НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

Романюк Світлана Іванівна

УДК 577.27:[591.145:616.931]

антигенні й імунобіологічні властивості дифтерійного токсину та його субодиниць

02.00.10 – біоорганічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі структури і функції білків та петидів Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України та відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Радавський Юрій Леонідович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу структури і функції білків та пептидів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Костянтинович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу хімії білка доктор медичних наук Оксіюк Віктор Глібович Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, завідувач лабораторії керованих інфекцій та заходів імунопрофілактики

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра мікробіології та загальної імунології

Захист відбудеться 27 вересня 2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул.Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ-94, вул.Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 27 серпня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дифтерійний токсин (ДТ) є головним фактором патогенності збудника дифтерії Corynebacterium diphtheriae. Не зважаючи на те, що молекулярна будова і механізм дії цього токсину досліджувались з моменту його відкриття наприкінці XIX століття, антигенна будова ДТ і особливості його розпізнавання антитілами та рецепторами імунних клітин почали активно вивчатися лише протягом останніх 10-15 років. Бурхливий розвиток досліджень антигенних властивостей ДТ обумовлений поширенням дифтерійної інфекції в 1990-1998 роках в країнах Східної Європи, в тому числі й в Україні. Виникнення епідемії дифтерії пов'язують, в першу чергу, з недосконалістю існуючих протидифтерійних вакцин і методів діагностики захворювання, а також з існуванням явища носійства дифтерійних бактерій, причини якого до сих пір не з'ясовані.

Традиційно в протидифтерійних вакцинах у якості антигену використовують дифтерійний анатоксин, що являє собою ДТ, оброблений формальдегідом. Оскільки імунні відповіді на нативний і модифікований антигени відрізняються, вивчення антигенних й імуногенних властивостей ДТ і дифтерійного анатоксину становить інтерес у плані подальшого удосконалення протидифтерійних вакцин. Розробка сучасних діагностикумів на основі імуноферментного аналізу (ІФА) також вимагає знання особливостей імунного розпізнавання ДТ у хворих на дифтерію, за якими можна було б чітко диференціювати їх від вакцинованих людей.

Крім того, дослідження антигенних властивостей ДТ є важливими для створення імунотоксинів на основі дифтерійних токсоїдів з мінімальною імуногенністю, які не викликають активного синтезу нейтралізуючих антитіл і можуть успішно застосовуватись при лікуванні онкологічних і вірусних захворювань.

Вивчення антигенних властивостей ДТ має не тільки прикладне значення, а й викликає суто теоретичний інтерес. Відомо, що багатьом токсинам патогенних бактерій притаманні властивості, що дозволяють їм уникати знешкодження імунною системою. Подібні властивості ДТ поки що невідомі. Тому інформація щодо антигенних та імунобіологічних властивостей ДТ може виявитись корисною при встановленні ймовірних механізмів подолання даним токсином захисних систем організму.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у межах тематичних планів Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (бюджетна тема № 2.1.10.14) “Дослідження фізико-хімічної та антигенної будови білка Р.69 кашлючного мікробу, дифтерійного токсину і нейрамінів бактерій” (номер держреєстрації 0197U009977), а також при сприянні проекту № 8 “Структурно-функціональний аналіз білкових антигенів та ліпоцукроїду збудників дифтерії та кашлюку з метою створення сучасних вакцин” Національної програми імунопрофілактики населення на 1993-2000 роки.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у встановленні антигенних властивостей ДТ і його субодиниць при різних формах дифтерійної інфекції, а також імунобіологічних властивостей цього токсину, які дозволяють йому протидіяти факторам імунного захисту.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:

1. Розробити на основі ІФА методи виявлення ДТ і антитіл проти нього в сироватці крові людини та вивчити можливість їх практичного застосування для діагностики дифтерії.

2. Виявити особливості імунного розпізнавання ДТ і його окремих субодиниць у дітей з різними формами дифтерійної інфекції, а також дітей, імунізованих дифтерійним анатоксином.

3. Змоделювати динаміку взаємодії ДТ з головними захисними факторами організму при дифтерійній інфекції за допомогою математичних методів.

4. Дослідити імунобіологічну активність ДТ по відношенню до клітин імунної системи in vitro, яка, можливо, дозволяє йому протидіяти факторам імунного захисту.

Об'єкт дослідження – ДТ і антитіла проти нього.

Предмет дослідження – антигенні й імунобіологічні властивості ДТ та його субодиниць.

Методи дослідження. При вивченні антигенних властивостей ДТ і його субодиниць використані методи біоорганічної хімії та біохімії (ІФА, ферментативна фрагментація білка, електрофорез та імуноблотинг), при дослідженні динаміки взаємодії ДТ із захисними факторами організму – методи математичного моделювання, а при вивченні імунобіологічної активності ДТ – методи виділення, культивування in vitro та визначення життєздатності клітин. В роботі застосовані також хімічні методи синтезу кон'югатів білків з пероксидазою, біотином та флуоресцеїнізотіоціанатом.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено аналіз антигенних властивостей ДТ і його субодиниць при різних формах дифтерійної інфекції у порівнянні з антигенними властивостями дифтерійного анатоксину, що входить до складу вакцини АКДП. Показано, що у хворих на дифтерію дітей в 57% випадків переважають антитіла до субодиниці А, а у носіїв дифтерійних бактерій і здорових вакцинованих дітей, як правило, переважають антитіла до субодиниці В.

