МIНIСТЕРСТВО ОСВIТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ХАРКIВСЬКИЙ НАЦIОНАЛЬНИЙ УНIВЕРСИТЕТ ім. В.Н. КАРАЗІНА

РУБIН Юрiй Вадимович

УДК 577.3

ФIЗИЧНI ВЛАСТИВОСТІ БIОЛОГIЧНО АКТИВНИХ АНАЛОГIВ КОМПОНЕНТIВ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

03.00.02 - бiофiзика

Автореферат

дисертацiї на здобуття наукового ступеня

доктора фiзико-матемaтичних наук

Харкiв-2002

Дисертацiєю є рукопис.

Робота виконана у Фiзико-технiчному iнституті низьких температур

iм. Б.I. Вєркiна НАН України (м. Харків).

Офiцiйнi опоненти:

доктор фiзико-математичних наук, професор Семенов Михайло Олексійович, Iнститут радiофізики та eлектронiки НАН України, провідний науковий співробітник (м. Харків);

доктор фiзико-математичних наук, старший науковий співробітник Волков Сергій Наумович, Iнститут теоретичної фiзики НАН України, провідний науковий співробітник (м. Київ);

доктор фiзико-математичних наук, професор Димант Леонід Наумович, Севастопольский національний технічний університет, професор (м. Севастополь).

Провiдна установа:

Iнститут фiзики НАН України, відділ фізики біологічних систем (м. Київ).

Захист вiдбудеться “_10____” _січня______2003 року о _15____ годинi на засiданнi спецiалiзованої вченої ради Д 64.051.13 Харкiвського нацiонального унiверситету ім. В.Н. Каразіна, 61077, м. Харкiв, пл. Свободи, 4, ауд.7-4.

З дисертацiєю можна ознайомитись у Центральнiй науковiй бiблiотецi Харкiвського нацiонального унiверситету ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харкiв, пл. Свободи, 4.

Автореферат розiсланий “__5__”_грудня________ 2002 р.

Вчений секретар

спецiалiзованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Увага багатьох дослідників в останні десятиріччя була привернута до вивчення фізичних властивостей канонічних основ нуклеїнових кислот. Ці дослідження у великій мірі забезпечили успіх у вивченні первинної, вторинної і т. д. структур нуклеїнових кислот, дозволили значно просунутися у вивченні функціонування нуклеїнових кислот, їх взаємодії з гістонами, ферментами, іонами металів, лікарськими препаратами, дозволили вивчити дію радіації та УФ опромінення на нуклеїнові кислоти.

Проте, на відміну від великої та заслуженої уваги, що приділялася спектроскопічним та іншим фізичним властивостям канонічних основ, фізичні властивості аналогів компонентів нуклеїнових кислот (АКНК) вивчені недостатньо.

Водночас відомо, що велика кількість аналогів компонентів нуклеїнових кислот має високу фармакологічну активність. Ці аналоги - основи, нуклеотиди та нуклеозиди мають структурні зміни в гетероциклічній, вуглеводній або ж у фосфатній частині молекули. Їхні фармакологічні властивості базуються на їхній дії на біосинтез нуклеїнових кислот у клітині. Цей тип речовин включає молекули, що мають протипухлинну, антивірусну, імунодепресивну дію, такі, як 5-фторурацил (5FU), 6-тіогуанін (6SG), 5- та 6-азацитозин (5azaC, 6аzаС), 6-азаурацил (6аzаU), та інші. Багато які з них виявляють свою фармакологічну дію після трансформації в моно-, ди- або три-фосфати нуклеозидів.

Молекулярний механізм дії деяких аналогів компонентів нуклеїнових кислот (АКНК) пов'язаний із заглушенням біосинтезу de novo попередників РНК та ДНК - пуринів та піримідинів, до яких, зокрема, належать 6аzаС та 6аzаU.

З іншого боку, існують АКНК, що впливають на біосинтез або на біотрансформацію макромолекулярних нуклеїнових кислот. Деякі з АКНК є такими, що заглушують ДНК-полімерази, біологічна дія інших виявляється під час включення цих молекул у первинну структуру нуклеїнових кислот. Було доведено, що АКНК арабінозилцитозин діє на ініціалізацію та редуплікацію ДНК, та що тіопурини впливають на редакторську функцію ДНК-полімерази. Важливим результатом включення 5-азацитозину в ДНК є заглушення метилювання ДНК. 5-Фторурацил, включений у РНК, викликає поліаденілізацію РНК.

Незважаючи на велику кількість рoбіт, присвячених біологічним та медичним застосуванням багатьох аналогів компонентів нуклеїнових кислот, кількість робіт, де аналізуються молекулярні механізми дії зазначених аналогів, вкрай обмежена. Пов’зано це, зокрема, з недостатньою кількістю робіт, присвячених вивченню фізичних та фізико-хімічних властивостей багатьох аналогів компонентів нуклеїнових кислот. Так, наприклад, у 1995 році у міжнародному журналі J. Organіc Chemіstry було надруковано, що у доступній авторам літературі відсутні експериментальні дані про важливіші фізико-хімічні властивості 6-тіогуаніну. Вивчення метаболізму АКНК викликає велику зацікавленість наукової громадськості. Цикл робіт з вивчення біотрансформації низки АКНК, у тому числі тіопуринів, був відзначений Нобелівською премією у 1988 році.

