КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Постригач Надія Олегівна

УДК:582.26/.27:611.013.12:616.001.28/29

ВПЛИВ НЕЛЕТАЛЬНИХ ДОЗ ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ

І СПІРУЛІНИ НА БІОХІМІЧНІ ТА УЛЬТРАСТРУКТУРНІ

ПОКАЗНИКИ СТАНУ СПЕРМАТОЗОЇДІВ ТА ОРГАНІВ

РЕГУЛЯЦІЇ СПЕРМАТОГЕНЕЗУ ЩУРІВ

03.00.01 – радіобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті експериментальної

радіології Наукового центру радіаційної медицини Академії

медичних наук України.

Науковий керівник: Доктор медичних наук, професор

Порохняк-Гановська Людмила Андріївна,

Інститут експериментальної радіології Наукового центру

радіаційної медицини Академії медичних наук України,

Завідувач лабораторії протекторних засобів

Офіційні опоненти: Доктор біологічних наук

Дружина Микола Олександрович,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології

імені Р.Є. Кавецького Національної академії наук України,

провідний науковий співробітник відділу біофізики канцерогенезу

Кандидат біологічних наук

Андрійчук Тетяна Ростиславівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

старший науковий співробітник лабораторії фізико-хімічної

біології біологічного факультету

Провідна установа:

Інститут онкології Академії медичних наук України,

лабораторія експериментальної онкології і променевої патології

Захист відбудеться 23 вересня 2002 р. о 12 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д .001.24 у Київському національному

університеті імені Тараса Шевченка за адресою:

03127, Київ–27, проспект Глушкова, 2, корпус 12,

біологічний факультет, к. , конференц-зал.

Поштова адреса: 01033, Київ–33, вул. Володимирська, 64.

Спецрада Д .001.24, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 58

Автореферат розіслано 22 червня 2002 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Брайон

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З’ясування впливу іонізуючого випромінювання (ІВ) на чоловічу статеву систему за умов, що склалися після Чорнобильської катастрофи на значних територіях України, є сьогодні надзвичайно важливим та актуальним завданням, оскільки кількість хворих із цією патологією зростає протягом останніх 10 років (Мостафа А.М. - 1997; Конопля Е.Ф., Чантурія А.Ф. - 1996; Лучицький С.В. - 1998). За ступенем радіочутливості сім’яники знаходяться на другому місці після органів кровотворення (Кевра М.К. - 1993). Тимчасову стерильність, порушення і припинення сперматогенезу зареєстровано при опроміненні сім’яників уже за дози 0,1 Гр (Люлько А.В. - 1992; Гофман Д. - 1994). Продемонстровано, що у осіб, котрі зазнали радіаційного впливу, спостерігаються суттєві порушення з боку гіпоталамо-гіпофізарно-генератив-ної системи (ГГГС). Зокрема, відмічаються сексуальні розлади, зниження андрогенної та гене-ративної функції тестикул, підвищення вмісту в крові пролактину, лютеотропного та фоліо-троп-ного гормонів, естрогенів і зниження рівня тестостерону (Возіанов А.Ф., Горпинченко І.І. - 1992, Демченко А.М. та ін. - 1992, Імшінецька Л.П. та ін. – 1990). За даними експериментальних і клініч-них досліджень, вже за доз 0,5-1 Гр у більшості тварин і людини спостерігається масивне клітинне спустошення сім’яників, а дози понад 2 Гр, призводять до тривалої стерильності (Москалев Ю.И. - 1991; Горбань Є.М. - 1996; Лучицький С.В. - 1998).

У зв’язку з тим, що на практиці іонізуюче опромінення обтяжується несприятливими стресовими чинниками різного генезу, в роботі досліджувались особливості комплексної дії ІВ та іммобілізаційного стресу на біохімічні показники крові, ультраструктурний стан сперматозоїдів та органів регуляції сперматогенезу, а також можливість модифікувати виявлені біоефекти препара-том спіруліни, що добре зарекомендував себе у лікарській практиці як засіб, який має широкий спектр медико-біологічної дії (Уокер М. - 1995; Нестеренко В.Б. - 1997; Николайчук Л.В. и др. - 1998). Однак до кінця не з’ясовано механізми його впливу. Предметом нашої уваги стали притаманні цьому препарату радіопротекторні, зокрема, антиоксидантні властивості. На вирішен-ня цього кола питань і спрямована дана робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота вико-нана в лабораторії протекторних засобів Інституту експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України як складова частина наукової теми, в якій автор була співви-конавцем. Тема НДР: ”Розробка способу запобігання мутагенним впливам шкідливих факторів довкілля”, що виконувалась у 1999-2001 рр. згідно із галузевим планом Міністерства з надзвичай-них ситуацій України в рамках Державної науково-технічної програми (№ держреєс-т-рації № U003866, шифр №17/12 а Н-99).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у дослідженні ізольованого та поєд-наного впливу тотального гамма-випромінювання й іммобілізаційного стресу на розвиток змін біохімічних параметрів сироватки крові, процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) у крові та тканинних гомогенатах досліджуваних органів; на рухливість сперматозоїдів, морфо-функціо-нальний стан ГГГС самців білих нелінійних статевозрілих щурів, а також передбачала оцінку можливості коригуючого впливу препарату спіруліни на стан досліджуваних показників при модельному ураженні.

