ХАРКIВСЬКИЙ НАЦIОНАЛЬНИЙ УНIВЕРСИТЕТ

iм. В.Н. КАРАЗIНА

Рудько Наталiя Петрiвна

УДК 612.354.2.085:577.152.1:613.863+612.67

РЕДУКТАЗНА АКТИВНІСТЬ МIКРОСОМ ПЕЧIНКИ ПРИ СТРЕСI У ДОРОСЛИХ ТА СТАРИХ ЩУРIВ

03.00.04 – бiохiмiя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертацiї на здобуття наукового ступеня

кандидата бiологiчних наук

Харкiв - 2002

Дисертацiєю є рукопис.

Робота виконана на кафедрi бiохiмiї Запорiзького державного медичного унiверситету МОЗ України

Науковий керiвник : доктор медичних наук, професор

Давидов Вадим В’ячеславович,

Інститут охорони здоров’я дітей та підлітків АМН України,

завідувач лабораторії вікової ендокринології та обміну речовин

Офiцiйнi опоненти: доктор біологічних наук, професор

Каліман Павло Авксентійович,

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна,

завідувач кафедри біохімії;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Колодуб Фелікс Аркадійович,

Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України, завідувач відділом медичної хімії.

Провiдна установа: Інститут геронтології АМН України

(лабораторія регуляції метаболізму), м. Київ

Захист вiдбудеться “ 6_ “_листопада_ 2002 року о 1515_ на засiданнi спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харкiвського нацiонального унiверситету iм. В.Н. Каразiна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харкiв, пл. Свободи, 4, ауд. III-15

З дисертацiєю можна ознайомитись у Центральнiй науковiй бiблiотецi Харкiвського нацiонального унiверситету ім. В.Н. Каразiна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харкiв, пл. Свободи, 4.

Автореферат дисертацiї розiсланий “30вересня_2002 р.

Вчений секретар

спецiалiзованої вченої ради,

кандидат бiологiчних наук Падалко В.I.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть теми. Численнi данi експериментальних та клiнiчних дослiджень свiдчать про те, що при старiннi вiдбувається зниження стiйкостi органiзму до пошкоджуючої дiї стресу [Чеботарев Д.В., Коркушко О.В., 1977; Меерсон Ф.З., 1981; Фролькис В.В., 1988; Lakkata E.G. , 1980; Pacifici R.E., Pavies K.I.A, 1991; Ando M. et al, 1997, Konstandi M. et al, 2000]. Серед iнших причин важливе значення в цьому набувають вiковi зсуви з боку функцiї печiнки [Косицкий Г.И. и др., 1987; Гичев Ю.П., 1990].

До теперiшнього часу в лiтературi накопичена велика кiлькiсть даних про змiни метаболiзму ксенобiотикiв в органiзмi при старiннi [Лемешко В.В., 1983; Парамонова Г.И., 1994; Schmucker D.L. et al, 1990; Hayashi T., Miyazawa T., 1998; Le Couteur D.G., McLean A.J., 1998; Sukhodub A.L., Padalko V.I., 1999; Haouzi D. et al, 2000; Palomero J. et al, 2001]. Зменшення швидкості катаболізму ксенобіотиків є частковим виявом вiкового зниження антитоксичної функцiї печiнки. Беручи до уваги те, що при стресi вiдбувається стимуляцiя процесiв катаболiзму [Селье Г., 1960], що супроводжується посиленням розпаду макромолекул та накопиченням ендогенних токсинiв в органiзмi [Меерсон Ф.З., 1984], це набуває суттєвого значення у вiковому зниженнi резистентностi органiзму до стресу.

Бiльшiсть дослiдникiв повязують змiни метаболiзму ксенобiотикiв при старiннi з порушенням процесiв мiкросомального окислення в печiнцi i в т.ч. реакцiй гiдроксилювання, спряжених з окислювально-вiдновлювальними перетвореннями цитохрома Р450 [Birnbaum L.S., Baird M.B., 1978; Plewka A. et al, 1994; Sotaniemi E.A. et al, 1997, Huynh H.t., Teel R.W., 1998; Oesterheld J.R., 1998; Plewka A., Kaminski M., 1998; Kanamura S., Watanabe J., 2000]. Особливу увагу при цьому придiляють зменшенню каталiтичної активностi цього цитохрому. Значно менше уваги дослiдникiв привертає вивчення стану редуктаз мiкросом, незважаючи на те, що цi ферменти є безпосереднiми учасниками мiкросомального окислення в якостi компонентiв оксигеназного електрон-транспортного ланцюга [Арчаков А.И., 1974, 1975, 1983; Карякин А.В., Арчаков А.И., 1985].

В літературі зустрічаються небагаточисленні відомості про характер метаболічної відповіді печінки на стрес [Парамонова Г.И., 1994; Парамонова Г.И. и др., 1996; Swain M.G., 2000]. Існують дані про порушення антитоксичної функції печінки [Деев Л.И. и др., 1986] та зміну в ній стану метаболізму ксенобіотиків при стресі [Konstanidi M. et al., 2000, 2001]. Причина виникнення подібного зсуву пов’язується з обумовленою стресом модуляцією активності переносників мікросомальних електрон-транспортних ланцюгів або зміною їх вмісту в мікросомах. Підтвердженням того служать відомості про зміну активності цитохрому Р450 та швидкості його біосинтезу в печінці при стресі [Деев Л.И. и др., 1986; Парамонова Г.И., 1994; Парамонова Г.И. и др., 1996; Чекман И.С. и др., 1996; Ando M. et al., 1997; Konstanidi M. et al, 2000, 2001]. Аналіз сучасних літературних даних дозволяє допускати важливу роль стресорної стимуляції симпатоадреналової системи [Парамонова Г.И. и др., 1996; Iber H. et al., 2001; Gervasini G. et al, 2001] та підсилення вільно-радикальних процесів [Парамонова Г.И.,1994; Парамонова Г.И. и др., 1996; Kovacs P. et al, 1996; Ando M. et al, 1997; Faff J., Frankiewich-Jozko A., 1997] в гепатоцитах у формуванні зсувів з боку мікросомального окислення.

