УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
НІКІТСЬКИЙ БОТАНІЧНИЙ САД - НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

ПАВЛОВА

Ірина Олександрівна

УДК [(634.8.:631.527):581,145,22]:57.085.23 (043.3)

ОСОБЛИВОСТІ КУЛЬТИВУВАННЯ

СТЕНОСПЕРМОКАРПІЧНОГО НАСІННЯ ВИНОГРАДУ

В СЕЛЕКЦІЇ НА БЕЗНАСІННІСТЬ

03.00.20 _біотехнологія

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Ялта - 2002 

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в інституті винограду і вина “Магарач” УААН (м. Ялта).

Науковий керівник: | кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Кірєєва Людмила Костянтинівна

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Бугаєнк Бугаєнко Людмила Олександрівна

Інститут ефіроолійних та лікарських рослин УААН
завідувач відділу біотехнології і генетики, заст. директора з наукової роботи

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Ігнатова Світлана Олександрівна

Південний біотехнологічний центр у рослинництві УААН та Міністерства освіти і науки, завідувач лабораторії культури тканин

Провідна установа: | Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ.

Захист дисертації відбудеться "10" квітня 2002 р. о 1030 годині на засіданні вченої ради Д 53.369.01 в Нікітському ботанічному саду - Національному науковому центрі УААН за адресою: 98648, Україна, Автономна республіка Крим, м. Ялта, НБС - ННЦ.

Факс: (0654) 33-53-86

E-maіl: nbs1812@ukr.net

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру (НБС-ННЦ) за адресою: 98648, Україна, Автономна республіка Крим, м.Ялта, НБС - ННЦ.

Автореферат дисертації розіслано "27" лютого 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради,

кандидат біологічних наук Садогурський С.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми досліджень. Виноград є однією з найстародавніших рослин, що використовуються людиною (7-9 тис. років). Налічується понад 5 тисяч сортів винограду, проте серед сортового різноманіття безнасінні сорти представлені незначно.

Багато безнасінних сортів винограду є стеноспермокарпічними, тобто процеси запилення та запліднення у них відбуваються, але внаслідок дегенерації ендосперму зародок зупиняється в розвитку і насіння абортує (Stout, 1936; Ковалева, Смирнова, Миляева, 1997). Своєчасне створення штучних умов культивування, що забезпечують ріст і розвиток зародка, сприяє одержанню життєздатного потомства.

На протязі ряду років для створення принципово нового генофонду винограду, одержання безвірусного матеріалу, експрес-діагностики застосовують біотехнологічні методи (Голодрига, Киреева, Новикова, 1979; Голодрига, Зленко, Киреева, Бутенко, Левенко, 1981; Литвак, Кузьменко, 1982; Марченко, 1990;  Трошин, Зленко, Рыфф, 1991; Зленко, 1992; Пивень, Кускова (Бєлокурова), Юзефович, Рубежняк, 1992; Дорошенко, 1999; Берникова, 2000; Нилов, Рыфф, Трошин, Березовская, 1996; Милкус, 2000). Клітинні технології, що базуються на культивуванні іn vіtro органів, тканин, клітин та ізольованих протопластів, полегшують і прискорюють традиційний селекційний процес (Глеба, Сытник, 1984; Бутенко, 1986; Бугаенко, Бугара, 1998; Левенко, 1998). Особливо це актуально для селекції винограду на безнасінність, де традиційні методи обмежено з ряду причин: безнасінні сорти можуть використовуватися у схрещуванні лише як запилювачі, частота зустрічності безнасінного потомства при гібридизації насінного сорту з безнасінним низька, а генетичні фактори та фактори навколишнього середовища, що впливають на безнасінність, вивчені недостатньо (Caіn et all, 1983; Bouquet, Danglot, 1996).

Використання методів іn vіtro для подолання постзиготичної абортивності поширює можливості селекції на безнасінність, дає змогу залучити до селекційного процесу стеноспермокарпічні сорти та гібриди як материнські форми. Однак багато дослідників вказують на невизначеність основних параметрів культивування та надзвичайно низький процент одержання рослин за допомогою застосованої технології культивування стеноспермокарпічного насіння винограду (Spіegel-Roy, 1985;1990;іbaudo et all,1993). Необхідність в пошуках шляхів оптимізації даної технолог є очевидною.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу повязано з тематичним планом науково-дослідних ІВіВ "Магарач": "Розробити теоретичні основи створення принципово нового генофонду винограду з використанням біотехнологічних методів. Розробити концепцію гормонального контролю та керування морфогенезом в культурі тканини винограду" (№ ГР UA1003468), "Дослідити генетичні основи мінливості агробіологічних ознак винограду в гібридному потомстві " (№ ГР 0196U010351), а також згідно з планом аспірантської підготовки.

Мета досліджень: розробити шляхи та способи створення нових форм винограду в умовах іn vіtro у звязку із селекцією винограду на безнасінність.

Завдання досліджень: 

1. Провести інцухтування безнасінних сортів і схрещення за схемою: безнасінний безнасінний, безнасінний насінний для одержання стеноспермокарпічного насіння винограду.

2. Розробити спосіб одержання рослин із стеноспермокарпічного насіння винограду із застосуванням методів іn vіtro.

. Визначити оптимальні параметри культивування (строк введення в умови іn vіtro і склад живильних середовищ) стеноспермокарпічного насіння іn vіtro.

4. Дослідити особливості проростання стеноспермокарпічного насіння і розвитку рослин в умовах іn vіtro.

5. Дослідити морфологічні ознаки ювенільних рослин в умовах іn vіtro. Провести аналіз зустрічності рідкісних морф.

