припущення про те, що протонування основ ДНК, що не заважає їхньому Вотсон-Криківському спарюванню, є поліфункціональним фізико-хімічним механізмом, який може використовуватися як на етапі збереження генетичної інформації (стабілізація пар основ з метою запобігання їхній модифікації), так і при реплікації ДНК (підтримання ДНК-полімеразою канонічного таутомерного статусу основ, що одночасно поліпшує їхню комплементарну афінність). Можливо протонування атома O2 Cyt пари Gua:Cyt є елементарним механізмом дії білків, які відповідають за розплітання ДНК.

3. Регуляція прототропної таутомерії нуклеотидних основ специфічною взаємодією з лігандами білкової природи

Вперше методами УФ і 1Н ЯМР-спектроскопії у зневодненому ДМСО та квантово-хімічними розрахунками (ab initio, MNDO/H) у вакуумі встановлено, що специфічна взаємодія депротонованої карбоксильної групи з нуклеотидними основами – Ade, Ura, Thy, isoGua, 2-amino-Pur і Xan – переводить їх у високоенергетичну таутомерну форму: Ade (N9H > N7H), Ura (дікето > кето-енол), Thy (дікето > кето-енол), isoGua (N9H > N7H), 2-amino-Pur (N9H > N3H), Xan (N7H > N9H) (в дужках вказано індуковані таутомерні перетворення), причому ефект слабко залежить від оточення. Як приклад, наведено отримані теоретичні (табл. 3, рис. 3) та експериментальні (рис. 4) дані для Ade.

Рис. 3. Енергетично найвигідніші комплекси таутомерів Ade з карбоксилат-іоном (див. табл. 3) Рис. 4. УФ спектр поглинання у зневодненому ДМСО: 5?10-4 М розчину Ade (1), його суміші з 5?10-3 М CH3COO–Na+ (2) та різниця між ними (3)

Таблиця 3

Енергетичні характеристики (ккал/моль) прототропних таутомерів аденіну та їхніх комплексів з карбоксилат-іоном, отримані методом ab initio на рівні теорії MP2/6-31G(d,p)//HF/6-31G(d,p) у вакуумі

Таутомер Відносна енергія Комплекс Відносна енергія Енергія взаємодії

N9H 0 Ade(N9H):CH3COO– 6,2 -32,6

N7H 10,1 Ade(N7H):CH3COO– 0 -49,1

N1H 23,1 Ade(N1H):CH3COO– 5,6 -56,5

Викладені вище результати дозволяють зробити біологічно важливий висновок про те, що вже на рівні точкових контактів білково-нуклеїнове впізнавання може відбуватися не лише за класичним конформаційним сценарієм структурно-динамічної відповідності (Koshland, 1967), а й супроводжуватися зміною таутомерного статусу нуклеотидних основ, тобто зачіпати їхню хімічну структуру.

4. Всеможливі точкові контакти електронейтральної і депротонованої карбоксильної групи амінокислот із деякими канонічними і модифікованими нуклеотидними основами

Вперше досліджено (MNDO/H, AM1) повні множини точкових контактів низки канонічних і модифікованих нуклеотидних основ, зокрема Ura, Thy, Xan, isoGua, 2-amino-Pur, з електронейтральною і депротонованою карбоксильною групою у вакуумі. Представлено їхню геометричну, електронну і енергетичну структуру.

Вперше виявлено, що електронейтральна карбоксильна група, на відміну від карбоксилат-іона, жодного разу не провокує перехід основ у рідкісну таутомерну форму – енергетично найвигідніші комплекси утворюються з основними їх таутомерами. Окрім того, жодного разу не зафіксовано перенесення протона від карбоксильної групи на основу, яке спостерігається для деяких модифікованих основ у зневодненому ДМСО (Желтовський, Самійленко та ін., 1995): це означає, що оточення (у даному випадку – розчинник) є структурно-динамічним стимулятором цього процесу. Цю властивість можна розглядати як засіб молекулярного управління таутомерним статусом специфічних комплексів. Як приклад, на рис. 5 зоображені деякі із зафіксованих комплексів, стосовно яких у літературі точиться дискусія (Самійленко та ін., 1997). Вони дозволяють адекватно пояснити існуючі експериментальні дані у зневодненому ДМСО (Самійленко, Коломієць, Степанюгін, 1996-2002).

