МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

Одеський державний медичний університет

РОЖКОВСЬКИЙ Ярослав Володимирович

УДК 615.214:616.45-001.1/.3

ПАТОГЕНЕТИЧНІ МЕХАНІЗМИ ПОРУШЕННЯ ІМУНОЛОГІЧНОЇ

РЕЗИСТЕНТНОСТІ ОРГАНІЗМУ ЗА УМОВ ФОРМУВАННЯ

СТРЕС-СИНДРОМУ ТА ШЛЯХИ ЇХ ФАРМАКОЛОГІЧНОЇ

КОРЕКЦІЇ

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Одеса – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий консультант:

Доктор медичних наук, професор, засл. діяч науки

і техніки України Кресюн Валентин Йосипович,

Одеський державний медичний університет МОЗ

України, завідувач кафедри загальної і клінічної

фармакології.

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор, академік АМН України,

Головенко Микола Якович, Фізико-хімічний інститут ім. О.В.Богатського

НАН України, завідувач відділу фізико-хімічної фармакології

Доктор медичних наук, професор, член-кор. НАН і АМН України

Коміссаров Ігор Васильович, Донецький державний медичний університет

МОЗ України, завідувач кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології

Доктор медичних наук, професор, засл. діяч науки і техніки України

Бобирьов Віктор Миколайович, Українська медична стоматологічна академія

МОЗ України, завідувач кафедри експериментальної та клінічної фармакології

Провідна установа: Інститут фармакології та токсикології АМН України,

відділ нейрофармакології, м.Київ

Захист відбудеться “ 14 ” лютого 2002 р. о 14 год.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному

медичному університеті (65026, м. Одеса, провулок Валіховський 2).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Одеського державного

медичного університету (65026, м. Одеса, провулок Валіховський, 3).

Автореферат розісланий “_ 9 _ ” січня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

к. мед. н. Р.В.Соболєв

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Імунні реакції є провідними в комплексі адаптивних механізмів, які забезпечують захист організму в умовах дії екстремальних факторів. Разом з тим, питання патогенезу розладів імунологічної резистентності при стресі залишаються відкритими, а отже, значну проблему являє собою і розробка сучасних методів їх фармакологічної корекції, що є одним з найактуальніших напрямків сучасної нейроімунофармакології (Г.Н.Крыжановский, 1985; Б.А.Фролов, 1987; Н.Г.Арцимович і інш., 1997; Г.М.Бутенко, 1997; К.В.Судаков, 1997).

Безперечно, що одним з провідних факторів негативного впливу стреса на стан імунологічної резистентності організму може бути системна лабілізація мембран імунокомпетентніх клітин (ІКК), внаслідок чого спостерігається їх масова деструкція, порушується рецепторний апарат, їх здатність до проліферації, кооперації та диференціювання (М.В.Милютин, 1996; В.А.Симоненкова, 1998; О.Г.Попов і спів., 1999). Однак у сучасній літературі мембранні механізми регуляції імунореактивності та перспективи імуномодуляції стрес-протекторами мембраноактивного типу дії досліджені недостатньо.

З іншого боку, дані останніх років свідчать про наявність тісного зв’язку між імунною і нейроендокринною системами організму. Основою цих взаємовідносин може бути наявність спільних рецепторів на нервових та ІКК і їх здатність продукувати східні ліганди (Е.А.Корнева, 1988-1993; A.Bateman et. al., 1989; J.E.Blalock, 1989; E.I.Cunningham, E.B.De Souza, 1993; H.O.Besedowsky, A.Del Rey, 1996; А.Д.Адо і спів., 1999). Враховуючи значення факторів нейрогуморальної регуляції в генезі порушень імунної системи, цілеспрямована корекція механізмів нейромедіаторного забезпечення ІКК і органів стає перспективним напрямком у вирішенні цієї проблеми. Одним з головних клітинних ефекторів, які забезпечують зв’язок імунної і нейроендокринної системи, є мононуклеарні фагоцити. Як основне джерело цитокінів, ці клітини здійснюють взаємодію неспецифічних і специфічних факторів резистентності організму. Здатність цитокінів виконувати функцію комунікаційного сигналу поміж різними популяціями клітин, проникати усередину клітини, змінюючи її метаболізм, здійснювати дистантний вплив на ЦНС відкриває реальну перспективу розширення уявлень про механізми забезпечення резистентності організму в умовах стресу. Отже, регуляція функціонального стану макрофагів та пов’язаних з ними клітинно-цитокінних механізмів впливу є принципово новим напрямком клінічної імунофармакології і набуває особливого значення як один з перспективних шляхів корекції стресових розладів імунітету в умовах хронічного стресу.

