НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В.ПАЛЛАДІНА

ПЕТРОВА Юлія Іванівна

УДК 577.27:576.322

ПОЛІРЕАКТИВНІ АНТИТІЛА ЯК РЕГУЛЯТОРИ АДГЕЗИВНИХ ВЗАЄМОДІЙ КЛІТИН

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ –2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук

БОБРОВНИК Сергій Опанасович,

провідний науковий співробітник Інституту

біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник ЛІТОШЕНКО Олександр Якович,

керівник лабораторії молекулярної генетики

Інституту геронтології АМН України;

доктор медичних наук, професор ЧУМАК

Анатолій Андрійович, керівник лабораторії

молекулярної біології Інституту клінічної

радіології Наукового центру радіаційної медицини

АМН України.

Провідна установа: Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН

України, відділ імунології та цитотоксичних

сироваток, м. Київ.

Захист відбудеться “23” вересня 2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, 01601, Київ-30, вул.. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: Київ, вул.. Леонтовича, 9.

Автореферат дисертації розісланий “20“ серпня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В.Кірсенко.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ще на початку минулого століття у сироватці крові здорових, неімунізованих тварин і людини було виявлено антитіла, здатні з низькою афінністю розпізнавати власні антигени організму. Ці антитіла одержали назву природних антитіл. Пізніше було показано, що одна молекула таких антитіл розпізнає більше одного антигена, тому їх називають поліреактивними чи поліспецифічними. Ці антитіла є ауто- та ксено-реактивними, тобто здатними реагувати як з власними, так і з чужорідними антигенами. Кількість таких антитіл в організмі, так само як і їх клітин-продуцентів – CD5-позитивних В лімфоцитів, є досить значною. Однак, незважаючи на велику кількість робіт, що публікуються з приводу структури та функцій поліреактивних антитіл, роль таких антитіл і їх клітин-продуцентів у роботі імунної системи та організму в цілому залишається невідомою. Було висунуто декілька гіпотез з приводу функцій поліреактивних антитіл, однак жодна з них не стала загальноприйнятою, тож питання лишається відкритим.

Незважаючи на те, що роль поліреактивних антитіл в організмі і насьогодні невідома, комерційні препарати таких антитіл з 70-х років минулого сторіччя широко використовуються у клініці для лікування аутоімунних захворювань та, особливо ефективно, різного роду запалень. В той же час механізми терапевтичного ефекту цих препаратів окреслено в загальних рисах. Відомо, що такі препарати здатні модулювати функції В і Т лімфоцитів, моноцитів та ендотеліальних клітин, в тому числі впливаючи на експресію молекул адгезії на поверхні цих клітин. Ці дані дають підставу до більш детального вивчення впливу поліреактивних антитіл на адгезивні взаємодії. Насьогодні цей вплив досліджено дуже мало. Адгезія є одним із проявів ліганд-рецепторних взаємодій і забезпечує існування багатоклітинних організмів. Цей процес опосередковується адгезивними рецепторами поверхні клітин, з одного боку, та адгезивними молекулами позаклітинного матриксу або рецепторами сусідніх клітин, з іншого. Оскільки послідовна адгезія та де-адгезія – це фізичний механізм міграції клітин, випадало логічним дослідити вплив поліреактивних антитіл і на міграційну активність клітин.

Продуцентами поліреактивних антитіл в організмі є CD5-позитивні В лімфоцити. Рівень сироваткових поліреактивних антитіл та їх клітин-продуцентів зростає під час інфекційних патологій, аутоімунних хвороб, злоякісного процесу, тощо. Таке зростання дозволяє припустити участь поліреактивних антитіл у перебігу цих захворювань, можливо, саме через модуляцію адгезивних властивостей та міграційної поведінки клітин, оскільки адгезія та міграція клітин відіграють надзвичайно важливу роль у імунній відповіді, запаленні та метастазуванні пухлин. Окремо слід підкреслити, що рівень CD5-позитивних В лімфоцитів у хворих не корелює зі стадією хвороби, патологічної дії поліреактивних антитіл не виявлено. Встановлення впливу поліреактивних антитіл на адгезію та міграцію клітин є вагомим підтвердженням гіпотези Стратіса Аврамеаса про участь імунної системи в регуляції роботи інших систем організму саме через поліреактивні антитіла. Вивчення впливу таких антитіл на адгезивні взаємодії має не лише фундаментальне значення для клітинної біології та імунології, а й практичну цінність для розробки більш ефективних засобів регуляції перебігу запалення та лікування аутоімунних хвороб. Розуміння взаємозв'язків між міграційною здатністю клітини та метастазуванням пухлин є ключовим для прогнозування перебігу злоякісного процесу і дає можливість пошуку нових засобів запобігання розвитку метастазів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась з 1991 по 2000 р. в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України в рамках науково-дослідної теми №11 “Вивчення імунохімічної структури антигенів та розвитку імунної відповіді до них”, держ. реєстрація №0190.0062551, шифр програми 2.28.2.8.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи стало дослідження імунохімічних характеристик поліреактивних антитіл та їх впливу на адгезивні взаємодії клітин і з'ясування можливого механізму такого впливу.