Усе вище згадане обумовлює актуальність докладних теоретичних та експериментальних досліджень фізичних властивостей аналогів компонентів нуклеїнових кислот з метою застосування їх для вивчення молекулярних механізмів дії, зокрема, взаємодії АКНК з нуклеїновими кислотами та численними ферментами клітини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконувалась у відповідності з планами науково-дослідних робіт відділу молекулярної біофізики Фізико-технічного інституту низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України “Дослідження структурних та фізико-хімічних властивостей комплексів нуклеїнових кислот з білками та біологічно активними речовинами” та “Дослідження структурних та фізико-хімічних властивостей комплексів нуклеїнових кислот з біологічно активними речовинами” (рег. номер 0195U009876), а також Всесоюзної Державної Науково-технічної програми ДКНТ СРСР "Геном людини" (тема "Розробка методів кріоконсервації клонотек фрагмeнтів ДНК“- рег. номер 1.1.1.1.01./203) та Програми ДКНТ СРСР "Низькотемпературний генетичний банк промислових і рідкісних риб та водних безхребетних" (рег. номер 03.04.06 018-9).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є визначення фізичних властивостей: молекулярної структури, стабільності, електронної структури, енергетичного спектра - аналогів компонентів нуклеїнових кислот як основи для вивчення їхніх молекулярних механізмів дії та нових застосувань.

Об’єктом дослідження є фізичні основи молекулярних механізмів дії аналогів компонентів нуклеїнових кислот, що мають біологічну активність.

Предметом дослідження є фундаментальні фізичні властивості – молекулярна структура, розподіл електронної густини, стабільність, енергетичний спектр цих сполук.

Відповідно до поставленої мети були поставлені та вирішені наступні задачі:

- Визначити фундаментальні фізичні властивості 6SG: просторову та електронну структуру, енергетичний спектр - і побудувати діаграму електронно-збуджених станів 6SG;

- виявити особливості побудови 6SG, зумовлені заміною кисню сіркою;

- вивчити стабільність таутомерних форм 6SG, побудувати схему кислотно-основної і таутомерної рівноваги 6SG;

- виявити нові можливості використання 6SG, зокрема, використання 6SG як люмінесцентної мітки, вивчити з його допомогою структурні переходи в кріопротекторах і розчинах ДНК в широкому інтервалі температур;

- визначити фізичні характеристики: молекулярну структуру, дипольні моменти, розподіл електронної густини, УФ та ІК спектри - 5- та 6-азацитозину, 6-азаурацилу, а також димеру 5-азацитозину з гуаніном;

- вивчити стабільність таутомерів 4-тіоурацилу та його аніонів;

- виявити ефекти міжмолекулярних взаємодій в асоціатах основ нуклеїнових кислот.

Для рішення поставлених у роботі задач були використані теоретичні та експериментальні методи дослідження. За допомогою неемпіричних методів (методу Хартрі-Фока, методів теорії збурень (МР2, МР4)) були проведені розрахунки повної енергії, молекулярної структури в газовій фазі та полярному розчиннику, розподілу електронної густини, коливальних спектрів, енергії міжмолекулярної взаємодії. Для розрахунку енергій електронних переходів, елементів електронної структури в електронно-збуджених станах були застосовані методи CNDO/S та CІS. При виконанні експериментальних досліджень були застосовані методи низькотемпературної люмінесцентної спектроскопії, а також методи абсорбційної та КД спектроскопії.

Наукова новизна одержаних результатів. При виконанні дисертаційної роботи одержані нові та оригінальні результати.

Вперше вивчені фізичні властивості протипухлинного препарату 6-тіогуанину, побудовані схема кислотно-лужної та таутомерної рівноваги у полярному розчиннику та діаграми електронно-збудженого стану.

Вперше запропоновано застосувати 6-тіогуанин як люмінесцентну мітку та за його допомогою вивчена поведінка розчинів ДНК в інтервалі температур 4.2-273К.

Із застосуванням ab іnіtіo методів розрахунків впливу дії розчинника вперше зроблені докладні дослідження таутомерії нейтральних та іонних форм 4-тіоурацилу.

Методами ab іnіtіo вперше вивчені фізичні властивості 5- та 6- аза-цитозинів, 6-азаурацилу, що мають протипухлинну активність.

Запропонована та обгрунтована гіпотеза прямої дії eкологічного УФ світла на ДНК.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати знайдуть застосування у молекулярній біології та фармакології, зокрема, при вивченні молекулярних механізмів дії протипухлинних та імуномодулюючих препаратів 6SG, 5azaC, 6azaC.

Отримані результати щодо спектроскопічних властивостей та таутомерії 6SG та 4SU знайдуть застосування при використанні їх як мішені для утворення фотохімічних зшивок при дослідженні субстрат-ферментних комплексів та при використанні їх як фотосенсибілізаторів.

Гіпотеза про пряму дію УФ світла на ДНК може бути застосована для створення більш повної теорії впливу сонячного світла на живі організми та для профілактики фотоканцерогенезу.

Одержані результати щодо поведінки розчинів ДНК (як з кріопротекторами, так і без них) в інтервалі температур 4.2-273К можуть бути застосовані в кріобіології при створенні методів кріоконсервації генетичного матеріалу.

Особистий внесок здобувача полягає в ініціюванні усієї представленої серії досліджень фізичних властивостей аналогів компонентів нуклеїнових кислот теоретичними та експериментальними методами.