Задачі дослідження:

Дослідити рухливість сперматозоїдів тварин при ізольованій дії ІВ та поєднаному впливі іонізуючої радіації й іммобілізаційного стресу, а також при застосуванні препарату спіруліни.

Встановити характер і глибину змін біохімічних показників крові та інтенсивності процесів ПОЛ у сироватці крові та тканинних гомогенатах досліджуваних органів тварин після ізольованого та поєднаного впливу тотального гамма-випромінювання, іммобілізаційного стресу та модифікаційного впливу препарату спіруліни.

Вивчити дію спіруліни на резистентність мембран еритроцитів після ізольованого та поєднаного впливу тотального гамма-випромінювання та стресу.

Дослідити ізольований вплив іонізуючого випромінювання на структурні та функціональні зміни в морфофункціональних ланках репродуктивної системи самців щурів.

Встановити біологічні ефекти поєднаного впливу тотального гамма-випромінювання і стресу на морфофункціональний стан нейросекреторних клітин гіпоталамусу, аденогіпофізу та клітин сперматогенного епітелію.

Випробувати на цих моделях нову лікарську форму спіруліни таблетки, покриті оболонкою.

Об’єкт дослідження – біохімічні параметри крові, ультраструктурні показники стану сперматозоїдів та органів регуляції сперматогенезу щурів, підданих ізольованому та поєднаному впливу тотального гамма-випромінювання та іммобілізаційного стресу.

Предмет дослідження – кров, сперматозоїди та тканини досліджуваних органів.

Методи дослідження – радіобіологічні, біохімічні, функціональні, морфологічні та математичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведена комплексна оцінка біологічного ефекту впливу препарату спіруліни на функціональну активність сперматозоїдів та морфофункціональний стан сім’яників щурів на фоні ізольованої та поєднаної дії тотального гамма-випромінювання та іммобілізаційного стресу.

Комплексно досліджена ультраструктурна основа компенсаторно-пристосувальних і репаративно-регенеративних процесів у гіпоталамусі, аденогіпофізі та сім’яниках після поєднаного впливу іонізуючої радіації, стресу та при тривалому уведенні в раціон опромінених лабораторних тварин препарату спіруліни.

Дістали подальшого розвитку електронномікроскопічні дослідження, які розкривають зв’язок між деструкцією мембранних компонентів, пригніченням внутрішньоклітинної репаративної регенерації секреторних клітин гіпоталамусу, аденогіпофізу і сім’яників, а також різкою активацією ПОЛ у сироватці крові та гомогенатах тканин досліджуваних органів після поєднаного впливу тотального гамма-випромінювання і стресу. Встановлено зменшення цих негативних ефектів при уведенні в раціон тварин препарату спіруліни.

Вперше на щурах при поєднаній дії ІВ і стресу показано, що радіозахисний ефект спіруліни пов’язаний з відновленням структурно-функціональної цілісності сперматоцитів 1-го та 2-го порядку і нормалізацією порушеної при опроміненні гіпоталамо-гіпофізарної регуляції сперматогенезу.

Проведені експериментальні дослідження дали змогу сформулювати гіпотезу щодо механізмів корекції променевих порушень генеративної функції щурів за допомогою спіруліни, зокрема, завдяки її антиоксидантним властивостям, які, на наш погляд, можуть бути пов’язані зі стабілізацією структурно-функціональних характеристик біологічних мембран.

Практичне значення одержаних результатів. Результати даного експериментального дослідження науково обгрунтовують можливості цілеспрямованої корекції препаратом спіруліни уражень органів регуляції сперматогенезу та клітин сперматогенного епітелію у разі впливу променевого та інших стрес-агентів нерадіаційної природи.

Отримані дані щодо ефективності розробленої й апробованої нової лікарської форми спіруліни з оболонкою можуть стати підгрунтям для розширення спектра застосування препарату серед різних, зокрема, дитячих, контингентів населення, що зазнають впливу несприятливих чинників довкілля, поповнюють та розширюють знання щодо характеру впливу ІВ і стресу на особливості розвитку променевих порушень чоловічої генеративної сфери. Одержані результати можуть бути враховані як у навчальному процесі з метою підготовки фахівців у галузі радіобіології та радіаційної медицини, так і при підготовці нормативних документів з основ радіаційної безпеки.

Особистий внесок здобувача. Автор роботи особисто проаналізувала вітчизняну та зарубіжну наукову літературу за темою, розробила програму наукового дослідження, обрала методи вирішення поставлених задач, виконала відповідні експерименти, провела математичну і статистичну обробку одержаних даних, проаналізувала та узагальнила одержані результати і сфор-мулювала висновки. Дисертантом спільно із співробітниками лабораторії електронної мікроскопії науково-дослідного інституту нейрохірургії імені А.П. Ромоданова здійснено електронно-мікрос-копічні дослідження, одержано результати та проведено їх обговорення разом із завідувачем вище згаданої лабораторії, доктором медичних наук, професором А.Т. Носовим.

Авторові особисто належить ідея та наукова технологія розробки таблетованої форми спіруліни з нанесенням спеціальної оболонки, а спосіб її отримання розроблено та впроваджено у виробничу практику спільно із співробітниками ЗАТ “Технолог” і ВАТ “Вітаміни” під загальним керівництвом директора з виробництва і розвитку ВАТ “Вітаміни”, доктора фармацевтичних наук Т.М. Будникової (м. Умань).