Адгезивні взаємодії досліджували на прикладі адгезії клітин до білків позаклітинного матриксу та неспрямованої міграції клітин (хемокінезу). Як модельні було взято швидкомігруючі нормальні та злоякісні фібробласти людини. Низька афінність і здатність утворювати комплекси з власними антигенами організму, розчиненими у сироватці, значно ускладнюють виділення сироваткових поліреактивних антитіл, тож роботи з вивчення їх імунохімічних характеристик та механізмів їхньої взаємодії з клітинами були нами проведені in vitro, в основному з моноклональними поліреактивними антитілами.

На досягнення вказаної мети було поставлено наступні задачі:

1. Охарактеризувати моноклональні антитіла клону 2С3, показати їхню поліреактивність та зв'язування таких антитіл із живими клітинами. Дослідити вплив хаотропних іонів, рН та іонної сили середовища на зв'язування поліреактивних антитіл з антигенами;

2. Дослідити вплив поліреактивних антитіл на адгезивну взаємодію із субстратом нормальних і малігнізованих фібробластів людини. Визначити, на якій із стадій адгезивного процесу здійснюється вплив;

3. Визначити, чи впливають поліреактивні антитіла на міграційну активність нормальних і малігнізованих фібробластів людини. Виявити причину такої їхньої дії;

4. Через порівняння з дією ефекторів модулювання адгезії та міграції – антиінтегринових антитіл, тромбоцитарного фактору росту та активатору плазміногену урокіназного типу дослідити можливий механізм зміни поведінки фібробластів під дією поліреактивних антитіл;

Наукова новизна одержаних результатів. Показано, що антитіла клону 2С3 є поліреактивними, тобто здатними, хоч і з низькою афінністю, реагувати з антигенами різної природи, в тому числі, з антигенами живих клітин. Їх здатність зв'язуватися з антигенами значною мірою залежить від вмісту заряджених амінокислотних залишків у їхньому активному центрі. Можливо, їх поліреактивність зумовлюється гнучкістю поліпептидного ланцюга і здатністю “підстроювати” свій активний центр під структуру антигену.

Вперше показано, що моноклональні поліреактивні антитіла здатні модулювати адгезію нормальних фібробластів людини та злоякісних клітин. Цей вплив здійснюється, головним чином, на етапі формування адгезивних комплексів і призводить до дозозалежного пригнічення адгезивної взаємодії клітини із субстратом.

Вперше виявлено вплив поліреактивних антитіл на міграційну активність клітин різної природи. Показано, що ослаблення за присутності антитіл клону 2С3 адгезивної взаємодії клітин із субстратом призводить до вираженого зростання міграційної активності клітин.

Через порівняння з дією специфічних антиінтегринових антитіл, тромбоцитарного фактору росту та активатору плазміногену урокіназного типу показано, що ефекти поліреактивних антитіл клону 2С3 на адгезію та міграцію клітин реалізуються найімовірніше через створення стеричних перешкод агрегації та кластеризації інтегринів на етапі формування адгезивних комплексів.

Запропоновано оригінальну модифікацію фагокінетичного методу вивчення міграції клітин для 96-коміркового планшету.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати щодо впливу поліреактивних антитіл на адгезію та міграцію клітин проливають світло на механізми дії поліреативних антитіл з комерційних препаратів, що широко використовуються в клініці для лікування різного роду запалень та аутоімунних захворювань. Більш глибоке розуміння механізмів дії таких препаратів дасть змогу розробити нові, більш ефективні модифікації.

Розуміння взаємозв'язків між міграційною здатністю клітини та метастазуванням пухлин є ключовим для прогнозування перебігу злоякісного процесу та дає можливість пошуку нових засобів запобігання розвитку метастазів. Чітко доведений факт, що за однакового зниження сили адгезивної взаємодії, міграційна активність малігнізованих фібробластів зростає більше, ніж нормальних клітин, вказує на поліреактивні антитіла як додатковий фактор ризику при захворюванні на рак та на можливість розробки нових методів прогнозування перебігу цієї хвороби.

Розроблена модифікація фагокінетичного методу реєстрації міграції клітин дала змогу значно спростити методику та збільшити кількість зразків в одному досліді за одночасного зниження витрати реактивів. Оскільки фагокінетичний метод є єдиною альтернативою методу мікровідеозйомки у візуалізації руху клітин, така його модифікація є дуже корисною і може бути застосована для вивчення широкого кола питань клітинної біології.