У надрукованих із співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

- у працях [1, 5, 9, 10, 12, 14, 18, 22, 25, 26-32, 35-38, 41-44] - у формулюванні мети досліджень, участі в експериментальних вимірюваннях, проведенні розрахунків, обробці результатів, обговоренні результатів, формулюванні висновків;

- у роботах [6, 11, 19, 39, 40, 45] - в участі у формулюванні мети досліджень, участі у проведенні розрахунків, обговоренні результатів та формулюванні висновків;

- у роботах [2, 3, 4, 33, 34] - в участі у формулюванні мети досліджень, обговоренні результатів, формулюванні висновків;

- у роботі [15] авторові належить огляд власних результатів, одержаних із використанням низькотемпературної люмінесцентної спектроскопії.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи за темою дисертації доповідались та обговорювались на: Всесоюзному біофізичному з’їзді, Москва, 1982; Міжнародній конференції “Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов”, Латвія, 1982; Всесоюзній конференції "Актуальные проблемы химиотерапии", Чорноголовка, 1987; ІІІ и ІV Всесоюзних конференціях "Люминесцентный анализ в медико-биологических исследованиях", Ріга, Латвія, 1988, Москва, Росія, 1992; V, VІ та VІІ Всесоюзних конференціях по спектроскопії біополімерів, Харків, 1985,1988, 1991; ІV та V Всесоюзних конференціях "Химия низких температур", Москва, 1989,1991; І та ІІ Всесоюзних конференціях "Геном человека", СРСР, Переславль-Залеський, 1990,1991; ІІ Іnternatіonal Conf. "Current progress іn Cryobіology", Kharkov 1992; І та ІІ з'іздах Українського біофізичного товариства, Kиїв, 1994, Харків 1998; 34,35 Sanіbel symposіum, Florіda, USA, 1994, 1995; XІІ та XІІІ Національних школах-семінарах з міжнародною участю “Спектроскопія молекул та кристалів", Нежін, 1995, Суми 1997; Іnt. Conf. "Physіcs and Chemіstry of Organіc Lumіnophores" Kharkov, Ukraіne, 1995; Іnt. Symposіum "Computer Assіstance іn Chemіcal Research" Russіa, Moscow, 1996; 4, 5 Conferences "Current Trend іn Computatіonal Chemіstry" Vіksburg, USA, 1995, 1996; 6 Іnt. Symposіum "Molecular Aspects of Chemotherapy" Gdansk, Poland, 1997; Іnt. Conference "Hydrogen Bond-98" Kіev, Ukraіne, 1998; Yablonskі Centennіal Conference, Torun, Poland, 1998; XІІІ Іnt. Rounde Table "Nucleosіdes and Nucleotіdes and Theіr Bіologіcal Aplіcatіon" Montpellіer, France, 1998; 7 Symposіum of the European Socіety for the Study of Purіne & Pyrіmіdіne Metabolіsm іn Man", Gdansk, Poland, 1999.

Публікації. Результати дисертації опубліковані у 45 наукових працях (у тому числі у 9 одноосібних), з яких 25 статей та 20 матеріалів та тез доповідей міжнародних та національних конференцій, з’їздів, симпозіумів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, семи розділів, висновків та списку використаних літературних джерел із 422 найменувань (на 39 сторінках).

Повний текст дисертації складає 328 сторінок, робота містить 54 рисунки та 66 таблиць, з яких 4 рисунки та 8 таблиць займають повні сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтована актуальність обраної теми, сформульовані мета та задачі дослідження, визначена наукова новизна та практична цінність одержаних результатів.

У розділі 1 подано літературний огляд, який охоплює аналіз теоретичних та експериментальних досліджень, що стоcуються фізичних властивостей 6SG, 4SU, 5azaC, 6azaC та 6azaU, а також аналіз відомих на цей час молекулярних механізмів дії цих сполук.

Другий розділ дисертації присвячений характеристиці об'єктів та методів дослідження. Головним об'єктом експериментальних досліджень був 6-тіогуанін, структурна формула якого приведена на рисунку 1. Досліджувалися також похідні 6-тіогуаніну, що моделювали його таутомерні форми: 6-тіогуанозин - фіксований N9Н тіонний таутомер та 10Мe6SGR - фіксований тіольний N9Н таутомер. Крім цього досліджувався 6-тіопурин із етильним радикалом по N9 та його похідні. Нами досліджувалася також ДНК з кишкової палички Е.Соlі, у яку методом біосинтезу був включений 6-тіогуанін. Крім того, були досліджені препарати 4-тіоурацилу та канонічних основ, у тому числі кристали та агрегати основ нуклеїнових кислот.

Головними експериментальними методами дослідження були спектроскопічні методи дослідження - методи УФ абсорбційної та люмінесцентної спектроскопії. Дослідження спектрів УФ поглинання проводилися при кімнатній температурі на спектрофотометрах Hіtachі, Specord М-40. Було проведено спектрофотометричне титрування 6SG у широкому інтервалі рН із подальшою математичною обробкою спектрів. Проводилися також дослідження кругового дихроїзму 6SGR. Були проведені дослідження спектрів люмінесценції та її збудження, дослідження часу життя триплетного стану. Ці дослідження були проведені на універсальній люмінесцентній установці, останнім часом оснащеній персональним комп'ютером. Установка дозволяла проводити дослідження в інтервалі температур 4.2-273К, в тому числі дослідження температурних залежностей інтенсивності люмінесценції в цьому ж інтервалі (від гелієвих до кімнатних) температур.

Експериментальні дослідження були доповнені теоретичними розрахунками. Розрахунки повної енергії, ентропії, теплоємності, геометрії, дипольних моментів, розподілу зарядів, ІК-спектрів досліджуваних молекул, сольватаційних ефектів проводилися за допомогою неемпіричних методів ЛКАО: методу Хартрі-Фока, а також методів, враховуючих кореляцію електронів: МР2 та МР4. Розрахунки неемпіричними методами проводилися на суперкомп'ютерах фірми Sіlіcon Graphіcs під час перебування в США, а також через Інтернет. Для цих розрахунків використовувалися програми Gaussіan 92 та Gaussіan 94.

Для розрахунку енергій електронних переходів і сил осциляторів та елементів електронної структури у електронно-збуджених станах використовувалися програми розрахунків електронно-коливальних спектрів багатоатомних молекул, розроблені Грибовим, Савіним із співавторами (Грибов, 1976). Розрахунок проводився за допомогою методу CNDO/S. При цьому використовувалася геометрія молекул, розрахована неемпіричними методами.