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповіда-лися та обговорювалися на ІІІ симпозіумі “Діагностика та профілактика негативних наслідків радіації” (Київ, 1997); науково-практичній конференції “Сучасні проблеми гематології та транс-фу-зіології” (Київ, 1998) та VII Конгресі Світової федерації українських лікарських товариств (Ужгород, 1998); науковій конференції “Актуальні питання радіаційної медицини” НЦРМ АМН України (Київ, 1999); науково-практичній конференції “Радиационная гигиена” та міжнародній конференції “Проблеми і шляхи створення засобів, які мінімізують негативні наслідки Чорнобиль-ської катастрофи і впливу оточуючого середовища” (Київ, 2000); на ювілейній конференції моло-дих учених НЦРМ АМН України, науково-практичній конференції “Експериментальна радіо-біо-логія” ІЕР НЦРМ АМН України; ІІІ Міжнародній конференції “Медицинские последствия Чернобыльской катастрофы: итоги 15-летних исследований” (Київ, 2001).

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 17 наукових праць: 1 – у співавторстві в колективній монографії; 11 статей – у наукових фахових журналах, 5 – в матеріалах та тезах конференцій, симпозіумів, з'їздів та конгресів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається із змісту, переліку умовних скорочень, вступу, 6 розділів експериментальних досліджень (включаючи огляд літератури, матеріали та методи, результати власних досліджень та їх обговорення), висновків, списку використаних літературних джерел. Повний обсяг дисертації – 136 сторінок друкованого тексту українською мовою, в тому числі – 1 сторінка таблиць (усього 8) та 10 сторінок рисунків (усього 25), 22 сторінки списку використаних джерел (199 посилань).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Дано грунтовний аналіз сучасних уявлень щодо механізмів патогенезу променевих уражень ГГГС. Наведено матеріали щодо медико-біологічних властивостей спіруліни та оцінки можливості її застосування як радіопротекторного засобу, коригуючого генеративну функцію самців.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведено на 160 білих нелінійних статевозрілих щурах-самцях з масою тіла 140-200 г. Було використано 4 експериментальні моделі:

1) Дворазове тотальне гамма-опромінення щурів з інтервалом у 1 та 14-ть діб (установка “ІГУР”, джерело – 137Сs, потужність 1,06 Гр/хв) за сумарних поглинених доз 0,1-2 Гр; 2) двора-зо-вий іммобілізаційний стрес, який проводили за добу після 1-го та повторного опромінення у камерах Когана (експозиція 2 год.); 3) поєднання тотального гамма-опромінення, стресу і спіруліни; 4) згодовування спіруліни контрольним тваринам.

Подрібнений препарат спіруліни вводили в раціон опромінених тварин, починаючи з 1-ї по 30-у добу після опромінення (200 мг/кг, 1 раз на добу, 6 разів на тиждень). Інтактним тваринам спіруліну згодовували впродовж усього періоду експерименту (30 діб). Обрана доза спіруліни відповідає терапевтичній дозі препарату для людини та діапазону ефективних доз в експерименті (Беленький М.Л. - 1963).

Концентрацію трийодтироніну, тироксину та тестостерону визначали у сироватці крові радіоіммунологічним методом (Славнов В.Н. - 1988) за допомогою наборів РІО-Т3-ІПР РІО-Т4 ПГ та СТЕРОН-Т-125I. Концентрацію адреналіну та кортикостерону визначали спектрофлуори-мет-ричним методом (Балашов Ю.Г. - 1990). Стан процесів ПОЛ оцінювали за даними вмісту в сироватці крові малонового діальдегіду (МДА) за Гавриловим В.П. та ін. (1987), а в тканинних гомогенатах гіпоталамусу, гіпофізу, щитовидної залози, надниркових залоз, сім’яників та печінки – за Владимировим Ю.А., Арчаковим А.І. (1972). Резистентність мембран еритроцитів визначали методом кислотного гемолізу (Гительзон М.И., Терсков И.А.- 1959). Концентрацію в сироватці крові загального білка (альбуміну), тригліцеридів (триацилгліцеролів), сечовини, креатиніну, глюкози, активність L-Аланін:2-оксоглутарат амінотрансферази (АлАт); L-Аспартат:2-оксоглу-тарат амінотрансферази (АсАт); лужної фосфатази (ЛФ); лактатдегідрогенази (ЛДГ) визначали, використовуючи стандартні клінічні біохімічні набори реактивів.

Життєздатність (рухливість) сперматозоїдів оцінювали за допомогою світлооптичної мікроскопії. Проводили оцінку морфофункціонального стану гіпоталамусу (ділянка супраоп-тичного ядра), аденогіпофізу та сім’яників, для чого, безпосередньо після декапітації тварин за допомогою гільйотини, брали біоптати відповідних тканин, які досліджували загальноприйнятими методами.

Методом електронної мікроскопії досліджували стан тканин гіпофізу, гіпоталамусу та сім’яників. Ультратонкі зрізи товщиною 400 - 500 A отримували на ультратомі ЛКБ та ультрамікротомі фірми Рейхердт. Дослідження проводили на електронному мікроскопі ЕМ – 400 Т фірми “Philips” (Голландія).

В дослідах використовували препарат синьо-зеленої водорості – спіруліни, що містить 50-70легко засвоюваного білка, вітаміни групи В, а також Е, С, D, бета-каротин, мікроелементи, вуглеводи, органічні жирні кислоти (пальмітинова, гамма-ліноленова, лінолева та ін.), пігменти (фікоціанін, хлорофіл, каротиноїди) тощо. Статистичну обробку отриманих даних проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики.