Особистий внесок здобувача. Тема дисертації була запропонована здобувачем і підтримана науковим керівником і вченою радою Інституту. Всі описані в роботі експерименти з вивчення впливу поліреактивних антитіл на адгезивні взаємодії були заплановані та виконані особисто здобувачем. Гібридома клону 2С3, що продукує поліреактивні антитіла, була одержана старшим науковим співробітником відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ Скок М.В. Експерименти з вивчення впливу рН, іонної сили середовища та хаотропних іонів на реактивність антитіл були заплановані науковим керівником і виконані здобувачем. Експерименти з визначення фагоцитарної активності перитонеальних клітин методом проточної цитофлюориметрії були заплановані науковим керівником і виконані здобувачем разом з співробітником відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ Веремєєнко О.Ю.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені на IV Літній програмі Джона Хамфрі з імунології (Fourth John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, 14-18 вересня 1998 р., Пущіно, Росія) та на Третій науковій конференції з міжнародною участю "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (23-25 травня 1999 р., Санкт-Петербург, Росія). Результати окремих етапів роботи доповідались і обговорювались на засіданнях відділу молекулярної імунології та науковому семінарі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Публікації. За результатами роботи опубліковано 5 статей у фахових наукових виданнях та 2 тези доповідей у збірках міжнародних конференцій.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури (1 розділ, 3 підрозділи), експериментальної частини (2 розділи, 11 підрозділів), висновків та списку літературних джерел (209 найменувань). Робота викладена на 135 сторінках друкованого тексту та містить 35 малюнків і 2 таблиці.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури представлені наукові дослідження відносно вивчення структури активного центру поліреактивних антитіл, їх функцій в організмі та ролі таких антитіл у деяких патологічних процесах. Детально висвітлені дані щодо молекулярних основ адгезивних взаємодій клітин з позаклітинним матриксом та описані механізми регуляції таких взаємодій.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Моноклональні антитіла вилучали із супернатанту гібридоми 2С3 на афінній колонці з імобілізованим на сефарозі 4В білком G стафілококу. Чистоту білкового препарату визначали за допомогою SDS-електрофорезу у 7% поліакриламідному гелі з трис-трисиновою буферною системою. Присутність домішок у очищеному препараті антитіл визначали за допомогою ізоелектрофокусування у градієнті рН в 1% агарозному гелі. Зв'язані антитіла виявляли за допомогою антимишачого пероксидаза-антипероксидазного (ПАП) комплексу.

Реакцію антиген-антитіло досліджували за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу. Визначення констант афінності антитіл проводили за допомогою методу Б.Фриге з використанням конкурентного імуноферментного аналізу. Фагоцитарну активність перитонеальних клітин оцінювали за допомогою проточного цитофлюориметра EPICS C.

До роботи було взято нормальні фібробласти шкіри людини та слідуючі лінії клітин людини: фібросаркома НТ1080, меланома Бовіса, аденокарцинома MDA231, карцинома MDA468 та лінія ембріональних фібробластів миші 3Т6. Клітини культивували у вологому СО2-інкубаторі за 5% (об/об) СО2 при 37оС, культуральне середовище RPMI 1640 з додаванням 5% ембріональної сироватки крові великої рогатої худоби. Первинну культуру нормальних фібробластів одержували в результаті міграції клітин із шматочків шкіри людини. Імуноцитохімічне забарвлення клітин, зафіксованих на скляних слайдах виконували з використанням комплексу лужна фосфатаза-антилужна фосфатаза. Швидкість проліферації визначали за темпами приросту кількості клітин через п'ять діб культивування. Кількість живих клітин оцінювали за допомогою методу включення диметилтіазол-дифенілтетразолію броміду (МТТ).

Адгезію клітин оцінювали як кількість клітин, що закріпилися у комірках планшету після спроби механічного відриву клітин. Як субстрат використовували колаген І типу, фібронектин та фібриноген. Планшети інкубували при 370С та 5% СО2. Через певні проміжки часу залишок суспензії клітин видаляли, комірки промивали і визначали кількість клітин, яким вдалося закріпитися, методом включення МТТ.

Міграційну здатність клітин визначали за допомогою фагокінетичного методу. В основу методу покладено здатність живих клітин поглинати частки колоїдного золота, прикріпленого до субстрату і, таким чином, залишати видимий “слід”. Колоїдне золото готували, відновлюючи HAuCl4 цитратом натрію. Як білки субстрату використовували колаген І типу та фібронектин. У комірки культурального планшету з нашарованим на білки колоїдним золотом вносили суспензію з щільністю 3х103 клітин у мл та розчин дослідної речовини. Планшет інкубували при 37оС та 5% СО2. Міграційні треки клітин фотографували через 6, 12, 16 та 18 год інкубації. Міграційний індекс визначали як відсоток сумарної площі треків від площі фіксованого простору (фотографії), поділений на число клітин. Площу міграційних треків клітин обчислювали за допомогою програмного пакету ArcView 3.1.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Характеристика моноклональних поліреактивних антитіл клону 2С3

Як модельні було використано моноклональні поліреактивні антитіла клону 2С3, одержані ст. наук. співр. відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України М.В.Скок. Клон 2С3 було отримано при клонуванні гібридоми проти нікотинового ацетилхолінового рецептору. Його було двічі реклоновано шляхом лімітуючих розведень.

Характеристика чистоти одержаного препарату антитіл клону 2С3.

Афінно очищені антитіла під час електрофорезу в ПААГ мігрували у гелі однією зоною, що відповідала молекулярній масі 150 кДа, тобто масі молекули IgG. За допомогою методу імуноблотингу з використанням антитіл до IgG мишей доведено, що одержаний препарат є цілою, нативною молекулою IgG мишей. Наявність у препараті антитіл інших клонів було перевірено методом ізоелектрофокусування. Показано, що імуноглобуліни препарату мігрують у агарозному гелі з градієнтом рН однією зоною з ізоточкою між значеннями рН 7 і 9, тобто препарат не має домішок імуноглобулінів інших клонів.

Імунологічна реактивність антитіл клону 2С3.

Здатність антитіл клону 2С3 реагувати з більш, ніж двома антигенами було визначено за допомогою методу імуноферментного аналізу. На Рис.1 наведено криві титрування зв'язування отриманих нами антитіл з рядом структурно неспоріднених антигенів різної природи.