Запропоновано оригінальну математичну модель дифтерійної інфекції, що враховує особливості патогенезу цього захворювання та дозволяє оцінювати вплив різноманітних факторів на процеси, що відбуваються в системі “паразит-хазяїн” при інфікуванні дифтерійними бактеріями.

Вперше показано, що ДТ здатен проникати в фагоцити і специфічні до нього В-лімфоцити та викликати їх загибель навіть за відсутності класичного рецептора для ДТ, що свідчить про потенційну здатність цього токсину пригнічувати гуморальну імунну відповідь, спрямовану проти нього, та перешкоджати виконанню фагоцитами захисних функцій в організмі.

Обґрунтованість і достовірність наукових положень, висновків і рекомендацій. Результати дисертаційної роботи одержані з використанням сучасних методичних підходів і статистичного аналізу, що обумовлює високу достовірність наведених в дисертації наукових положень, висновків і рекомендацій.

Наукове значення роботи. Одержані дані щодо імунного розпізнавання ДТ і його субодиниць при дифтерії та після вакцинації анатоксином можуть бути теоретичною основою для створення нових протидифтерійних вакцин і діагностикумів. Виявлені відмінності у специфічності антитоксичних антитіл хворих на дифтерію і носіїв дифтерійних бактерій, очевидно, сприятимуть з'ясуванню причин виникнення носійства. Відкриття існування додаткових шляхів проникнення ДТ в клітини імунної системи демонструє важливе значення цього токсину для виживання дифтерійних бактерій в організмі і дозволяє з нової точки зору оцінити біологічну роль білкових екзотоксинів у житті патогенних бактерій. Крім того, отримані результати дають підстави припускати, що імунотоксини, які складаються з дифтерійного токсоїду і антигенного компонента, можуть виявитися перспективними для вибіркового знищення певних популяцій В-клітин при лікуванні аутоімунних захворювань.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено імуноферментні методи виявлення ДТ і антитіл проти нього в сироватці крові людини, які можуть бути застосовані у тест-системах для експрес-діагностики дифтерії. Показано, що найбільш чутливим методом виявлення ДТ є метод “сендвіч”-ІФА з використанням біотинильованих похідних F(abґ)2-фрагментів антитіл коня проти ДТ та кон'югату стрептавідину з полімерною пероксидазою. Продемонстровано, що одночасне визначення в сироватці крові вмісту ДТ і антитіл проти нього дозволяє встановити діагноз при дифтерії з чутливістю 84% і специфічністю 93%. Переважання ж в сироватці крові антитіл до субодиниці А ДТ над антитілами до субодиниці В може бути додатковим критерієм при встановленні діагнозу.

Створена нами денситометрична комп'ютерна програма для кількісної оцінки результатів імуноблотингу може бути застосована також для обробки результатів одномірного електрофорезу й авторадіографії.

Запропонована математична модель дифтерійної інфекції може використовуватись для прогнозування перебігу дифтерійної інфекції і розрахунку терапевтичних доз антитоксичної сироватки крові коня в залежності від тривалості інфекції та даних про рівень ДТ і антитоксичних антитіл в сироватці крові хворого.

Особистий внесок здобувача. Аналіз сироваток крові дітей з різним діагнозом щодо вмісту ДТ, рівня антитіл проти нього та їх специфічності до окремих субодиниць ДТ, а також вивчення in vitro цитотоксичного впливу ДТ на клітини імунної системи тварин здійснені особисто здобувачем. Матеріали дослідів, що опубліковані в статтях зі співавторами і що увійшли до дисертації, одержані за безпосередньої участі дисертанта.

Виділення ДТ і його розщеплення на субодиниці трипсином, електрофорез та блотинг проводилися разом зі співробітниками відділу структури і функції білків та пептидів Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України к.б.н. С.С. Вітером і Т.Ю. Ткаченко. Сироватки крові дітей з різними формами дифтерійної інфекції досліджені завдяки співпраці з Дитячою інфекційною лікарнею № 12 та особисто з д.м.н., проф. С.О. Крамарєвим і співробітниками кафедри дитячих інфекційних захворювань Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця. Співробітники відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України брали участь у плануванні деяких експериментів та обговоренні результатів.

Автор щиро вдячний співробітникам вищеназваних організацій і висловлює особливу подяку к.б.н. Д.В. Колибі і В.В. Вовку за допомогу у створенні математичної моделі дифтерійної інфекції та комп'ютерної програми для обробки результатів імуноблотингу, а також к.б.н. М.В. Скок за методично-консультативну допомогу в опануванні методів культивування клітин in vitro та керівництву НВП “ДіапрофМед” за надання рекомбінантного дифтерійного токсоїду, який не має токсичних властивостей.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені на IV Літній програмі Джона Хамфрі з імунології (Пущино, Росія, 1998); V з'їзді інфекціоністів України (Тернопіль, 1998); X з'їзді педіатрів України (Київ, 1999); Міжнародних курсах з молекулярної біології та мікробіології для молодих вчених, організованих Угорським Мікробіологічним товариством та Міжнародною школою з молекулярної біології та мікробіології університету Unesco-Hebrew міста Єрусалим (Кешелі, Угорщина, 2000); ХV конференції з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, 2000); конференціях молодих вчених “Актуальні проблеми фундаментальної та прикладної біохімії” (Київ, 2000, 2002); Науковій конференції молодих вчених в рамках спільного засідання відділень молекулярної біології, біохімії, експериментальної та клінічної фізіології і загальної біології НАН України та Вченої ради біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, 2001).