Рис.1. Структурні формули досліджених молекул 6-тіогуаніну та його похідних.

Ці розрахунки були доповнені розрахунками енергій електронних переходів за допомогою неемпіричного методу CІS.

У розділі 3 наведені результати досліджень фізичних властивостей 6-тіогуаніну.

На початок наших досліджень просторова структура 6-тіогуаніну в полярних розчинах не була чітко встановлена. Для ідентифікації просторової структури 6-тіогуаніну в розчині були вивчені спектри УФ поглинання 6-тіогуанозину, котрий є фіксованим N9Н таутомером, і 10-метил-6-тіогуанозину, який є фіксованим тіольним N9Н таутомером (pис. 2), у воді. Були також досліджені УФ спектри 6-тіопурину з етильним радикалом та його похідного 10Me6SPR, метильованого по сірці, що використовувалися як модельні системи.

Аналіз спектрів УФ поглинання показав (рис. 2), що спектри 6-тіогуанозину та похідного 6-тіопурину зміщені в низькочастотну область відносно їхніх метильованих по сірці похідних на 4 кК. Були також проведені розрахунки енергій електронно-збуджених станів цих сполук, що показали низькочастотний зсув спектрів тіонних форм відносно спектрів тіольних форм. Порівняння експериментальних і теоретичних результатів дозволило зробити висновок щодо присутності 6-тіогуаніну в полярному розчиннику у тіонній формі. |

Рис.2. Спектри УФ поглинання нейтральних форм: 6-тіогуанозину - 1,

6SPR - 2, 10-метил-6-тіогуанозину - 3, 10Me6SPR - 4.

Питання про знаходження протона в імідазольному кільці 6-тіогуаніну було вирішено за допомогою досліджень спектрів УФ поглинання і люмінесценції 6-тіогуанозину та 6-тіогуаніну, котрий апріорі здатний до N7Н та N9Н таутомерії, в розчинах, що мають різну полярність, а також за допомогою розрахунків енергій електронно-збуджених станів таутомерів 6-тіогуанину.

Проведені експериментальні та теоретичні дослідження показали, що у воді 6-тіогуанін існує в вигляді тіонного N9Н таутомеру, а в етанолі - у вигляді суміші двох тіонних таутомерів: N7Н і N9Н таутомерів.

За допомогою неемпіричних методів (НF і МР2) був проведений розрахунок молекулярної структури (довжин зв'язків і кутів між атомами) п'яти найбільш стабільних таутомерів 6SG. Ці розрахунки були зроблені проф. Лещинським з нашою участю і подані в нашій спільній публікації. На рис. 3 приведена просторова структура N9Н таутомеру 6-тіогуаніну та гуаніну. Треба відзначити, що така таутомерна форма 6-тіогуаніну існує тільки у воді, тому дані рентгеноструктурного аналізу для цієї форми відсутні. Слід також зазначити, що при виконанні дисертаційнoї роботи ми досліджували фізичні властивості також N7Н тіонного та N9Н тіольногo таутомерів, але в авторефераті, за браком місця, ми в основному наводимо результати досліджень лише для одного, найбільш поширeного у водному середовищі N9Н тіонного таутомеру. На рис. 3 перший і другий рядки показують результати розрахунку методами МР2 та НF для 6-тіогуаніну, третій рядок - результати розрахунку для гуаніну, виконаного методом МР2.

Рис.3. Структурні формули, розраховані довжини зв’язків та кути між атомами N9Н-таутомерів тіонної форми 6-тіогуаніну та кетонної форми гуаніну.

Порівняння першого та третього рядків показує значну подібність довжин зв'язків 6-тіогуаніну і гуаніну в піримідиновому та імідазольному кільцях. Відмінності спостерігаються для екзоциклічних тіокарбонільного та карбонільного зв'язків: тіокарбонільний зв'язок С=S 6-тіогуаніну має довжину 1.645А, а карбонільний зв'язок С=О гуаніну - 1.225А. Невеликі відмінності (0.01-0.02А) спостерігаються для зв'язків N1-С6 і С5-С6. Як і у гуаніну, аміногрупа у 6-тіогуаніну с неплоскою, зокрема, протон аміногрупи, що прилягає до N1Н, виведений з площини на 40о.

Треба відзначити, що проведений нами аналіз експериментальних (визначених методом рентгеноструктурного аналізу) (Тсевалт, 1974) і розрахованих довжин зв'язків для пуринового ядра N7Н таутомеру показав їх добру згоду - відмінності знаходяться в межах 1.5%.

Порівняльний аналіз зарядів електростатичного потенціалу на атомах гуаніну та 6-тіогуаніну показав значні зміни в розподілі зарядів, зокрема, заряд на С5 збільшується майже у 5 разів, значно зменшується заряд на С6.

Спостерігається також зменшення заряду на атомі сірки в 6SG у порівнянні з зарядом на кисні у гуаніну. Розрахунок дипольних моментів показав зростання дипольного моменту в 6SG у порівнянні з гуаніном: відповідно 7.42D у 6SG та 6.14D у гуаніну.

Проведений нами розрахунок повної енергії, ентропії та теплоємності N9Н таутомерів гуаніну та 6-тіогуаніну показав збільшення цих величин у 6-тіогуаніну.

Спектроскопічні властивості N9Н таутомеру нейтральної форми 6SG у воді показані на рисунках 2, 4 та 5. Як видно на рис. 4, у спектрі УФ поглинання 6-тіогуаніну є інтенсивна смуга поглинання в області 300-360 нм, малоінтенсивна смуга в області 240-290 нм, а також малоінтенсивна смуга в області 380-400 нм. Перший інтенсивний максимум спектра УФ поглинання 6SGR зміщений у низькочастотну область відносно першого максимума в спектрі УФ поглинання гуанозину (Морозов,1977) на 8 кК. Коефіцієнт молярної екстинкції першої інтенсивної смуги поглинання 6SGR значно вищий, ніж у гуанозину.