[Aт], mг/мл [Aт], mг/мл [Aт], mг/мл

[Aт], mг/мл [Aт], mг/мл [Aт], mг/мл

Рис.1. Визначене за допомогою ІФА зв'язування поліреактивних антитіл клону 2С3 з: А – D-фрагментом фібриногену (), фібриногеном (·), фібронектином () та антитромбіном ІІІ (С); Б – овальбуміном (С), лізоцимом (·), сироватковим альбуміном людини (), сироватковим альбуміном бика (), ліпопротеїном А () та колагеном І типу (о); В – плазміногеном (), урокіназою (о), a2-антиплазміном (·) та активатором плазміногену тканинного типу (); Г – гістонами (), РНК (С), ДНК (·); Д – тіроглобуліном (о), інсуліном (·); Е – КАМ (о), холерним токсином (·), ППД () та батроксобіном (С).

Зв'язування поліреактивних антитіл з цілими бактеріальними клітинами було показано непрямим методом, а саме як зростання фагоцитарної активності перитонеальних клітин внаслідок опсонізації бактерій антитілами.

Константи дисоціації комплексу антиген-антитіло, визначені для деяких білків за методом Фриге, уклалися у діапазон від 1.5*10-5 для лізоциму до 7.2*10-7 для гістонів. Отже, антитіла клону 2С3 виявляють порівняно низьку афінність зв'язування різних антигенів. Це загалом укладається у визначення поліреактивних антитіл як досить низькоафінних.

Вплив хаотропних іонів, іонної сили та рН середовища на імунологічну реактивність антитіл клону 2С3.

Вивчення залежності реактивності антитіл клону 2С3 від іонної сили та рН середовища було проведено за допомогою імуноферментного аналізу з метою визначення внеску електростатичних (кулонівських) сил у взаємодію цих антитіл з антигенами та перевірки можливої наявності заряджених амінокислот у активному центрі.

Показано, що за високих концентрацій NaCl у середовищі взаємодія антитіл клону 2С3 з овальбуміном і лізоцимом була різко пригніченою (Рис.2), в той час як за таких концентрацій NaCl реактивність моноспецифічних антитіл з відповідними антигенами майже не змінювалася. Низькі значення рН на рівні 3-3.5 пригнічували реактивність як поліреактивних, так і моноспецифічних антитіл. Зміна рН розчину від 4 до 8 мала різний вплив на реактивність антитіл клону 2С3 з трьома різними антигенами, причому кореляції між максимальним впливом рН і значенням ізоелектричної точки досліджених антигенів не зафіксовано (Рис.3). На відміну від поліреактивних, чотири з п'яти досліджених моноспецифічних антитіл майже не реагували на зміни рН розчину від 4 до 8. Загалом можна зробити висновок, що електростатичні взаємодії та наявність заряджених залишків мають критичне значення для зв'язування поліреактивних антитіл з антигенами.

[NaCl], M [NaCl], M

Рис.2. Вплив іонної сили розчину на зв'язування поліреактивних антитіл клону 2С3 з овальбуміном (о), плазміногеном (·), лізоцимом () (А) та моноклональних антитіл до фібронектину (*), активатору плазміногену тканинного типу (С), сироваткового альбуміну людини (), a2-антиплазміну (о), плазміногену (·) з відповідними антигенами (Б).

Рис.3. рН-залежності зв'язування поліреактивних антитіл клону 2С3 з плазміногеном (·), овальбуміном (), лізоцимом (D) (А) та моноклональних антитіл до сироваткового альбуміну людини (С), фібронектину (*), a2-антиплазміну (о), плазміногену (·), активатору плазміногену тканинного типу () з відповідними антигенами (Б).

Конформаційну стабільність молекул антитіл клону 2С3 оцінювали як їх здатність після обробки хаотропними іонами зв'язувати антиген. Виявилось, що реактивність антитіл клону 2С3 після обробки KSCN значно змінювалася, тобто їх конформація досить нестабільна (Рис.4). Це дозволяє припустити, що можливим механізмом їх поліреактивності є здатність “підлаштовувати” свою конформацію під структуру антигену, явище, відоме під назвою “наведена відповідність”.

[Ат], мкг/мл [Ат], мкг/мл

Рис.4. Зв'язування поліреактивних антитіл клону 2С3 з плазміногеном (А) та овальбуміном (Б) без обробки KSCN (о) та після такої обробки (·).

Конформаційні зміни під впливом хаотропних іонів відбувались і в молекулах моноспецифічних антитіл. Виявилося, що з шести перевірених моноклональних антитіл лише одне після обробки KSCN зберегло свою специфічність, інші більшою чи меншою мірою набули здатності розпізнавати крім “власного” інші антигени, тобто ці антитіла стали поліреактивними. Схожа картина “трансформації” у поліреактивні антитіла виявлялася і після обробки роданідом калію сумарних сироваткових імуноглобулінів.

Зв'язування антитіл клону 2С3 з клітинами.

Перше, ніж розпочати дослідження впливу поліреактивних антитіл на поведінку живих клітин, необхідно було довести сам факт зв'язування антитіл клону 2С3 з антигенами клітин. За допомогою імуноцитохімічного фарбування показано здатність наших антитіл дозозалежно зв'язуватися з антигенами як нормальних, так і злоякісних фібробластів людини. Моноклональні антитіла клітин лінії MOPS-21, використані як контроль, за таких умов позитивного забарвлення не давали.