Результати окремих етапів роботи доповідались і обговорювались на засіданнях Вченої ради та наукових семінарах в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України та в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Проведені дослідження відзначені стипендією дирекції Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України для молодих вчених 2000-2001 років та Премією Президента України для молодих вчених Національної академії наук України 2001 року (Указ Президента України від 25 грудня 2001 року № 1250/2001).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 6 статей у галузевих наукових журналах (в тому числі 3 у фахових виданнях) та 6 тез у збірках українських і міжнародних наукових конференцій.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури (1 розділ, 3 підрозділи), експериментальної частини (5 розділів, 11 підрозділів), висновків, списку літературних джерел (372 найменування) і 1 додатку. Робота викладена на 162 сторінках машинописного тексту, з яких загальний обсяг (без списку літературних джерел і додатку) становить 119 сторінок. Дисертація містить 38 ілюстрацій.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ роботи

Огляд літератури. В огляді літератури докладно висвітлені сучасні погляди на молекулярну будову, механізм біологічної дії, а також особливості імунного розпізнавання ДТ та перспективи його використання в медицині.

Матеріали та методи досліджень. ДТ був виділений за допомогою двохстадійної іонообмінної хроматографії (Rappuoli R., 1983) на колонках з феніл-сефарозою та DEAE-целюлозою з культурального середовища штаму PW-8 C.diphtheriae, яке було отримане у Харківському науково-дослідному інституті мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова МОЗ України. Чистота препарату була перевірена за допомогою SDS-електрофорезу (Laemmli U.K., 1970). Рекомбінантний дифтерійний токсоїд (рДТ), у якого відсутній N-кінцевий фрагмент ДТ довжиною 28 амінокислотних залишків, що відповідає за токсичну дію, люб'язно наданий НВП “ДіапрофМед” (Київ, Україна). Токсичність ДТ і нетоксичність рДТ були підтверджені в цитотоксичному тесті на спленоцитах морських свинок. В роботі використано 20 мишей лінії Balb/c і 5 морських свинок, а також проаналізовано 100 сироваток крові дітей, хворих на дифтерію, носіїв токсигенних і нетоксигенних дифтерійних бактерій, хворих на інші захворювання верхніх дихальних шляхів та здорових імунізованих вакциною АКДП, що отримані в Дитячій інфекційній лікарні № 12 м. Києва.

Для розробки методів виявлення ДТ і антитіл проти нього з протидифтерійної антитоксичної сироватки коня (“Аллерген”, Росія) були виділені специфічні до ДТ F(abў)2-фрагменти антитіл осадженням сульфатом амонію (Harlow E., 1988) і гельфільтрацією на колонці з сефадексом G-25 (Остерман Л.А., 1985). За допомогою перйодатного методу (Nakane P.K., 1974) синтезовано кон'югат F(abў)2-фрагментів імуноглобулінів коня проти ДТ з пероксидазою (рис. 1), а також за допомогою N-гідроксисукцинімідного ефіру біотину отримано біотинильовані похідні F(abў)2-фрагментів (Кэтти Д., 1991) (рис. 2). Активність і специфічність кон'югатів перевірена за допомогою непрямого ІФА (Егоров А.М., 1991).

Рис. 1. Синтез кон'югату F(abў)2-фрагментів імуноглобулінів коня проти ДТ з пероксидазою за допомогою перйодатного методу. Примітка. На рисунку позначено “Ig” – F(abў)2-фрагмент імуноглобуліну коня проти ДТ; “П” – пероксидаза.

Рис. 2. Біотинилювання F(abў)2-фрагментів імуноглобулінів коня проти ДТ за допомогою N-гідроксисукцинімідного ефіру біотину. Примітка. На рисунку позначено “Ig” – F(abў)2-фрагмент імуноглобуліну коня проти ДТ.

Вміст ДТ в сироватках крові дітей визначали за допомогою методу "сендвіч"-ІФА з використанням біотинильованих F(abў)2-фрагментів антитіл коня проти ДТ і кон'югату стрептавідину з полімерною пероксидазою, який було обрано як найбільш ефективний серед трьох розроблених варіантів "сендвіч"-ІФА. Рівень антитіл проти ДТ в сироватках крові визначали методом непрямого ІФА і виражали у вигляді титру антитіл. Титром антитіл в ІФА вважали максимальне розведення сироватки, при якому значення інтенсивності імуноферментної реакції перевищувало в 2 рази відповідне значення контрольної суміші сироваток здорових людей (Ling T.Y., 1993).

Субодиниці А і В ДТ отримували методом обмеженого гідролізу ДТ трипсином (Drazin R., 1971). Розщеплення молекули ДТ на субодиниці контролювали за допомогою електрофорезу. Специфічність антитіл до окремих субодиниць ДТ досліджували методом імуноблотингу в модифікації, описаній в роботі (Романюк С.І., 2001). Результати імуноблотингу оцінювали кількісно за допомогою денситометричної комп'ютерної програми, що була створена за допомогою пакету програм “Delphi 3.0.” (“Borland”, США). Програма апробована при аналізі результатів електрофорезу проб, які містили відомі концентрації сироваткового альбуміну бика, а також успішно застосована для обробки результатів авторадіографії (Hobta A., 2001).