Разом з тим, сучасна профілактика стресу, заснована на пріоритетному застосуванні депримуючих засобів, не завжди враховує того, що більшість з них додатково підсилює його негативний вплив на імунологічну реактивність організму (М.Г.Айрапетянц, 1988; В.Й.Кресюн і спів, 1993; M.Fava, 1997; R.R.Griffiths et al., 1997). Традиційне ж застосування антиоксидантної терапії та класичних імуномодуляторів також не вирішує всіх проблем корекції стресових розладів імунітету (К.М.Дюмаев и спів., 1995; Н.Г.Арцимович і спів., 1997). На наш погляд, одним з нових підходів у вирішенні цієї проблеми є застосування засобів метаболітної терапії, молекулярно-біохімічні механізми дії яких імітують, захищають або підсилюють природні нейроендокринні системи захисту організму. Типовим представником цієї групи є літоніт, здатний обмежувати стресові порушення біоенергетичних процесів в структурах головного мозку та запобігати морфо-функціональним змінам мембран організму в умовах стресу (В.Й.Кресюн і спів., 1991). Однак його імуномодулюючі властивості стосовно стресових порушень імунітету залишаються ще не дослідженими.

Останнім часом особлива увага науковців зосереджена на вивченні молекулярних механізмів імунотропної дії індукторів ендогенного інтерферону, сучасним представником яких є один з похідних класу флуоренонів аміксин (Т.О.Філіпова, 1996; Ф.И.Ершов, 1998; С.А.Андронаті та інш.,1999). Окрім загальновідомих противірусних ефектів, аміксину притаманні імуномодулюючі властивості, здатність, шляхом індукції інтерферону, регулювати продукцію цитокінів в організмі, що, разом з іншими позитивними ефектами препарату відкриває перспективу його профілактичного використання з метою усунення деяких ланок патогенезу стресових розладів імунітету. З іншого боку, система інтерферону, завдяки встановленим центральними механізмам дії, поряд з ГАМК-ергічною та іншими, розглядається як одна з важливих ланок стрес-лімітуючої системи організму (N.Dafny et al., 1985; E.M.Smith, J.E.Blalock, 1993). Тому вивчення можливостей профілактичного застосування аміксину та встановлення молекулярних механізмів його імунорегуляторного впливу в умовах стресу набуває особливої актуальності. Подібні дослідження раніше не проводились.

Таким чином, складність та багатовекторність патогенетичних механізмів стресових порушень імунологічної резистентності з одного боку, неоднозначність їх оцінки на різних етапах стрес-синдрому та недослідженість провідних механізмів імунокорегуючого впливу більшості з відомих лікарських засобів, з іншого боку, диктує необхідність їх подальшого вивчення та розробки на цій основі нових підходів до імунокорекції, які б сприяли нормалізації гомеостазу всього організму.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Напрямок дисертаційної роботи тісно пов’язаний з комплексною НДР МОЗ України “Методи ранньої діагностики інфекційних та запальних хвороб на основі використання молекулярно-генетичних та біофізичних технологій” (№ держреєстрації 0196U001839), які виконуються в рамках НТП 01.01. “Охорона генофонду населення України”. Автор не є безпосереднім виконавцем вказаної теми, але працює на кафедрі, де ця НДР виконувалась.

Мета і задачі дослідження. Дослідити провідні патогенетичні механізми порушення імунологічної резистентності організму в умовах формування хронічного стрес-синдрому та розробити адекватні шляхи їх фармакологічної корекції.

У відповідності до мети було визначено такі основні задачі дослідження:

1. Дослідити особливості порушення неспецифічної резистентності організму, клітинних та гуморальних факторів імунітету за умов розвитку стрес-синдрому та післястресового періоду.

2. Виявити вплив хронічного стресу на продукцію лімфоцитактивуючого фактора (ЛАФ) перитонеальними макрофагами мишей та встановити патогенетичне значення цього факту у механізмах порушення імунологічної резистентності.

3. Вивчити залежність змін вмісту катехоламінів і циклічних нуклеотидів (ЦН) з порушенням структурно-функціонального стану мембран лімфоцитів імунокомпетентних органів та визначити їх значення в патогенезі стресових розладів імунітету.

