Міністерство охорони здоров'я України

Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика

Приходько Тетяна Володимирівна

УДК: 615.011.17:615.014.4:615.074

Хімічні перетворення та контроль якості лікарських препаратів

спеціального призначення під час тривалого зберігання

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Українській військово-медичній академії Міністерства оборони України.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор Трохимчук Віктор Васильович, Українська військово-медична академія, начальник кафедри військової фармації

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор Ветютнева Наталія Олександрівна, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, професор кафедри фармацевтичної хімії і фармакогнозії

кандидат фармацевтичних наук Герасимчук Таїса Володимирівна, Центральна лабораторія з аналізу якості лікарських засобів МОЗ України, завідуюча Центральної лабораторії з аналізу якості лікарських засобів

Провідна установа: Національна фармацевтична академія України Міністерства охорони здоров'я України, кафедра фармацевтичної хімії, м. Харків

Захист відбудеться “11” жовтня 2002 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.04 при Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П. Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П. Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9).

Автореферат розісланий “9” вересня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Пилипчук Л.Б.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Медичні наслідки бойових дій, стихійних лих, техногенних аварій та катастроф потребують надання медичної допомоги на високому рівні, досягнення якого можливе лише при наявності широкого асортименту ефективних лікарських препаратів різних фармакологічних груп. Характер основних патологічних станів зумовлює використання для потреб військово-медичної служби та медицини катастроф близько 600 найменувань лікарських засобів. Найбільш широко вживані та ефективні з їх числа, що застосовуються в особливий період, віднесені до препаратів спеціального призначення. Особливості зберігання цих препаратів в польових умовах та використання для надання медичної допомоги у вогнищах масових санітарних втрат визначають пріоритетність проблеми належної їх якості.

Державною політикою України в сфері забезпечення населення лікарськими засобами є створення комплексної системи управління якістю лікарських препаратів, що використовуються для лікування, діагностики та профілактики хвороб. Досягнення належного рівня якості лікарських засобів, враховуючи постійне розширення їх асортименту, варіабельність компонентного складу, запровадження нових технологій виробництва, потребує введення у фармацевтичну практику сучасних фізичних і фізико-хімічних методів дослідження стабільності лікарських і допоміжних речовин. У зв'язку з цим вивчення механізмів та кінетичних закономірностей деструкції, встановлення природи домішкових компонентів і продуктів розкладу в процесі зберігання та розробка нових і удосконалення вже існуючих методів аналізу, що дають можливість об'єктивно контролювати вміст лікарських речовин в присутності продуктів їх руйнування, набуває особливої актуальності.

Дисертаційна робота присвячена вивченню хімічних перетворень і кінетичних закономірностей процесів деструкції лікарських препаратів спеціального призначення, до складу яких входять антибіотики групи пеніциліну і цефалоспорину, похідні аміду кислоти сульфанілової, кислоти барбітурової, в процесі тривалого зберігання, встановленню природи домішкових компонентів і продуктів розкладу та розробці високочутливих, вибіркових методик аналізу досліджуваних лікарських засобів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом наукових досліджень Української військово-медичної академії Міністерства оборони України і є складовою частиною науково-дослідних тем “Нормування та контроль якості лікарських засобів та інших видів медичного майна для аптек медичних закладів на мирний час” (№ державної реєстрації 0197U011040), “Створення загальнодержавної номенклатури медичного майна вітчизняного виробництва для нормування, ешелонування та накопичення недоторканих запасів” (№ державної реєстрації 0197U011041), “Положення про роботу військових аптек” (№ державної реєстрації 0199U000786) та “Розробка методики створення оптимальної системи мобілізаційного резерву в інтересах Збройних Сил України, інших військових формувань, галузей господарства України з урахуванням можливостей національної економіки” (№ державної реєстрації 0100U004553).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є вивчення хімічних перетворень антибіотиків груп пеніциліну і цефалоспорину, похідних аміду кислоти сульфанілової та барбітурової кислоти в процесі тривалого зберігання під впливом зовнішніх факторів і розробка та валідація спектрофотометричних методів їх кількісного визначення.

Для досягнення поставленої мети необхідно вирішити наступні завдання:

·

· дослідити хімічні перетворення лікарських препаратів антибіотиків груп пеніциліну і цефалоспорину, похідних аміду кислоти сульфанілової та барбітурової кислоти в процесі тривалого зберігання;

· ідентифікувати домішкові компоненти та продукти деструкції досліджуваних препаратів;

· встановити кінетичні закономірності розкладу антибіотиків груп пеніциліну і цефалоспорину, похідних сульфаніламіду та барбітурової кислоти в процесі тривалого зберігання;

· встановити оптимальні умови кількісного визначення досліджуваних лікарських препаратів спеціального призначення з сульфофталеїновими барвниками;

· відпрацювати адекватні методи аналізу лікарських препаратів в процесі тривалого зберігання та здійснити їх валідацію.

Об'єкт дослідження - фармацевтичний аналіз лікарських препаратів спеціального призначення антибіотиків груп пеніциліну, цефалоспорину, похідних аміду кислоти сульфанілової та кислоти барбітурової.

Предмет дослідження – лікарські препарати спеціального призначення: антибіотики груп пеніциліну, цефалоспорину, похідні аміду кислоти сульфанілової та кислоти барбітурової.

Методи дослідження: фізичні та фізико-хімічні - ідентифікація продуктів розкладу і встановлення кінетичних закономірностей утворення продуктів деструкції лікарських речовин (ЯМР1Н–спектроскопія, хроматомас-спектрометрія, високоефективна рідинна хроматографія, тонкошарова хроматографія, спектрофотометрія в УФ та видимій областях спектру);

хімічні – встановлення кількісного вмісту лікарських речовин;

статистичні - обробка результатів експериментальних досліджень з використанням персонального комп'ютера ІВМ за програмою Microsoft Excel 7.0.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведені дослідження та встановлені кінетичні закономірності розкладу (порядок, константа швидкості реакції розкладу, час напіврозпаду, енергія активації) лікарських препаратів спеціального призначення (ампіциліну натрієвої солі, оксациліну натрієвої солі, цефотаксиму натрієвої солі, цефтриаксону натрієвої солі, сульфацил-натрію, етазол-натрію, етамінал-натрію і барбітал-натрію) в процесі тривалого зберігання.