З метою отримання наближених чисельних рішень математичної моделі дифтерійної інфекції використано метод Рунге-Кутта (Заварыкин В.М., 1990), який реалізували у вигляді комп'ютерної програми, що була створена за допомогою програми “Microsoft Visual Basic for Excel 97” (“Microsoft”, США).

Для вивчення імунобіологічної активності ДТ in vitro використані клітини імунної системи мишей і морських свинок: спленоцити, адгезивні фагоцити та В-лімфоцити, специфічні до овальбуміну і ДТ. Клітини культивували в стерильних умовах при 370 С у вологій атмосфері, насиченій СО2, в середовищі RPMI-1640, яке містило 4,765 мг/мл Hepes, 5ґ10-5 М 2-меркаптоетанолу, 50 мкг/мл гентаміцину, 10% ембріональної сироватки крові теляти (рН=7,3). Життєздатність клітин після інкубації з ДТ оцінювалась при їх забарвленні трипановим синім і підрахунку в камері Горяєва (Клаус Д., 1990).

Спленоцити отримували з селезінок інтактних тварин за стандартною методикою (Клаус Д., 1990). Суспензії цих клітин з концентрацією 2ґ106 кл/мл вносили по 100 мкл в лунки 96-лункових планшетів для культивування клітин. Фагоцити виділяли з суспензії спленоцитів, використовуючи їх підвищену здатність до адгезії (Клаус Д., 1990), культивували в чашках Петрі або на предметних скельцях, а потім визначали їх життєздатність і фагоцитарну активність (Пастер Е.У., 1989) по відношенню до спор штаму ІР 5832 бактерій Bacillus cereus, що були отримані з препарату “Бактисубтил” (“Hoechst Marion Roussel”, Франція).

Для отримання В-лімфоцитів різної специфічності тварин імунізували за класичною схемою овальбуміном і рДТ по 50 мкг/тварину для мишей і 150 мкг/тварину для морських свинок (Harlow E., 1988). Ефективність імунізації контролювали шляхом визначення в сироватках крові тварин рівня специфічних антитіл методом непрямого ІФА. Для виявлення специфічних антитіл у морських свинок був синтезований кон'югат білка А стафілококу з пероксидазою (Егоров А.М., 1991), активність і специфічність якого перевіряли методом непрямого ІФА. В-лімфоцити різної специфічності виділяли з суспензій спленоцитів імунізованих тварин на 5-й день після останньої імунізації за допомогою антиген-специфічного пенінгу (Steenbakkers P.G., 1993) – методу афінного виділення специфічних В-клітин на пластиковій поверхні з сорбованим антигеном. Ефективність виділення контролювали шляхом перевірки відлипання клітин від пластикової поверхні при додаванні відповідного антигену, а також за допомогою імунофлуоресцентного забарвлення клітин синтезованими кон'югатами рДТ і овальбуміну з флуоресцеїнізотіоціанатом (Кэтти Д., 1991).

Дослідження загальних антигенних властивостей ДТ. ДТ, виділений з культурального середовища дифтерійних бактерій, був досліджений щодо його чистоти і функціональної активності. Результати електрофорезу показали, що одержаний препарат містив один білок з молекулярною вагою 58 кДа, що відповідає молекулярній вазі ДТ. Цитотоксичний вплив ДТ на спленоцити морських свинок проявлявся, починаючи з концентрації 0,00001 нг/мл.

На основі “сендвіч”-ІФА розроблено три методи виявлення ДТ в сироватці крові людини: 1) за допомогою кон'югату F(abў)2-фрагментів антитіл коня проти ДТ з пероксидазою; 2) за допомогою біотинильованих F(abў)2-фрагментів антитіл коня проти ДТ та кон'югату екстравідину з пероксидазою; 3) за допомогою біотинильованих F(abў)2-фрагментів антитіл коня проти ДТ та кон'югату стрептавідину з полімерною пероксидазою. Порівняльний аналіз цих методів показав, що метод з використанням біотинильованих F(abґ)2-фрагментів антитіл коня проти ДТ і кон'югату стрептавідину з полімерною пероксидазою вигідно відрізняється від двох інших методів детекції ДТ високою чутливістю (1нг/мл) та інтенсивністю сигналу (рис. 3).

При аналізі вмісту ДТ в сироватках крові дітей різних діагностичних груп, що проводився за допомогою найбільш чутливого методу, було виявлено ДТ у вільній формі переважно лише у хворих на дифтерію, причому, частота виявлення ДТ в цій групі складала 51,4% (рис. 4а). У решти хворих на дифтерію, очевидно, концентрація вільного ДТ в сироватці становила менше 1 нг/мл, або токсин знаходився переважно у складі імунних комплексів.

Рис. 3. Чутливість трьох методів визначення ДТ: 1 - за допомогою кон'югату F(abў)2-фрагментів антитіл коня проти ДТ з пероксидазою; 2 - за допомогою біотинильованих F(abў)2-фрагментів антитіл коня проти ДТ та кон'югату екстравідину з пероксидазою; 3 - за допомогою біотинильованих F(abў)2-фрагментів антитіл коня проти ДТ та кон'югату стрептавідину з полімерною пероксидазою.