У спектрі люмінесценції 6SG спостерігається тільки фосфоресценція - флуоресценція повністю пригнічена. Це є наслідком збільшення спін-орбітальної взаємодії в молекулі 6SG у порівнянні з гуанозином. Однією з причин зростання спін-орбітальної взаємодії в молекулі 6SG може бути існування низькоенергетичного електронного рівня n?* типу.

Дійсно, в спектрах УФ поглинання є малоінтенсивна довгохвильова смуга в області 25-27 кК (370-400 нм) (рис. 4). Проведені дослідження спектрів кругового дихроїзму нейтральної форми 6-тіогуанозину (рис. 5) незаперечно показали, що в області 370-400 нм (25-27 кК) є смуга іншого (протилежного) знака, ніж інтенсивна смуга в області 300-370 нм (27-33 кК). Ця смуга в малополярному розчиннику - діоксані змістилaся в низькочастотну область, що є характерною ознакою електронного переходу n?* типу.

Як показано на рис. 4, спектр фосфоресценції 6SG має добре виражену коливальну структуру. Час загасання фосфоресценції нейтральної форми 6SGR - 32 мсек, що на два порядки менше часу згасання фосфоресценції гуаніну.

Нами також були проведені дослідження спектрів УФ поглинання та люмінесценції іонних форм 6-тіогуаніну, нейтральних та іонних форм 6-тіопурину.

Окрім експериментальних досліджень спектрів були проведені розрахунки сил осциляторів, енергій електронних переходів, дипольних моментів, зарядів на атомах і порядків зв'язків в основному стані та їх змін при переході в електронно-збуджені стани нейтральної та іонних форм N9Н таутомеру 6-тіогуаніну та 6-тіопурину. Ці розрахунки показали добру згоду з експериментальними даними по енергіям електронних переходів нейтральної та іонних форм 6SG та 6-тіопурину. Зокрема, розрахунки показали наявність низькоенергетичного електронного переходу n?* типу у тіонних таутомерів.

Рис.4. Індивідуальні спектри УФ поглинання - 1 та фосфоресценції - 2 нейтральної форми 6-тіогуанозину (N9H таутомер).

Угорі ліворуч - локалізація збудження, праворуч - діаграма збуджених станів N9Н-таутомеру 6-тіогуаніну.

Рис. 5. Спектри кругового дихроїзму 6SGR: у воді -1, у діоксані – 2.

У верхній частині рисунку 4 зліва показана локалізація збудження у нижчих електронно-збуджених станах 6SG. Ця діаграма отримана на основі аналізу змін зарядів на атомах і порядків зв'язків при переході в електронно-збуджені стани. Діаграма показує, що в усіх збуджених станах збудження локалізовано на фрагменті C=S. B усіх збуджених станах відбувається відтікання електронної густини від атома сірки на піримідинове кільце 6SG.

Аналіз експериментальних та теоретичних розрахунків дозволив запропонувати діаграму електронно-збуджених станів нейтральної форми N9Н таутомеру 6SG, зображену на рис. 4 праворуч угорі. Згідно з цією діаграмою, нижчим по енергії синглетним електронним переходом є перехід n?* типу. Згідно з діаграмою збуджених станів електронний перехід в області 29 кК зумовлений електронним переходом внутрішньомолекулярного переносу заряду. Цей висновок зроблений на основі аналізу локалізації збудження в молекулах гуанозину та 6-тіогуанозину і аналізу спектроскопічних властивостей 6SGR (збільшення сили осцилятора, а також аномально великого низькочастотного зсуву цієї смуги відносно першої смуги УФ поглинання гуанозину). Аналогічні діаграми побудовані також для нейтральної форми N7Н таутомеру 6-тіогуаніну та нейтральної форми N9Н таутомеру 6-тіопурину.

У розрахованому ІЧ спектрі N9Н таутомеру 6SG відсутнє коливання С=О групи з частотою 1800 см-1. У спектрі N7Н тіонного таутомеру 6SG показано існування коливання С=S групи з частотою 1200 см-1. У спектрі тіольної форми повинно спостерігатися коливання SН групи. Це корeлює з експериментальними ІЧ спектрами 6SG в аргоновій матриці (Щепанек, 1995).

Отже, заміна кисню атомом сірки в молекулі 6SG призводить до збільшення довжини зв'язку С6-S10, значної зміни зарядів на атомах С5 та С6, зменшення величини заряду на гетероатомі в 10-й позиції, збільшення дипольного моменту, ентропії та теплоємності, збільшення спін-орбітальної взаємодії, з'явлення нової інтенсивної смуги внутрішньомолекулярного переносу заряду в спектрі УФ поглинання, проявлення електронного переходу n?* типу. Усі ці особливості зумовлені різницею маси та атомних радіусів, кількістю електронних оболонок, потенціалів іонізації атомів кисню і сірки.

Четвертий розділ присвячений вивченню таутомерії 6-тіогуаніну. З метою вивчення стабільності таутомерних форм 6SG були досліджені водні і неводні, зокрема, етанольні розчини 6SG та 6SGR. При цьому були виявлені відмінності спектрів 6SG та 6SGR - як спектрів УФ поглинання, так і спектрів люмінесценції 6SG та 6SGR.

У спектрах УФ поглинання 6SG в етанолі було виявлено плече в низькочастотній області. Спектри люмінесценції 6SG та 6SGR відрізнялися по формі спeктра і кількості максимумів. Для 6SG спостерігалася залежність форми спектрів від довжини хвилі збуджуючого опромінення (рис. 6). Це дозволило припустити існування, принаймі, двох таутомерів в етанольних розчинах 6SG. За допомогою вилучення спектра УФ поглинання 6SGR (фіксованого N9Н таутомеру) із спектра 6SG (сума двох компонентів) був отриманий спектр УФ поглинання другого компонента. За допомогою зміни довжини хвилі збуджуючого світла був отриманий спектр люмінесценції (фосфоресценції) цього другого компонента ( рис. 6, верхня крива).