Встановлені дві групи домішкових продуктів в препаратах барбітал-натрію і етамінал-натрію: перша група – побічні продукти синтезу, похідні барбітурової кислоти; друга група – техногенні домішки, зумовлені механічним контактом лікарських препаратів з гумовотехнічними виробами і полімерними матеріалами в процесі зберігання.

Вперше вивчені та встановлені оптимальні умови спектрофотометричного визначення у видимій області 8 лікарських речовин з класу солей слабких кислот з бромфеноловим синім і бромкрезоловим пурпуровим. В результаті виконаних досліджень запропоновані нові, високочутливі, прості у виконанні та валідовані способи кількісного визначення для 8 індивідуальних речовин і 10 найменувань лікарських форм.

Наукова новизна одержаних результатів підтверджується деклараційними патентами України на винахід № 38793 А та № 38814 А.

Практичне значення одержаних результатів. На основі встановлених кінетичних закономірностей розкладу підтверджено стабільність лікарських препаратів при тривалому зберіганні.

Результати проведених досліджень домішкових компонентів і продуктів розкладу натрієвих солей ампіциліну, оксациліну, цефотаксиму, цефтриаксону, сульфацил-натрію, етамінал-натрію і барбітал-натрію дозволили оптимізувати умови зберігання досліджуваних препаратів в польових умовах та методи контролю якості в присутності продуктів деструкції, що впроваджені в практику медичної служби Збройних Сил України (керівні документи “Положення про роботу військових аптек”, “Положення про роботу медичних складів”, “Положення про зберігання медичної техніки і майна у військових частинах та установах Міністерства оборони України” (акти впровадження від 22 березня 2002р.)).

Розроблені методики спектрофотометричного визначення у видимій області спектру 8 лікарських речовин спеціального призначення з класу солей слабких кислот як в індивідуальному вигляді, так і в лікарських формах з використанням бромфенолового синього та бромкрезолового пурпурового.

Основні результати дисертації впроваджені в навчальний процес Української військово-медичної академії (акти впровадження від 16 лютого 2001 р.), Національної фармацевтичної академії (акт впровадження від 2 березня 2001 р.) та Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації Національної фармацевтичної академії України (акт впровадження від 1 березня 2001 р.), а також у виробничий процес Фармацевтичного центру Головного військового клінічного госпіталю МО України (акти впровадження від 16 лютого 2001 р.). За результатами досліджень втілені 4 раціоналізаторські пропозиції (протоколи №57 та №58 від 20.10.2000, протоколи №73 і №74 від 16.02.2001).

Особистий внесок здобувача. У комплексному дослідженні хімічних перетворень лікарських препаратів в процесі тривалого зберігання та розробці нових способів кількісного визначення, над яким працював творчий колектив співавторів публікацій, особисто здобувачем проаналізована наукова література з досліджуваної проблеми, встановлені домішки, продукти деструкції та кінетичні закономірності розкладу препаратів, відпрацьовані методики кількісного визначення лікарських речовин в субстанціях та лікарських формах, проведено інтерпретацію та узагальнення одержаних результатів, формування основних положень та висновків, що виносяться на захист.

Особисто дисертантом проведено математико-статистичний аналіз результатів досліджень, написані всі розділи дисертації, сформульовані висновки.

Автором особисто підготовлена 1 стаття, а персональний внесок в опублікованих наукових працях із співавторами вказується за текстом дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дослідження доповідалися і обговорювалися на V-му національному з’їзді фармацевтів України (м. Харків, 1999), науково-практичних конференціях Української військово-медичної академії (м. Київ, 2000, 2001), науково-практичній конференції “Вчені України – вітчизняній фармації” (м. Харків, 2000), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми екстремальної і військової фармації” (м. Київ, 2000), науково-практичній конференції “Сучасні проблеми фармацевтичної науки і практики” (м. Харків, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 статей в наукових журналах та збірниках наукових праць, з яких 5 статей - у фахових наукових журналах та збірниках наукових праць, 2 тези доповідей і матеріалів наукових конференцій, 2 деклараційні патенти України.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, п'яти розділів, висновків, списку використаних літературних джерел та додатків, викладена на 133 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 46 рисунками (13 с.), 39 таблицями (15 с.) та містить 15 додатків (17 с.). Список використаних літературних джерел включає 146 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Розділ 1. Хімічні перетворення препаратів спеціального призначення в процесі зберігання та сучасний стан контролю їх якості. Нестабільність молекул пеніцилінів та цефалоспоринів обумовлена нестійкістю b-лактамного кільця, визначальна роль якого для прояву біологічної активності антибіотиків підтверджена чисельними дослідженнями. Першим продуктом деструкції пеніциліну у водних розчинах, внаслідок гідролітичного розщеплення b-лактамного циклу, є пеніцилоїнова кислота, яка в подальшому підлягає руйнуванню з утворенням пенілоїнової і пенальдинової кислот, пенілальдегіду та пеніциламіну. Характерною особливістю пеніцилінів є їх здатність до перегрупувань з утворенням ізомерних сполук, яким не притаманна антибактеріальна активність: пенілонової, пенілової, пеніциленової та ізопенілової кислот.

Для антибіотиків групи цефалоспорину на основі 7-аміноцефалоспоранової кислоти існує два реакційні центри, що зумовлюють їх нестабільність, а саме: карбамідний зв'язок в ?-лактамному циклі та складноефірний зв'язок у 3-метиленової групи дигідротіазинового циклу, руйнування яких і складає сутність інактивації. В нейтральних і лужних розчинах цефалоспорини на основі 7-аміноцефалоспоранової кислоти легко перетворюються в дезацетильні похідні – продукти гідролізу складноефірного зв'язку, які в розчинах кислот здатні утворювати лактони. Для антибіотиків групи цефалоспорину на основі 7-амінодезацетоксицефалоспоранової кислоти сутність інактивації полягає в гідролізі карбамідного зв'язку ?-лактамного циклу. Деструкція розчинів антибіотиків груп пеніциліну та цефалоспорину підпорядковується закономірностям кінетичної реакції першого порядку, а в присутності катіонів важких металів - другого порядку.