До теперішнього часу не існує чітких уявлень про вікові особливості функціонування мікросомальних редуктаз при стресі. Разом з тим детальне вивчення цього питання відкриває перспективи у пізнанні молекулярних механізмів вікового зниження резистентності до стресу та розробці нових підходів до фармакологічної корекції стійкості організму до стресу при старінні.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках науково-дослідницької роботи кафедри біологічної хімії Запорізького державного медичного університету "Вивчення мелекулярних механізмів зниження резистентності до дії стресорних факторів при старінні" (N держреєстрації 0196 U 00 22-56).

Мета i задачi дослiдження. Метою роботи було встановлення вікових особливостей зміни редуктазної активності мікросом печінки під час імобілізаційного стресу та розробка нових підходів до її корекції.

Для реалiзацiї поставленої мети передбачалося вирiшити такi задачi:

1. Встановити особливості функціонування мікросомальних редуктаз на основі оцінки їх активності в реакціях відновлення різних акцепторів електронів (2,6-дихлорфенолiндофенол, нітротетразолієвий синій, феррицианід калію, цитохром с) в печінці у дорослих та старих щурів при імобілізаційному стресі.

2. Вивчити особливості регуляції НАД(Ф)Н:2,6-дихлорфенолiндофенол-редуктаз мікросом печінки дорослих та старих щурів при стресі деякими мембранотропними речовинами.

3. Охарактеризувати стан субстратного забезпечення мікросомальних редуктаз при стресі у дорослих та старих щурів шляхом визначення концентрації окислених та вiдновлених пiридiнових коферментiв в печiнцi.

4. Оцiнити можливiсть використання нових похiдних 1,2,4-триазолін-5-тіоацетату для корекцiї вiкових порушень з боку мiкросомальних редуктаз печінки при стресі.

Об’єкт дослідження. Антитоксична функція печінки, мікросомальне окислення.

Предмет дослідження. Редуктазна активність мікросом печінки у дорослих та старих щурів при імобілізаційному стресі.

Методи дослідження. Спектрофотометрія (визначення активності маркерних ферментів; редуктазної активності мікросом; вмiсту цитохромiв b5 та Р450, білку; концентрації піридінових коферментів; рiвня дiєнових конъюгатiв та шиффових основ, карбонiлiруваних бiлкiв; активностi глюкозо-6-фосфат дегiдрогенази та малатдегiдрогенази декарбоксилюючої); спектрофлюорометрія (визначення вмісту 11-оксикортикостероїдів, адреналіну та норадреналіну); препаративне ультрацентрифугування (фракціонування гомогенату печінки); іонообмінна хроматографія (розділення катехоламінів).

Наукова новизна одержаних результатiв. В роботі вперше встановлена вікова специфіка зміни редуктазної активності мікросом печінки при імобілізаційному стресі. Показано, що імобілізація дорослих щурів не супроводжується зміною НАДФН-залежної редуктазної активності в печінці. Вона приводить тільки до слабо вираженого зниження НАДН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазної активності мікросом. Разом з тим, у дорослих щурів при стресі відбувається зниження концентрації НАДФН та зростає доля відновленого НАД у загальному пулі піридінових коферментів у печінці. Виникаючі зсуви в субстратному забезпеченні мікросомального окислення сприяють підсиленню частки окислювально-відновлювальних перетворень, пов’язаних з НАДН-залежною редуктазою, в умовах обмеження функціонування НАДФН-залежної редуктази. Подібні зміни з боку мікросомального окислення забезпечують можливість підтримання ефективного перебігу процесів гідроксилювання в печінці у дорослих щурів під час їх імобілізації. В умовах підвищеної продукції ендогенних токсинів та цитотоксичних метаболітів (аліфатичні альдегіди та інш.) в організмі при стресі, це може набувати адаптивного значення.

Виявлено, що при старінні відбувається часткове інгібірування редуктаз мікросом в реакціях з акцепторами, які відновлюються повільно (2,6-дихлорфенолiндофенол та нітротетразолієвий синій), та зменшення сили регуляторної дії на них вивчених мембранотропних речовин (додецилсульфату натрія, перекису водню, сечовини). Імобілізація старих щурів супроводжується обмеженням НАДН- та НАДФН-залежних редуктазних активностей в присутності тих акцепторів електронів, які швидко ними відновлюються (феррицианід калію, цитохром с), та збільшенням відношення НАДН- і НАДФН-залежних редуктазних активностей на користь НАДН-залежної. Виникаючі зсуви з боку редуктазної активності у старих щурів при стресі доповнюються зменшенням відновленості пулу НАДФ та зниженням вмісту відновленого НАД в печінці у порівнянні з його рівнем у дорослих імобілізованих тварин. У подібній ситуації обмежується можливість компенсаторного підсилення окислювально-відновлювальних перетворень, пов’язаних з НАДН-залежною редуктазою, в умовах порушення процесу окислення НАДФН мікросомами. Формування подібних зсувів з боку мікросомального окислення у старих щурів може призводити до зменшення у них антитоксичної функції печінки при стресі.

Практичне значення одержаних результатів. В роботі вперше запропоновано новий засіб корекції вікових змін з боку редуктазної активності мікросом печінки при стресі, суть якого заключається у застосуванні нових синтетичних препаратів, які мають виражену гепатотропну дію і є похідними 1,2,4-триазолін-5-тіоацетату. Встановлено нові аспекти механізму фармакологічної дії цих препаратів на редуктази мікросом. Показано, що ефект румосолу на активність мікросомальних редуктаз при стресі має характер терапевтичної дії. Він забезпечує підсилення процесів мікросомального окислення в печінці і, тим самим, стимулює її антитоксичну функцію. В умовах стресорної стимуляції катаболічних процесів румосол сприяє підвищенню резистентності організму до пошкоджуючої дії стресу, що особливо актуально при старінні.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційної роботи, встановлення мети, вибір об’єкту та методів дослідження проведено спільно з науковим керівником. Авторка самостійно провела аналіз наукової літератури за даною проблемою. Усi результати, що приведенi в рукописi, отриманi пошукачем самостiйно. Дисертантом особисто проведенi експерименти та визначення показникiв, що обранi для дослiджень. Інтерпретація отриманих даних проведена спільно з науковим керівником.