4. Виявити наявність та встановити механізми імунотропної дії реланіуму на тлі його профілактичного використання в умовах хронічного стресу.

5. Вивчити вплив атипового транквілізатора літоніта на різні ланки патогенезу стресових розладів імунітету та визначити провідні молекулярні механізми його імунопрофілактичної дії.

6. Довести доцільність застосування імуномодулятора тималіна для попередження розвитку стресових розладів імунітету та встановити провідні механізми його імунокорегуючого впливу.

7. Вивчити вплив профілактичного уведення індуктора ендогенного інтерферону аміксина на функціональну активність системи мононуклеарних фагоцитів (СМФ), характер нейро-медіаторного забезпечення органів імуногенезу, структурно-функціональний стан мембран лімфоцитів та встановити провідні механізми імуномодулюючого впливу цього препарату.

8. З метою корекції виявлених порушень імунологічної резистентності обґрунтувати доцільність комплексного застосування літоніта, тималіна та аміксина.

Об’єкт дослідження – імунологічна резистентність організму.

Предмет дослідження – показники імунного гомеостазу та патогенетичні механізми його порушення у тварин на тлі хронічного стресу і його фармакологічної корекції.

Методи дослідження – для досягнення поставленої в роботі мети використані фармакологічні, біохімічні, радіоімунологічні, імуноферментні, морфологічні, гістохімічні та статистичні методи дослідження.

Наукова новизна роботи. Вперше комплексно досліджена роль та встановлений зв’язок динаміки порушень неспецифічної і специфічної резистентності організму з функціональною активністю СМФ, характером нейро-медіаторного забезпечення органів імуногенезу та структурно-функціональним станом мембран лімфоцитів на різних етапах формування стрес-синдрому. Вперше отримані важливі дані про участь ендотоксинів кишкової флори у механізмах ендогенної інтоксикації і сенсибілізації організму в умовах стресу. Встановлено, що хронічний стрес, який на різних етапах супроводжується різнобічними змінами величини гуморальної імунної відповіді, призводить до стимуляції продукції ЛАФ перитонеальними макрофагами, підвищує рівень ІЛ-1 в плазмі крові тварин та знижує чутливість лімфоцитів крові до комітогенного впливу ІЛ-1 в РБТЛ. Показано різке зниження продукції макрофагами ЛАФ під час стадії виснаження, яка ще більш пригнічується після додаткової стимуляції макрофагів Staphylococcus aureus за умов in vitro. Вперше зроблений порівняльний аналіз динамічних змін структурно-функціонального стану мембран лімфоцитів з характером катехоламінового забезпечення і вмістом циклічних нуклеотидів у різних органах імуногенезу в залежності від стадії стресу та встановлений їх зв’язок з характером порушення основних показників імунологічної резистентності. Показано, що початковий етап післястресового періоду характеризується подальшим, ще більш виразним пригніченням окремих показників імунологічної резистентності.

Вперше отримано широкий комплекс даних щодо профілактичної активності реланіума, літоніта, тималіна і аміксина на резистентність організму, інтегральні показники функціональної активності СМФ, нейро-медіаторної регуляції та структурно-функціонального стану мембран лімфоцитів на тлі розвитку хронічного стресу. Встановлені нові оригінальні дані про молекулярні механізми стрес- та імунопротекторної дії літоніта, пов’язані з його виразними мембранопротекторними властивостями та найбільш вдалою корекцією порушеного нейро-медіаторного балансу провідних органів імуногенезу. На основі комплексного дослідження розкриті механізми імунодепресивної дії реланіуму, які полягають у здатності цього препарату за умов профілактики хронічного стресу додатково підсилювати післястресову депресію показників фагоцитозу, Т-клітинних та деяких гуморальних факторів імунітету, збільшуючи термін їх післястресової реабілітації. Встановлено зв’язок цих змін зі здатністю реланіума поглиблювати негативні стресові зміни в мембранах лімфоцитів внаслідок додаткового накопичення в них мембранних лізофосфатидів. Вперше доведена можливість корекції стресових розладів імунітету індуктором ендогенного інтерферону аміксином та показана його висока ефективність щодо корекції порушення продукції імунорегуляторних пептидів клітинами СМФ, стабілізації фосфоліпідного матриксу лімфоцитів, зменшення в лімфоцитах надмірного катаболізму ЦН та нормалізації внаслідок цього активності мембранних ферментів обміну аденозину. Теоретично доведена ефективність імунокорегуючого впливу тималіна, здатного за умов профілактичного уведення найбільш вдало зменшувати індуковану стресом Т-клітинну лімфопенію, стабілізувати співвідношення теофілінчутливих і теофілінрезистентних клітин та підсилювати природні детоксикаційні резерви організму шляхом збільшення в крові рівня нормальних АТ. Вперше розроблено спосіб підвищення ефективності профілактики стресових порушень імунологічної резистентності комбінацією літоніта, тималіна та аміксина, яка найбільш вдало коригує ключові ланки патогенезу виявлених порушень.