Основним напрямком розкладу похідних аміду кислоти сульфанілової в розчинах є гідролітичне руйнування амідного зв'язку, з утворенням сульфаніламіду, азобензол-4,4`-дисульфонаміду, азоксибензол-4,4`-дисульфонаміду та сульфанілової кислоти, при чому характер утворюваних продуктів в значній мірі залежить від величини рН розчину та проходить відповідно закономірностям кінетичної реакції першого порядку.

Похідні кислоти барбітурової, як циклічні аміди, є нестійкими сполуками. В лужних розчинах проходить розкриття піримідинового циклу з подальшим гідролізом, що спричиняє утворення уреїдів малонової кислоти.

Проведений аналіз літературних джерел свідчить, що питання стабільності антибіотиків груп пеніциліну і цефалоспорину, похідних сульфаніламіду та кислоти барбітурової досліджувались переважно з використанням модельних розчинів, які не відтворюють умови тривалого зберігання лікарських препаратів і не дозволяють встановити закономірності процесів деструкції під впливом зовнішніх факторів.

Контроль якості антибіотиків груп пеніциліну і цефалоспорину, похідних аміду кислоти сульфанілової та кислоти барбітурової здійснюють із застосуванням хімічних, фізичних, фізико-хімічних та біологічних методів. Але незважаючи на розмаїття відомих методик аналізу досліджуваних лікарських засобів, більшість з них ґрунтується на попередньому руйнуванні молекул фізіологічно активної речовини, а тому є непридатними для вивчення хімічних перетворень та контролю якості в процесі тривалого зберігання.

Розділ 2. Об'єкти і методи дослідження. Характер основних патологічних станів, з якими поранені надходять на етапи медичної евакуації для проведення лікувальних заходів, має вирішальне значення для формування номенклатури лікарських засобів для потреб військово-медичної служби і медицини катастроф. Аналіз номенклатури лікарських засобів свідчить, що препарати для лікування бойової травми і профілактики інфекційних захворювань складають приблизно 40% (представлені переважно ?-лактамними антибіотиками і похідними сульфаніламіду), а препарати для лікування судомних станів та розладів психіки 10% від загального асортименту.

Об'єктами дослідження хімічних перетворень лікарських препаратів в процесі тривалого зберігання та відпрацювання методик спектрофотометричного кількісного визначення були субстанції ампіциліну натрію (ВФС 42У-4-1582-00), оксациліну натрію (ФС 42-2884-92), цефтриаксону натрію (ВФС 42У-3-186-96), цефотаксиму натрію (ВФС 42У-62-94), сульфацил-натрію (ФС 42-2714-90), етазол-натрію (ДФ Х, ст. 32), барбітал-натрію (ФС 42-2230-84), етамінал-натрію (ДФ Х, ст. 28) і лікарські форми вітчизняного виробництва. Як об'єкти дослідження також були обрані бромфеноловий синій (ТУ 6-09-5421-88) і бромкрезоловий пурпуровий (ТУ 6-09-1386-90). В якості робочих стандартних зразків використовували субстанції лікарських речовин, для яких були встановлені якість і чистота шляхом порівняння з офіційними стандартними зразками, зазначеними в аналітичній нормативній документації відповідного виробника, надані Головним військовим представництвом (м. Київ).

Для виявлення домішкових компонентів в процесі зберігання застосовували метод тонкошарової хроматографії (ДФУ 2.2.27), використовуючи хроматографічні пластинки із закріпленим шаром марки Silufol UF254 (Чехія).

Дослідження вмісту лікарських речовин і домішкових продуктів здійснювали методом рідинної хроматографії (ДФУ 2.2.29) за допомогою високоефективного рідинного хроматографа Hewlett Packard та Waters 510 (США) з діодно-матричним детектором 996 PDA, детектування при 200 – 400 нм, температура хроматографічної колонки – 20 0С, швидкість потоку рухомої фази – 0,25 мл/хв, об'єм проби – 1 мкл. Хроматографування проводили ізократичним та градієнтним способами з використанням розчинників для хроматографії фірми Merck (Німеччина).

Спектри ЯМР1Н отримували на приладі Tesla BS 497 (100 МГц) при кімнатній температурі в умовах монорезонансу та з повною розв'язкою від протонів з використанням дейтерованих розчинників: диметилсульфоксиду (для антибіотиків групи цефалоспорину), лугу (для похідних сульфаніламіду), метанолу або суміші рівних частин метанолу і диметилсульфоксиду (для похідних барбітурової кислоти).

Хроматомас-спектрометричне дослідження зразків барбітал-натрію та етамінал-натрію проводили в режимі іонізації електронним ударом на приладі “Saturn-3” (іонна пастка) фірми “Varian”. Мас-спектри записувались в діапазоні 20-360 а.о.м. в наступних умовах: енергія іонізуючих електронів 70 еВ; температура джерела іонів 250 0С. Розділення компонентів проводилось за допомогою газового хроматографа фірми “Хьюлетт Паккард” (модель 5890) на капілярній колонці довжиною 25 м, діаметром 0,2 мм з нерухомою фазою SPB-5 (товщею шару 0,33 мкм). Режим роботи термостату: 100 0С – 20 0С/хв; 200 0С – 5 0С/хв. Температура інжектора – 300 0С, температура колонки – 320 0С; газ-носій – гелій зі швидкістю 1,5 мл/хв.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили за ДФ ХI, ч.1. з використанням персонального комп'ютера ІВМ за програмою Microsoft Excel 7.0