Отже, наведені фізико-хімічні та імунологічні характеристики антитіл клону 2С3 дають змогу однозначно віднести їх до поліреактивних, тобто здатних до зв'язування з більше ніж двома антигенами. Так само, як і інші поліреактивні антитіла, описані у літературі, вони є низькоафінними, їхня реактивність значною мірою залежить від іонної сили та рН середовища, що свідчить про важливість заряджених амінокислотних залишків для зв'язування ними антигенів. Можливо, їх поліреактивність зумовлюється гнучкістю поліпептидного ланцюга і здатністю “підлаштовувати” свій активний центр під структуру антигену.

Здатність антитіл клону 2С3 до зв'язування з антигенами клітин дозволяє зробити припущення щодо їхньої здатності модулювати такі аспекти поведінки клітин, як адгезія та міграція.

ВПЛИВ АНТИТІЛ КЛОНУ 2С3 НА АДГЕЗІЮ КЛІТИН

Адгезію клітин до різних субстратів вивчали у динаміці розвитку процесу з використанням планшетів з бактеріологічного пластику, аби виключити неспецифічне прилипання клітин. Умови експерименту оптимізували за такими параметрами: кількість клітин на комірку; концентрація сорбованих адгезивних білків; час закріплення клітин. Відповідно, для подальшої роботи було обрано кількість 5*104 клітин на комірку, робочими було обрано концентрації фібронектину, колагену І типу та фібриногену відповідно 10, 500 та 30 мкг/мл, як найменші з концентрацій, що дозволяють закріпитись максимальному числу клітин, число закріплених клітин визначали через 30 хв інкубації для нормальних фібробластів і 45 хв – для злоякісних клітин.

Вплив антитіл клону 2С3 на початкові етапи адгезії клітин – закріплення та розпластування.

Закріплення є початковим етапом адгезії, який проходить протягом перших 5-10 хв після контакту клітини із субстратом. Виявилось, що антитіла клону 2С3 не впливають на процес закріплення клітин (Рис.5).

При закріпленні клітини відбувається взаємодія поодиноких інтегринових рецепторів, які на цей час розподілені по всій поверхні клітини, з поодинокими адгезивними молекулами субстрату. На цьому етапі сила адгезивної взаємодії визначається афінністю зв'язку інтегрин-ліганд та кількістю таких зв'язків на клітину. За умови, що поліреактивні антитіла клону 2С3 не впливали на закріплення клітин, можна припустити, що ці антитіла не перешкоджають безпосередній взаємодії інтегринових рецепторів з молекулами екстрацелюлярного матриксу (ЕЦМ) та не впливають на афінність зв'язку інтегрин-ліганд і на експресію інтегринів на поверхні клітин.

Розпластування є наступним етапом адгезії, який характеризується зміною форми клітини з округлої на пласку з метою збільшення площі взаємодії із субстратом. Наявність у культуральному середовищі антитіл клону 2С3 не впливала на розпластування фібробластів на фібронектині. Визначальною і для цього етапу адгезії є взаємодія одиночних інтегринів з одиночними молекулами субстрату, а сила адгезії клітини зростає, в основному, за рахунок збільшення площі контакту із субстратом. Оскільки антитіла клону 2С3 не впливали на розпластування клітин, можна припустити, що вони не перешкоджали безпосередній взаємодії інтегринів з субстратом, що узгоджується з попереднім висновком.

Кінетика адгезії клітин за присутності антитіл клону 2С3.

При дослідженні кінетики адгезії клітин виявилось, що на пізніших етапах антитіла клону 2С3 пригнічували адгезію як нормальних, так і злоякісних фібробластів, досягаючи максимального ефекту через 30 хв після посадки клітин (Рис.6). Водночас, антитіла до a5b1 інтегрину пригнічували адгезію клітин значно сильніше.

час, хв час, хв

Рис.6. Кінетика адгезії нормальних фібробластів людини (А) та клітин лінії НТ1080 (Б) за відсутності додаткових чинників () та в присутності 7 мкг/мл поліреактивних антитіл клону 2С3 (·) або антитіл до a5b1 інтегрину (о) за тієї ж концентрації.

За присутності у культуральному середовищі антитіл клону 2С3 сила адгезії клітин дозозалежно знижувалась, що було показано для чотирьох типів клітин через 2 год. після посадки на трьох різних субстратах (Табл.1). Інгібування сили адгезії сягало максимально 30-40% від контролю для всіх типів клітин. Якщо взяти кількість клітин, які закріпилися у контрольних комірках за 100%, то, за концентрації антитіл клону 2С3 7 мкг/мл, адгезувало 65-80% клітин.

Таблиця 1. Вплив поліреактивних антитіл клону 2С3 та антитіл до a5b1 інтегрину на адгезію нормальних людських фібробластів, клітин фібросаркоми людини лінії НТ1080, меланоми Бовіса та злоякісних фібробластів миші лінії 3Т6 (процент від контрольної адгезії) (n = 3, M ± m), нд – не досліджували.