Практичне значення роботи. Отримані експериментальні дані розширили існуючі уявлення про ключові патогенетичні механізми порушення резистентності організму на різних етапах хронічного стресу та надали можливість пошуку нових методів цілеспрямованої фармакологічної корекції виявлених патологічних змін. Комплексна оцінка стану інтегральних показників неспецифічної і специфічної резистентності перспективна в плані підвищення ефективності і надійності діагностики фази розвитку, ступеню глибини стресових порушень та контролю за ефективністю лікувальних заходів. Зокрема, результати досліджень дозволяють використати показники цитокінової регуляції: інтенсивність продукції ЛАФ перитонеальними макрофагами, рівень ІЛ-1 в плазмі крові і реакцію лімфоцитів на комітогенний вплив ІЛ-1, як сучасні і найбільш чутливі методи діагностики та ефективності профілактики стресу. Теоретичне значення роботи також визначається створенням нових уявлень про роль ЛАФ і ІЛ-1 у механізмах імуносупресивної дії реланіуму та імунопротективної дії аміксину на тлі хронічного стресу. Прикладний аспект роботи пов’язаний з обґрунтуванням недоцільності тривалого застосування реланіуму на тлі хронічного стресу внаслідок його негативного впливу на окремі показники імунологічної резистентності організму. Обґрунтовано використання за новими показаннями літоніту у якості мембраноактивного імунокоректора метаболітного типу дії та індуктора інтерферону аміксина як модулятора продукції цитокінів в умовах хронічного стресу. На основі результатів проведених досліджень пропонується найбільш ефективна комбінація препаратів, які впливають на різні ланки патогенезу стресових порушень імунологічної резистентності: мембраноактивний стреспротектор з неспецифічною імунокорегуючою активністю літоніт, імуномодулятор тималін та регулятор продукції цитокінів аміксин. Отримані дані, які свідчать про позитивний вплив застосованої комбінації на ключові ланки патогенезу виявлених порушень, є новим і ефективним вирішенням проблеми корекції імунологічної резистентності, зниження ендогенної інтоксикації, підвищення адаптивних можливостей організму та покращання віддалених наслідків перенесеного стресу.

Результати роботи впроваджені в клінічні заклади м. Одеси і області, а також у практику наукових досліджень і навчальний процес ряду кафедр медичних академій і університетів України.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблена дослідницька програма, проведено більшість біохімічних, біофізичних та імунологічних досліджень. Частина радіоімунних досліджень виконана за технічної допомоги співробітників лабораторій Наукового центру акушерства, гінекології і перинатології РАМН (директор – академік РАМН В.І.Кулаков, м. Москва, Росія). Морфологічне дослідження імунокомпетентних органів виконано за допомогою співробітників гістологічної лабораторії кафедри топографічної анатомії Одеського державного медичного університету (зав. кафедри – професор О.Г. Попов), за що автор висловлює їм щиру подяку. Самостійно проведено аналіз результатів дослідження, обгрунтування основних положень дисертаційної роботи, зроблені висновки, статистична обробка матеріалу, написання та оформлення дисертаційної роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації, оприлюднено на науково-практичній конференції молодих вчених Одеського медичного інституту “Творчість молодих” (Одеса,1991); 2-й Всесоюзній конференції “Фармакологічна конференція гіпоксичних станів” (Гродно,1991); Всесоюзній науковій конференції “Тривалість життя: механізми, прогнози, шляхи збільшення” (Київ,1991); Республіканській науковій конференції “Прискорене старіння, зв’язок з віковою патологією”(Київ,1992); XI-му з’їзді анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів країн СНД (Смоленськ,1992); 1-му Національному Конгресі анатомів, гістологів і ембріологів України (Івано-Франківськ,1994); VI Congress of the World Federation of Ukrainian Medical Association (Odesa,1996); Виїзній сесії Української академії наук національного прогресу (Тернопіль,1997); 2-му Національному Конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Луганськ,1998); VIII Congress of the World Federation of Ukrainian Medical Association (Lviv-Truskavets, 2000); Науково-практичній конференції “Ліки – людині” (Харків,2001); II Українській науково-практичній конференції “Прискорене старіння і шляхи його профілактики (Одеса,2001); Республіканській науково-практичній конференції “Досягнення та перспективи розвитку клініки внутрішніх хвороб” (Харків,2001); Міжнародній науково-практичній конференції “Медикаментозна та немедикаментозна профілактика та відновне лікування в клінічній практиці”(Київ,2001); Науково-практичній конференції “Актуальні проблеми морської медицини” (Одеса,2001); II Національному з’їзді фармакологів України (Дніпропетровськ,2001).