Рис. 4. Частота виявлення ДТ (а), а також високих і низьких титрів антитіл проти ДТ (б) в різних групах дітей: 1 – хворі на дифтерію; 2 – носії токсигенних дифтерійних бактерій; 3 – носії нетоксигенних дифтерійних бактерій; 4 – здорові та хворі на інші захворювання, імунізовані вакциною АКДП.

Визначення рівня антитіл проти ДТ в сироватках крові дітей різних груп показало, що високі титри антитіл проти ДТ (1:8100 і більше) частіше всього зустрічалися у носіїв токсигенних дифтерійних бактерій (72,2%) і у хворих на дифтерію (56,8%) (рис. 4б). Низькі титри антитіл проти ДТ (1:300 і менше) виявлені у здорових дітей, переважної більшості (85,7%) хворих на інші захворювання дихальних шляхів і у 50% носіїв нетоксигенних дифтерійних бактерій.

Розроблені імуноферментні методи виявлення ДТ і антитоксичних антитіл можуть бути використані для вдосконалення існуючих методів діагностики дифтерії. ДТ або титри антитіл проти нього більше 1:2700 виявлені у 84% хворих на дифтерію, 83% носіїв токсигенних дифтерійних бактерій і лише у 7% хворих на інші інфекційні захворювання дихальних шляхів. Отже, одночасне визначення двох показників: вмісту в сироватці крові ДТ і антитіл проти нього дозволяє досягти чутливості діагностики 84% та специфічності 93%.

У хворих на дифтерію і носіїв токсигенних дифтерійних бактерій в повній мірі проявляються імуногенні властивості ДТ, що викликає синтез великої кількості антитоксичних антитіл, в той час як ДТ виявляється переважно лише у хворих на дифтерію. Можливо, що антитіла проти ДТ у хворих і носіїв, відрізняються за своїми якісними характеристиками, наприклад, за специфічністю, внаслідок чого мають різні протективні властивості. Тому у дітей різних діагностичних груп була досліджена специфічність антитіл до окремих субодиниць молекули ДТ.

Дослідження антигенних властивостей субодиниць ДТ. ДТ розщеплювали на субодиниці А і В обмеженим гідролізом трипсином, після чого проводили електрофоретичне розділення субодиниць й імуноблотинг. Результати електрофорезу підтвердили, що після обробки трипсином ДТ розпався на 2 фрагменти з молекулярною вагою 21 кДа і 37 кДа, характерною для субодиниць А і В токсину.

З метою кількісної оцінки результатів імуноблотингу була створена денситометрична комп'ютерна програма, за допомогою якої отримані профілі середньої інтенсивності забарвлення вздовж нітроцелюлозних мембран, а також для кожної сироватки обчислений коефіцієнт В/А, що дорівнював відношенню площ відповідних піків інтенсивності та відображав співвідношення кількості антитіл до субодиниць В і А токсину в сироватці крові (рис. 5).

Результати денситометричного аналізу показали, що для різних груп дітей є характерним різне співвідношення антитіл до субодиниць В і А ДТ. У хворих на дифтерію в 57 % випадків переважали антитіла до субодиниці А ДТ, а у носіїв дифтерійних бактерій і, особливо, у імунізованих вакциною АКДП (як здорових, так і хворих на інші захворювання) частіше переважали антитіла до субодиниці В (Рис. 6). Аналогічні результати були отримані при розрахунках середнього значення коефіцієнту В/А: максимальне значення отримано для здорових (В/А=16,75) і хворих на інші інфекційні захворювання (В/А=15,98), а мінімальне – для хворих на дифтерію (В/А=2,32). Ймовірно, переважання в сироватці крові антитіл до субодиниці А ДТ над антитілами до субодиниці В може бути додатковим критерієм при діагностиці дифтерії.

В молекулі ДТ субодиниця А просторово екранована субодиницею В (Choe S., 1992). Тому часте переважання антитіл до субодиниці А у хворих на дифтерію можна пояснити розщепленням нативного ДТ фурином клітин-“мішеней” або протеїназами, що активуються в осередку запалення. При обробці формальдегідом молекула ДТ стабілізується за рахунок метиленових зшивок, які перешкоджають її розщепленню на субодиниці, тим самим, усуваючи токсичність (Воробьев А.А., 1965). Тому у дітей, антитоксичний імунітет яких обумовлений, головним чином, вакцинацією анатоксином, частіше переважають антитіла до субодиниці В.

Рис. 5. Визначення кількісного співвідношення антитіл до субодиниць В і А ДТ в сироватці крові за допомогою денситометричної програми. Примітка. На рисунку обернені піки інтенсивності забарвлення вдовж нітроцелюлозної мембрани, які відповідають кількості антитоксичних антитіл з різною специфічністю, позначені наступним чином: “ДТ” – антитіла до цілої молекули ДТ, “В” – антитіла до субодиниці В, “А” – антитіла до субодиниці А.