Апробацiя результатiв дисертацiї. Матерiали дисертацiї доповiдалися та обговорювалися на ювiлейнiй пiдсумковiй науковiй конференцiї студентiв та аспiрантiв Донецького державного медичного унiверситету (Донецьк, 2000); мiжнародному конгресi молодих вчених (Тернопiль, 2000); науково-практичнiй конференцiї “Вченi України - вiтчизнянiй фармацiї“ (Харкiв, 2000); III Нацiональному конгресi геронтологiв та герiатрiв України (Київ, 2000), науково-практичнiй конференцiї “Региональные проблемы охраны здоровья населения центрального черноземья” (Бєлгород, 2000), науково-технiчнiй конференцiї “Экология и здоровье человека. Охрана водного и воздушного бассейнов” (Щелкiно, 2000); ювiлейнiй науковiй конференцiї “Научное наследие академика И.Н.Буланкина и его развитие в современной биологии” (Харкiв, 2001); конференцiї молодих вчених в iнститутi геронтологiї, присв’яченiй пам’ятi В.В.Фролькiса (Київ, 2001).

Публiкацiї. За матерiалами дисертацiї опублiковано 11 наукових робiт, серед яких 6 статей та 5 тез доповiдей.

Структура та обсяг дисертацiї. Дисертацiя викладена на 165 сторiнках машинописного тексту та складається iз вступу, огляду лiтератури, опису матерiалiв i методiв дослiдження, трьох роздiлiв результатiв дослiджень та їх обговорення, заключення, висновкiв, списку лiтератури, що мiстить 274 джерела i розташований на 31 сторiнці. Дисертацiя iлюстрована 14 таблицями та 40 рисунками.

ОБЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕННЯ

Постановка експерименту. В роботi використовували 172 щурi самцi лiнiї Вiстар, якi були отриманi з iнституту геронтологiї АМН України (м.Київ). Усi тварини роздiлялися на двi вiковi групи: дорослi - 10-12 мiсяцiв (маса 150-280 г) та старi - 22-25 мiсяцiв (маса 250-390 г). Кожна група, в свою чергу, роздiлялася на чотири пiдгрупи: 1 - iнтактнi (n=42); 2 - щурi, що пiдлягали iмобiлiзацiйному стресу, (n=84); 3 та 4 - тварини, яким за 30 хвилин до iмобiлiзацiї внутрiшньочеревинно уводили розчини: румосолу (3-(4-пiриділ)-1,2,4-триазолiн-5-тiоацетат морфолiнiя) (n=23) та 3-(4-пiриділ)-1,2,4-триазолiн-5-тiоацетату калiя, (n=23), в дозi 50 мг на 1 кг маси.

Iмобiлiзацiйний стрес моделювали шляхом привязування тварин за кiнцiвки спиною до нерухомої опори (дошки). Час iмобiлiзацiї - 30 хвилин. Ефективнiсть відтворення стресу контролювали за появою патоморфологiчних змін у надниркових залозах, серці та слизовій оболонці шлунку, а також шляхом визначення концентрацiї адреналiну та 11-оксикортикостероїдiв у кровi.

Тварин декапiтували. Наважку печiнки гомогенiзували в 3 обємах 1,15 % розчину КСl. Мікросоми виділяли за методом I.I.Карузiної та О.I.Арчакова [1977]. В роботi використовували препаративно-аналiтичну ультрацентрифугу МОМ-3180 (Угорщина). Чистоту одержаної мiкросомальної фракцiї печiнки визначали за активнiстю маркерних ферментiв: сукцинатдегідрогенази [Кривченкова Р.С., 1977] та глюкозо-6-фосфатази [Асатиани В.С., 1966].

В якості джерела ферментних препаратів використовували суспензію мiкросом печiнки. НАД(Ф)Н:2,6-дихлорфенолiндофенол, НАДН:цитохром с та НАД(Ф)Н:К3[Fe(CN)6] редуктазні активності вимiрювали за методом G.Dallner [1963], а НАДН:нiтротетразолiєвий синiй редуктазну активність - за методом D.L.Roering et al. [1972]. Вміст цитохромів b5 та Р450 в мікросомах визначали за методом T.Omura, R.Sato [Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977].

З метою вивчення особливостей субстратного забезпечення редуктаз мiкросом проводили визначення вмiсту окислених та вiдновлених форм пiридiнових коферментiв в печiнцi. Для цього печiнку заморожували в рiдкому азотi. Наважки замороженої тканини використовували для екстракцiї окислених та вiдновлених форм пiридiнових коферментiв.

Экстракцiю НАД+ та НАДФ+ проводили за допомогою охолодженої 0,4 н. хлорної кислоти [Мильман Л.С. и соавт., 1974], а для видiлення НАДН та НАДФН - використовували сумiш, яка мiстить 0,3 М К2СО3 в 25% этанолi з доданням 0,7 % цистеїну [Мильман Л.С. и соавт., 1974]. Приготованi екстракти нейтралiзували та використовували для кiлькiсного ензимологiчного визначення вмiсту окисленого [Klingenberg M., 1962] та вiдновленого НАД [Klingenberg M., 1959], а також окисленого НАДФ [Klingenberg M., 1962].

Визначення концентрацiї НАДФН проводилось пiсля його попереднього фотоокислення в нейтралiзованих спиртових екстрактах печiнки [Прохорова М.И., 1982]. Окислена проба використовувалась для кiлькiсного визначення НАДФ+ за методом M.Klingenberg [1962].

У якості маркерів окислювального стресу використовували дієнові кон’югати, шиффові основи та карбонілірувані білки. Дієнові кон’югати та шиффові основи визначалися в екстрактах із замороженої у рідкому азоті печінки за методом І.Д.Стальної [1977] та C.A. Rice-Evans et al. [1991] відповідно. Рівень карбоніліруваних білків вимірювали в гомогенатах, мітохондріальній, мікросомальній та цитозольній фракціях печінки [Дубинин Е.Е., 2000].