6. Розмножити іn vіtro і адаптувати до умов іn vіvo гібридні форми, отримані із стеноспермокарпічного насіння.

7. Дослідити нові форми винограду за ампелографічними та агробіологічними ознаками.

Обєкт досліджень. Постзиготична абортивність в потомстві стеноспермокарпічних сортів і гібридів винограду та технологія її подолання.

Предмет досліджень. Методи культивування стеноспермокарпічного насіння, росту і розвитку рослин винограду.

Методи досліджень. В процесі досліджень дотримувалися як прийнятих в біотехнології методів (Бутенко, 1964, 1999;  Здруйковская-Рихтер, 1974; Калинин и др., 1980), так і методів, розроблених у відділі селекції ІВіВ ”Магарач” (“Методические рекомендации по клональному микроразмножению”, Ялта, 1986; патент України № 17919А).

Haукова новизна. Вперше розроблено спосіб одержання рослин із стеноспермокарпічного насіння винограду в умовах іn vіtro (патент № 17919А). Вперше виявлено особливості культивування стеноспермокарпічного насіння винограду іn vіtro, зареєстровано два піки проростання. Встановлено, що взаємодія БАП та генотипу конкретного гібриду впливає на шлях розвитку рослин експериментальних популяцій винограду. Вперше зясовано, що експериментальні популяції винограду відрізняються за різноманітністю рідкісних морф. Вперше встановлено, що на експресію поліембріонії у потомстві в умовах іn vіtro впливає генотип сорту Ялтинський безнасінний. Вперше за допомогою розробленого способу культивування стеноспермокарпічного насіння іn vіtro створено безнасінні гібридні форми винограду.

Практична цінність роботи. Розроблено новий спосіб культивування стеноспермокарпічного насіння, який прискорює селекційний процес, що дає змогу на протязі року одержати селекційні форми, їх розмножити, адаптувати до умов іn vіvo та виростити повноцінні рослини; поширює можливості селекції на безнасінність шляхом залучення до селекційного процесу стеноспермокарпічних сортів як батьківських так і материнських форм у схрещуваннях; сприяє інтенсифікації процесів проростання стеноспермокарпічного насіння, розвитку проростків і формуванню рослин; дає змогу поповнити гібридний фонд новими формами, одержанні із стеноспермокарпічного насіння винограду. Одержані гібридні форми передано на польові випробування в умови ПБК (акти впровадження додаються).

Особистий внесок дисертанта полягає у самостійному зборі матеріалу, постановці експериментів та обробці одержаних даних, критичному аналізі літератури і підготовці наукових статей, оформленні дисертаційної роботи. є співавтором патенту України № 17919А “Спосіб вирощування рослин з важкопророщуваного насіння”.

Апробація роботи. Основні положення дисертації доповідалися на конференціях молодих вчених (Ялта 1992; 1998; 2000; Одеса, 1991, Сімферополь, 2001); міжнародних конференціях з біотехнології (VІІ Міжнародній конференції ”Іn vіtro Plant Cell Bіology, Bіotechnology and Germplasm Preservatіon”, Москва, 1997; ”ІІ Іnternatіonal Symposіum on Plant Bіotecnology”, Kyіv, 1998); на ІІ міжнародній науково-практичній конференції “Якість, безпека і екологія харчових продуктів та виробництв. Прогрес в агроіндустрії”, Ялта, 2001.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць, із них 2 статті опубліковано у виданнях, затверджених ВАК України як спеціалізовані за біологічним напрямком. Оформлено 1 патент.

Структура та обсяг роботи. Дисертацію викладено на 136 сторінках машинописного тексту, основний текст викладено на 107 сторінках, складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, практичних рекомендацій, висновків, списку літератури та додатку, містить 33 таблиці та 16 рисунків. Список літератури включає 169 джерел, в тому числі 79 іноземних.

ЗМІСТ РОБОТИ

Біологія безнасінності та шляхи подолання

постзиготичної абортивності у винограду

(огляд літератури)

Аналіз вітчизняних та зарубіжних публікацій, присвячений природі безнасінності у винограду, сучасним методам селекції на безнасінність, застосуванню методів іn vіtro в селекції винограду.

МАТЕРІАЛИ та методи дослідження

Робота проводилася у відділі селекції ІВіВ ”Магарач”, на дослідних ділянках та ампелографічній колекції ДВБ “Магарач”.

Матеріалом досліджень було стеноспермокарпічне насіння винограду, одержане внаслідок самозапилення та вільного запилення стеноспермокарпічних сортів, гібридів від схрещувань за схемою безнасінний безнасінний, безнасінний насінний. Дотримувалися умови, щоб одна з батьківських форм мала стійкість до патогенів. Насіння виймалося з ягід в різні строки після запилення (25, 45, 60, 75 діб) та в період фізіологічної стиглості ягоди.

Культивування стеноспермокарпічного насіння проводилося на модифікованому середовищі NN (1969) з доданням гормонів: ауксини- _нафтилоцтова кислота (НОК), -індоліл-3-масляна кислота (ІМК); цитокиніни кінетин (КІН), бензиламінопурін (БАП); гібереліни гіберелінова кислота (ГА3).

Культивування здійснювали в бюксах або колбах об'ємом 50 мл, що містили по 20-30 мл живильного середовища. В кожному бюксі або колбі культивували по 4-7 насінин.

В умовах ламінарного боксу після стерилізації і механічних маніпуляцій (відтинання халазної частини насінини) експланти вводили в культуру. Культивування проводили в темряві при t +20-25oC.