Рис. 6. Частота переважання антитіл до певної субодиниці ДТ над антитілами до іншої субодиниці в сироватках крові дітей різних груп: 1 – хворі на дифтерію; 2 – носії токсигенних дифтерійних бактерій; 3 – носії нетоксигенних дифтерійних бактерій; 4 – здорові та хворі на інші захворювання, імунізовані вакциною АКДП.

Оскільки саме антитіла проти субодиниці В ДТ переважно володіють протективними властивостями внаслідок здатності блокувати зв'язування токсину з рецепторами клітин-“мішеней” (Зайцев Е.М., 1985), то можна припустити, що якісні відмінності між антитілами хворих на дифтерію та носіїв можуть визначати різну форму перебігу інфекції.

Математичне моделювання взаємодії ДТ з антитілами та клітинами імунної системи. Для вивчення взаємодії ДТ з факторами імунного захисту, що обумовлена його антигенними властивостями, була створена і досліджена математична модель дифтерійної інфекції. В її основу покладений принцип класичної моделі Лотки-Вольтерра (Lotka A.J., 1925; Volterra V., 1931), яка традиційно використовується для опису взаємовідносин популяцій за типом хижак-жертва або паразит-хазяїн, з урахуванням біологічних особливостей ДТ і C. diphtheriae. Модель являла собою систему з 5 нелінійних диференційних рівнянь першого порядку (1-5), що описували динаміку ДТ, антитоксичних антитіл, дифтерійних бактерій, фагоцитів і плазматичних клітин, що синтезують антитіла, а саме:

В моделі використані наступні коефіцієнти: a1 – коефіцієнт міграції фагоцитів в зону запалення; а2 – коефіцієнт розмноження бактерій; a3 – коефіцієнт продукції ДТ; а4 – коефіцієнт антитілопродукції; a5 – коефіцієнт антигенної стимуляції; k1 – коефіцієнт ймовірності загибелі фагоцитів при зустрічі з ДТ; k2 – коефіцієнт фагоцитозу бактерій; k3 – коефіцієнт ймовірності нейтралізації ДТ антитілами; Мo – постійний рівень резидентних фагоцитів в здоровому організмі; Во – кількість активних плазматичних клітин, специфічних до ДТ, в здоровому організмі; mm – коефіцієнт еміграції фагоцитів з вогнища запалення; ma – коефіцієнт виведення антитіл; mb – коефіцієнт природної загибелі плазматичних клітин; tm – період напіввиведення фагоцитів із зони запалення; tc – період одного поділу дифтерійної бактерії; tа – період напіврозпаду антитіл; tb – період напівзагибелі активних плазматичних клітин.

При чисельному вирішенні даної системи рівнянь за допомогою методу Рунге-Кутта отримані дані щодо динаміки головних факторів інфекційного процесу при дифтерії, який завершується одужанням (рис. 7). Інші форми перебігу інфекції, що призводять до летального фіналу або хронічного процесу (носійства) також можуть бути описані за допомогою даної моделі. Моделювання початкових етапів інфекції дозволило знайти мінімальну дозу бактерій, здатну викликати інфекційний процес (рис. 8), а також визначити захисний рівень антитоксичних антитіл, необхідний для попередження захворювання (рис. 9). Співставлення модельних розрахунків з літературними даними про перебіг експериментальної дифтерійної інфекції у морських свинок показало, що динаміка інфекційного процесу, передбачена за допомогою моделі, досить близька до реальної.

Рис. 7. Моделювання динаміки основних факторів інфекційного процесу при дифтерії: 1 – ДТ, 2 – антитоксичних антитіл, 3 – дифтерійних бактерій, 4 – активних фагоцитів і 5 – плазматичних клітин.

Рис. 8. Динаміка чисельності дифтерійних бактерій в залежності від їх початкової кількості С(0), вираженої в умовних одиницях: 1 – С(0) = 0,003; 2 – С(0)= 0,002; 3 – С(0) = 0,001.

Для моделювання ефекту введення протидифтерійної антитоксичної сироватки (ПДС) коня, яку використовують для лікування хворих на дифтерію, в систему ввели додаткове рівняння, що описує швидкість виведення антитоксичних антитіл коня S(t) з організму:

де k4 – ймовірність нейтралізації ДТ антитілами коня; ms – коефіцієнт виведення антитіл коня; ts – час напіввиведення антитіл коня, а також додали до правої частини рівняння (1) член –k4S(t)D(t). Рішення системи рівнянь (1-6) показало, що недостатня кількість антитоксичних антитіл або невчасне їх введення (рис. 10) може лише тимчасово пригнітити інфекцію.

Існування проблеми вибору дози ПДС обумовлене тим, що недостатня її доза може призвести до переходу інфекції у хронічний стан, а повторне введення – часто призводить до виникнення ускладнень алергічного характеру. Таким чином, розроблена математична модель є важливим кроком у пошуку кількісних підходів для прогнозування перебігу дифтерійної інфекції та розрахунку терапевтичних доз ПДС коня в залежності від тривалості захворювання та даних про рівень ДТ і антитоксичних антитіл в сироватці крові хворого, які можуть бути визначені за допомогою запропонованих в роботі імуноферментних методів.

Рис. 9. Динаміка чисельності дифтерійних бактерій в залежності від початкового титру антитіл проти ДТ при однаковій дозі зараження (С(0) = 0,002): 1 – Ао = 0,005 МО/мл; 2 – Ао = 0,01 МО/мл; 3 – Ао = 0,02 МО/мл.