В цитозольніі фракціі печінки визначали активність глюкозо-6-фосфат дегідрогенази [Путилина Ф.Е., Зоидзе С.Д., 1982] та декарбоксилюючої малатдегідрогенази [Путилина Ф.Е., Зоидзе С.Д., 1982].

Концентрацiю бiлку в пробах визначали за методом O. Lowry et al. [1951]. Для розрахункiв використовували калiбровочну криву на альбумiн.

Визначення вмiсту адреналiну в сироватцi кровi проводили спектрофлюориметрично за методом C. Atrac, T. A. Madnusson [1987], 11-оксикортикостероїдiв - за методом А.Г.Резникова [1980].

Результати оброблювали статистично, використовуючи непараметричні та параметричні критерії оцінки різниці між вибірками.

Використані в роботі похідні 1,2,4-триазолiн-5-тiоацетату були синтезовані в Запорізькому державному медичному університеті [Панасенко А.И., Кныш Е.Г. и др., 1996] та люб’язно були надані для роботи проф.Книшом Є.Г.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проведенi дослiдження показали, що при старiннi виникало зниження редуктазної активності мiкросом в присутностi тих акцепторiв електронiв, з якими вони проявляють низьку каталiтичну активнiсть - 2,6-дихлорфенолiндофенол i нiтротетразолiєвий синiй [Карякин А.В., Арчаков А.И., 1985]. В присутностi феррицианiду та цитохрому с, якi з високою швидкiстю вiдновлюються мiкросомальними редуктазами [Карякин А.В., Арчаков А.И., 1985], не виявлено вiкової рiзницi в їх ферментативній активності (табл. 1). Прояви цих змін могли бути пов’язані з віковими змінами в структурі мікросомальних мембран [Miyazawa T. et al, 1993; Hayashi T. et al., 1998], що зумовило порушення взаємодії акцептора електронів з активним центром фермента.

Таблиця 1.

Редуктазна активність мікросом печінки дорослих і старих щурiв при імобілізаційному стресі (M m; n)

Акцептор | Дорослi | Старi | електронiв | Iнтактнi | Стрес | Iнтактнi | Стрес | НАДН –залежна редуктазна активність | К3[Fe(CN)6] | 849 + 66

7 | 964 + 96

6 | 956 + 88

5 | 660

6 | Цитохром с

660 + 60

7 | 630+ 30

6 | 650 + 80

4 | 450 + 20*

6 | 2,6-дихлорфе-нолiндофенол | 129 + 11

6 | 81+ 6*

6 | 76 + 5**

6 | 89 + 4

5 | Нiтротетразолiєвий синiй | 10 + 1

7 | 10 + 1

6 | 5,0 + 0,5**

4 | 9 + 2

5 | НАДФН –залежна редуктазна активність | К3[Fe(CN)6] | 155 + 6

7 | 164 + 15

5 | 225 + 28**

5 | 89 + 4*

5 | 2,6-дихлорфе-нолiндофенол | 12 + 1

6 | 11 + 1

5 | 7 + 1**

5 | 5 + 1

6 | Примiтки: Активнiсть виражена в нмоль/мг бiлкухв.

* - вірогідно відносно до інтактних тварин (р<0,05).

** - вірогідно відносно до інтактних дорослих тварин (р<0,05)

Під час імобілізаційного стресу відбувається зміна редуктазної активності мікросом печінки. Проте прояв цього ефекту має залежний від віку характер. Так, імобілізація дорослих тварин супроводжується лише слабо вираженим зниженням НАДН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазної активності мікросом. НАДФН-залежна редуктазна активність в реакціях відновлення усіх використаних акцепторів електронів залишається у них на рівні інтактних тварин.

У старих щурiв при стресi знижувалася НАДН та НАДФН-залежна редуктазна активність в присутностi тих акцепторiв електронiв, якi з бiльшою швидкiстю вiдновлювалися редуктазами (феррицианiд калiя, цитохром с), та збiльшувалося спiввiдношення НАДН та НАДФН-залежних редуктазних активностей на користь НАДН-залежної.

Оцiнюючи результати проведених дослiджень можна зробити висновок про те, що при старiннi змiнюються властивостi мiкросомальних редуктаз в печiнцi. Це проявляється в частковому зниженні редуктазної активності мікросомальних фракцій в реакцiях з акцепторами електронiв, якi вiдновлюються повiльно, а також в зменшеннi прояву регуляторного ефекту на редуктазну активність окремих регуляторiв (додецилсульфату натрiя, перекису водню). Виникнення подiбних зсувiв, цiлком iмовiрно, суттєво не впливає на стан окислювально-вiдновлювальних перетворень в процесi мiкросомального окислення в печiнцi у старих iнтактних щурiв. Проте, їх поява може вносити значнi корективи в функцiонування оксигеназних ланцюгiв мiкросом у тварин цiєї вiкової групи при стресi.

Разом з тим, незважаючи на збереження високої ферментативної НАДФН:2,6-дихлорфенолiндофенол та НАДН:нiтротетразолiєвий синiй редуктазної активності, є пiдстави припустити, що in situ в печiнцi старих щурiв при стресi все таки вiдбувається обмеження каталiтичних властивостей цих ферментiв.

Пiдтвердженням цього служать результати експериментiв, в яких було продемонстровано зменшення НАДФН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазної активності мiкросом печiнки старих iмобiлiзованих щурiв в умовах зниження концентрацiї НАДФН в реакцiйнiй сумiшi зi 100 до 40 мкмоль. Характерно, що аналогiчний ефект не виявлявся нi у старих iнтактних щурiв, нi у дорослих тварин при стресi (рис.1).

нмоль/мг білку* хв. *

Рис.1. НАДФН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазна активність мiкросом печiнки дорослих та старих щурiв в середовищі інкубації, яке містить 40 мкмоль НАДФН.

Примітка: * - вірогідно відносно до інтактних тварин (р<0,05).

Зниження НАДФН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазної активності при зменшенні концентрацiї субстрату в реакцiйнiй сумiшi саме у старих iмобiлiзованих щурiв може бути наслiдком обумовленої стресом окислювальної модифiкацiї молекули ферменту [Парамонова Г.И., 1994; Pacifici R.E., Pavies K.I.A., 1991].