Оцінка можливості корекції функціональних порушень сперматозоїдів за допомогою спіруліни. Цей розділ дисертації присвячено оцінці можливостей корекції за допомогою спіруліни функціональних порушень сперматозоїдів після впливу застосованих чинників. Наведено результати щодо життєздатності (рухливості) сперматозоїдів після ізольованого та поєднаного впливу тотального гамма-випромінювання і стресу, продемонстровано значні її зміни за цих умов.

Вивчення впливу препарату спіруліни на рухливість сперматозоїдів на першому етапі проводили за впливу доз ІВ від 0,1 до 2 Гр ( розділ 2). На 30-у добу цей показник був найменшим за дози 2 Гр (рис. 1).

Рис 1. Вплив іонізуючого випромінювання на життєздатність сперматозоїдів (% нежиттєздатних до загальної кількості) щурів

* – вірогідно у порівнянні з інтактними тваринами

Виходячи з цього, подальші дослідження доцільно було, на наш погляд, проводити саме за впливу дози ІВ (2 Гр). Показано, що таблетки спіруліни, покриті оболонкою, у застосованій дозі (200 мг/кг) виявляють коригуючий вплив на рухливість сперматозоїдів опромінених щурів. Результати цього досліду відображено на рисунку 2.

Дослідження впливу іонізуючого випромінювання, стресу і спіруліни на біохімічні параметри крові та процеси ПОЛ у щурів. У цьому розділі експериментально показано, що як при ізольованому, так і поєднаному впливі ІВ та стресу рівень гормонів надниркових залоз в сироватці крові вірогідно (p<0,05) зростає. В останньому випадку підвищення концентрації цього гормону було більш значним. Згодовування спіруліни щурам сприяло нормалізації (p<0,05) вмісту кортикостерону в сироватці крові тварин, підданих впливу гамма-випромінювання та стресу (порівняно з групою 3) й істотно не впливала на цей показник у інтактних тварин. Уведення в раціон щурів 5-ї групи спіруліни призводить до вірогідного (p<0,05) зменшення рівня адреналіну відносно групи 4 і не викликає змін цього показника відносно інтактних щурів (рис. 3).

Рис. 2. Дослідження рухливості (в %) сперматозоїдів щурів за різних експериментальних умов–

* вірогідно (p<0,05) між групами 3 та 5 у порівнянні з відповідним контролем (2 і 3).–

1, 2, 3, 4, 5 дослідні групи: “Інтактні”, “2 Гр”, “2 Гр+стрес”, “2 Гр + спіруліна”, “2 Гр+стрес+спіруліна”, відповідно.

– життєздатні, – нежиттєздатні.

Рис. 3. Показники вмісту гормонів надниркових залоз у сироватці крові щурів дослідних груп

* – вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 1;

# – вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 4.

Умовні позначення: 1 – “Інтактні”; 2 – “2 Гр”; 3 – “Стрес”; 4 – “2 Гр+стрес”;

5 – “2 Гр+стрес+спіруліна”; 6– “Спіруліна”.

Визначення вмісту тестостерону в сироватці крові опромінених самців щурів показало, що окрема дія тотального гамма-випромінювання викликає вірогідне (p<0,05) його зниження порівняно з групою . Дослідженнями доведено, що іонізуюче опромінення (p<0,01) призводить до суттєвого зниження рівня тестостерону в сироватці крові. При застосуванні спіруліни вміст цього гормону в сироватці крові опромінених і інтактних тварин майже не відрізняється. Дані, які отримано в цій серії досліджень, відображено в таблиці 1.

Нами визначено також активність мембранозв’язаних ферментів у сироватці крові, які маркерами цитолізу гепатоцитів – лужної фосфатази (ЛФ), аспартатамінотрансферази (АсАт) та аланінамінотрансферази (АлАт) тварин різних дослідних груп. Отримані дані, які відображено на рис. , демонструють, що застосовані чинники викликають різноспрямовані зміни цих показників.

Таблиця 1

Вміст тестостерону у сироватці крові щурів на 30 добу після їх опромінення (2 Гр) та при застосуванні спіруліни

Рис. 4. Активність ряду ферментів у сироватці крові щурів різних дослідних груп

* – вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 1;

# – вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 4.

Умовні позначення: 1 – “Інтактні”; 2 – “2 Гр”; 3 – “Стрес”; 4 – “2 Гр+стрес”;

5 – “2 Гр+стрес+спіруліна”; 6 – “Спіруліна”.

Так, встановлено істотне (p<0,05) зростання активності ЛФ лише після поєднаного впливу іонізуючої радіації та іммобілізаційного стресу. Ізольований вплив цих чинників помітно не позначився на активності ЛФ. Уведення спіруліни в харчовий раціон тварин не змінює цього показника в жодній дослідній групі. Визначення активності ферменту АсАт показало, що в порівнянні з інтактними тваринами, після впливу ІВ, стресу та їх поєднаної дії спостерігається вірогідне (p<0,05) зростання його активності. Уведення спіруліни до харчового раціону тварин, що зазнали впливу вищезазначених чинників, призводить до нормалізації активності аспартат-амінотрансферази.