Клітини + антитіла (Ат) [Ат], мкг/мл Колаген I типу Фібронектин Фібриноген

Фібробласти + поліреактивні Ат 7 3,5 1 72 ± 4.9 88 ± 2.8 97 ± 1.2 65 ± 4.6 82 ± 2.2 99 ± 0.8 78 ± 3.1 91 ± 5.1 96 ± 3.6

Фібробласти + Ат до a5b1 інтегрину 17,5 7 3,5 1,8 0,9 0 25 ± 2.7 50 ± 3.4 81 ± 9.1 92 ± 2.2 0 17 ± 3.3 37 ± 7.1 71 ± 5.2 93 ± 4.4 20 ±3.7 48 ± 8.2 68 ± 4.6 100 ± 1.1 99 ± 3.5

НТ 1080 + поліреактивні Ат 7 3,5 1 63 ± 5.2 81 ± 3.5 97 ± 2.0 61 ± 5.3 75 ± 2.7 96 ± 4.1 нд

НТ 1080 + Ат до a5b1 інтегрину 17,5 7 3,5 0 17 ± 4.9 43 ± 3.2 0 13 ± 7.3 33 ± 4.1 нд

Меланома Бовіса + поліреактивні Ат 7 3,5 1 72 ± 4.5 90 ± 7.3 98 ± 2.1 нд нд

ЗТ6 + поліреактивні Ат 7 3,5 61 ± 6.2 78 ± 2.0 нд нд

Специфічні антитіла до a5b1 інтегрину за тієї ж концентрації послаблювали адгезію значно більше – закріплювалося від 15 до 25% клітин порівняно з контролем (Табл.1). За концентрації анти-a5b1 антитіл 17.5 мкг/мл і більше інгібування сягало 100%.

При вивченні кінетики адгезії було показано ослаблення сили адгезії клітин за присутності антитіл клону 2С3 на пізніших етапах адгезії, коли вирішальною стає не сила одиночної взаємодії інтегрина з лігандом, а ступінь агрегованості інтегринів. Імовірною причиною такого ослаблення може бути створення поліреактивними антитілами стеричних перешкод до агрегації інтегринів.

Вплив тромбоцитарного фактору росту на адгезію клітин. Порівняння з дією поліреактивних антитіл.

До складу адгезивного комплексу окрім агрегованих інтегринів входять рецептори цитокінів і факторів росту. Аби з'ясувати, чи не реалізується вплив поліреактивних антитіл клону 2С3 на адгезію клітин через рецептори ростових факторів, нами було досліджено модулювання адгезії тромбоцитарним фактором росту (ТФР). За модельних умов нашого експерименту адгезія фібробластів до фібронектину та колагену І типу за присутності 10 нг/мл ТФР посилювалася (Рис.7). Дія антитіл клону 2С3 на адгезію клітин не збігається з такою для факторів росту.

Вплив активатору плазміногену урокіназного типу на адгезію клітин. Порівняння з дією поліреактивних антитіл.

Для визначення дії урокінази на адгезію та міграцію клітин у наших експериментах використовували профермент, тобто одноланцюгову форму урокінази, яка не виявляє ензиматичної активності, у концентрації 50 нг/мл.

час, хв

Рис.7 Рис.8

Рис.7. Адгезія нормальних фібробластів людини до фібронектину та колагену І типу за відсутності додаткових чинників () та за присутності 10 нг/мл ТФР ().

Рис.8. Адгезія до колагену І типу клітин лінії НТ1080 за відсутності додаткових чинників () та за присутності 7 мкг/мл поліреактивних антитіл клону 2С3 (), 50 нг/мл урокінази () і обох чинників одночасно ().

Виявилося, що урокіназа, так само як і поліреактивні антитіла, ослаблювала адгезію клітин до субстрату, причому за внесення у культуральне середовище поліреактивних антитіл клону 2С3, тобто одночасної дії обох регуляторів, ослаблення адгезії було більшим (Рис.8), що свідчить скоріше за незалежні механізми реалізації впливу.

Вплив антитіл клону 2С3 на проліферативну активність фібробластів.

Факти залежності мітотичного циклу клітин від наявності адгезивних сигналів є загальновідомими. Відповідно, визначення проліферативної активності клітин за присутності регуляторів сили адгезії може надати додаткову інформацію щодо механізмів їхнього впливу. Антитіла клону 2С3 змінювали проліферативну активність нормальних фібробластів людини, знижуючи її на 10% (n = 3, р = 0.01). Час подвоєння популяції клітин у контролі був 43.4 год, а за присутності антитіл клону 2С3 збільшувався до 47.3 год. На порівняння, присутність 10 нг/мл ТФР призводила до зростання проліферативної активності клітин на 47%, час подвоєння популяції – 36.1 год.

Однією з умов активації мітотичних сигнальних шляхів є агрегація інтегринів. Ослаблення мітотичної активності нормальних фібробластів людини за присутності поліреактивних антитіл клону 2С3 може бути спричинене перешкодами у агрегації інтегринів.

Таким чином, нами зафіксовано ослаблення сили адгезії фібробластів до субстрату під впливом поліреактивних антитіл клону 2С3. Така регуляторна дія антитіл не обумовлена зв'язком з рецептором тромбоцитарного фактору росту чи з урокіназним рецептором. Показано також, що поліреактивні антитіла не впливали на початкове закріплення та розпластування клітин, коли вирішальне значення має взаємодія одиночних інтегринів з одиночними молекулами субстрату. При вивченні кінетики адгезії нами було показано ослаблення сили адгезії клітин за присутності антитіл клону 2С3 на пізніших етапах адгезії, коли вирішальною стає не сила одиночної взаємодії інтегрина з лігандом, а ступінь агрегованості інтегринів. Імовірною причиною такого ослаблення може бути створення поліреактивними антитілами стеричних перешкод до агрегації інтегринів.