Рис. 5. Деякі комплекси модифікованих нуклеотидних основ з електронейтральною і депротонованою карбоксильною групою (за даними AM1, MNDO/H)

Оскільки біологічну значущість точкових контактів, а саме – розповсюдженість у високомолекулярних білково-нуклеїнових комплексах, не можна ототожнювати з їхньою енергетичною стабільністю (Говорун, 1999), то отримані множини точкових контактів можуть слугувати частиною "абетки" білково-нуклеїнового впізнавання.

Природа структурних переходів полі(С) і полі(dC), спричинених протонуванням

На основі літературних даних (Hartman, Rich, 1965; Klump, 1975; Inman, 1964) вперше розраховано криві протонної буферної ємності полі(С) (0,1Na+) та полі(dC) (0,05Na+) і розкладено їх на базисні функції (Сухоруков и др., 1983), які відповідають іонізації атомних груп з однаковим значенням pK.

Виявлено, що крива протонної буферної ємності полі(С) має чотири піки. Перший вузький пік (рК = 5,6 ) ототожнено з кооперативним процесом утворення подвійних спіралей, спричиненим протонуванням атома азоту N3 нуклеотидних основ. Інший вузький пік (рК = 2,9) віднесено до кооперативного розпаду цих спіралей. Перший широкий пік (рК = 5,3) відповідає некооперативному протонуванню подвійних спіралей полі(С) на атомах азоту N3 цитидинових основ, які частково експоновані в розчин. Інший широкий пік (рК = 3,1) віднесено до некооперативного протонування атома кисню електронейтральних основ із цис-орієнтацією приєднаного протона щодо глікозидного зв'язка. Ця реакція знижує термодинамичну стабільність подвійної спіралі полі(С), спричиняючи врешті-решт її дисоціацію.

Крива протонної буферної ємності полі(dC) задовільно описується суперпозицією трьох базисних функцій. За аналогією з полі(С), перші два піки – вузький і широкий – відносимо до кооперативного утворення упорядкованих спіралей і до некооперативного протонування атома N3 цитидинових залишків, які ще не утворили протонних пасток. Третій широкий пік – це процес протонування макромолекули з кооперативністю g < 1: аж до значення pH = 3,1 (ступінь протонування полі(dC) при цьому сягає ~75%) розпад упорядкованих спіралей не відбувається. Таку поведінку полі(dC) логічно пояснити утворенням при протонуванні енергетично вигіднішого типу упорядкування спіралей – так званого і-(intercalated) мотиву, дві підструктури котрого, які складаються із паралельно орієнтованих ланцюгів, що мають спарені основи, взаємно інтеркальовані одна в одну і зорієнтовані антипаралельно.

Проаналізовано (AM1, MNDO/H) можливі молекулярні механізми переходу полі(С) і полі(dC) із одноланцюгової у дволанцюгову напівпротоновану спіраль та і-мотив відповідно, спричиненого внутрішнім протонуванням (рис. 6).

Рис. 6. Механізм утворення напівпротонованих спіралей полі(С) і полі(dC) внутрішнім протонуванням – захоплення протона протонною пасткою

Запропоновано також молекулярний механізм розпаду упорядкованих спіралей полі(С) і полі(dC) на одноланцюгові при зовнішньому протонуванні (рис. 7).