Розділ 3. Хімічні перетворення препаратів антибіотиків груп пеніциліну і цефалоспорину, похідних аміду кислоти сульфанілової, барбітурової кислоти в процесі тривалого зберігання. Вивчення хімічних перетворень досліджуваних нами лікарських препаратів проводили із застосуванням тонкошарової та високоефективної рідинної хроматографії. Детектування домішкових компонентів та лікарських речовин антибіотиків груп пеніциліну з використанням хроматографічних систем 1, 2, а також цефалоспорину з використанням хроматографічної системи 1 проводили обприскуванням хроматографічної пластинки 0,1% водним розчином нінгідрину з наступним нагріванням пластинки на протязі 5 хв. в сушильній шафі при температурі 100 0С. Детектування при використанні інших хроматографічних систем проводили ультрафіолетовим світлом з довжиною хвилі 254 нм. Детектування похідних сульфаніламіду здійснювали шляхом обробки хроматографічної пластинки розчином п-диметиламінобензальдегіду в концентрованій кислоті хлористоводневій. Детектування препаратів похідних кислоти барбітурової при використанні хроматографічної системи 1 здійснювали шляхом обприскування 0,01% розчином дифенілкарбазону в хлороформі з наступним обприскуванням 5% розчином сульфату ртуті (ІІ). При використанні хроматографічних систем 2,3 детектування здійснювали 1% водним розчином нітрату ртуті. Результати досліджень препаратів спеціального призначення із закінченим терміном придатності, проведених методом тонкошарової хроматографії з використанням описаних в літературі систем, представлені в табл.1.

Таблиця 1

Дослідження препаратів спеціального призначення методом тонкошарової хроматографії

Системи розчинників Величина Rf (, n = 3 )

робочого стандартного зразка досліджуваного препарату

лікарської речовини домішкових компонентів лікарської речовини домішкових компонентів

Ампіциліну натрієва сіль

1. бутанол – ацетон – метанол – кислота оцтова – вода (25:25:25:2:20) 0,70 0,88; 0,79; 0,54; 0,45 0,70 0,88; 0,79; 0,54; 0,45

2. ацетон – метанол – кислота оцтова (25:25:2) 0,49 0,94; 0,32 0,49 0,94; 0,83; 0,32

3. ізоамілацетат – метанол – кислота мурашина – вода (65:20:5:10) 0,10 0,48 0,10 0,48; 0,31; 0,16

4. н-бутанол – діетиловий ефір – ацетон – вода (14:4,5:4,5:5) 0,34 0,46; 0,25 0,34 0,46; 0,25; 0,17; 0,10

Оксациліну натрієва сіль

1. бутанол – ацетон – метанол – кислота оцтова – вода (25:25:25:2:20) 0,57 0,93; 0,67; 0,44 0,57 0,93; 0,67; 0,44; 0,22

2. ацетон – метанол – кислота оцтова (25:25:2) 0,23 0,12 0,23 0,12; 0,07

3. н-бутанол – діетиловий ефір – ацетон – вода (14:4,5:4,5:5) 0,47 0,58; 0,44 0,47 0,58; 0,44

Цефотаксиму натрієва сіль

1. ацетон – метанол – кислота оцтова (25:25:2) 0,64 0,44; 0,29 0,64 0,44; 0,29

2. етилацетат – ацетон – кислота оцтова – вода – метанол (5:2:1:1:1) 0,36 0,90; 0,10 0,36 0,90; 0,10; 0,08

Цефтриаксону натрієва сіль

1. ацетон – метанол – кислота оцтова (25:25:2) 0,58 0,90; 0,31; 0,27 0,58 0,90; 0,66; 0,31; 0,27

2. етилацетат – ацетон – кислота оцтова – вода – метанол (5:2:1:1:1) 0,27 0,16 0,27 0,16; 0,10

Сульфацил-натрій

1. хлороформ – метанол (80:15) 0,37 - 0,37 -

Продовження табл.1

Системи розчинників Величина Rf (, n = 3 )

розчину порівняння досліджуваного препарату

лікарської речовини домішкових компонентів лікарської речовини домішкових компонентів

2. хлороформ – кислота оцтова (90:10) 0,56 - 0,56 -

3. бензол – етанол – кислота оцтова (65:15:15 ) 0,22 - 0,22 -

Етазол-натрій

1. хлороформ – метанол (80:15) 0,25 - 0,25 -

2. хлороформ – кислота оцтова (90:10) 0,34 - 0,34 -

3. бензол – етанол – кислота оцтова (65:15:15 ) 0,17 - 0,17 -

Барбітал-натрій

1. хлороформ - н-бутанол - 25% розчин аміаку (70:40:5) 0, 73 - 0, 73 -

2. бензол - етанол (70:30) 0,58 - 0,58 -

3. хлороформ - н-бутанол (98:2) 0,12 - 0,12 -

Етамінал-натрій

1. хлороформ-н-бутанол-25% розчин аміаку (70:40:5) 0,95 - 0,95 -

2. бензол - етанол (70:30) 0,34 - 0,34 -

3. хлороформ - н-бутанол (98:2) 0,11 - 0,11 -

Аналіз результатів, наведених в табл.1, свідчить про наявність домішкових компонентів для натрієвих солей ампіциліну, оксациліну, цефотаксиму і цефтриаксону, при чому кількість виявлених домішок варіює в залежності від властивостей хроматографічної системи. Застосування методу тонкошарової хроматографії не дозволило виявити домішкові компоненти в препаратах сульфацил-натрій, етазол-натрій, барбітал-натрій та етамінал-натрій, що можливо пов'язано з вмістом їх у незначних кількостях.