Зміна структури НАДН-залежної редуктази може виникати внаслiдок окислювальної модифiкацiї її полiпептидного ланцюга внаслiдок дiї активних форм кисню, якi посилено генеруються в тканинах при стресi [Меерсон Ф.З. и др., 1979, Владимиров Ю.А. и др., 1991]. Пiдтвердженням цього служать результати експериментiв, в яких було показано зменшення впливу in vitro додецилсульфату натрiя та перекису водню на НАДН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазну активність мiкросом у дорослих iмобiлiзованих щурiв (рис.2).

%

Рис. 2. Вплив 0,01 % розчину додецилсульфату натрiя (ДДС Na) та 0,03 М перекису водню на НАДН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазну активність мiкросом печiнки дорослих iнтактних та iмобiлiзованих щурiв.

Примiтка: * - вірогідно відносно до інтактних тварин (р<0,05).

Беручи до уваги викладенi вище данi експериментальних дослiджень, можна дiйти висновку про iснування вiкових особливостей змiни функціонування мiкросомальних редуктаз при формуваннi iмобiлiзацiйного стресу. Їх поява сприяє виникненню передумов для залежної вiд вiку змiни швидкостi окислювально-вiдновлювальних перетворень в процесi мiкросомального окислення в печiнцi, а значить, у цiлому, її антитоксичної функцiї. Проте, можливiсть реалiзацiї цих передумов в умовах in vivo може обмежувати цiлий ряд факторiв, а особливо рiвень субстратного забезпечення даних ферментiв.

Беручи до уваги те, що рівень субстратного забезпечення ферментів може суттєво впливати на активність мікросомальних редуктаз, у дослiджених груп тварин було проведено вивчення стану пулу пiридiнових коферментiв в печiнцi (табл.2).

Таблиця 2.

Вмiст пiридiнових коферментiв в печiнцi дорослих та старих щурiв

при iмобiлiзацiї (Mm; n=5-6)

Показник | Дорослi | Старi | Iнтактнi | Стрес | Iнтактнi | Стрес | НАД+1,8 + 0,1 | 2,3 + 0,2 * | 1,7 + 0,1 | 1,6 + 0,2 | НАДН | 0,33 + 0,08 | 0,39 + 0,03 | 0,29 + 0,02 | 0,21 + 0,02 | НАДФ+0,14 + 0,02 | 0,23 + 0,02 * | 0,19 + 0,03 | 0,19 + 0,03 | НАДФН 0,13 + 0,02 | 0,08 + 0,01* | 0,16 + 0,01 | 0,11 + 0,02 * | НАДН/НАДФН2,4 + 0,2 | 5,5 + 1,0 * | 2,1 + 0,3 | 1,7 + 0,2 | Примiтки: Концентрацiя коферментiв виражена в мкмоль/г тканини (сира вага).

* - вірогідно відносно до інтактних тварин (р<0,05).

Дослiдження показали, що в печiнцi дорослих iмобiлiзованих тварин значно зростала концентрацiя окислених НАД та НАДФ. Разом з цим, знижувався рiвень вiдновностi пулу НАДФ та, навпаки, рiзко пiдвищувалася частка вiдновленого НАД в загальному пулi пiридiнових коферментiв. Зменшення вiдновностi пулу НАДФ у дорослих щурiв при iмобiлiзацiї було повязане зi зниженням концентрацiї НАДФН. Причиною цього може бути збiльшення швидкостi використання цього метаболiту при стресi в процесах мiкросомального окислення [Посохова Е.А., 1996], а також в реакцiях, повязаних з вiдновленням глутатiону [Ando M. et al, 1997] та iнш.

У старих щурiв, що пiдлягали iмобiлiзацiї, також вiдзначали зменшення вiдновленостi пулу НАДФ, що супроводжувалося зниженням концентрацiї вiдновленої форми даного кофермента в печiнцi. Проте, цей зсув, на вiдмiну вiд такого у дорослих тварин, не супроводжувався змiною рiвня вiдновленостi НАД. Бiльш того, абсолютний вмiст вiдновленого НАД в печiнцi старих щурiв при стресi значно зменшувався у порiвняннi з величиною аналогiчного показника у дорослих iмобiлiзованих тварин.

Зменшення концентрації відновленого НАДФ в печінці не пов’язане з обмеженням інтенсивності його утворення в реакціях, які каталізуються цитозольними НАДФ-залежними дегідрогеназами (малатдегідрогеназою декарбоксилюючою та глюкозо-6-фосфат дегідрогеназою), як основними джерелами даного метаболіту в клітині [Путилина Ф.Е. и др., 1982]. На це вказують результати дослідження активності цитозольної малатдегідрогенази та глюкозо-6-фосфат дегідрогенази в печінці щурів обох вікових груп при стресі (табл.3).

Таблиця 3.

Активність НАДФ-залежних дегідрогеназ цитозолю печінки дорослих

та старих щурів при стресі (M + m; n=5-6)

Фермент | ДоросліСтарі | Інтактні | Стрес | Інтактні | Стрес | Глюкозо-6-фосфат

дегідрогеназа | 15,0 + 1,1 | 15,2 + 0,8 | 10,5 + 2,2 | 20,7 + 3,5*Малатдегідрогеназа декарбоксилююча2,0 + 0,7 | 1,9 + 0,6 | 4,0 + 0,7 | 3,3 + 0,3 | Примітки: Активність ферментів виражена в нмоль НАДФ/мг білку?хв.

* - вірогідно відносно до інтактних тварин (р<0,05).

Вiковi вiдмiнностi повязанi з тим, що у старих тварин при стресi зменшення вмiсту НАДФН супроводжується паралельним зниженням концентрацiї НАДН в печiнцi. Їх поява може вносити суттєвi корективи в характер взаємодiї мiкросомальних електрон-транспортних ланцюгiв.