Рис. 7. Механізм розпаду упорядкованих спіралей полі(С) і полі(dC) при зовнішньому протонуванні на одноланцюгові

Взаємозалежні внутрішньомолекулярні Н-зв'язки в 6azaCyd та одноланцюгових полі(А), полі(С) і полі(dC)

Вперше напівемпіричним квантово-хімічним методом MNDO/H, який добре зарекомендував себе для подібного кола об'єктів і задач (Говорун, Міщук, 1996), проведено конформаційний аналіз молекули 6azaCyd – модифікованого нуклеозиду з широким спектром біологічної активності (Алексеєва, Пальчиківська та ін., 1999) і визначено основні фізико-хімічні чинники, які відповідають за її конформаційну рівновагу. Зафіксовано чотири конформації: syn, anti, high anti та high syn (рис. 8). Встановлено, що вони стабілізуються просторовою сіткою-"павутиною" взаємозалежних внутрішньомолекулярних Н-зв'язків з енергією декілька ккал/моль кожний, які локалізовані в основі (N4H'…N3), цукровому залишку (O3'H…O2' і O5'H…O4') та між основою і цукровим залишком (O5'H…N6, C1'H…O2, C2'H…N6 та C2'H…O2) і взаємопосилюють один одного. За цими властивостями 6azaCyd суттєво відрізняється від канонічного нуклеозиду – Cyd. Внутрішньомолекулярні Н-зв'язки, стабілізуючи конформаційні стани, значною мірою визначають профіль потенціальної енергії syn-anti конформаційного переходу. Вперше зафіксовано ефект взаємоузгодженого перемикання Н-зв'язків, що локалізовані між основою та цукровим залишком, при syn-anti переході та суттєву структурну деформацію фуранози, що залежить від кута ч. Виявлено вперше аномерний ефект за участі аміногрупи: він проявляється у тому, що її орієнтація та пірамідальність істотно залежать від конформації нуклеозиду. Порівняння розрахованої геометричної структури 6azaCyd з тією, що спостерігаєтсья в кристалічному стані – high anti (Singh, Hodson, 1974), свідчить про значну деформацію молекули при переході в кристал, де реалізується конформація, що не є енергетично найвигіднішою для ізольованої молекули. Цей промовистий, на нашу думку, факт зайвий раз акцентує увагу на принципових обмеженнях рентгеноструктурного аналізу щодо конформаційно-рухливих біомолекул.

Рис. 8. Основні конформації 6azaCyd (Н-зв'язки подано пунктиром) за даними MNDO/H

В одноланцюгових полінуклеотидах полі(А), полі(С) і полі(dC), що мають біологічне значення (Зарудна, 1999), вперше виявлено (MNDO/H) поздовжні внутрішньомолекулярні Н-зв'язки за участі сусідніх аміногруп ...NH...NH...NH..., де кожна із них одночасно є донором і акцептором протона. Ці неканонічні Н-зв'язки взаємопосилюють один одного і мають енергію, що принаймні вдвічі перевищує kT = 0,6 ккал/моль при фізіологічній температурі. Вони почасти є відповідальними за підтримання спіральної конформації цих макромолекул.

Протонодонорні-протоноакцепторні властивості модифікованих нуклеотидних основ

Напівемпіричним квантово-хімічним методом AM1, який добре зарекомендував себе для подібного кола об'єктів і задач (Говорун та ін., 1999), вперше досліджено кислотно-лужні властивості низки модифікованих нуклеотидних основ, модифікація яких зводиться до метилювання атомів азоту і водню, взаємної зміни положення аміно- і карбонільної груп та до заміни груп СН на ендоциклічний атом азоту – всього 42 молекули. При такій модифікації основ відбувається настільки суттєва зміна їхньої електронної будови, що всі спроби якісного прогнозу змін кислотно-лужних властивостей порівняно з немодифікованими основами є неефективними і не можуть замінити прямих квантово-хімічних розрахунків.

Біологічний інтерес до цих об'єктів зумовлений тим, що серед них є мінори нуклеїнових кислот, метаболіти нуклеотидних основ, сполуки біологічної та терапевтичної дії тощо. Всі нуклеотидні основи з метильованими ендоциклічними атомами азоту є фіксованими високоенергетичними таутомерами канонічних аналогів. Ця обставина, на яку раніше в літературі уваги не звертали, може пролити світло на біологічну роль високоенергетичних таутомерів нуклеотидних основ.