Рис. 10. Результати прогнозування впливу на динаміку рівня ДТ різних доз ПДС і часу її введення: 1 – ПДС не вводилась; 2 – 1000 МО на 1-шу добу; 3 – 3000 МО на 1-шу добу; 4 – 1000 МО на 7-му добу; 5 – 10 000 МО на 7-му добу. Примітка. МО – міжнародні одиниці кількості антитіл.

Вплив ДТ на клітини імунної системи чутливих і нечутливих до нього видів тварин. З метою встановлення антигенних та імунобіологічних властивостей ДТ, які дозволяють йому протидіяти захисним факторам організму, був досліджений вплив токсину на клітини імунної системи. Як відомо, для здійснення цитотоксичної функції необхідно, щоб ДТ після зв'язування з клітинним рецептором HB-EGF (Naglich J.G., 1992) потрапив у ендосому з кислим середовищем. Саме завдяки низькому значенню рН в його молекулі проходять конформаційні зміни, які дозволяють субодиниці А проникнути в цитозоль і зупинити синтез білка в клітині (Sandvig K., 1981). Нами висунута гіпотеза, що ДТ може проникати в В-лімфоцити через специфічні імуноглобулінові рецептори, а також в фагоцити шляхом фагоцитозу, оскільки в цих випадках він також потрапляє в ендосому з кислим середовищем і може активуватись. Для перевірки цієї гіпотези були проведені порівняльні дослідження на нечутливих до ДТ мишах, у яких HB-EGF не здатний зв'язуватись з токсином (Abraham J.A., 1993), і чутливих до ДТ морських свинках.

Токсична дія ДТ на суспензії спленоцитів тварин виявлялася, починаючи з концентрації ДТ 0,00001 нг/мл для морських свинок і 0,1 нг/мл для мишей. Причому, під впливом ДТ життєздатність клітин обох видів тварин різко знижувалась протягом перших 2-3 годин, а потім протягом доби практично не змінювалась. Тому з метою вивчення можливих шляхів проникнення ДТ в спленоцити мишей були обрані концентрації ДТ більше 0,1 нг/мл, а тривалість інкубації клітин з ДТ становила 3 години.

Для перевірки можливості проникнення токсину у В-клітини через специфічні до нього імуноглобулінові рецептори був вивчений вплив ДТ (10 нг/мл) на життєздатність В-клітин, специфічних до ДТ і контрольного антигену – овальбуміну. Щоб отримати В-клітини, специфічні до ДТ, тварин імунізували рекомбінантним дифтерійним токсоїдом, в якого відсутня N-кінцева ділянка з 28 амінокислотних залишків, що відповідає за токсичний ефект (рис. 11).

Проведені дослідження показали, що майже половина В-клітин мишей, що не мали класичного рецептора до ДТ, але несли специфічні до нього імуноглобулінові рецептори, гинули при інкубації з токсином, в той час як життєздатність В-клітин мишей, специфічних до овальбуміну, при інкубації з токсином майже не змінювалася в порівнянні з контролем (рис. 12).

Рис. 11. Будова рекомбінантного дифтерійного токсоїду (рДТ), в якого відсутня N-кінцева ділянка ДТ 1-28 (позначена стрілкою), що відповідає за токсичний ефект.

Рис. 12. Частка В-клітин, специфічних до овальбуміну і рДТ, що вижили після інкубації з ДТ (10 нг/мл), по відношенню до живих В-клітин в контролі у мишей і морських свинок. Примітка. На рисунку позначені статистично достовірні за критерієм Стьюдента відмінності від контролю: “**”– р<0,05; “*” – р<0,001.

При порівнянні чутливості до ДТ В-клітин мишей і морських свинок було виділено три групи клітин. Стійкими до ДТ виявились В-клітини мишей, специфічні до овальбуміну, які не мали ніяких рецепторів до токсину. Більш чутливими були В-клітини мишей, які мали імуноглобулінові рецептори до ДТ, та В-клітини морських свинок, які мали класичні рецептори до ДТ. А найбільш чутливими виявилися В-клітини морських свинок, специфічні до ДТ, які мали два типи рецепторів, здатних з ним зв'язуватись.

При вивченні впливу ДТ (0,1-10 нг/мл) на життєздатність адгезивних фагоцитів селезінки виявилося, що хоча його цитотоксичний ефект сильніше проявлявся по відношенню до фагоцитів морських свинок, ДТ також істотно впливав на фагоцити мишей (рис. 13). Здатність ДТ вражати систему неспецифічного захисту організму навіть у нечутливих до токсину тварин підтверджена і в експериментах по вивченню впливу ДТ на функціональну активність фагоцитів мишей. Як видно з рисунку 14, під впливом ДТ (10 нг/мл) здатність фагоцитів мишей поглинати спори бактерій Bacillus cereus зменшувалась в 3,6 рази.

Рис. 13. Частка фагоцитів, що вижили після інкубації з ДТ, по відношенню до живих фагоцитів в контролі у мишей і морських свинок

Рис. 14. Функціональна активність фагоцитів мишей: 1 – в контролі; 2 - при інкубації з ДТ (10 нг/мл). Примітка. На рисунках позначені статистично достовірні за критерієм Стьюдента відмінності від контролю: “**”– р<0,05; “*” – р<0,001.