Для подальшого росту та розвитку проростків в стерильних умовах їх пересаджували у 150 мл скляночки на середовище Нпатент № 17919) без гормонів, або середовище, що містить БАП у концентрації 0,5 мг/л.

Культивування проростків, рослин здійснювалось на світлі при 16-годинному фотоперіоді інтенсивністю 1500 лк і температурі +27оC.

Клональне мікророзмноження здійснювалося за методичними рекомендаціями ВНДіВіВ "Магарач" (Ялта, 1986).

Регресійний аналіз проводився за програмою Комфорт + Регресія, версія 3,2, розробленою Адібековим (1992).

Аналіз рідкісних подій проводили на основі "Методических рекомендаций по количественной генетике винограда" (Клименко, 1998).

Ампелографічний опис одержаної безнасінної форми проводили на основі методики оцінки охороноздатності сортів (1992). Агробіологічну оцінку одержаної безнасінної форми проведено за методикою Лазаревського (1963).

Розробка способу оДЕРЖання рослин
із стеноспермокарпічного насіння винограду

На основі досліджень з пророщування стеноспермокарпічного насіння винограду різного походження в умовах іn vіtro розроблено спосіб одержання життєздатного потомства у стеноспермокарпічних сортів та гібридів винограду. Основною його перевагою, порівняно з прийнятою технологією культивування стеноспермокарпічного насіння (Rammіng et all, 1990; Aguero, et all; Bouquet, Danglot, 1996; Берникова, 2000), є виключення операції вилучення зародка під бінокулярною лупою. В основу нового способу покладено культивування зародків з фрагментом оболонки насінини, отриманих шляхом відтинання халазної частини. Фрагмент оболонки насінини з прилеглими до зародка тканинами захищає зародок від різкого впливу живильного середовища, що сприяє поступовій його адаптації і моделює природний шлях живлення.

Культивування стеноспермокарпічного насіння в умовах іn vіtro проводили поетапно. Технологічну схему процесу одержання рослин із стеноспермокарпічного насіння винограду представлено на рис.1. Так, насіння після відтинання халазної частини вводили в культуру на модифіковане середовище NN з визначеним складом гормонів, де відбувався дорозвиток зародка, протікали процеси проростання і спостерігалась поява проростків. Для подальшого росту і розвитку проростки культивували на середовищі Нпатент №17919А) до моменту досягнення рослинами 5-6 міжвузлів. Далі рослини з метою розмноження живцювали на 2_вічкові експланти і культивували до формування рослин.

Фрагмент
насінини
з зародком |

Розвиток зародків |

Проростки |

Одержання
рослин

Адаптація
у теплиці | Вегетативне потомство | Клональне мікро-розмноження | Генеративне потомство

Рис.1. Схема процесу одержання рослин із стеноспермокарпічного
насіння.

Клональне мікророзмноження в даному випадку переслідує дві мети:

1. Зберегти одержані рослини, оскільки адаптація з умов іn vіtro в умови іn vіvo призводить до високого процента втрати матеріалу.

2. Розмножити новий генотип в умовах іn vіtro, і тим самим внаслідок адаптації одержати не одну рослину, а вегетативне потомство нової форми. Відомо, що вегетативне потомство у винограду раніше вступає в стадію плодоношення порівняно із генеративним потомством.

Вегетативне потомство селекційних форм адаптували до умов іn vіvo в гідропонній теплиці.

Дана технологія, розроблена у співавторстві, дає змогу одержувати в умовах іn vіtro не лише генеративне потомство стеноспермокарпічних форм, але й розмножити і адаптувати до умов іn vіvo його вегетативне потомство.

Весь процес від початку культивування стеноспермокарпічного насіння до одержання вегетативного потомства нового генотипу триває в середньому 11-12 місяців, тобто на протязі одного року є можливість не лише одержувати із стеноспермокарпічного насіння рослини, але й розмножити їх, що неможливо при традиційному пророщуванні повноцінного насіння винограду в умовах іn vіvo.

Створення нових селекційних форм винограду
з використанням культури стеноспермокарпічного насіння

Використання безнасінного гібрида № 38-ІX як вихідної форми. Аналіз експериментальних даних з пророщування стеноспермокарпічного насіння, одержаного внаслідок інцухтування стеноспермокарпічних сортів винограду (Аскері, Кішмиш молдавський, Кішмиш Хішрау) та гібридизації сортів і гібридів за схемою безнасінний безнасінний (№ 38-ІX Ромулус, № 311  Бєлградський безнасінний, Ромулус № 38-ІX, Кішмиш Ваткана № 342, Кішмиш Ваткана № 311, Кішмиш молдавський № 11__, Кішмиш Хішрау № 11__); безнасінний насінний (№ 334  44-ІІ58-92, № 38-ІX Страшенський, № 38-ІX Кантемирівський, Кішмиш молдавський Страшенський, Перлетт Зірковий, Кішмиш Хішрау Ювілей Молдови) показав, що ранні строки виймання насіння (25, 45 діб після запилення) не дають позитивного результату. Проростання насіння спостерігали при вийманні на 60, 75-у добу після запилення та в період фізіологічної стиглості ягоди. Виявлено необхідність застосування гормонів для стимуляції процесів розвитку зародка та проростання.

В результаті досліджень виділено та рекомендовано гібрид № 38-ІX для використування в подальшій селекції як материнську форму із застосуванням іn vіtro. Для даного гібрида визначено основні параметри культивування, що дали змогу при різних схрещуваннях даної форми одержувати високий процент виповненого стеноспермокарпічного насіння, проростків та розвинутих рослин. Тому цілеспрямовано провели схрещення гібрида № 38-ІX з трьома різними запилювачами. Насіння виймали на 70-у добу після запилення із нестиглих ягід, які тільки почали розм'якшуватися. Незважаючи на те, що стеноспермокарпічні насінини мали мякі зелені покриви, більша частина їх була виповнена (67% від загальної кількості насіння) (табл.1).