На основі отриманих даних вперше побудовано ряди їхньої кислотності та лужності. Деякі характерні приклади кислотно-лужних властивостей основ наведено на рис. 9.

Рис. 9. Кислотно-лужні властивості деяких модифікованих нуклеотидних основ (за даними AM1). Стрілками вказано місця протонування і депротонування; поруч наведено відповідні енергії (ккал/моль)

З-поміж досліджених молекул "рекордсменом"-протофілом є цвітеріон mGua – енергія протонування його атома N1 сягає –252,5 ккал/моль. Загалом, спостерігається така закономірність: усі модифіковані нуклеотидні основи, за винятком азапохідних, є значно кращими акцепторами Н-зв'язку, ніж канонічні аналоги чи найпростіші моделі їхніх нуклеозидів.

Пуринові основи з двічі метильованим імідазольним кільцем – mXan, mHyp і mGua є сильними СН-кислотами з низькою енергією депротонування групи С8Н (323,9; 326,9 і 328,7 ккал/моль, відповідно). Екзоциклічна іміногрупа m1Ade, mAde, mAde і mCyt є прекрасним акцептором протона і дуже поганим його донором. Окрім того, на прикладі mGua показано, що протонодонорні та протоноакцепторні властивості основи залежать від її конформації. Це положення, на наш погляд, має загальнобіологічне значення.

Отримані числові дані щодо кислотно-лужних властивостей модифікованих основ дозволили встановити структуру найефективніших протонних пасток, утворених гомо- та гетероасоціатіми модифікованих основ, та їхню стабільність: mGua:mGua+(-28,1) ? m1Cyt:m1Cyt+(-27,6) > mHyp:mHyp+(-23,0) > mGua+:m1Cyt(-22,0) > mXan:mXan+(-14,5) (у дужках вказано енергію міжмолекулярної взаємодії у ккал/моль (AM1)) (рис. 10).

Рис. 10. Структура деяких протонних пасток, утворених гомо- та гетероасоціатами модифікованих нуклеотидних основ (у дужках вказано місце локалізації захопленого протона)

Висновки

1. Поєднуючи неемпіричну та напівемпіричну квантову хімію з УФ та 1Н ЯМР-спектроскопією вперше виявлено і охарактеризовано елементарні молекулярні механізми, здатні забезпечувати управління таутомерним статусом нуклеотидних основ, – протонування та специфічну взаємодію з карбоксилат-іоном.

Зроблено висновок про те, що вже на рівні точкових контактів білково-нуклеїнове впізнавання може відбуватися не лише за класичним конформаційним сценарієм структурно-динамічної відповідності, а й супроводжуватися зміною таутомерного статусу нуклеотидних основ, тобто зачіпати їхню хімічну структуру.

Висловлено і обгрунтовано припущення про те, що протонування основ ДНК, яке не заважає їхньому Вотсон-Криківському спарюванню, є поліфункціональним фізико-хімічним механізмом, який може реалізовуватися як на етапі збереження генетичної інформації, так і при реплікації ДНК.

2. Вперше отримано (AM1, MNDO/H) повне сімейство точкових контактів електронейтральної і депротонованої групи амінокислот із низкою канонічних і модифікованих нуклеотидних основ. Представлено їхню геометричну, електронну і енергетичну структуру.

Вперше показано, що електронейтральна карбоксильна група, на відміну від карбоксилат-іона, не провокує у вакуумі переходу основ у високоенергетичну таутомерну чи протоновану форму.

3. Методом протонної буферної ємності та напівемпіричної квантової хімії вперше встановлено природу структурних переходів полі(С) і полі(dC), спричинених протонуванням. Доведено, що протонування полінуклеотидів захопленням протонів із навколишнього середовища може відігравати як структуроформуючу, так і дестабілізуючу роль. Вперше зроблено припущення про те, що полі(dС), на відміну від полі(С), утворює при внутрішньому протонуванні енергетично вигідніший і-мотив.