Таким чином, отримані результати свідчать на користь висунутого нами припущення, що ДТ може проникати у фагоцити і специфічні до нього В-лімфоцити та викликати їх загибель навіть при відсутності класичного рецептора до ДТ. Це означає, що ДТ має потенційну здатність пригнічувати гуморальну імунну відповідь, спрямовану проти нього, і перешкоджати виконанню фагоцитами захисних функцій в організмі. Отримані дані дозволяють також припустити, що імунотоксини, які складаються з дифтерійного токсоїду і антигенного компонента, можуть виявитися перспективними для вибіркового знищення певних популяцій В-клітин при лікуванні аутоімунних захворювань.

Ймовірно, у інших бактеріальних токсинів, що активуються в ендосомах при низьких рН, також існують додаткові шляхи проникнення в клітини імунної системи. Очевидно, здатність ДТ уражати фагоцити та специфічні до нього В-лімфоцити не є унікальною властивістю даного токсину, а скоріше, – є прикладом чисельних пристосувань, що виникли в процесі еволюції в системі “паразит-хазяїн”, які дозволяють патогенним бактеріям використовувати токсини в боротьбі з імунною системою і виживати за рахунок цього в організмі хазяїна.

ВИСНОВКИ

1. У дисертаційній роботі встановлені антигенні властивості ДТ і його субодиниць при різних формах дифтерійної інфекції у дітей, а також виявлені імунобіологічні властивості ДТ, які дозволяють йому протидіяти факторам імунного захисту.

2. Розроблено імуноферментний метод виявлення ДТ з використанням біотинильованих похідних F(abґ)2-фрагментів антитіл коня та кон'югату стрептавідину з полімерною пероксидазою, який виявився достатньо чутливим для застосування його у діагностиці дифтерії. Одночасне визначення вмісту в сироватці крові ДТ і антитіл проти нього дозволяє досягти чутливості діагностики 84% та специфічності – 93%.

3. За допомогою розроблених методів виявлення ДТ і антитіл проти нього встановлено, що завдяки сильним антигенним та імуногенним властивостям природного ДТ відбувається активний синтез антитіл проти нього у 72,2% носіїв токсигенних дифтерійних бактерій і у 56,8% хворих на дифтерію, хоча ДТ у вільній формі переважно виявляється тільки в сироватках крові хворих на дифтерію.

4. Показано, що імунне розпізнавання окремих субодиниць ДТ при дифтерійній інфекції та після вакцинації відрізняється: у хворих на дифтерію у 57 % випадків утворюються антитіла переважно до субодиниці А ДТ, а у носіїв дифтерійних бактерій і, особливо, у хворих на інші захворювання та здорових дітей, імунізованих дифтерійним анатоксином, в сироватці крові частіше переважають антитіла до субодиниці В.

5. Встановлено, що ДТ може проникати у В-лімфоцити через специфічні до нього імуноглобулінові рецептори та у фагоцити шляхом неспецифічного поглинання та викликати загибель цих клітин навіть за відсутності у них класичного рецептора для ДТ, що свідчить про потенційну здатність токсину пригнічувати гуморальну імунну відповідь, спрямовану проти нього, та перешкоджати виконанню фагоцитами захисних функцій в організмі.

6. Запропонована математична модель дифтерійної інфекції, що описує динаміку ДТ і головних захисних чинників організму, дозволяє моделювати форму протікання інфекції, якісно оцінювати вплив різноманітних факторів на перебіг захворювання і може знайти застосування при розрахунку індивідуальних доз протидифтерійної сироватки крові коня в залежності від тривалості інфекції та даних про рівень ДТ і антитоксичних антитіл у сироватці крові хворого.

7. Створена денситометрична комп'ютерна програма, що дозволяє кількісно оцінювати результати імуноблотингу, також може бути застосована для аналізу результатів одномірного електрофорезу, авторадіографії тощо.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Крамарев С.А., Литвиненко Н.Г., Буц А.Р., Кавун Э.М., Колибо Д.В., Романюк С.И., Джеджула Г.Г., Радавский Ю.Л., Комиссаренко С.В. Значение обнаружения токсина в крови при дифтерийной инфекции у детей // Лабораторная диагностика. – 1998. № 3. – С. 21-24.

2. Литвиненко Н.Г., Буц О.Р., Радавський Ю.Л., Кавун Е.М., Колибо Д.В., Романюк С.І., Михальський Л.О., Фуртат І.М. Значення виявлення токсину та антитоксину в крові при дифтерійній інфекції у дітей // Дитячі інфекції. – 1999. № 25. – С. 47-54.

3. Литвиненко Н.Г., Буц О.Р., Дорошенко В.О., Головач О.В., Бадакіна І.Г., Радавський Ю.Л., Кавун Е.М., Колибо Д.В., Романюк С.І. Оцінка гуморального антитоксичного імунітету при дифтерії у дітей // Дитячі інфекції. – 2001. № 28. – С. 16-22.

4. Романюк С.И., Колибо Д.В., Кавун Э.М., Радавский Ю.Л., Ткаченко Т.Ю., Крамарев С.А., Комиссаренко С.В. Специфичность антител к субъединицам дифтерийного токсина у детей с