Зменшення вмiсту НАДФН в печiнцi чинить регуляторну дiю на функцiонування початкової дiлянки оксигеназного ланцюга мiкросом. Навiть за умов пiдтримання високої НАДФН-залежної редуктазної активності, зниження концентрацiї субстрату (НАДФН) сприяє обмеженню швидкостi окислювально-вiдновлювальних реакцiй, якi каталiзуються цим ферментом. Ранiше це вже було показано на прикладi НАДФН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазної активності (рис.1).

Таким чином, виникаючi при стресi зсуви в станi пулу пiридiнових коферментiв сприяють зменшенню швидкостi перенесення електронiв через початкову дiлянку оксигеназного ланцюга мiкросом. В результатi цього формуються передумови для гальмування процесу гiдроксилювання субстратiв в печiнцi та порушення метаболiзму ксенобiотикiв навіть в умовах відсутності виражених змін з боку вмісту цитохрома Р450 в мікросомах при стресі, що було показано нами в спеціальних експериментах. Проте, можливi негативнi наслiдки подiбних зсувiв можуть значно обмежуватися у звязку з iснуванням тiсної структурно-функцiональної взаємодiї мiж мiкросомальними редокс-ланцюгами [Арчаков А.И., 1974]. За рахунок цього, за певних умов, електрони з НАДН, завдяки цитохрому b5 , можуть поступати на термiнальний компонент оксигеназного ланцюга - цитохром Р450 i, таким чином, використовуватися для процесу гiдроксилювання [Карякин А.В., Арчаков А.И., 1985]. До цього ж, в спеціальних експериментах нами було показано, що вміст цитохрому b5 в мікросомах печінки при стресі не зменшується (рис.3).

нмоль/мг білку

Рис. 3. Вміст цитохрому b5 в мікросомах печінки дорослих та старих щурів при стресі.

Враховуючи це та приймаючи до уваги характер зсувiв в редуктазній активностi мiкросом, а також змiни у станi пулу пiридiнових коферментiв, можна припустити, що у дорослих щурiв при стресi за умов обмеження НАДФН-залежної редуктазної активності виникає компенсаторна стимуляцiя окислювально-вiдновлювальних перетворень, повязаних з функцiонуванням НАДН-залежного фермента. Подiбна перебудова у мiкросомальному окисленнi сприяє пiдтриманню ефективного функцiонування оксигеназного ланцюга в печiнцi. При стресi, за умов пiдвищеної продукцiї ендогенних токсинiв в органiзмi та метаболiтiв, що мають цитотоксичну дiю [Coon M. J. et al., 1996; Guerand F. et al.,1999; Banoglu E. et al., 2001 ], це набуває адаптивного значення.

У старих щурiв формування стресу не супроводжується виникненням подiбних компенсаторних сзувiв з боку мiкросомального окислення. Причиною цього можуть бути вiковi особливостi змiни стану пулу НАД в печiнцi, що виявляється в зменшеннi концентрацiї НАДН, а також обмеження НАДН-залежної редуктазної активності мiкросом та пiдвищення її лабiльностi. Цi, характернi для старiння, зсуви обмежують можливiсть шунтування гiдроксилазного мiкросомального ланцюга редуктазним ланцюгом i саме тому сприяють зниженню антитоксичної функцiї печiнки при стресi. Останнє вносить суттєвий вклад в механiзм зменшення резистентностi органiзму до стресу при старiннi.

На основi даних про характер вiкових змiн з боку мiкросомальних редуктаз та їх можливої ролi в змiнi антитоксичної функцiї печiнки далi було здiйснено спробу проведення фармакологiчної корекцiї їх активностi. Були застосованi препарати, що мають спрямовану гепатотропну дiю. В якостi таких засобiв використовували новi синтетичнi препарати - похiднi 3-(4-піриділ)-1,2,4-триазолін-5-тіоацетату: його морфолiнiєву (румосол) та калiєву (препарат 2) солi [Панасенко А.И. и др., 1996].

Проведенi дослiдження показали, що використанi препарати чинили певний вплив на редуктазну активність мiкросом при стресi. Проте характер цього ефекту у дорослих та старих щурiв суттєво вiдрiзнявся (табл.4).

Таблиця 4

Вплив похiдних 1,2,4-триазолiн-5-тіоацетату на редуктазну активнiсть мiкросом печiнки дорослих та старих щурiв при iмобiлiзацiйному стресi ( M + m; n )

Акцептор | Дорослi | Старi | електронів | Контроль | Румосол | Препарат 2 | Контроль | Румосол | Препарат 2 | НАДН-залежна редуктазна активнiсть | Цитохром с | 660+ 20

5 | 460+30*

6 | 480+10*

6 | 450+20

6 | 810+30*

5 | 380+30

5 | К3[Fe(CN)6] | 892+78

5 | 806+73

6 | 671+16*

6 | 621+19

5 | 1194+66*

4 | 517+47

4 | НАДФН-залежна редуктазна активнiсть | К3[Fe(CN)6] | 164 +15

5 | 90 + 9*

5 | 120 + 6*

6 | 89 + 4

5 | 216 + 11*

5 | 135+16*

4 | Примiтки: Активнiсть виражена в нмоль/мг бiлкухв.

* - вірогідно відносно до тварин, яким препарат не уводили (р<0,05).

Контроль - група щурiв, яким перед iмобiлiзацiєю препарати не уводили.

У дорослих щурiв, iмобiлiзацiя яких не супроводжувалася значною змiною редуктазної активностi мікросом, обидва препарати чинили на них помiрний iнгiбiруючий ефект. У старих тварин, iмобiлiзацiя яких супроводжувалася значним зниженням редуктазної активностi, уведення румосолу сприяло збiльшенню цієї активностi до рiвня iнтактних тварин. Аналогiчний ефект у старих щурiв на НАДФН: К3[Fe(CN)6] редуктазну активність чинив препарат 2.

Отриманi данi дають пiдставу зробити висновок про те, що використанi похiднi 1,2,4-триазолін-5-тіоацетату чинять подвiйний ефект на редуктази мiкросом печiнки. Вiн може мати характер прямої та непрямої дiї.