Це може свідчити про нормалізацію функціонального стану клітинних мембран, маркером проникності яких виступає АсАт. Дослідження активності іншого ферменту – АлАт показало, що цей показник, у порівнянні з інтактними тваринами, дещо зростає (p<0,05) при ізольованому та поєднаному впливі ІВ і стресу. Застосування препарату спіруліни в раціон щурів 5-ї групи призводить до часткової нормалізації рівня активності аланінамінотрансферази.

У тварин різних дослідних груп визначали також вміст основних біохімічних параметрів сироватки крові: глюкози, загального білка, тригліцеридів, сечовини та креатиніну як показників вуглеводного і білкового обміну. Таким чином, аналіз одержаних даних свідчать про стабілізацію під дією спіруліни показників білкового обміну та вмісту глюкози, порушення яких спостерігалося за впливу застосованих чинників. Результати цієї серії досліджень наводяться у таблиці 2.

Таблиця 2

Вміст біохімічних параметрів у сироватці крові тварин різних дослідних груп (n=6)

Примітки:

1. – * вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 1

2. – # вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 4.

Для з’ясування стану клітинних мембран після впливу ІВ та стресу, а також можливості корекції виявлених змін у разі застосування спіруліни, проведено серію досліджень з оцінки резистентності мембран еритроцитів. Продемонстровано, що спіруліна, уведена в раціон тварин, підданих поєднаному впливу ІВ і стресу, за даними часу настання гемолізу помітно підвищує (p<0,05) резистентність мембран еритроцитів у порівнянні з групою 4. В інших дослідних групах застосування препарату істотно не вплинуло на цей показник.

Встановлено, що тривалість кислотного гемолізу у тварин, підданих ізольованому та поєднаному впливу ІВ і стресу, вірогідно знижувалася, а у разі введення в їх раціон препарату спіруліни (вірогідно у порівнянні з тваринами групи 4 – p<0,05) – значно підвищувалася. Таким чином, аналіз отриманих результатів свідчить про виражений мембраностабілізуючий ефект спіруліни. Одержані дані щодо часу настання та тривалості гемолізу проілюстровано рисунком 5.

Для з’ясування можливих механізмів впливу препарату спіруліни в сироватці крові дослідних та інтактних тварин визначали вміст МДА – вторинного ТБК-активного продукту ПОЛ. Результати цих досліджень наводяться у таблиці 3.

Рис. 5. Резистентність мембран еритроцитів у тварин різних дослідних груп

* – вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 1;

# – вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 4.

Умовні позначення: 1 – “Інтактні”; 2 – “2 Гр”; 3 – “Стрес”; 4 – “2 Гр+стрес”;

5 – “2 Гр+стрес+спіруліна”; 6– “Спіруліна”.

Таблиця 3

Дослідження вмісту МДА у крові тварин різних експериментальних груп

Примітки:

1.– * вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 1

2. – # вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 4.

Визначення у сироватці крові тварин різних дослідних груп вмісту МДА показало, що як ізольований вплив ІВ і стресу, так і їх поєднана дія призводять до вірогідного (p<0,05) зростання цього показника. Спіруліна усуває ці зміни у щурів, які зазнали поєднаного впливу опромінення і стресу, і суттєво не впливає на вміст МДА у інтактних тварин. Рівень МДА визначали також у тканинах внутрішніх органів після ізольованого та поєднаного впливу ІВ і стресу, а також у разі уведення в раціон щурів спіруліни. Дані, які наведено у таблиці , свідчать про суттєве і вірогідне зростання інтенсивності процесів ПОЛ в тканинах усіх досліджуваних органів. При цьому інтенсивність ПОЛ є найбільш значною при поєднаному впливі ІВ і стресу. Так, у сім’яниках рівень МДА за цих умов перевищує його рівень у інтактних тварин в 3,5 рази.

Таблиця 4

Вміст МДА в тканинних гомогенатах щурів різних дослідних груп

Примітки:

1.– * вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 1;

2. – вірогідно (p<0,05) у порівнянні з групою 4.

Уведення спіруліни в раціон тварин, підданих поєднаному впливу ІВ і стресу, призвело до вірогідного (p<0,05) зменшення вмісту МДА у всіх досліджених тканинах. Хоча, за винятком гіпоталамуса, рівень МДА і відрізняється від такого у інтактних тварин, можна стверджувати, що спіруліна виявляє виражений антиоксидантний вплив і суттєво зменшує інтенсивність процесів ПОЛ, спричинених застосованими чинниками. Сам по собі препарат спіруліни також впливає на цей показник, але ці зміни, у порівнянні з інтактними тваринами, відносно незначні і їх виявлено лише для деяких тканин. Таким чином, з’ясовано, що застосування спіруліни суттєво зменшує негативний вплив комбінованої дії ІВ і стресу. Спостерігається повна нормалізація рівня кортико-стерону та адреналіну і частково – тестостерону, активності ферменту цитолізу гепатоцитів – АлАт у сироватці крові, зменшення інтенсивності процесів ПОЛ у сироватці крові і тканинах майже усіх досліджуваних органів, а також мембраностабілізуючий ефект препарату. Виявлено позитивний вплив спіруліни на білковий обмін, порушення якого спостерігалося після впливу застосованих чинників. Саме зі зменшенням інтенсивності процесів ПОЛ у ГГГС можливо і пов’я-заний вищезазначений позитивний ефект спіруліни.