З метою подальшого вивчення хімічних перетворень досліджуваних препаратів в процесі зберігання, нами застосовувався метод високоефективної рідинної хроматографії з використанням хроматографічної колонки Nova-Pak C18, розміром 150х2,1 мм. Дослідження натрієвих солей оксациліну, цефотаксиму і цефтриаксону, сульфацил-натрію і етазол-натрію проводили ізократичним способом із використанням рухомої фази: ацетонітрил - 0,1% розчин кислоти мурашиної (38:6) для оксациліну, ацетонітрил - 0,1М розчин ацетату амонію (25:75) для решти препаратів. Для вивчення ампіциліну натрієвої солі використовували градієнтний спосіб із застосуванням в якості рухомої фази суміші ацетонітрилу, співвідношення якого змінювалось від 34% до 58% за 5 хв та 0,1% розчину кислоти мурашиної, співвідношення якого змінювалось від 66% до 42%. Довжина хвилі детектування дорівнювала відповідно 205, 225 і 254 нм для натрієвих солей ампіциліну, оксациліну і решти препаратів.

Аналіз хроматограм препаратів антибіотиків груп пеніциліну та цефалоспорину свідчить, що досліджувані препарати містять від 3 до 12 домішкових продуктів, утворених в процесі синтезу субстанцій та зберігання препаратів в межах терміну спостереження. Кількість та склад домішкових компонентів досліджуваних препаратів в межах терміну спостереження змінюється (рис.1).

Рис. 1. Динаміка змін складу домішкових компонентів: а - цефотаксиму натрієвої солі; б – цефтриаксону натрієвої солі; в – оксациліну натрієвої солі

Розраховані коефіцієнти кореляції свідчать про високий ступінь зв'язку між кількостями лікарських речовин і домішкових компонентів (rxy = 0,71-0,99), а також між кількостями домішок в процесі тривалого зберігання, що свідчить про їх взаємоперетворення (rxy = 0,85-0,91). Проведення ідентифікації домішок хроматографічними методами ускладнюється відсутністю стандартів домішок, а тому потребує сумісного застосування декількох фізико-хімічних методів дослідження.

Препарати, похідні аміду кислоти сульфанілової, в процесі тривалого зберігання залишаються практично незмінними, про що свідчать результати проведеного аналізу методом високоефективної рідинної хроматографії.

В подальших дослідженнях нами вивчався вплив домішкових компонентів на аналітичні характеристики спектрів ЯМР1Н досліджуваних лікарських препаратів антибіотиків груп пеніциліну, похідних аміду кислоти сульфанілової та барбітурової кислоти, термін придатності яких скінчився. Спектральні характеристики препаратів мали значення хімічних зсувів, мультиплетності, інтегральної інтенсивності, притаманні для молекул відповідних речовин, що можливо пояснити малими кількостями індивідуальних домішок (від 0,1 до 1%). Спектри ЯМР1Н цефотаксиму натрієвої солі (І) з термінами зберігання 1, 2 і 3 роки разом з характерними сигналами протонів, містили синглет при ? 1,89 м.д., що притаманний для протонів метильного залишку в положенні 3 дигідротіазинового кільця і свідчить про наявність дезацетоксицефотаксиму (ІІ), утворення якого відбувається внаслідок проходження реакції дезацетилювання (схема 1).

Схема 1. Реакція дезацетилювання цефотаксиму натрієвої солі

Застосування методу тонкошарової хроматографії не дозволило виявити домішкові компоненти та продукти руйнування в препаратах барбітал-натрій та етамінал-натрій тому подальші дослідження похідних кислоти барбітурової, враховуючи складність їх хроматографічного дослідження, зумовлену значною полярністю та термічною нестійкістю, проводили методом хроматомас-спектрометрії. Виходячи зі схеми синтезу похідних кислоти барбітурової, можливо припустити, що домішкові компоненти будуть представлені вихідними компонентами синтезу, похідними кислоти барбітурової та продуктами їх руйнування. Враховуючи властивості перелічених речовин, застосовували екстракцію етилацетатом х.ч. (похідні кислоти барбітурової на відміну від натрієвих солей добре розчиняються в етилацетаті) з наступним концентруванням за допомогою вакууму. На рис. 2, 3 представлені типові хроматограми домішкових компонентів етамінал-натрію і барбітал-натрію, записані по повному іонному току, які свідчать, що лікарські препарати вміщують по п'ять домішкових компонентів.

Рис. 2. Типова хроматограма домішкових компонентів етамінал-натрію, записана по повному іонному току

Ідентифікацію досліджуваних домішкових компонентів здійснювали за отриманими мас-спектрами на основі відомих кореляційних залежностей для барбітуратів, “бібліотечного” пошуку та розрахунку індексів подібності за Біманом, отримані результати наведені в табл.2.

Таким чином, отримані результати дозволяють виділити дві групи домішкових сполук в препаратах барбітал-натрій та етамінал-натрій. Наявність першої групи - похідних барбітурової кислоти (5-етилбарбітурову кислоту, 1-етил-5-етил-5-(2' –аміл)-барбітурову кислоту) пояснюється особливостями проходження етилювання в процесі синтезу досліджуваних препаратів. Другу групу домішкових продуктів (етиловий ефір п-амінобензойної кислоти, бутилфталат, ді-(2-етилгексил)-фталат, ді-(2-етилгексиловий ефір)-адипінової кислоти), неможливо пояснити, виходячи з схеми синтезу похідних кислоти барбітурової.

Рис.3. Хроматограма продуктів деструкції та домішкових компонентів барбітал-натрію, записана по повному іонному току

Таблиця 2

Ідентифікація домішкових компонентів в препаратах етамінал-натрій і барбітал-натрій за даними мас-спектрометричного аналізу

Препарат Хімічна назва сполуки Бруто-формула Час утримання, хв Мас-спектр, m/z

Етамінал-натрій, барбітал-натрій Етиловий ефір п-амінобензойної кислоти С9NO2H11 7,42 165 – [M]+, 150, 137, 120, 108, 92, 65, 39

Барбітал-натрій 5-Етилбарбітурова кислота С6N2O3H8 8,72 156– [M]+, 141,126, 113, 98, 84, 70, 57, 40

Етамінал-натрій, барбітал-натрій Дибутилфталат C16O4H22 9,22 278 – [M]+, 223, 205, 149, 104, 76, 56, 41

Етамінал-натрій 1-Етил-5-етил-5-(2' –аміл)-барбітурова кислота C13O3N2H22 9,35 254 - [M]+, 185, 156, 140, 126, 113, 98, 84, 71, 57, 43

Етамінал-натрій, барбітал-натрій Ді – (2-етилгексиловий ефір)-адипінової кислоти C22O4H42 10,90 259, 241, 147, 129, 112, 101, 83, 70, 57, 43

Етамінал-натрій, барбітал-натрій Ді-(2-етилгексил)-фталат C24O4H38 11,61 279, 167, 149, 113, 104, 83, 70, 57, 43

За літературними відомостями означені продукти можливо віднести до технологічних домішок, наявність яких не пов'язана з синтезом цільового продукту, а спричинена механічним контактом лікарського препарату з гумовотехнічними та полімерними матеріалами в процесі зберігання.