Прямий ефект препаратiв повязаний з їх безпосереднiм впливом на молекулу ферменту. Його наслiдком стає зниження редуктазної активностi мiкросом. Непрямий ефект, цiлком iмовiрно, обумовлює антиоксидантна дiя похiдних 1,2,4-триазолін-5-тіоацетату [Панасенко А.И. и др, 1998]. Обмежуючи iнтенсивнiсть стимуляцiї вiльно-радикальних процесiв при стресi, вони запобiгають тим самим стресорному обмеженню редуктазної активностi мiкросом.

Iснуючi лiтературнi данi про вiкове зниження потужностi антиоксидантних систем органiзму [Jorquera Plaza F. et al, 1997] дозволяють припустити бiльшу величину обумовленої стресом окислювальної модифiкацiї редуктаз мiкросом у старих, нiж у дорослих тварин. На це вказують результати експериментiв по вивченню вмiсту карбонiлiруваних бiлкiв у мiкросомах печiнки дорослих та старих щурiв при стресi (рис.4). З цiєї причини превентивне введення румосолу для запобiгання зниження редуктазної активності мiкросом печiнки при стресi у старих щурiв виявилося бiльш ефективним, нiж у дорослих тварин.

%

Рис. 4. Змiна вмiсту карбонiлiруваних бiлкiв у мiкросомах печiнки дорослих та старих щурiв при стресi.

Примiтка: Вмiст карбонiлiруваних бiлкiв у iнтактних щурiв прийнято за 100 %).

Активуюча дiя румосолу на мiкросомальнi редуктази при стресi має характер терапевтичної дiї. Вiн забезпечує посилення процесiв мiкросомального окислення в печiнцi i цим самим стимулює її антитоксичну функцiю. В умовах стресорної стимуляцiї катаболiчних процесiв це сприяє пiдвищенню резистентностi органiзму до пошкоджуючої дiї стресу, що особливо актуально при старiннi.

ВИСНОВКИ

1. Iмобiлiзацiйний стресс супроводжується виникненням залежних вiд вiку особливостей у редуктазнiй активностi мiкросом печiнки. У дорослих тварин вони проявляються у слабо вираженому зниженнi НАДН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазної активності зі збереженням НАДФН-залежної редуктазної активності на рівні iнтактних тварин. У старих тварин при стресi вiдбувається обмеження НАДН-залежної редуктазної активностi мікросом печінки при відновленні феррицианіду калію, цитохрому с, а також НАДФН-залежної редуктазної активності при відновленні феррицианіду калію. Паралельно відбувається збільшення збільшення відношення НАДН- та НАДФН-залежних редуктазних активностей на користь НАДН-залежної. Формування комплексу подібних зсувів з боку редуктазної активності мікросом сприяє обмеженню швидкості окислювально-відновлювальних процесів у гідроксилазних ланцюгах печінки у старих щурів при стресі.

2. НАДН- та НАДФН-залежні редуктази мікросом печінки проявляють неоднакову чутливість до дії ряду мембранотропних речовин (додецилсульфату натрія, перекису водню та сечовини), що визначається відмінностями в їх структурі та властивостях як мембранозв’язаних ферментів. НАДФН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктаза більш стійка до дії цих речовин, ніж НАДН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктаза.

3. У дорослих тварин імобілізаційний стрес супроводжується зменшенням ефекту додецилсульфату натрія, перекису водню та сечовини на НАДН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазну активність мікросом. У старих імобілізованих щурів величина ефекту даних мембранотропних речовин на НАДН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазну активність мікросом не відрізняється від такої у старих інтактних тварин. Відмінності у проявленні дії додецилсульфату натрія, перекису водню та сечовини на НАДН:2,6-дихлорфенолiндофенол редуктазну активність мікросом печінки дорослих та старих щурів при імобілізації відображає існування вікових особливостей зміни структури та характеру взаємодії редуктаз з мікросомальними мембранами при стресі.

4. Формування імобілізаційного стресу призводить до порушення субстратного забезпечення мікросомальних редуктаз. Проявом цього служить зміна стану пулу піридінових коферментів в печінці щурів, що підлягали імобілізації. Ці зміни мають залежний від віку характер. У дорослих тварин пiд час iмобiлiзацiйного стресу зменшується концентрацiя НАДФН та збiльшується частка НАДН у сумарному пулi вiдновлених пiридiнових коферментiв. У старих щурiв при стресi вiдбувається зменшення вмiсту НАДФН в печiнцi. При цьому значно знижується концентрацiя НАДН у порiвняннi з його рiвнем у дорослих iмобiлiзованих тварин.

5. Змiна редуктазної активності мiкросом та стану пулу пiридiнових коферментiв у печiнцi дорослих щурiв при стресi сприяють обмеженню ролi НАДФН-залежних реакцiй та зростанню ролi НАДН-залежних реакцiй в процесi мiкросомального окислення. Цей зсув має компенсаторне значення для пiдтримання ефективностi процесiв гiдроксилювання в печiнцi. Зниження ролi НАДН-залежних реакцiй в процесi мiкросомального окислення при стресі у старих щурiв обмежує можливість шунтування редуктазної ланки оксигеназного ланцюга. Внаслідок цього у них формуються умови для порушення процесів гідроксилювання в печінці, а, значить, і зменшення її антитоксичної функції при стресі.

6. Морфолiнiєва (румосол) та калiєва солi 3-(4-пiридiл)-1,2,4-триазолін-5-тіооцтової кислоти чинять модулюючий вплив на редуктазну активнiсть мiкросом печiнки при стресi. Дiя цих препаратiв має залежний вiд вiку характер.

7. Румосол сприяє збiльшенню редуктазної активностi мiкросом у старих щурів при імобiлiзацiйному стресі і може використовуватися у якоcті ефективного препарату для корекції обумовлених стресом порушень з боку мікросомального окислення в печiнці при старiннi.

СПИСОК ОСНОВНИХ РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Рудько Н.П., Давыдов В.В. Активность редуктаз микросом печени в присутствии различных акцепторов электронов у взрослых и старых крыс при стрессе // Пробл. старения и долголетия .-2000.-Т. 9, N 3. - С.256-261.