Рис.6. Залежність спектрів фосфоресценції 6SG від довжини хвилі збуджуючого світла.

З метою ідентифікації цього та інших можливих таутомерів 6SG були проведені теоретичні розрахунки стабільності, геометрії, дипольних моментів, енергій електронно-збуджених станів, ефектів сольватації п'яти найбільш стабільних таутомерів 6SG. На основі аналізу теоретичних та експериментальних даних було зроблено висновок, що другим таутомером в етанольних розчинах 6SG є N7Н таутомер.

Аналіз розрахунку стабільності N7Н і N9Н таутомерів показав, що, хоча в газовій фазі N7Н таутомер виявляється більш стабільним, проте у полярному розчині типу води N9Н таутомер стає більш стабільним, що зумовлено, зокрема, більшим за величиною дипольним моментом N9Н таутомеру. Це пояснило існування 6SG у воді переважно в вигляді N9Н таутомеру, а в етанолі (менш полярному розчиннику, ніж вода) - у вигляді суміші двох таутомерів: N7Н та N9Н таутомерів.

Згідно з літературними даними в кристалі 6SG існує в вигляді N7Н таутомеру (Tсевалт, 1974). N7Н таутомер 6SG присутній і в газовій фазі, що було показано в роботі Щепанек і Персона (1995) за допомогою методу матричної ізоляції. Проте, в їхній роботі було також показано, що в газовій фазі 6SG існує переважно у вигляді тіольного SН таутомеру.

Наші розрахунки стабільності, виконані разом із проф. Лещинським, показали, що в газовій фазі тіольний таутомер повинен мати перевагу. Водночас, урахування впливу середовища (урахування впливу об'ємної води) за допомогою моделі Онзагера знижує ймовірність існування тіольного таутомеру та підвищує ймовірність існування N9Н тіонного таутомеру. Проте тільки урахування утворення водневих звязків з молекулами води дозволило з’ясувати причину переваги N9Н тіонного таутомеру у водних розчинах. Для цього були проведені розрахунки комплексів тіонного та тіольного таутомерів 6-тіогуаніну з молекулою води, що показали збільшення стабільності комплексу тіонного таутомеру у порівнянні з тіольним.

Аналіз спектроскопічних властивостей 6SG і його похідних, що моделювали його таутомерні форми - 6SGR, 10Ме6SGR, а також 6-тіопурину у широкому інтервалі рН і в різних розчинниках, теоретичних розрахунків іонних і таутомерних форм 6SG разом із описаними в літературі результатами досліджень 6SG методами матричної ізоляції дозволив запропонувати схему кислотно-лужної і таутомерної рівноваги 6-тіогуаніну у водному розчині (рис. 7).

Рис.7. Схема таутомерної та кислотно-лужної рівноваги 6-тіогуаніну.

Згідно з цією схемою, у воді при нейтральних рН 6SG існує в вигляді N9Н тіонного таутомеру. В лужному середовищі 6SG існує в вигляді аніона з відривом протона по N1, а в сильнолужному середовищі - у вигляді діаніона з відривом протона по N1 та N9. У кислому середовищі 6SG існує в вигляді катіона з приєднанням протона по N7. Треба відзначити зменшення величини кислотного рК у 6SG у порівнянні з гуаніном (кислотне рК у 6SG 8.12 проти 9.2 у гуаніну).

Як було зазначено вище, у різних експериментальних умовах, зокрема, у газовій фазі або у кристалі, спостерігаються тіольний N9Н таутомер та тіонний N7Н таутомери. Однак у водному розчині таутомерна рівновага значно зміщена у бік N9Н тіонного таутомеру.

Аналіз вивчених характеристик 6-тіогуаніну разом данними про стабільність додекамеру із включеними двома молекулами 6-тіогуаніну замість гуаніну (Болтон,1999) дозволив припустити, що зменшення стабільності додекамеру обумовлено зміною просторової структури та розподілу електронної густини (зокрема, на атомах N1, C5, C6, S10) молекули 6-тіогуаніну у порівнянні з гуаніном.

Пятий розділ присвячений застосуванню 6-тіогуанину як люмінесцентної мітки та дослідженню за його допомогою поведінки ДНК в інтервалі температур 4.2-273К.

Наявність довгохвильового поглинання в області 28-33 kК, значна інтенсивність цієї смуги, можливість вбудовуватися у ДНК, значний зсув люмінесценції - дозволили запропонувати використання 6SG як люмінесцентної мітки для вивчення структурних змін у ДНК при низьких температурах.

Спочатку ми провели дослідження спектрів 6SGR у різних кріопротекторах. Ці дослідження показали, що інтенсивність люмінесценції 6SGR суттєво змінюється під час структурних та фазових перетворень у кріопротекторах: під час склування (розсклування), а також при кристалізації або плавленні кристалічних фаз (рис. 8). Зміни, що спостерігалися, добре корелювали з нерівноважними діаграмами стану. спиртів та їхніх водних розчинів.

Дослідження спиртів (етанолу, гліцерину, пропандіолу) за допомогою 6SGR підтвердили наявність молекулярної рухливості у твердому стані спиртів в інтервалі температур від 4.2К до початку розсклування.

Ми також провели вивчення структурних перетворень у ДНК у водних розчинах, а також у суміші води з кріопротекторами, а також плівки ДНК з використанням 6SG як мітки та зонда.