Результати проведених досліджень свідчать, що при тривалому зберіганні в суворій відповідності до умов, регламентованих аналітичною нормативною документацією, на протязі термінів, встановлених керівними документами, у барбітал-натрію та етамінал-натрію не відбувається розриву піримідинового циклу з утворенням уреїдів малонової кислоти, що притаманно для розчинів аналізованих лікарських препаратів.

Розділ 4. Кінетичні закономірності розкладу препаратів антибіотиків груп пеніциліну і цефалоспорину, похідних аміду кислоти сульфанілової, кислоти барбітурової в процесі тривалого зберігання. Для вивчення кінетичних закономірностей розкладу препаратів в процесі тривалого зберігання нами вивчалась зміна концентрації лікарських речовин в залежності від часу зберігання методами високоефективної рідинної хроматографії для антибіотиків груп пеніциліну та цефалоспорину, нітритометрії для похідних сульфаніламіду, нейтралізації для натрієвих солей похідних кислоти барбітурової. Отримані експериментальні дані дозволили визначити порядок реакції розкладу натрієвих солей ампіциліну, оксациліну, цефтриаксону, цефотаксиму, сульфацил-натрію, етазол-натрію, барбітал-натрію, етамінал-натрію в процесі зберігання. Графіки залежності концентрації від часу зберігання за методом “прискореного старіння” в лінійних координатах представлені на рис. 4 і 5.

Рис.4. Кінетична крива розкладу цефотаксиму натрієвої солі: 1 - при 313 К; 2 - при 333 К

Лінійна залежність між концентрацією та часом свідчить, що процес деструкції препаратів антибіотиків груп пеніциліну та цефалоспорину в процесі тривалого зберігання проходить відповідно кінетичної реакції нульового порядку, на відміну від процесу деградації досліджуваних речовин в розчинах, який за літературними відомостями підпорядковується закономірностям реакцій першого та другого порядків. Лінійна залежність спостерігалась також між концентрацією і часом для препаратів похідних сульфаніламіду та кислоти барбітурової, що свідчить про підпорядкованість процесу деструкції досліджуваних препаратів в процесі тривалого зберігання кінетичній реакції нульового порядку.

Рис.5. Кінетична крива розкладу ампіциліну натрієвої солі: 1 - при 313 К; 2 - при 333 К

Розраховані константи швидкості реакцій розкладу лікарських препаратів при різних температурах, періоди напіврозкладу та рівень енергії активації наведені в табл. 3.

Таблиця 3

Значення константи швидкості реакції, періоду напіврозкладу та енергії активації для препаратів спеціального призначення (n=6, P=95%)

Лікарський препарат Константа швидкості реакції К (місяць-1) Період напіврозкладу t1/2 (102, місяць) Енергія активації Е (ккал/мол)

313 К 333 К 313 К 333 К

Ампіциліну натрієва сіль 0,1229± 0,016 0,3937± 0,046 4,06±0,52 1,27±0,16 12,04±0,43

Оксациліну натрієва сіль 0,0753± 0,006 0,2075± 0,015 6,54±0,56 2,37±0,17 10,49±0,39

Цефотаксиму натрієва сіль 0,1177± 0,017 0,3245± 0,056 4,29±0,62 1,56±0,10 10,42±0,48

Цефтриаксону натрієва сіль 0,1423± 0,021 0,4304± 0,118 3,57±0,48 1,19±0,13 11,44±0,41

Сульфацил-натрій 0,0023± 0,001 0,0156± 0,001 221,41±21,54 32,09±0,83 19,84±2,98

Етазол-натрій 0,0039± 0,001 0,0156± 0,002 129,22±49,74 32,07±3,91 14,36±1,34

Продовження табл.3

Лікарський препарат Константа швидкості реакції К (місяць-1) Період напіврозкладу t1/2 (102, місяць) Енергія активації Е (ккал/мол)

313 К 333 К 313 К 333 К

Барбітал-натрій 0,0034± 0,001 0,0203± 0,002 147,02±51,11 24,58±2,23 18,44±1,17

Етамінал-натрій 0,0041± 0,001 0,0173± 0,003 121,81±30,34 28,39±2,75 14,83±0,83

Розділ 5. Розробка спектрофотометричних методик кількісного визначення лікарських препаратів спеціального призначення на основі реакції з сульфофталеїновими барвниками та їх валідація. Для встановлення оптимальних умов спектрофотометричного визначення лікарських речовин з класу солей слабких кислот з бромфеноловим синім і бромкрезоловим пурпуровим, нами вивчався вплив на величину оптичної густини природи розчинника, величини рН розчину, надлишку реагенту, часу і послідовності додавання реактивів.

При виборі розчинників враховувалась їх спроможність розчиняти лікарські речовини, реагент, а також інтенсивність світлопоглинання. Виходячи з даних літератури, а також попередніх власних досліджень, нами в якості розчинників використовувались водно-ацетонові суміші та ізопропиловий спирт у різних співвідношеннях.

Результати досліджень оптимальних умов спектрофотометричного визначення наведені в табл.4.