2. Рудько Н.П., Давидов В.В. Активність НАДФН-дихлорфеноліндофенол редуктази печінки дорослих та старих щурів при імобілізаційному стресі // Вісник Запорізького державного університету.- 2001. - № 2. - С.221-224.

3. Швец В.Н., Рудько Н.П., Давыдов В.В., Панасенко А.И., Кныш Е.Г., Горбач Т.В. Действие производных 1,2,4-тиотриазолил-5-меркаптоуксусной кислоты на содержание катехоламинов в крови взрослых и старых крыс при стрессе // Експерим. і клініч. медицина. - 2001.- №3.- С.11-13.

4. Рудько Н.П., Давыдов В.В. Активность редуктаз микросом печени взрослых и старых крыс при иммобилизационном стрессе // Вопр. мед. химии. - 2001.- Т.47, вып.5.- С.506-511.

5. Рудько Н.П., Давыдов В.В. Изучение особенностей регуляции активности редуктаз микросом печени взрослых и старых крыс при стрессе // Вопр. мед. химии. - 2001.- Т.47, вып.6.- С.599-601.

6. Рудько Н.П., Давыдов В.В. Изучение особенностей влияния новых производных 1,2,4-триазолил-5-меркаптоуксусной кислоты на активность редуктаз микросом печени взрослых и старых крыс при иммобилизационном стрессе // Эксперим. и клинич. фармакология.- 2001.- Т.64, № 3.- С.53-55.

7. Рудько Н.П., Давыдов В.В. Активность редуктаз микросом печени с различными акцепторами электронов у взрослых и старых крыс при иммобилизационном стрессе // Матеріали III націон. конгресу геронтологів і геріатрів України.- Київ.- 2000.- С.164.

8. Рудько Н.П., Давыдов В.В. Изменение активности редуктаз микросом в печени крыс при стрессе // Труды науч.-технич. конф. “Экология и здоровье человека. Охрана водного и воздушного бассейнов. Утилизация отходов”.- Тез.докл.-12-16 июня 2000 г.- Харьков, 2000.- Т.1.- С.145.

9. Рудько Н.П., Давыдов В.В. Влияние стресса на активность редуктаз микросом печени у старых крыс // Материалы науч.-практ. конф.“Региональные проблемы охраны здоровья населения центрального Черноземья”.-Тез.докл.- Белгород, 2000.- С.589-592.

10. Рудько Н.П. Активность редуктаз микросом печени старых крыс при иммобилизационном стрессе // Материалы конф. молодых ученых в институте геронтологии, посвященной памяти В.В.Фролькиса. – Киев, 2001.- С.94-95.

11. Рудько Н.П., Давыдов В.В. Состояние системы пиридиновых коферментов в печени взрослых и старых крыс при стрессе // Труды науч. конф. “Научное наследие академика И.Н. Буланкина и его развитие в современной биологии”.- Тез.докл.- Харьков, 2001. – С.148-150.

АНОТАЦІЯ

Рудько Н.П. „Редуктазна активнiсть мiкросом печiнки при стресi у дорослих та старих щурiв”. – Рукопис.

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук за спецiальнiстю 03.00.04 - бiохiмiя. - Харкiвський нацiональний унiверситет ім. В.Н.Каразіна, Харкiв, 2002.

Вивчали вiковi особливостi змiни редуктазної активності мiкросом печiнки щурiв пiд час iмобiлiзацiйного стресу. Встановлено, що iмобiлiзацiя дорослих тварин не супроводжується суттєвою змiною редуктазної активності мiкросом. Проте, у них вiдбувається зниження концентрацiї НАДФН та зростає частка НАДН у пулi вiдновлених пiридiнових коферментiв у печiнцi. При iмобiлiзацiї старих щурiв вiдбувається часткове зниження редуктазної активності мiкросом, зменшується вiдновнiсть пулу НАДФ та вмiст НАДН у печiнцi у порiвняннi з його рiвнем у дорослих iмобiлiзованих щурiв.

Така перебудова мiкросомального окислення забезпечує можливiсть ефективного перебiгу процесiв гiдроксилювання в печiнцi у дорослих щурiв при їх iмобiлiзацiї, а у старих щурiв може бути причиною зменшення антитоксичної функцiї печiнки при стресi. .

Вперше показано, що для корекцiї зсувiв з боку редуктаз мiкросом печiнки старих щурiв при стресi можна ефективно використовувати румосол.

Ключовi слова: редуктази мiкросом, пiридiновi коферменти, похiднi 1,2,4-триазолін-5-тіоацетату, печiнка, стрес, старiння.

АННОТАЦИЯ

Рудько Н.П. „Редуктазная активность микросом печени взрослых и старых крыс при стрессе”. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Харьковский национальный университет им. В.Н.Каразина, Харьков, 2002.

Диссертация посвящена изучению редуктазной активности микросом печени взрослых и старых крыс при иммобилизационном стрессе. Установлено, что иммобилизация взрослых животных не сопровождается существенным изменением редуктазной активности микросом. Однако у них значительно возрастала концентрация окисленных НАД и НАДФ. Одновременно с этим, снижался уровень восстановленности пула НАДФ и, наоборот, резко повышалась доля восстановленного НАД в общем пуле пиридиновых коферментов. Уменьшение восстановленности пула НАДФ у взрослых крыс при иммобилизации было связано со снижением концентрации НАДФН. Возникающие сдвиги способствуют стимуляции окислительно-восстановительных превращений, связанных с НАДН-зависимой редуктазой, в условиях ограничения функционирования НАДФН-зависимого фермента. Подобного рода изменения со стороны микросомального окисления обеспечивают возможность эффективного течения процессов гидроксилирования в печени у взрослых крыс при их иммобилизации. В условиях повышенной продукции эндогенных токсинов в организме при стрессе, это приобретает адаптивное значение.

При иммобилизации старых животных происходит частичное снижение редуктазной активности микросом в реакциях восстановления феррицианида и цитохрома с. Этому сдвигу сопутствует уменьшение восстановленности пула НАДФ, сопровождающееся снижением концентрации восстановленной формы данного кофермента в печени.

При стрессе происходит снижение содержания восстановленного НАДФ