Як видно на рис. 9, термограма водного розчину ДНК має особливості при 21, 90, 145, 180, 268 К. Найбільш значний ефект - гасіння фосфоресценції спостерігається в області 180-220К. Ця область гасіння зсувається в область більш низьких температур, характерну для розсклування аморфних фаз розчинів пропіленгліколю та ДМСО, при добавленні до водного розчину зазначених

Рис.8. Температурна залежність інтенсивності фосфоресценції 6SGR та прозорість розчинів пропандіолу (ПД) у воді (при спос.= 483 нм) при нагріванні з швидкістю 1 К/хвил: 1 - 15% ПД, 2 - 40% ПД, 3 - 55% ПД, 4 - прозорість 55% розчину ПД.

Рис.9. Температурна залежність емісії 6SGR, вбудованого в ДНК за різних умов: 1 - водний розчин, 2 - 15% розчин пропандіолу, 3 - 15% розчин ДМСО, 4 - температурна залежність емісії 6SGR у гідратованій плівці ДНК (зонд не був вбудований у ДНК).

сполук (криві 2 та 3). Аналіз одержаних результатів разом із рентгеноструктурними даними про В форму ДНК та здібність 6SG вбудовуватися у ДНК дозволили припустити, що гасіння світіння мітки в області 200 К пов'язано із розсклуванням гідратної оболонки ДНК в області великого жолобка.

Таким чином, проведені дослідження показали, що в області температур нижче -70С вода у гідратній оболонці ДНК є твердою, a при температурах вище -70С вода є рідкою. Це важливий висновок для розробки методів кріоконсервації пpепаратів, що містять генетичний матеріал. Слід зазначити, що наша стаття про застосування 6-тіогуаніну як люмінесцентної мітки була надрукована у спеціальному випуску міжнародного журналу Journal Fluorescence, присвяченому люмінесцентним міткам.

Розділ 6 присвяченй вивченню таутомерії 4-тіоурацилу та деяких міжмолекулярних взаємодій компонентів нуклеїнових кислот.

Відомо, що 4-тіоурацил є мінорною основою деяких тРНК. 4-Тіоурацил застосовується як люмінесцентна мітка та мішень для утворення фотохімічних зшивок при дослідженні різноманітних фермент-субстратних комплексів. Внаслідок низької величини кислого рК 4-тіоурацилу (біля 8) частина його знаходиться у іонізованому стані при фізіологічних рН.

За допомогою теоретичних методів нами була вивчена таутомерія нейтральних та аніонних форм 4-тіоурацилу. Були проаналізовані спектри УФ поглинання та люмінесценції нейтральних форм 4SU, 4dSUР і 8Ме4SU в полярних розчинниках. За допомогою неемпіричних методів, що включають кореляцію електронів з великим базисом, були проведені розрахунки шести таутомерів нейтральної форми 4-тіоурацилу та трьох аніонних форм.

Проведені розрахунки таутомерів нейтральних форм 4-тіоурацилу (рис. 10) показали, що, як у газовій фазі, так і в полярному розчиннику найбільш стабільною виявляється кето-тіонна форма 4-тіоурацилу, і ряд стабільності в газовій фазі має вигляд: 4SU1>4SU2>4SU3>4SU4>4SU5>4SU6, а в полярному розчиннику він має такий вигляд: 4SU1>4SU2>4SU4>4SU3>4SU6>4SU5. Хоча наступною за енергією є єнольна форма 4SU2, проте стабільність її на 10 ккал/моль менша, ніж стабільність кето-тіонної форми. Аналіз експериментальних досліджень показав їх узгодженість з результатами розрахунків.

Нами були детально проаналізовані отримані раніш спектри УФ поглинання та люмінесценції аніонів 4SU, а також проведені теоретичні розрахунки кількох таутомерів аніонних форм 4SU (рис. 11). Виконані розрахунки з’ясували присутність аніонів 4-тіоурацилу у полярних розчинниках у вигляді суміші двох таутомерів: N1Н та N3Н таутомерів, зокрема, з’ясували залежність відносної концентрації цих таутомерів від полярності розчинника.

Другий підрозділ шостого розділу присвячений деяким взаємодіям у кристалах та агрегатах компонентів нуклеїнових кислот та впливу УФ світла на

Рис.10. Структурні формули розрахованих таутомерів нейтральної форми 4-тіоурацилу.

Рис.11. Структурні формули розрахованих таутомерів аніонних форм 4-тіоурацилу.

них. На початок наших досліджень було відомо: 1) що УФ опромінення має мутагенну та канцерогенну дію, 2) що основним фотопродуктом у ДНК є димери тиміну, що утворюються внаслідок міграції енергії з сусідніх основ, 3) що спектр фотоушкоджуючого впливу УФ світла на ДНК у клітині не

Рис.12. Спектри УФ поглинання - 1, збудження люмінесценції - 2, флуоресценції - 3, фосфоресценції - 4: а - розчинів СМР у суміші етиленгліколь-вода [Вільсон, 1976]; б - кристалів цитозину безводного; в - кристалів цитозину моногідрату; спектр поглинання кристалів цитозину безводного узятий з роботи [Гуменюк, 1979]; спектр флуоресценції дінуклеотиду СрС [Вільсон, 1976] - 5; спектр люмінесценції водного замороженого розчину цитозину - 6; поляризація спектра збудження СМР (спост.= 320 нм) - 7 [Вільсон, 1976]; поляризація спектра збудження СрС (спост.= 375 нм) - 8 [Вільсон, 1976].

збігається зі спектром УФ поглинання ДНК і дещо зміщений у довгохвильову область (аж до 320 нм), 4) що короткохвильове УФ світло (<300 нм), що має найбільшу ушкоджуючу активність, майже повністю поглинається атмосферою.