ВПЛИВ АНТИТІЛ КЛОНУ 2С3 НА МІГРАЦІЮ КЛІТИН

Швидкість міграції клітин визначається силою адгезивної взаємодії з субстратом, опосередкованої інтегринами, та зовнішніми сигналами від ЕЦМ, цитокінів і факторів росту. Оскільки поліреактивні антитіла є досить ефективними регуляторами адгезії, випадало логічним дослідити іхній вплив на міграційну активність клітин. Для того було взято як нормальні, так і злоякісні фібробласти людини – клітини сполучної тканини.

Міграцію вивчали за допомогою фагокінетичного методу Альбрехта-Бехлера, адаптованого нами до 96-коміркового планшету. Така адаптація дала змогу значно спростити методику та збільшити кількість зразків в одному досліді за одночасного зниження витрати реактивів. Умови експерименту було оптимізовано за трьома параметрами: розмір часток колоїдного золота, кількість клітин на комірку та концентрація сорбованих адгезивних білків. Виявилося, що оптимальними є діаметр часток колоїдного золота у 410 ?, а кількість клітин - 3*102 на комірку. Для успішної міграції клітин існує оптимальний діапазон концентрації адгезивних білків (Рис.9). Форма кривої залежності швидкості міграції від концентрації лігандів у субстраті пояснюється необхідністю проміжної сили адгезії клітини до субстрату для забезпечення її максимальної швидкості.

[фібронектин], мкг/мл [колаген], мкг/мл

Рис.9. Залежність міграції нормальних фібробластів людини (о) та клітин лінії НТ1080 (·) від концентрації адгезивних білків. Час міграції – 16 год.

Вплив антитіл клону 2С3 на міграційну активність клітин.

Поліреактивні антитіла клону 2С3 стимулювали міграцію як нормальних, так і злоякісних фібробластів. Стимуляцію було показано для двох різних субстратів – фібронектину та колагену І типу. Контрольні IgG мишей за тих же концентрацій не справляли ніякого впливу на міграцію клітин, тоді як міграційна активність нормальних фібробластів за присутності 7 мкг/мл антитіл клону 2С3 зростала на 30% порівняно з контролем (Рис.10), а злоякісних фібробластів лінії НТ1080 вдвічі (Рис.11).

Рис.10 Рис.11

Рис.10. Міграція фібробластів людини за відсутності додаткових чинників (А) та в присутності 7 мкг/мл Ат клону 2С3 (Б). Час міграції – 16 год.

Рис.11. Міграція клітин лінії НТ1080 за відсутності додаткових чинників (А) та в присутності поліреактивних антитіл клону 2С3 (Б). Час міграції – 16 год.

Вплив антитіл до a5b1 інтегрину на міграцію клітин. Порівняння з дією поліреактивних антитіл.

Оскільки міграцію клітин опосередковано інтегринами, то для з'ясування механізму впливу поліреактивних антитіл на міграцію клітин ми порівняли їхню дію з дією специфічних анти-інтегринових антитіл. Як показано вище (Табл.1), антиінтегринові антитіла повністю блокували розпізнавання інтегрином відповідного ліганду субстрату, пригнічуючи тим самим адгезію клітин. Така їхня дія дозозалежно пригнічувала і міграцію нормальних фібробластів на фібронектині, причому за концентрації антитіл 7 мкг/мл пригнічення сягало майже 80%, а за 17.5 мкг/мл вони повністю інгібували рух (Рис.12).

Отже, поліреактивні та моноспецифічні антиінтегринові антитіла діяли протилежним чином на міграцію клітин. Такі їхні ефекти можуть пояснюватися різною модуляцією сили адгезивної взаємодії інтегринів з субстратом. Як було показано раніше, специфічні антитіла блокували розпізнавання інтегриновим рецептором ліганду, а поліреактивні ослабляли адгезію в основному на стадії агрегації та кластеризації інтегринів, тобто на етапі формування адгезивних комплексів (Табл.1). Саме зменшення сили адгезивної взаємодії через зменшення розмірів адгезивних комплексів і могло бути причиною зростання міграційної активності клітин.

Вплив тромбоцитарного фактору росту на міграцію клітин. Порівняння з дією поліреактивних антитіл.

Градієнт концентрації ТФР у середовищі є ефективним стимулятором хемотаксису фібробластів. Але, як виявилося, постійна концентрація фактору в середовищі, на відміну від поліреактивних антитіл клону 2С3, не лише не стимулює ненаправлену рухливість, тобто хемокінезис, клітини, а й пригнічує його (Рис.13). Отже, з різниці ефектів антитіл клону 2С3 та ТФР у міграції клітин можна зробити висновок, що поліреактивні антитіла не взаємодіють з рецептором цього фактору росту.

Рис.12 Рис.13 Рис.14

Рис.12. Міграція нормальних фібробластів людини за відсутності додаткових чинників (А) та в присутності 7 мкг/мл (Б) та 17.5 мкг/мл (В) антитіл до a5b1 інтегрину. Час міграції – 16 год.

Рис.13 Міграція фібробластів людини за відсутності додаткових чинників (А) та в присутності 10 нг/мл ТФР (Б). Час міграції – 16 год.

Рис.14 Міграція клітин НТ1080 за відсутності додаткових чинників (А) і в присутності 7 мкг/мл поліреактивних антитіл клону 2С3 (Б), 50 нг/мл урокінази (В) та обох вищезазначених чинників одночасно (Г). Час міграції – 6 год.