Дослідження морфофункціонального стану гіпоталамо-гіпофізарно-генеративної системи після впливу іонізуючого випромінювання, стресу та при застосуванні спіруліни. Результати електронної мікроскопії свідчать, що на 30 добу після впливу іонізуючого гамма-вип-ромінювання спостерігаються значні деструктивно-дистрофічні зміни в цитоплазмі клітин тканин супраоптичного ядра гіпоталамусу, аденогіпофізу та сім'яників; деструкція мембранних компонен-тів органел, а також порушення функції сперматогенезу на рівні сперматоцитів 2-го порядку. Це, в свою чергу, призводить до порушень у формуванні клітин-попередників сперма-тозоїдів – сперма-тид. У разі ізольованого стресового впливу, в порівнянні з окремою дією опро-мінення на щурів, помітної різниці у клітинах сперматогенного епітелію виявлено не було. Встановлено, що при введенні в раціон щурів, котрі зазнали комбінованого впливу ІВ та іммобілі-заційного стресу спіруліни, у них поліпшуються процеси сперматогенезу, підвищується секре-торна активність соматотропів та гонадотропів аденогіпофізу, стан мікроциркуляторного русла, стабілізується білковий обмін, що вважається дуже важливим для регуляції статевої системи самців, зокрема її генеративної функції (рис. 6).

Рис.6. Стінка сім’яного канальця яєчка після опромінення тварин (2 Гр), підданих стресу із уведенням спіруліни. Напівтонкий зріз. Забарвлення метиленовим синім піроніном х 600.

Обговорення результатів досліджень. У цьому розділі проводиться зіставлення результатів за окремими напрямками досліджень та даними літератури. Висловлюється, зокрема, припущення, що одним із можливих пояснень виявленого позитивного впливу спіруліни є наявність у її складі таких вітамінів, як Е, С та -каротину. Останні ж, як відомо, виявляють виражені антиоксидантні властивості, що може забезпечувати усунення деяких змін, спричинених опроміненням і стресом, зокрема тих, що призводять до ушкодження мембранних структур, порушень нейрогуморальної регуляції сперматогенезу та морфофункціональних характеристик стану сперматозоїдів.

ВИСНОВКИ

Встановлено, що тотальне гамма-випромінювання, його поєднання із стресом викликають як зворотні, так і незворотні зміни біохімічних та ультраструктурних показників стану сперматозоїдів та органів регуляції сперматогенезу щурів.

Доведено, що іммобілізаційний стрес дещо поглиблює ступінь деструктивно-дистрофічних змін у генеративній системі опромінених щурів-самців, що призводить до вираженого зниження функціональної активності її морфофункціональних ланок.

З’ясовано, що тотальне гамма-випромінювання, іммобілізаційний стрес та їх поєднана дія, призводять до посилення процесу ліпопероксидації в крові та тканинах досліджуваних органів, особливо в гіпоталамусі, сім’яниках та печінці, зменшення резистентності мембран еритроцитів, підвищення вмісту кортикостерону, активності ферментів лужної фосфатази, аспартатамінотрансферази, зменшення вмісту тестостерону в крові.

Тотальне гамма-випромінювання викликає структурні та функціональні зміни в усіх морфофункціональних ланках репродуктивної системи дослідних тварин: деструкцію мембранних компонентів органел та деструктивно-дистрофічні зміни цитоплазми значної частини нейросекреторних клітин гіпоталамусу, гонадотропоцитів аденогіпофізу і клітин сперматогенного епітелію сім’яників, зниження активності сперматогенної і ендокринної функції сім’яників, значне зменшення рухливості сперматозоїдів.

Доведено, що патогенетичним механізмом морфофункціональних змін генеративної статевої системи дослідних щурів-самців є порушення структури і функцій мікроциркуляторного русла гіпоталамусу, гіпофізу і сім’яників та значна активація процесів перекисного окиснення ліпідів.

Установлено, що уведення в раціон опромінених тварин спіруліни призводить до нормалізації вмісту адреналіну та кортикостерону, активності ферментів гепатобіліарної системи в сироватці крові тварин, покращує морфофункціональний стан мікроциркуляторного русла, знижує інтенсивність перекисного окиснення ліпідів, стабілізує білковий обмін, активує процеси внутрішньоклітинної репаративної регенерації в морфофункціональних ланках репродуктивної системи тварин, що позитивно впливає на процеси гіпоталамо-гіпофізарної регуляції сперматогенезу, збільшує рухливість сперматозоїдів.

Застосування нової фармакопейної форми спіруліни поширює можливості її використання як засобу нормалізації генеративної функції самців після дії нелетальних доз іонізуючого опромінення та стресу.

Список пРАЦЬ, ОПУблікОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Пищевые продукты и добавки, минимизирующие отрицательные эффекты радиации / Руднев М.И., Порохняк-Гановская Л.А., ЧаялоП.П. , Варецкий В.В., Деревянко Л.П., Горчакова Л.А., Божок О.В., Ракочи А.Г., Порохняк И.В., Скачек М.Ю., Постригач Н.О., Мельник М.К., Савицкий А.П., Гришко Г.Н., Дмитриева И.Р. // Медицинские последствия аварии на Чернобыльской атомной станции: Кн. 3 . – К.: “МЕДЭКОЛ” МНИЦ БИО-ЭКОС, 1999. – С. 173-199.

Морфологічні зміни ендокринних залоз експериментальних тварин в умовах впливу малих доз радіації / Царенко А.В., Порохняк Л.А., Носов А.Т., Постригач Н.О., Романко М.М. // Зб. наук. робіт міжнар. конф. “Актуальні питання морфології”. – Тернопіль, 1996. – С. 674-675.