4. Вперше встановлено (MNDO/H), що всі чотири конформації ізольованого 6azaCyd – syn, anti, high anti та high syn – стабілізуються просторовою сіткою-"павутиною" взаємозалежних внутрішньомолекулярних Н-зв'язків з енергією декілька ккал/моль кожний, які локалізовані в основі (N4H'…N3), цукровому залишку (O3'H…O2' і O5'H…O4') та між основою і цукровим залишком (O5'H…N6, C1'H…O2, C2'H…N6 та C2'H…O2) і взаємопосилюють один одного. Цей результат допускає узагальнення на ширше коло нуклеозидів.

5. В одноланцюгових полінуклеотидах полі(А), полі(С) і полі(dC) виявлено поздовжні внутрішньомолекулярні Н-зв'язки за участі сусідніх аміногруп …NH…NH…NH…, де кожна із них є одночасно донором і акцептором протона, які посилюють один одного і мають енергію 1 ккал/моль.

Перелік НАУКОВИХ ПРАЦь, ОПУБЛІКОВАНИХ за темою дисертації

1. Samijlenko S.P., Bogdan T.V., Trygubenko S.A., Potyahaylo A.L., Hovorun D.M. Deprotonated carboxylic group of amino acids transforms adenine into its rare prototropic tautomers // Український біохімічний журнал. – 2000. – Т. 72, № 6. – C.92-95.

2. Mishchuk Ya.R., Potyagaylo A.L., Hovorun D.M. Structure and dynamics of 6-azacytidine by MNDO/H quantum-chemical method // Journal of Molecular Structure. – 2000. – Vol. 552, № 1-3. – P.283-289.

3. Степанюгін А.В., Коломієць І.М., Потягайло А.Л., Самійленко С.П. Вплив метилювання та взаємодії з карбоксильною групою амінокислот на УФ спектри пуринових основ та нуклеозидів у диметилсульфоксиді. 2. Гуанін // Биополимеры и клетка. – 2000. – Т. 16, № 5. – C.384-402.

4. Зарудная М.И., Потягайло А.Л., Говорун Д.Н. Конформационные переходы поли(С) и поли (dC): исследование методом протонной буферной емкости // Биополимеры и клетка. – 2000. – Т. 16, № 6. – C.495-504.

5. Самійленко С.П., Потягайло А.Л., Степанюгін А.В., Богдан Т.В., Дзержинський М.Е., Говорун Д.М. Квантовохімічні розрахунки специфічної взаємодії ізогуаніну з нейтральною та депротонованою карбоксильною групою амінокислот // Український біохімічний журнал. – 2001. – Т. 73, № 3. – C.147-151.

6. Samijlenko S.P., Kondratyuk I.V., Potyahaylo A.L., Stepanyugin A.V., Hovorun D.M. Specific interactions of deprotonated carboxylic group with uracil and thymine provoke diketo > keto-enol tautomeric transition in bases // Український біохімічний журнал. – 2001. – Т. 73, № 4. – C.128-131.

7. Samijlenko S.P., Potyahaylo A.L., Stepanyugin A.V., Kolomiets I.M., Hovorun D.M. Recognition modes of hypoxanthine, xanthine and their derivatives by amino acid carboxyl group: UV spectroscopic and quantum chemical data // Український біохімічний журнал. – 2001. – Т. 73, № 6. – C.61-72.

8. Потягайло А.Л., Говорун Д.М. Регуляція прототропної таутомерії основ ДНК протонуванням: результати квантово-хімічного дослідження // Біополімери і клітина. – 2002. – Т. 18, № 2. – C.174-176.

9. Zarudnaya M.I., Samijlenko S.P., Potyahaylo A.L., Hovorun D.M. Structural transitions in polycytidilic acid: proton buffer capacity data // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. – 2002. – Vol. 21, № 2. – P.125-137.