Вплив активатору плазміногену урокіназного типу на міграцію клітин. Порівняння з дією поліреактивних антитіл.

За умов нашого експерименту одноланцюгова, протеолітично неактивна, урокіназа, внесена до комірок культуральних планшетів у концентрації 50 нг/мл, діяла на рух клітин приблизно так само, як антитіла клону 2С3, внесені до культурального середовища концентрацією 7 мкг/мл (Рис.14). Аби з'ясувати, чи не діють урокіназа та поліреактивні антитіла клону 2С3 через один рецептор, нами було проведено дослідження їхньої одночасної дії. Як виявилося, посилення міграційної активності клітин було ще більшим за спільної інкубації, аніж за дії кожного з агентів окремо (Рис.14 Г). Таке посилення ефекту є свідченням на користь різних місць зв'язування на поверхні клітини для урокінази та антитіл клону 2С3.

Таким чином, зростання швидкості міграції клітини за присутності поліреактивних антитіл найімовірніше пояснюється зниженням сили адгезивної взаємодії через зменшення розмірів адгезивних комплексів. Досліджений нами вплив антитіл клону 2С3 на адгезію та міграцію клітин виявляв порівняно незначне ослаблення адгезії з досить великим зростанням міграційної активності фібробластів. Одержані дані узгоджуються з теорією DiMilla еt al, згідно з якою для досягнення максимальної швидкості міграції потрібна проміжна сила адгезії клітини до матриксу – за малої сили клітина нездатна розвинути достатню тягу, за великої – відірватися від субстрату. Отже, посилення міграції та ослаблення адгезії нормальних і злоякісних фібробластів людини під дією поліреактивних антитіл клону 2С3 найімовірніше обумовлено перешкодами кластеризації інтегринів і зменшенням таким чином розміру фокальних адгезій.

ВИСНОВКИ

1. Антитіла клону 2С3 є поліреактивними, тобто здатними, хоч і з низькою афінністю, реагувати з антигенами різної природи, в тому числі з антигенами живих клітин. Їх здатність зв'язуватися з антигенами значною мірою залежить від вмісту заряджених амінокислотних залишків у їхньому активному центрі. Можливо, їх поліреактивність зумовлюється гнучкістю поліпептидного ланцюга і здатністю “підлаштовувати” свій активний центр під структуру антигену.

2. Поліреактивні антитіла клону 2С3 здатні модулювати адгезію нормальних фібробластів людини та злоякісних клітин. Цей вплив здійснюється, головним чином, на етапі формування адгезивних комплексів і призводить до зниження сили адгезивної взаємодії клітини із субстратом.

3. Часткове пригнічення антитілами клону 2С3 адгезивної взаємодії клітин із субстратом призводить до вираженого зростання міграційної активності клітин.

4. Через порівняння з дією специфічних антиінтегринових антитіл, тромбоцитарного фактору росту та активатору плазміногену урокіназного типу показано, що ефекти поліреактивних антитіл клону 2С3 на адгезію та міграцію клітин реалізуються, найімовірніше, через створення стеричних перешкод агрегації та кластеризації інтегринів на етапі формування адгезивних комплексів.

Список опублікованих праць за темою дисертації.

1. Бобровник С.А., Веремеенко Е.Ю., Петрова Ю.И., Комисаренко С.В. Оценка фагоцитарной активности перитонеальних клеток с помощью проточной цитофлюориметрии // Доповіді НАН України. – 1995. – № 11. – С. 139-142.

2. Бобровник С.А., Петрова Ю.И., Ефетов К.А. Трансформация сывороточных иммуноглобулинов в полиреактивные антитела // Укр биохим журн. – 1997. – Т. 69, №3. – С. 36-42.

3. Петрова Ю.И. Влияние полиреактивных антител на адгезию и миграцию клеток in vitro. // Медицинская иммунология. – 1999. – Т.1, № 3-4. – С. 22.

4. Петрова Ю.І., Скок М.В. Регуляція адгезії фібробластів поліреактивними антитілами // Укр біохім журн. – 2002. – Т. 74, №1. – С. 44-51.

5. Петрова Ю.І., Скок М.В., Комісаренко С.В. Регуляція міграції фібробластів поліреактивними антитілами // Доповіді НАН України. – 2002. – №9. – С. 152-155.

6. Bobrovnik S.A., Petrova Yu.I., Veremeenko E.Yu. Opsonizing properties of polyreactive immunoglobulins // The 9th International Congress of Immunology, – San Francisco, California, USA, 23-29 July, 1995, P. 283, N. 3137.

7. Petrova J.I., Skok M.V. The influence of polyreactive immunoglobulins on cell adhesion and migration in vitro // Fourth John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, - Puschino, Russia, 14-18 September, 1998, P. 61.

Петрова Ю.І. Поліреактивні антитіла як регулятори адгезивних взаємодій клітин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2002.

Показана поліреактивна природа моноклональних антитіл клону 2С3 та можливість зв'язування цими антитілами антигенів нормальних фібробластів людини і злоякісних клітин. Показано, що поліреактивні антитіла здатні модулювати адгезію клітин. Цей вплив здійснюється, головним чином, на етапі формування адгезивних комплексів і призводить до зниження сили адгезивної взаємодії