Постригач Н.О. Вплив спіруліни на чоловічу генеративну функцію // Мат. 3-го симпозіуму “Діагностика та профілактика негативних наслідків радіації”. – Київ, 1997. – С. 190-194.

Медико-біологічні властивості спіруліни / М.Ю. Скачек, Л.П. Дерев’янко, Н.О. Постригач, Л.А. Порохняк-Гановська // Мат. 3-го симпозіуму “Діагностика та профілактика віддалених наслідків радіації”. – Київ, 1997. – С. 229-233.

Постригач Н.О. Вплив спіруліни на морфофункціональний стан нейроендокринних органів при комбінованому впливі іонізуючого опромінення і стресу Буковинський медичний вісник. – 1999. – Т. 3, № . – С. 213-219.

Постригач Н.О. Спіруліна як засіб реабілітації генеративної функції самців при іонізуючому опроміненні // Науковий вісник Ужгородського університету, серія Медицина. – 1999. – Вип. . – С. 127-130.

Побічний вплив ліків на статеву систему / О.П. Вікторов, Л.А. Порохняк, Н.О. Постригач, І.О. Борзенко // Клінічна фармація. – 1999. – Т. 3. – № 1. – С. 75-79.

Постригач Н.О. Біохімічні показники крові та морфофункціональний стан ендокринних органів на фоні впливу іонізуючого опромінення та стресу при застосуванні препарату спіруліни // Гигиена населенных мест:  Сб. тр. – Киев, 2000. – Вып. . – Ч. . – С. .

Постригач Н.О. Вибір ефективної дози та форми спіруліни по визначенню загальної рухливості сперматозоїдів при іонізуючому опроміненні і стресі // Гигиена населенных мест: Сб. тр. – Киев, 2000. – Вып. . – Ч. . – С. .

Постригач Н.О. Спіруліна як адаптогенний засіб при променевому ураженні // Екологічна фізіологія. – Тернопіль, 2000. – №1. – С.34-37.

Особливості реакції мозку та печінки щурів на одноразовий вплив тотального іонізуючого опромінення в дозі 5 Гр / Порохняк-Гановська Л.А., Горчакова Л.А., Постригач Н.О., Костянецька О.І., Мельник М.К. // Проблеми військової охорони здоров’я: Зб. наук. праць УВМА. – Київ, 2000. – Вип.6. – С.337-344.

Постригач Н.О., Носов А.Т. Дослідження модифікаційного ефекту застосування спіруліни на морфофункціональний стан генеративної системи в експерименті після впливу іонізуючого опромінення і стресу Науковий вісник Ужгородського національного університету, серія Біологія. – 2001. – Вип. 9. – С. .

Постригач Н.О. Спіруліна як засіб реабілітації при променевому ураженні // Тез. доп. наук.-практ. конф. “Сучасні проблеми гематології та трансфузіології”. – Київ, 1998. – С.33.

Постригач Н.О. Екопротекторні властивості спіруліни // Укр. мед. вісті: Тез. доп. 7-го Конгресу Світової Федерації Українських Лікарських Товариств. – К.: Мед. Україна, 1998. – Ч. 1. – Р. 4. – С. 212-213.

Постригач Н.О. Вплив спіруліни на морфофункціональний стан сперматозоїдів та тестикул опромінених щурів / Межд. журн. радиац. медицины: Матер. 3-й межд. конф. “Медицинские последствия Чернобыльской катастрофы: итоги 15-летних исследований. – Київ, 2001. – Т. 3, № 1–2. – С. 277.

Постригач Н.О. Влияние внешнего облучения и стресса на морфо-функциональное состояние семенников белых крыс Тез. докл. IV съезда по радиационным исследованиям. – М.: Изд-во Российского университета дружбы народов, 2001. – Т. 2. – С. .

Радіопротекторна активність фармакологічних композицій на основі спіруліни і апротонних розчинників, що застосовуються в медицині /  Г.М. Ларіонов, Н.О. Постригач, Л.А. Порохняк-Гановська, А.М. Яніна // Зб. тез міжнар. конф. “П’ятнадцять років Чорнобильської катастрофи. Досвід подолання”. – Київ, 2001. – Ч. 3. – С. 62.

АНОТАЦІЇ

Постригач Н.О. Вплив нелетальних доз іонізуючої радіації і спіруліни на біохімічні та ультраструктурні показники стану сперматозоїдів та органів регуляції сперматогенезу щурів”. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01 радіобіологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка.- Київ.- 2002.

Дисертація присвячена дослідженню особливостей коригуючого впливу спіруліни на морфофункціональний стан сперматозоїдів та органів регуляції сперматогенезу після поєднаного впливу тотального гамма-випромінювання та стресу. Проведено порівняльний аналіз біоефектів окремого та поєднаного впливу тотального гамма-випромінювання, іммобілізаційного стресу та спіруліни на рухливість сперматозоїдів тварин, зміни біохімічних показників крові та інтенсивності процесів ПОЛ у сироватці крові та тканинних гомогенатах досліджуваних органів. Встановлено подібність біологічних ефектів окремого та поєднаного впливу тотального зовнішнього гамма-випромінювання і стресу на морфофункціональний стан нейросекреторних клітин гіпоталамусу, аденогіпофізу та клітин сперматогенного епітелію. Доведено, що уведення спіруліни в раціон щурів після комбінованого впливу іонізуючого випромінювання і стресу стабілізує морфофункціональний стан клітин сперматогенного епітелію і покращує внутрішньоорганний кровообіг.