10. Самійленко С.П., Степанюгін А.В., Кречківська О.М., Потягайло А.Л., Говорун Д.М. Специфічна взаємодія ксантину з депротонованою карбоксильною групою спричиняє його хімічне перетворення у високоенергетичний прототропний таутомер N9H // Доповіді Національної академії наук України. – 2002. – № 4. – C.187-191.

11. Міщук Я.Р., Самійленко С.П., Алексеєва І.В., Пальчиківська Л.І., Потягайло А.Л., Шаламай А.С., Говорун Д.М. Структура 6-aza-Сyd: визначальна роль внутрішньо-молекулярних водневих зв'язків. // Тези доповідей ІІ з'їзду Українського біофізичного товариства. – Харків (Україна). – 1998. – C.53.

12. Самійленко С.П., Міщук Я.Р., Кондратюк І.В., Потягайло А.Л., Степанюгін А.В., Говорун Д.М. Внутрішньомолекулярні водневі зв'язки в цитозинових нуклеозидах: результати ПМР дослідження та квантовохімічних розрахунків // Тези доповідей ІІ з'їзду Українського біофізичного товариства. – Харків (Україна). – 1998. – C.56.

13. Mishchuk Ya.R., Potyahajlo A.L. Intramolecular H-bonds in pyrimidine nucleosides // Conference on Physics of Biological Systems, Book of abstracts. – Poushcha-Vodytsa (Ukraine). – 1998. – P.93.

14. Говорун Д.Н., Мищук Я.Р., Кондратюк И.В., Потягайло А.Л. “Необычные” физико-химические свойства нуклеотидных оснований и их возможное биологическое значение // Тезисы докладов II съезда биофизиков России. – Москва (Россия). – 1999. – Т. I. – C.107-108.

15. Hovorun D.M., Potyahaylo A.L., Zarudna M.I. The …N6H…N6H… vertical hydrogen bonds contribute to the helical structure of single-stranded poly(A) // Proceedings of the XIV International School-Seminar "Spectroscopy of molecules and crystals". – Odessa (Ukraine). – 1999. – P.146.

16. Zarudnaya M.I., Potyahaylo A.L., Hovorun D.M. Mechanism of the polycytidylic acid protonation // XIV International Roundtable "Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications". – San-Francisco (USA). – 2000. – P.136.

17. Potyahaylo A.L., Stepanyugin A.V., Samijlenko S.P., Hovorun D.M. Specific interaction of isoguanine with neutral and deprotonated amino acid carboxylic group: results of model quantum chemical calculations // First Russian-Ukrainian-Polish Conference on Molecules Interactions, School of Physical Organic Chemistry, Book of abstracts. – Gdansk (Poland). – 2001. – P.202-203.

18. Samijlenko S.P., Stepanyugin A.V., Potyahaylo A.L., Kharchenko V.M., Trygubenko S.A., Bohdan T.V., Hovorun D.M. Stimulation of tautomeric transition in nucleotide bases by interaction with deprotonated carboxylic group: spectroscopic and quantum chemical evidences // Proceedings of the XV International School-Seminar "Spectroscopy of molecules and crystals". – Chernihiv (Ukraine). – 2001. – P.42.

АНОТАЦІЯ

Потягайло А. Л. Протонна рухливість у модельних білково-нуклеїнових і нуклеїново-нуклеїнових комплексах та її можливе біологічне значення. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.03 – молекулярна біологія. – Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2002.

Роботу присвячено теоретичному і експериментальному вивченню фізико-хімічних властивостей модельних білково-нуклеїнових і нуклеїново-нуклеїнових комплексів, пов'язаних з протонною рухливістю, та аналізу їх можливої біологічної значущості. Висвітлено елементарні молекулярні механізми управління таутомерним статусом нуклеотидних основ через протонування та специфічну взаємодію з карбоксилат-іоном. Отримано повне сімейство точкових контактів електронейтральної і депротонованої карбоксильної групи амінокислот з низкою канонічних і модифікованих нуклеотидних основ. Показано, що електронейтральна карбоксильна група, на відміну від карбоксилат-іону, не провокує у вакуумі перехід основ у рідкісну таутомерну чи протоновану форму. Встановлено природу структурних переходів полі(С) і полі(dС), спричинених протонуванням. Зафіксовано неканонічні внутрішньомолекулярні Н-зв'язки у 6azaCyd та в одноланцюгових полі(А), полі(С) і полі(dС). Досліджено кислотно-лужні властивості низки модифікованих нуклеотидних основ.