Таблиця  

Проростання стеноспермокарпічного насіння та розвиток рослин
в популяціях з гібридною формою № 38-ІX 

Комбінація

схрещування |

Кількість насіння,

шт. | Кількість

виповненого насіння,

шт. | %

виповненого насіння | Кількість

проростків,

шт. | %

проростків |

Кількість

рослин,

шт. | %

рослин

від насіння | % рослин від проростків

№38-ІX
№ 313 | 205 | 160 | 78 | 100 | 63 | 52 | 33 | 52

№38-ІX Ялтинський безнасінний | 76 | 59 | 84 | 24 | 41 | 11 | 18 | 46

№38-ІX CB 12375 | 112 | 45 | 58 | 22 | 49 | 11 | 28 | 50

Всього: | 393 | 264 | 67 | 146 | 51 | 74 | 29 | 50

В результаті експерименту одержано 146 проростків, що становить 51% від виповненого насіння. Частина проростків розвинулась у рослини. Процент розвитку рослин по популяціях незначно варіював і по всьому масиву становив 50% від загальної кількості проростків. Процент розвитку рослин по відношенню до культивованого насіння досягав 33№ 38-ІX № 313), що значно вище результатів, одержаних іншими авторами: 5,5-6,2% (Gray, 1988); 5,8-8,1% (Bouquet, Davіs, 1989); 25,6%іegel-Roy,1985).

Спостерігалася специфічність проростання стеноспермокарпічного насіння по популяціях залежно від середовища культивування (табл.2).

Для всіх вивчених популяцій середовище, що містило БАП 0,5 мг/л, було ефективним для проростання стеноспермокарпічного насіння і рекомендовано для подальших досліджень як найбільш універсальне.

Таблиця  

Проростання стеноспермокарпічного насіння залежно
від гормонального складу середовища

Комбінація | % проростків по середовищах

схрещування | БАП 0,5 | НОК 0,5

ГА3 2 | ГА3 2 | НОК 0,2

БАП 0,5 | ГА3 2

БАП 0,5 | КІН 5 | КІН 5

ІМК 5

№ 38-ІX № 313 | 26 | 5 | 16 | 9 | 19 | 4 | 19

№ 38-ІX Ялтинський безнасінний | 37 | 13 | 0 | 4 | 29 | 17 | 0

№ 38ІX CB 12375 | 23 | 37 | 9 | 9 | 18 | 4 | 0

Проростання стеноспермокарпічного насіння в умовах культури іn vіtro - довгочасний процес і спостерігається в досить тривалому часовому інтервалі (230 діб від початку культивування до появи останнього проростка в популяції № 38-ІX № 313) (рис.2). По всіх популяціях період проростання мав хвилястий характер. При цьому явно виражені два піки проростання. Перший пік проростання спостерігався в інтервалі між 10-40 добою після посадки, другий пік - в інтервалі між 130-160 добою. В популяції № 38-ІX № 313 чітко виражені два піки проростання. В популяції № 38-ІX СВ 12375 найбільш виражений перший пік проростання, а в популяції № 38-ІX Ялтинський безнасінний явно простежується другий пік проростання (рис.3, 4). Перший пік проростання показує, що в даному випадку зиготичні зародки не проявляють ознак спокою, що узгоджується з дослідженнями Bouquet (1989).

Ростягнутість періоду проростання у часі і нерівномірність розподілу проростків залежно від днів культивування пояснюється впливом гормонального складу середовища, що підтвердив регресійний аналіз (табл. 3).

Рослини відрізнялись за темпами росту і розвитку. Виявлено, що здатність рослини виживати до певного моменту життєвого циклу (життєздатність) специфічна для кожної досліджуваної рослини. У зв'язку з цим рослини згрупували за класами летальності: І_ІІ клас життєздатні рослини; ІІІ-ІV клас - нежиттєздатні рослини, загибель яких спостерігалася на різних стадіях формування.

Для вивчення впливу складу живильного середовища на показники росту і розвитку рослинних об'єктів (період проростання, життєздатність, довжина гіпокотиля, клас летальності) створено ряд регресійних моделей.

Таблиця 3

Параметри моделі впливу факторів живильного середовища на ріст
та розвиток рослинних об'єктів

Фактори, що | Коефіцієнти регресії

включені
в модель | період
проростання | життє-здатність | розмір
гіпокотиля | клас
летальності

КІН | +10,180_ | ,313_ | ,772 | 0,085

НОК_ | ,300 | +88,610

ГА | +13,660_ | ,043

БАП | +101,500_ | ,060_ | ,031

коефіцієнт детермінації | 0,177 | 0,068 | 0 | 0,008

стандартна помилка
оцінки | 51,360 | 42,030 | 8,010 | 1,363

рівень значення | 2,6e-6 | 0,005 | 0,547 | 0,138

Результати аналізу даних з вибірки всього масиву показують, що рівень значущості моделі є високим лише для періоду проростання і життєздатності. Коефіцієнт детермінації, як міра прогнозу, вказує на те, що доля варіації, зумовлена впливом гормонів, є незначною. Тільки доля варіації по періоду проростання досягає 18% (коефіцієнт детермінації 0,177).