Таблиця 4

Оптимальні умови спектрофотометричного визначення лікарських речовин з сульфофталеїновими барвниками (, n = 3 )

Лікарська речовина лмах, нм Вміст води в ацетоново-водній суміші, % Об'єм 0,1% розчину реагенту, мл Величина рН

Бромфеноловий синій

Ампіциліну натрієва сіль 598 8 0,5 4,0

Оксациліну натрієва сіль 598 10 0,5 4,0

Цефтриаксону натрієва сіль 598 7 0,2 4,0

Цефотаксиму натрієва сіль 598 2 0,2 4,0

Барбітал-натрій 600 4 2,0 4,0

Етамінал-натрій 600 4 2,0 4,0

Бромкрезоловий пурпуровий

Сульфацил-натрій 590 20 3,0 6,0

Етазол-натрій 590 20 3,0 6,0

Таким чином, оптимальним в якості розчинника для лікарських речовин і реагенту є використання ацетоново-водних сумішей, що вміщують від 2% до 20% води, розчинів реагенту з концентрацією 0,1%, об'єм розчину реагенту, який вводиться коливається в межах від 0,2 мл до 3,0 мл, величина рН середовища 4,0 – 6,0.

Межа виявлення лікарських речовин з бромфеноловим синім дорівнює 0,44 – 1,6 мкг/мл, а з бромкрезоловим пурпуровим - 0,87 – 1,73 мкг/мл. На підставі експериментально встановлених оптимальних умов спектрофотометричного визначення з сульфофталеїновими барвниками нами розроблені способи кількісного визначення ряду лікарських засобів антибіотиків груп пеніциліну, цефалоспорину, похідних сульфаніламіду, кислоти барбітурової.

Кількісне визначення проводили з використанням розчинів робочих стандартних зразків (РСЗ) - субстанцій досліджуваних лікарських речовин, які відповідають вимогам Державної фармакопеї та іншої аналітичної нормативної документації (АНД).

Можливість використання розроблених методик при дослідженні лікарських форм встановлювалась шляхом порівняльної оцінки відносно методик, що описані в АНД (таблетки етамінал-натрію ДФ Х, ст. 29; розчин етазол-натрію 10% для ін'єкцій, ФС 42-1761-82; барбітал-натрію ФС 42-2230-84; цефтриаксону натрієва сіль ВФС 42У-3-186-96). Метрологічна оцінка розроблених методик дозволяє рекомендувати їх для проведення експертизи лікарських засобів в умовах надзвичайного стану.

Проведена валідація розроблених аналітичних методик у відповідності зі статтею “Валідація аналітичних методик і випробувань” ДФУ, визначені специфічність, лінійність, діапазон застосування, правильність, точність та межі виявлення запропонованих методик.

ВИСНОВКИ

1. Вивчені та узагальнені проблеми стабільності, хімічних перетворень лікарських препаратів спеціального призначення антибіотиків груп пеніциліну, цефалоспорину, похідних аміду кислоти сульфанілової та кислоти барбітурової в процесі зберігання з метою забезпечення їх належної якості в екстремальних умовах для потреб військово-медичної служби та медицини катастроф.

2. Методами тонкошарової хроматографії та хроматомас-спектрометрії встановлено, що барбітал-натрій та етамінал-натрій містять дві групи домішкових продуктів: похідні барбітурової кислоти (5-етилбарбітурову кислоту, 1-етил-5-етил-5-(2'–аміл)-барбітурову кислоту) та технологічні домішки (етиловий ефір п-амінобензойної кислоти, бутилфталат, ді-(2-етилгексил)-фталат, ді-(2-етилгексиловий ефір)-адипінової кислоти), наявність яких не пов'язана з синтезом цільового продукту, а обумовлена механічним контактом лікарських препаратів з гумовотехнічними та полімерними матеріалами в процесі зберігання.

3. На підставі результатів хроматомас-спектрометричних досліджень встановлено, що при тривалому зберіганні етамінал-натію та барбітал-натрію у суворій відповідності з вимогами аналітичної нормативної документації не відбувається руйнування піримідинового циклу.

4. Для цефотаксиму натрієвої солі, що містить в основі 7-аміноцефалоспоранову кислоту, деструкція в процесі тривалого зберігання полягає в проходженні дезацетилювання в положенні 3 дигідротіазинового циклу з утворенням дезацетоксицефотаксиму.

5. Методами високоефективної рідинної хроматографії, нітритометрії та нейтралізації встановлено, що процес розкладу натрієвих солей ампіциліну, оксациліну, цефотаксиму, цефтриаксону, барбітал-натрію, етамінал-натрію, етазол-натрію, сульфацил-натрію в процесі тривалого зберігання проходить відповідно кінетичної реакції нульового порядку, визначені константи швидкості реакцій розкладу та час напіврозпаду. Енергії активації дорівнюють для натрієвих солей ампіциліну 12,04±0,43 ккал/мол, оксациліну 10,49±0,39 ккал/мол, цефотаксиму 10,42±0,48 ккал/мол, цефтриаксону 11,44±0,41 ккал/мол, етазол-натрію 14,36±1,34 ккал/мол, сульфацил-натрію 19,84±2,98 ккал/мол, барбітал-натрію 18,44±1,17 ккал/мол, етамінал-натрію 14,83±0,83 ккал/мол.

6. Розширені аспекти використання сульфофталеїнових барвників в аналітичній практиці для кількісного визначення лікарських препаратів спеціального призначення. Встановлені оптимальні умови фотометричного визначення лікарських речовин з бромфеноловим синім та бромкрезоловим пурпуровим: розчинник - ацетоново-водна суміш з вмістом води 2-20%, 0,1% розчин бромфенолового синього та бромкрезолового пурпурового в межах 0,2 до 3,0 мл, величина рН середовища 4,0 – 6,0, кімнатна температура.

7. Розроблені методики характеризуються високою чутливістю. Межа виявлення досліджуваних лікарських речовин з бромфеноловим синім знаходиться в межах 0,44-1,6мкг/мл, з бромкрезоловим пурпуровим - 0,87-1,66 мкг/мл.