Усі перераховані закономірності та їхня біологічна інтерпретація отримані вперше.

Ключові слова: протонна рухливість, протонування та депротонування, білково-нуклеїнове та нуклеїново-нуклеїнове впізнавання, прототропна таутомерія нуклеотидних основ, молекулярне управління, квантова хімія, УФ та 1Н ЯМР-спектроскопія.

АННОТАЦИЯ

Потягайло А. Л. Протонная подвижность в модельных белково-нуклеиновых и нуклеиново-нуклеиновых комплексах и ее возможное биологическое значение. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 – молекулярная биология. – Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2002.

Работа посвящена теоретическому и экспериментальному изучению физико-химических свойств модельных белково-нуклеиновых и нуклеиново-нуклеиновых комплексов, связанных с протонной подвижностью, а также анализу их возможного биологического значения. Описаны элементарные молекулярные механизмы управления таутомерным статусом нуклеотидных оснований путем протонирования и специфического взаимодействия с карбоксилат-ионом. Получено полное семейство точечных контактов электронейтральной и депротонированной карбоксильной группы аминокислот с рядом канонических и модифицированных оснований. Показано, что электронейтральная карбоксильная группа, в отличие от карбоксилат-иона, не провоцирует в вакууме переход оснований в редкую таутомерную или протонированную форму. Установлена природа структурных переходов поли(С) и поли(dС), вызванных протонированием. Зафиксированы неканонические внутримолекулярные водородные связи в 6azaCyd и в одноцепочечных поли(А), поли(С) и поли(dС). Исследованы кислотно-щелочные свойства ряда модифицированных нуклеотидных оснований.

Все перечисленные закономерности и их биологическая интерпретация получены впервые.

Ключевые слова: протонная подвижность, протонирование и депротонирование, белково-нуклеиновое и нуклеиново-нуклеиновое узнавание, прототропная таутомерия нуклеотидных оснований, молекулярное управление, квантовая химия, УФ и 1Н ЯМР-спектроскопия.

SUMMARY

Potyahaylo A. L. Proton mobility in model protein - nucleic acid and nucleic acid - nucleic acid complexes and its possible biological significance. – Manuscript.

Thesis for a candidate's scientific degree of biological sciences by speciality 03.00.03 – molecular biology. – Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

Using the combination of non-empirical and semi-empirical quantum chemistry with UV and 1H NMR spectroscopy, we were the first to determine elementary molecular mechanisms for controlling of tautomeric status of nucleotide bases, i.e. protonation and specific interaction with carboxylate-ion.

It was first determined that a single protonation of DNA bases, which does not interfere Watson-Crick base pairing, substantially shifts their prototropic tautomeric equilibrium to either sides depending on the site of protonation. The protonation of N3 Ade, O6 or N7 Gua, O2 Cyt and O4 Thy stabilizes the canonical tautomeric form of base, while the high energy non-canonical tautomers (imino Ade, enolic Gua and enolic Thy) are stabilized by the protonation of N7 Ade, N3 Gua and O2 Thy.

It was also shown that a single protonation of Watson-Crick pairs of DNA bases at sites which are not involved in H-bonding increases their stability, a maximal effect are being observed under the protonation of O2 or O4 Thy in Ade:Thy base pair.

It was assumed that the protonation of DNA bases, which does not interfere Watson-Crick base pairing, is multifunctional physico-chemical mechanism which can be used both at the stage of genetic information storage and DNA replication.

By means of UV and 1H NMR spectroscopy in anhydrous DMSO and quantum chemical calculations (ab initio, MNDO/H) in vacuum, it was first found that specific interaction of deprotonated carboxylic group with such nucleotide bases