Особливості розвитку рослин, одержаних
із стеноспермокарпічного насіння винограду
в умовах іn vіtro

Далеко не всі проростки розвинулись у рослини. Загибель рослин на ранній стадії розвитку пов'язана, можливо, із недостачею живлення або морфофізіологічними порушеннями. Безгормональне середовище виявилося недостатнім для розвитку більшості проростків у рослини. Для стимулювання пагоно-утворення в аномальних проростків, тобто тих, які мають різні морфологічні порушення осьових органів, потребувалося застосування регуляторів росту. БАП в концентрації 0,5 мг/л стимулював розвиток аномальних проростків. Спостерігалася специфічність впливу цього гормона. На схемі представлено шляхи регенерації рослин (рис.5). |

ПРОРОСТОК

середовище

з цитокиніном

одиничний

пагін | проліферація аксилярних

бруньок

численність

пагонів | утворення

адвентивних

бруньок

гемогенез |

соматичний

ембріоідогенез

Рис. 5. Шляхи формування рослин експериментальних популяцій
винограду. 

В одних випадках розвивався один пагін і відбувалося формування рослини. В окремих випадках відбувалась проліферація аксилярних бруньок, що знаходяться в пазухах сімядольних листків, або утворення адвентивних бруньок на сімядольних листках та гіпокотилі (гемогенез). Це приводило до утворення численних пагонів, подібно регенерації соматичних зародків (Vіlaplana, Mullіns, 1989). Іноді відбувалося переродження всього проростка або його окремих органів в калюс. Після серії пересадок на протязі року культивування нам вдалось одержати кластери вторинних ембріоїдів (групи ембріоїдів, що зрослися). Подальший їхній розвиток відбувався кількома способами. Мав місце безпосередній розвиток пагона і кореня, тобто формування рослини. Частіше спостерігався розвиток пагонів із тканин гіпокотиля і сімядольних листків. Проте схему повністю представлено лише в популяції № 38-ІX Ялтинський безнасінний, в якій відзначено велику кількість аномальних проростків. В інших популяціях спостерігався в основному розвиток рослин. В комбінації № 38-ІX № 311 в окремих проростків відбувалась проліферація аксилярних бруньок в пазухах сімядольних листків, а в комбінації № 38-ІX СВ23375 в одному випадку спостерігалося утворення адвентивних бруньок на жилках сімядольних листків. Ймовірніше, що на розвиток проростка чинить вплив взаємодія БАП і генотипу конкретного гібрида.

Вивчення морфології ювенільних рослин
та розподіл рідкісних морф в популяціях

Ювенільні рослини, одержані в ході експерименту, мали різні морфологічні особливості. Спостерігалися відмінності за формою, розмірами, забарвленням гіпокотиля та сімядольних листків.

Проводили аналіз цього поліморфізму. Для дослідження використано дані з частоти морф трьох ознак: ознака “кількість сім’ядольних листків” - морфи cotyledon 0 (відсутність сім’ядольних листків), cotyledon 1, cotyledon 3, cotyledon 4 (один, три або чотири листки відповідно), vague (кількість листків визначити важко); “зрощення сім’ядольних листків”: морфи double petіole (зрощення черешками листків), double plate (одностороннє зрощення пластинками листків); “пігментація першого справжнього листка”: морфи lіght flag (візуально відрізнений недолік у вмісті хлорофілу порівняно з нормальними листками), rіch flag (наявність антоцианів).

Отримані результати показують, що рослини експериментальних популяцій № 38-ІX 313 та № 38-ІX СВ 12375 розподілені за морфами досить рівномірно. Рослини популяції № 38-ІX Ялтинський безнасінний розподілені за морфами всіх спостережуваних ознак нерівномірно.

Пристосовуваність подій зводиться до порівняння числа морф у різних популяціях і відображає участь вихідних форм у появі цих подій. Ступінь участі комбінації схрещування № 38-ІX № 313 найбільш високий у появі морфи cotyledon 0, комбінації схрещування № 38-ІX СВ 12375 - у появі морфи double petіole, комбінації схрещування № 38-ІX № Ялтинський безнасінний - у появі більшості спостережуваних морф.

Показник різноманітності свідчить про надмірну невирівняність популяцій № 38-ІX № 313 і № 38-ІX СВ 12375 за морфами зрощення сімядольних листків (табл. 4.). Популяція № 38-ІX № Ялтинський безнасінний більш вирівняна за морфами всіх ознак, частоти рідкісних ознак тут більш близькі за значенням.

Таблиця  

Різноманітність експериментальних популяцій

Популяція | Показник

різноманітності | Похибка

показника різноманітності

Кількість сімядольних листків

№ 38-ІX № 313 | 3,07 | 0,30

№ 38-ІX СВ 12375 | 2,40 | 0,63

№ 38-ІX Ялтинський безнасінний | 4,07 | 0,57

Зростання сімядольних листків

№ 38-ІX № 313 | 1,38 | 0,17

№ 38-ІX СВ 12375 | 1,45 | 0,34

№ 38-ІX Ялтинський безнасінний | 2,30 | 0,28

Пігментація першого справжнього листка

№ 38-ІX № 313 | 1,84 | 0,20

№ 38-ІX СВ 12375 | 1,57 | 0,45

№ 38-ІX Ялтинський безнасінний | 2,63 | 0,30

Можна припустити, що існує специфічність участі вихідних форм у появі тих або інших рідкісних морф у потомстві.

Виявлення поліембріонії при проростаннІ

стеноспермокарпічного насіння в умовах іn vіtro

Аналіз літературних даних і власні дослідження свідчать про те, що у потомстві стеноспермокарпічних сортів спостерігається в умовах іn vіtro явище поліембріонії (Tsolova, 1994, Павлова, 2000).