З метою дослідження причин фотоушкоджуючого впливу УФ світла з =290-330нм на нуклеїнові кислоти було проведено вивчення спектроскопічних властивостей кристалів і агрегатів основ нуклеїнових кислот у порівнянні з раніш відомими спектроскопічними властивостями мономері основ нуклеїнових кислот, ДНК і нуклеосом. Аналіз літературних даних показав, зокрема, наявність малоінтенсивних смуг в області 290-320 нм в спектрах КД B-форм ДНК і нуклеосом.

Експериментальні дослідження показали, що внаслідок асоціації основ у спектрах УФ поглинання та збудження люмінесценції з'являються довгохвильові смуги в області 290-300 нм, що примикають до спектрів люмінесценції (рис. 12). Проведені розрахунки зарядово-резонансної взаємодії в асоціатах ("димерах") цитозину різної конформації показали, що в "димерах" з'являються нові смуги поглинання, до того ж довгохвильові смуги в спектрах поглинання (збудження) можуть з'являтися тільки у "димерах" із вертикальним розташуванням складових мономерів, але не в компланарних (Н-зв'язаних) "димерах".

З метою з'ясування рухливості виявлених низькоенергетичних збуджених станів були проведені дослідження міграції енергії в асоціатах основ. В асоціатах канонічних основ показана наявність міграції енергії на акцептор - 4-тіоурацил (основу, що має найменшу енергію S і Т станів серед основ нуклеїнових кислот) як при збудженні = 280нм, так і при = 312 нм.

Проведені дослідження дозволили зробити висновок, що внаслідок взаємодії в асоціатах основ нуклеїнових кислот (і, вірогідно, в нуклеїнових кислотах) утворюються низькоенергетичні стани, що забезпечують пряму дію екологічного УФ-світла з = 290-320 нм на нуклеїнові кислоти, що врешті решт може призвести до онтогенезу.

У розділі 7 викладені результати досліджень фізичних властивостей аза-похідних аналогів компонентів нуклеїнових кислот.

Відомо, що аза-похідні аналоги основ компонентів нуклеїнових кислот мають протипухлинні, антивірусні, імуномодулюючі властивості. Відомо, зокрема, що 5-азацитозин (5аzаC) має протипухлинні властивості. Зараз у США проходить клінічні випробування лікарська форма 5аzаC - фазарабін, у котрій 5-азацитoзин сполучений з арaбінозою. Доведено, що 5-азацитозин вбудовується у ДНК і перешкоджає метилюванню цитозину, він інгібірує цитозин-метилтрансферазу. Також доведено, що 6аzаC та 6аzаU після перетворення в нуклеотиди – 6-азацитидин-5-фосфат та 6-азауридин-5-фосфат інгібірують фермент декарбоксилазу оротидилової кислоти, блокуючи синтез de novo уридин-5-фосфату.

Ми провели вивчення фізичних властивостей 5аzаC, 6аzаC, 6аzаU та димеру 5аzaC із гуаніном. За допомогою неемпіричних (НF, МР2, НF SСRF) та напівемпіpичних методів ми здійснили розрахунки повної енергії, геометрії, ентропії, теплоємності, сольватаційних ефектів, розподілу зарядів на атомах, інфрачервоного спектра та енергій електронних переходів нейтральних молекул 5-азацитозину, 6аzаC, 6аzаU, а також розрахунок енергії взаємодії у комплексі

5аzаC із гуаніном. Проведені розрахунки були порівняні з аналогічними розрахунками для цитозину та урацилу, а також з відомими з наукової літератури експериментальними результатами.

На рис.13 показана структурна формула 5-азацитозину та цитозину, а також показані розраховані довжини зв'язків та кути між атомами в цих молекулах у газовій фазі (перший рядок - для 5аzaC та другий рядок - для цитозину). Порівняння довжини зв'язків цитозину та 5-азацитозину показало, що довжини зв'язків між атомами С4, N5, С6, N1 та С4, N8 у 5-азацитозину коротші, ніж довжини зв'язків між атомами С4, С5 , С6, N1, N8 у цитозину.

Порівняння довжини зв'язків цитозину та 6-азацитозину показало, що довжина зв'язків між атомами С5, N6 та N1 у 6-азацитозину коротша, ніж довжина зв'язків між атомами С5, С6, N1 у цитозину. Розрахунки довжини зв'язків добре збігаються з даними рентгеноструктурного аналізу [Сінг, 1974]. Відмінності знаходяться в межах 1.5%. Розрахована довжина зв’язків 6azaU також добре збігається з даними рентгеноструктурного аналізу.

Аміногрупа у 5azaC та 6azaC є неплоскою, до того ж у 6azaC, на відміну від 5azaC, атоми водню аміногрупи розташовані несиметрично.

Аналіз зарядів на атомах у вивчених аза-похідних показав, що найбільші зміни відбуваються на шостому атомі - у 5azaC заряд на цьому атомі зростає майже вдвічі у порівнянні з цитозином, у 6azaC та 6azaU - заряд змінює знак. У вивчених аза-похідних спостерігаються також значні зміни зарядів на першому, четвертому та п’ятому атомах. Зміною зарядів на п’ятому атомі 5azaC та 6azaC, певно, можна пояснити особливості ЯМР спектрів цих сполук, виявлені Говоруном та Самійленко (1997).

Порівняльний аналіз розрахованих енергій синглетних ??* збуджених станів аза-похідних та експериментальних даних показав їхню якісну згоду. Розрахунок передвіщає, що в усіх аза-похідних нижчим по енергії синглетним станом повинен бути синглетний n?* стан. Різниця в енергіях синглетних ??* та n?* станів 6azaC та 6azaU більшa ніж 1 эв. Це повинно привести до зростання квантового виходу фосфоресценції цих сполук.

Як видно з табл.1, розраховані величини повної енергії 5azaC та 6azaC більші, ніж у цитозину, також,