За результатами роботи запропоновано новий препарат природного походження – таблетки спіруліни, покриті оболонкою, як засіб корекції генеративної функції сім’яників в умовах комбінованого впливу тотального гамма-випромінювання та інших стрес-агентів нерадіаційної природи.

Ключові слова: тотальне гамма-випромінювання, іммобілізаційний стрес, комбінована дія, перекисне окиснення ліпідів, сім’яники, сперматогенез, препарат спіруліни.

Постригач Н.О. Влияние нелетальных доз ионизирующей радиации и спирулины на биохимические и ультраструктурные показатели состояния сперматозоидов и органов регуляции сперматогенеза крыс. Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01 радиобиология, Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко. – Киев. – 2002.

Диссертация посвящена исследованию особенностей корригирующего влияния спирулины на морфофункциональное состояние сперматозоидов и органов регуляции сперматогенеза после комбинированного воздействия тотального гамма-излучения и стресса. Проведен сравнительный анализ биоэффектов отдельного и комбинированного воздействия тотального гамма-излучения, иммобилизационного стресса и действия на этих моделях спирулины. Показано, что тотальное гамма-излучение, иммобилизационный стресс, а также их комбинация, приводят к усилению процесса липопероксидации в крови и тканях исследуемых органов, особенно в гипоталамусе, семенниках и печени, уменьшению резистентности мембран эритроцитов, повышению содержания кортикостерона и адреналина, активности ферментов аспартатаминотрансферазы и лужной фосфатазы, уменьшению концентрации тестостерона в крови. Применение спирулины приводит к нормализации содержания адреналина, кортикостерона и тестостерона, активности аспартатаминотрансферазы, снижению интенсивности ПОЛ, стабилизации белкового обмена в сыворотке крови исследуемых животных. Результаты электронномикроскопических исследований свидетельствуют о том, что внешнее ионизирующее облучение на 30 сутки вызывает деструкцию мембранных компонентов органелл и деструктивно-дистрофические изменения цитоплазмы клеток в тканях исследуемых органов. Электронномикроскопические данные свидетельствуют также об нарушении функции сперматогенеза на уровне сперматоцитов 2-го порядка, что препятствует полноценному созреванию сперматид. В новообразованных сперматидах просматривались четко выраженные дистрофические изменения в акросомальной области митохондрий, а также признаки снижения энергетического потенциала. Установлено, что при введении в пищевой рацион крыс спирулины улучшается регуляция сперматогенеза у облученных животных: повышается секреторная активность соматотропных и гонадотропных клеток аденогипофиза, улучшается состояние микроциркуляторного русла, активизируются процессы внутриклеточной репаративной регенерации во всех морфофункциональных звеньях репродуктивной системы крыс, что положительным образом влияет на процессы гипоталамо-гипофизарной регуляции сперматогенеза, увеличивает подвижность сперматозоидов, что способствует коррекции нарушений генеративной функции мужской половой системы. Применение спирулины существенно уменьшает негативное влияние облучения и его комбинированного воздействия на фоне иммобилизационного стресса. В частности, после применения тотального гамма-облучения в дозе 2 Гр доля подвижных сперматозоидов в сравнении с контролем достоверно увеличивается. По данным электронномикроскопических исследований семенников, спирулина оказывает выраженное протекторное влияние на морфофункциональное состояние семенников в условиях комбинированного воздействия облучения и стресса. По результатам работы предложен новый препарат спирулины – таблетки спирулины, покрытые оболочкой, как средство коррекции нарушений генеративной функции семенников в условиях длительного комбинированного воздействия ионизирующего гамма-излучения низких интенсивностей и других стресс-агентов нерадиационной природы.

Ключевые слова: тотальное гамма-излучение, иммобилизационный стресс, комбинированное воздействие, перекисное окисление липидов, семенники, сперматогенез, препарат спирулины.

Postrygach N.O. Influence of nonlethal doses of ionizing radiation and Spirulina on biochemical and ultrastructural parameters of a state of spermatozoons and organs of a regulation of a spermatogenesis of rats. - Manuscript.

The dissertation for seeking of the scientific degree of Candidate of biological sciences by the speciality 03.00.01 - radibiology. - National Taras Shevchenko University of Kyiv. – Kyiv. – 2002.

The dissertation is devoted to research of features modification influence of Spirulina on the morphofunctional state of spermatozoons and organs of a regulation of a spermatogenesis after combined influence of an external ionizing irradiation and stress. The comparative analysis of bioeffects of the separate and combined influence of the total -irradiation, of an immobizating stress and action on these models Spirulina is carried out. The application of Spirulina normalizes the contents of an epinephrine, concentration of the Corticosteronum; activity of an enzymes hepatobiliar systems, reduces intensity of POL, stabilizes protein metabolism in serum of blood of researched animals. On the data of submicroscopical researches of spermaries, Spirulina has expressed protective influence on the morphofunctional state of spermatozoons and organs of a regulation of the spermatogenesis under conditions of the prolonged combined influence of the total -irradiating and other stress-agent of a nonradiating nature offered. It is represented very important for a regulation of man’s sexual system, in particular to its generative function.

Key words: total gamma-irradiation, immobilizating stress, combined influence, POL, spermaries, spermatogenesis, drugs of Spirulina.