Спочатку це явище було виявлено в потомстві комбінації № 38-ІX Ялтинський безнасінний. В подальшому дослідили вплив генотипу сорту Ялтинський безнасінний на виявлення поліембріонії в потомстві. Провели ряд схрещувань (табл. 5).

Таблиця 

Розвиток множинних проростків в потомстві
різного походження

Походження | Кількість

насіння,

шт. | Кількість

проростків, шт. | % проростків |

Кількість

поліембріонного

насіння, шт. | % поліемб-

ріонного насіння

Ялтинський безнасінний вільне запилення | 50 | 7 | 14 | 2 | 4

Ялтинський безнасінний j | 35 | 5 | 14 | 1 | 3

№ 38-ІX Ялтинський безнасінний | 42 | 10 | 27 | 1 | 3

Ялтинський безнасінний 25__ | 30 | 7 | 23 | 3 | 0

Поряд з одиничними проростками визначено розвиток з однієї насінини двох і більше проростків. Поліембріонія спостерігалася в потомстві від схрещувань, у яких Ялтинський безнасінний використаний як материнська так батьківська форми. Однак в комбінаціях, де Ялтинський безнасінний є материнською формою, процент поліембріонного насіння вищий.

Результати експериментів свідчать про те, що на виявлення поліембріонії в потомстві чинить вплив генотип батьківської форми сорту Ялтинський безнасінний.

В процесі субкультивування множинних проростків спостерігався високий ступінь летальності. Встановлено необхідність екзогенних гормонів (БАП 0,5 мг/л) для стимулювання їхнього росту і розвитку.

Спонтанна поліембріонія має кілька механізмів, реалізація одного з яких може призвести до одержання гаплоїдних рослин (Поддубная-Арнольди, 1976; Bouquet,1980;іng, 1984; Durham et al, 1989;et al, 1989). У звязку з цим сорт Ялтинський безнасінний можна рекомендувати для проведення експериментів зі створення гаплоїдів винограду.

Оцінка нових форм за ампелографічними
та агробіологічними ознаками

Адаптація і подальше вивчення селекційних форм, одержаних з стеноспермокарпічного насіння винограду, проведилися в умовах гідропонної культури. Одержано гібридні форми різних комбінацій схрещення. У результаті попередньої агробіологічної оцінки виділено безнасінну форму Магарач № 5__комбінація схрещення № 311 44-ІІ58-90), що відрізняється раннім строком достигання і польовою стійкістю до оїдіуму.

Аналіз та обговорення одержаних результатів

Проведені дослідження показали перспективність застосування методів іn vіtro для одержання життєздатного потомства у стеноспермокарпічних форм винограду, що істотно поширює можливості селекції на безнасінність. Розроблений в ході експерименту спосіб культивування стеноспермокарпічного насіння здається нам більш перспективним порівняно з відомими. Основними його перевагами є: скорочення трудових затрат; забезпечення високого процента прямого проростання; скорочення періоду проростання насіння, росту і розвитку рослин.

В основному отримано рослини від стеноспермокарпічного насіння, що належить до III категорії безнасінності за класифікацією Смірнова (1977). Але навіть одиничні проростки і рослини, що розвинулися із насіння П категорії безнасінності, вказують на можливість подальшої роботи з даною групою безнасінних форм.

Практичні рекомендації

Розроблений спосіб рекомендовано використовувати для розмноження видів рослин з низькою схожістю насіння, зумовленою твердою насінневою оболонкою; для використання в селекції рослин із залученням форм з низькою фертильністю; для одержання рослин при міжвидовій та віддаленій гібридизації.

Висновки

1. Сучасний стан проблеми подолання постзиготичної абортивності стеноспермокарпічних сортів показав перспективність використання методу культивування зародків іn vіtro в селекції винограду на безнасінність.

2. Розроблено та упроваджено спосіб культивування насіння в умовах іn vіtro (патент Украины № 17919А), що дав змогу подолати постзиготичну абортивність у стеноспермокарпічних сортів винограду. Встановлено, що культивування зародків з фрагментом оболонки насінини спрощує процес одержання рослин, істотно скорочуючи затрати праці.

3. Розроблена технологічна схема процесу одержання рослин із стеноспермокарпічного насіння винограду дає змогу на протязі року одержати селекційні форми, розмножити, адаптувати до умов іn vіvo і виростити їхнє повноцінне вегетативне потомство.

4. Встановлено параметри культивування стеноспермокарпічного насіння винограду: строк уведення в культуру (на 70-у добу після запилення), середовище культивування (модифіковане середовище NN з БАП 0,5 мг/л).

5. В період культивування стеноспермокарпічного насіння винограду експериментальних популяцій в умовах культури іn vіtro відзначено два піки проростання. Перший пік проростання встановлено в інтервалі 10-40 діб після посадки, другий пік - в інтервалі 130-160 діб.

6. Створені регресійні моделі дали змогу встановити вплив середовища культивування на показники росту і розвитку рослинних об'єктів. Рівень значущості моделей високий лише для періоду проростання (доля варіації 18%).

7. Встановлено необхідність використання регуляторів росту для стимулювання розвитку аномальних проростків, при цьому взаємодія БАП і генотипу конкретного гібрида чинить вплив на шлях формування рослин.

8. Виявлено диференціацію в рівномірності розподілу як рослин за рідкісними морфами, так і морф за популяціями. З'ясовано, що експериментальні популяції винограду відрізняються за різноманітністю спостережуваних морф.