8. Розроблено і проведено валідацію 8 методик кількісного визначення субстанцій лікарських речовин спеціального призначення з класу солей органічних кислот. Метрологічна оцінка розроблених методик дозволяє рекомендувати їх для проведення експертизи лікарських засобів в умовах надзвичайного стану. Розроблено методики кількісного визначення досліджуваних лікарських речовин антибіотиків груп пеніциліну, цефалоспорину, похідних аміду кислоти сульфанілової, кислоти барбітурової в їх лікарських формах.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кількісне визначення деяких барбітуратів за реакцією з бромфеноловим синім / С.Б. Бут, Л.М. Стрілець, Т.В. Кутуза, Т.В. Приходько // Фармац. журн.- 1994.- №4.- С.85-87. (Дисертант особисто приймав участь у проведенні дослідження, інтерпретації і статистичній обробці отриманих даних, написанні наукової статті).

2. Спектрофотометричне визначення барбіталу-натрію за реакцією з бромфеноловим синім / С.Б. Бут, Л.М. Стрілець, Т.В. Кутуза, Т.В. Приходько // Вісник фармації. – 1995.- №1-2.- С.38-39. (Дисертант особисто приймав участь у проведенні дослідження, статистичній обробці отриманих даних, написанні наукової статті).

3. Трохимчук В.В., Приходько Т.В. Сучасні методи кількісного визначення ?-лактамних антибіотиків і можливість їхнього використання для контролю якості лікарських засобів у процесі тривалого зберігання // Ліки України.- 2000.- №4(33). – С. 49-50. (Дисертант особисто приймав участь в узагальненні даних та написанні наукової статті).

4. Приходько Т.В., Трохимчук В.В., Гринчук І.Г. Сучасні уявлення про механізми деструкції ?-лактамних антибіотиків // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. – К.: КМАПО, 2001.-Вип.10. – С.1049 – 1054. (Дисертант особисто приймав участь в узагальненні даних та написанні наукової статті).

5. Раціональний вибір антибіотиків для створення формуляру лікарських засобів /В.В. Трохимчук, В.Г. Іванісенко, В.С. Гульпа, Т.В. Приходько //Вісник фармації. – 2001.- №3. – С.105. (Дисертант особисто приймав участь у проведенні дослідження, узагальненні та інтерпретації отриманих даних, написанні наукової статті).

6. Пат. 38793 А Україна, МКИ G 01 N 21/78. Спосіб визначення кількісного вмісту ампіциліну натрієвої солі в порошку для приготування ін'єкційного розчину: Пат. 38793 А України, МКИ G 01 N 21/78/ В.В. Трохимчук, Т.В. Приходько. - №2000105642; Заявл. 4.10.00; Опубл. 15.05.01, Бюл. №4. – 2с. (Дисертант особисто приймав участь у проведенні дослідження, статистичній обробці отриманих даних, підготовці матеріалів деклараційного патенту України).

7. Пат. 38814 А Україна, МКИ G 01 N 21/78. Спосіб визначення кількісного вмісту цефотаксиму натрієвої солі в порошку для приготування ін'єкційного розчину: Пат. 38814 А Україна, МКИ G 01 N 21/78/ В.В. Трохимчук, Т.В. Приходько. - №2000105939; Заявл. 20.10.00, Опубл. 15.05.01, Бюл. №4 – 3с. (Дисертант особисто приймав участь у проведенні дослідження, статистичній обробці отриманих даних, підготовці матеріалів деклараційного патенту України).

8. Трохимчук В.В., Приходько Т.В., Базунова Н.В. Сучасні методи стандартизації антибіотиків груп пеніциліну і цефалоспорину // Проблеми військової охорони здоров'я: Збірник наукових праць Української військово-медичної академії /За ред. В. Я. Білого. - К.: УВМА, 2000. - Вип.7. - С.250-254. (Дисертант особисто приймав участь в узагальненні даних та написанні наукової статті).

9. Приходько Т.В. Кількісне визначення етазолу натрію та сульфацилу натрію на основі реакції з бромкрезоловим пурпуровим // Проблеми військової охорони здоров'я: Збірник наукових праць Української військово-медичної академії /За ред. В. Я. Білого. - К.: УВМА, 2000. – Вип.6. - С.204-208.

10. Трохимчук В.В., Приходько Т.В. Контроль якості лікарських препаратів спеціального призначення похідних барбітурової кислоти в процесі тривалого зберігання // Тез. доп. V Нац. з'їзду фармацевтів України.- Х., 1999.- С.526. (Дисертант особисто приймав участь у проведенні дослідження, узагальненні та інтерпретації отриманих даних, написанні тез доповіді, виступав з доповіддю на конференції).

11. Трохимчук В.В., Приходько Т.В. Застосування ЯМР 1Н-спектроскопії для аналізу лікарських препаратів похідних барбітурової та тіобарбітурової кислот в процесі тривалого зберігання // Тез. доп. наук.-практ. конф. “Вчені України - вітчизняній фармації”.- Х., 2000.- С.206-208. (Дисертант особисто приймав участь у проведенні дослідження, узагальненні та інтерпретації отриманих даних, написанні тез доповіді).

Приходько Т.В. Хімічні перетворення та контроль якості лікарських препаратів спеціального призначення під час тривалого зберігання. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія. - Київська медична академія післядипломної освіти ім. П. Л. Шупика МОЗ України, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено вивченню кінетичних закономірностей процесів деструкції лікарських препаратів спеціального призначення: антибіотиків групи пеніциліну і цефалоспорину, похідних сульфаніламіду, кислоти барбітурової в процесі тривалого зберігання, встановленню природи домішкових компонентів і продуктів розкладу із застосуванням хроматографічних, мас-спектрометричних та спектроскопічних методів аналізу, розробці високочутливих, вибіркових спектрофотометричних методик аналізу 8 лікарських речовин з класу слабких кислот з сульфофталеїновими барвниками.

Ключові слова: лікарські препарати, хімічні перетворення, аналіз, спектроскопія, високоефективна рідинна хроматографія, мас-спектрометрія, тонкошарова хроматографія, спектрофотометрія, сульфофталеїни.

Приходько Т.В. Химические превращения и контроль качества лекарственных препаратов специального назначения в процессе