9. При проростанні стеноспермокарпічного насіння винограду в умовах культури іn vіtro виявлено поліембріонію і визначено вплив генотипу сорту Ялтинський безнасінний на ступінь її експресії.

10. Як материнську форму в селекції винограду на безнасінність рекомендовано гібрид № 38-ІХ. Поповнено гібридний фонд винограду новими формами, виділено нову безнасінну форму винограду Магарач № 5__, що відзначається раннім строком достигання, польовою стійкістю до оїдіуму.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Павлова И.А. Культура іn ovulo іn vіtro в селекции винограда на бессемянность // Bіcник Луганского державного педагогічного університету ім. Т.Шевченко. - 2001. - 6(38). - С. 63-66.

2. Павлова И.А. Особенности развития растений, полученных из рудиментов семян винограда в условиях культуры іn vіtro // Записки Таврического национального университета. Серия "Биология". - 2001.-Т. 14, № 1. - С. 158-161.

3. Патент № 17919А Україна, Cпосіб вирощування рослин з важко-пророщуванного насіння і відбору стійких генотипів на рівні зародків: - МПК 6АО1H4/00, АО1H4/04 / Зленко В.А., Котіков І.В., Трошин Л.П. Павлова І.А. № 95010191, Заявл. 11.01.95.; Опубл. 28.02.2000; бюл. № 2.

4. Павлова И.А. Использование культуры ткани в селекции на бессемянность // Тез. докл. конференции молодых ученых и специалистов на иностранных языках "Научно-практические достижения в области виноградарства и виноделия". - Ялта: НИИВиВ"Магарач". - 1992. - С. 24.

5. Павлова И.А. Адаптация растений из условий ин витро к условиям ин виво // Тез.докл. Республиканской научно-практической конференции по виноградарству и виноделию "Проблемы и перспективы развития виноградовинодельческого комплекса Республики Молдова ". - Кишинев (Молдова). - 1992. - С. 27-28.

6. Павлова И.А., Мелконян М.В., Киреева Л.К. Получение сеянцев из рудиментов семян бессемянных сортов винограда // Тез. докл. VІІ Международной конференции "Биотехнология клеток растений іn vіtro, биотехнология и сохранение генофонда" - Москва: из-во РАН. - 1997. - С. 145- 146.

7. Патент № 2113111, Россия - Способ выращивания растений из труднопрорастающих семян: Пат. № 2113111, МПК АО1H1/04 / Зленко В.А., Котиков И.В., Трошин Л.П., Павлова И.А. - N 95101091/13; Заявл. 26.01.95.; Опубл. 20.06.98.; Бюл. № 17.

8. Pavlova І.A. Rroductіn of іnterspectfіc hybrіds by іn vіtro embryo culture // Materіals of the ІІ Іnternatіonal Symposіum on Plant Bіotechnology. - Kyіv (Ukraіne). - 1998. - P. 96.

9. Павлова И.А. Использование зародышей культуры іn vіtro в селекции на бессемянность // Виноградарство и виноделие. Cборник научных трудов. - Ялта: ИВиВ "Магарач". - 1999. - Т.XXX. - С. 34-36.

10. Павлова И.А. Получение межвидовых гибридов в селекции на бессемянность с использованием культуры ткани іn vіtro // Виноград и вино России. - 1999. - № 2. - С. 11-12.

11. Павлова И.А. Полиэмбриония у винограда в условиях культуры зародышей іn vіtro // Труды научного центра виноградарства и виноделия. - Ялта: ИВиВ "Магарач". - 2000. - T.ІІ, кн. 2. - С. 48-51.

12. Павлова И.А. Технология іn ovulo в селекции на бессемянность// Сб. научных трудов П международной научно-практической конференции "Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в агроиндустрии" - Ялта: ИВиВ "Магарач". - 2001. - С.74.

Анотація

Павлова І.О. Особливості культивування стеноспермокарпічного насіння винограду в селекції на безнасінність. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20. - біотехнологія. Нікітський Ботанічний сад - Національний науковий центр УААН, Ялта, 2002.

Дисертацію присвячено дослідженню проблеми постзиготичної абортивності у стеноспермокарпічних сортів і гібридів винограду та пошуку шляхів її подолання. В результаті досліджень розроблено спосіб одержання рослин із стеноспермокарпічного насіння винограду за допомогою культури іn vіtro, що дає змогу на протязі року одержувати селекційні форми, їх розмножити, адаптувати до умов іn vіvo і виростити їхнє повноцінне вегетативне потомство. Виявлено біологічні особливості проростання стеноспермокарпічного насіння, росту та розвитку ювенільних рослин в умовах культури. Встановлено залежність тривалості періоду проростання від гормонального складу середовища культивування. Визначено шляхи регенерації рослин експериментальних популяцій. Встановлено вплив взаємодії БАП і генотипу конкретного гібрида на розвиток рослин, одержаних із стеноспермокарпічного насіння винограду. Аналіз поліморфізму за частотою морф трьох ознак (кількість сім’ядольних листків, зростання сім’ядольних листків, пігментація першого справжнього листка) виявив диференціацію в рівномірності розподілу як рослин за рідкісними морфами, так і морф за популяціями. Виявлено різницю досліджених експериментальних популяцій винограду за різноманітністю спостережуваних морф. Виявлено явище поліембріонії в потомстві експериментальних комбінацій і встановлено вплив генотипу сорту Ялтинський безнасінний на ступінь її експресії. Виділено безнасінну форму, яка відзначається раннім строком достигання, польовою стійкістю до оїдіуму.

Ключові слова: виноград, стеноспермокарпія, іn vіtro, стеноспермокарпічне насіння, поліембріонія, проросток, морфа, генотип, гормон, БАП.

Аннотация

Павлова И.А. Особенности культивирования стеноспермокарпических семян винограда в селекции на бессемянность. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20. - Биотехнология. Никитский ботанический сад - национальный научный центр УААН, Ялта, 2002.

Диссертация посвящена изучению проблемы постзиготической абортивности у стеноспермокарпических сортов и гибридов винограда и поиску путей ее преодоления. В результате исследований разработан способ получения растений из стеноспермокарпических семян винограда с помощью культуры іn vіtro. В основу нового способа положено культивирование зародышей с фрагментом оболочки семян, полученным путем отсечения халазной части. Фрагмент оболочки семени с прилегающими к зародышу тканями защищает зародыш от резкого воздействия питательной среды, что способствует постепенной его адаптации и моделирует естественный путь питания. Данная технология, разработанная в соавторстве, позволяет получить в условиях іn vіtro не только генеративное потомство стеноспермокарпических форм, но его размножить и адаптировать к условиям іn vіvo его вегетативное потомство.

Выявлены биологические особенности прорастания стеноспермокарпических семян, роста и развития ювенильных растений в условиях іn vіtro. Прорастание семян наблюдали при введении в культуру на 60,75 день после опыления и в период физиологической зрелости ягоды. Период прорастания семян носил волнообразный характер, при этом выражены два пика прорастания. Выявлена необходимость применения гормонов для стимулирования процессов развития зародыша и прорастания. Установлена зависимость продолжительности периода прорастания от гормонального состава среды культивирования. Для всех изученных популяций среда, содержащая БАП 0,5 мг/л являлась эффективной для прорастания стеноспермокарпических семян и рекомендована для дальнейших исследований как наиболее универсальная.

Установлено влияние взаимодействия БАП и генотипа конкретного гибрида на развитие растений, полученных из стеноспермокарпических семян винограда.

Ювенильные растений, полученные в ходе эксперимента имели различные морфологические особенности. Наблюдались отличия по форме, размерам, окраске подсемядольного колена и семядольных листьев. Анализ полиморфизма по частоте морф трех признаков: признак “количество семядольных листьев”, “срастание семядольных листьев”, ”пигментация первого настоящего листа” выявил дифференциацию в равномерности распределения как растений по редким морфам, так и морф по популяциям. Обнаружено различие исследованных экспериментальных популяций винограда по разнообразию наблюдаемых морф. Обнаружено явление полиэмбрионии в потомстве экспериментальных комбинаций и установлено влияние генотипа сорта Ялтинский бессемянный на степень ее экспрессии. С помощью разработанного способа культивирования стеноспермокарпических семян іn vіtro созданы бессемянные гибридные формы. Выделена бессемянная форма, отличающаяся ранним сроком созревания, полевой устойчивостью к оидиуму.

Ключевые слова: виноград, стеноспермокарпия, іn vіtro, стеноспермокарпические семена, полиэмбриония, проросток, морфа, генотип, гормон, БАП.

ANNOTATІON

Pavlova І.A. "Peculіarіtіes of culturіng stenospermocarpіc grape seeds іn breedіng for seedlessness" - manuscrіpt.

Thesіs for the Degree of Candіdate of Bіologіcal Scіences іn Specіalіty 03.00.20 - Bіotechnology - Nіkіtsky Botanіcal Garden - Natіonal Scіentіfіc Centere UAAN, Yalta, 2002.

The Thesіs іs concerned wіth the problem of post-zygotіc abortіveness іn stenospermocarpіc cultіvars and hybrіds of grapevіnes and the searth for ways to overcome thіs dіffіculty. A method of obtaіnіng plants from stenospermocarpіc seeds by usіng іn vіtro culture has been developed whіch enables, wіthіn a one-year perіod, obtaіnіng new forms, theіr clonal propagatіon, adaptatіon to іn vіvo condіtіons and raіsіng theіr full-value vegetatіve progeny. Bіologіcal peculіarіtіes referrіng to germіnatіon of stenospermocarpіc seeds, growth and development of juvenіle plants under culture condіtіons have been revealed. Іt has been establіshed that the length of seed germіnatіon іs dependent on the hormone composіtіon of the nutrіent medіum. Regeneratіn pathways of plants belongіng to experіment populatіons have been determіned. The іnteractіon of BAP and the genotype of a gіven hybrіd has been found to іnfluence the development of plantlets obtaіned from stenospermocarpіc seeds. Polymorphіsm analysіs for the frequency of morphs wіth one of three traіts ("number of cotyledonary leaves", "adnatіon of cotyledonary leaves", "pіgmentatіon of the fіrst true leaf") has revealed dіfferentіatіon іn the homogeneіty of the dіstrіbutіon of both the plants for the rare traіts and the morphs across the populatіons. The experіment populatіons have been found to dіffer іn the dіversіty of the morphs revealed. Polyembryony has been revealed іn the progeny of experіment combіnatіons, and the effect of genotype of cv. Yaltіnskі bessemіanny on the degree of polyembryony expressіon has been establіshed. A seedless form has been revealed whіch іs dіstіnguіshed for early maturatіon and oіdіum resіstance іn the fіeld.

Key words: grapevіne, stenospermocarpy, іn vіtro, stenospermocarpіc seeds, polyembryony, plantlet, morph, genotype, hormone, BAP.

Підписано до друку 18.10.2002 р. Формат 60Х84 1/16.

Умовн.друк. арк. 1,2 тираж 120 пр., замовлення № 106.

печатна група. Інститут винограду і вина "Магарач",

98600, м. ялта, вул. кірова, 31.