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 44 наукових роботах (28 статей - у фахових наукових журналах і збірниках наукових праць, решта робіт – в матеріалах і тезах конференцій та симпозіумів).

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 359 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 5 розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел (257 робіт вітчизняних і 238 зарубіжних авторів). Текст містить одну схему, ілюстрований 42 таблицями і 64 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження проведені на 1352 високопородних щурах самцях лінії Август масою 160-180 г та 778 мишах лінії (CBA x C57BL6)F1 вагою 18-22 г, які утримувались в стандартних умовах віварію. При проведені досліджень всі піддослідні тварини були розділені на наступні групи: 1 – інтактні тварини (контрольна група); 2,3,4 і 5-та групи – тварини, які зазнали хронічного стресу відповідно протягом 1,2,3 та 4 діб; 6,7,8 і 9 групу становили тварини, яких досліджували відповідно через 1, 3, 7 та 14 діб після закінчення експозиції стресу; наступні групи становили тварини, які протягом 4 діб аплікації стресу профілактично отримували реланіум (2 мг/кг, п/шкірно), літоніт (30 мг/кг, п/шкірно), тималін (1 мг/кг, в/черевно), аміксин (2 мг/кг, в/черевно), та одночасно комбінацію літоніта, тималіна і аміксина. У якості моделі хронічного стресу був обраний метод депривації парадоксального сну протягом 4 діб (D.Jouvet et al., 1964). Після закінчення експерименту щурів декапітували під легким ефірним наркозом. Об’єктом дослідження служили цільна кров, плазма, сироватка та окремі формені елементи крові, гомогенат і лімфоцити тимуса, селезінки і мезентеріальних лімфатичних вузлів (ЛВ), перитонеальні макрофаги. Морфологічно досліджували наднирковики та мезентеріальні ЛВ.

Для визначення фагоцитарної активності нейтрофілів у якості тест-об’єкту використовували мікроорганізми штаму Staphylococcus aureus N209-P (А.С.Козлюк і спів., 1987). Функціональний стан нейтрофілів оцінювали за НСТ-тестом (E.Guthy, D.O’Brien, 1982). Визначення вмісту лізосомально-катіонних білків (ЛКБ) проводили за лізосомально-катіонним тестом (В.Е.Пигаревский, 1979). Лізоцимну активність сироватки крові вимірювали нефелометричним методом (Г.В.Дорофейчук, 1968), сумарну пероксидазну активність (СПА) сироватки крові - методом Е.М.Мікаеляна і спів. (1984), активність комплементу – за ступенем сенсибілізованих гемолізином еритроцитів у присутності комплементу (А.С.Козлюк та інш., 1987). Кількість циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) визначали методом Е.Ф.Чернушенко, Л.С.Когосова (1978). Встановлення рівня ендогенної інтоксикації (ЕІ) проводили за допомогою лейкоцитарного індексу інтоксикації (ЛІІ) (Г.Н.Карабанов, 1990). ДНК-зв’язуючу активність білків сироватки крові вивчали радіоімунним методом (Р.А.Беловолова, 1992).

Лімфоцити з периферичної крові тварин видаляли за методом Boyum (1968). Встановлення вмісту Е-РУК і ЕАС-РУК в периферичній крові здійснювали методом розеткоутворення (Р.В.Петров і спів., 1976). Антитіла (АТ) до ДНК визначали методом імуноферментного аналізу. У якості антигену (АГ) використовували курчачу нативну і денатуровану ДНК (“Лахема”, Чехія) у концентрації 10 мкг/мл, а інтенсивність реакції оцінювали на багатоканальному фотометрі Мультіскан при =492 нм. Визначення вмісту АТ до гліколіпіду А E.Coli здійснювали реакцією пасивної гемаглютинації (Р.А.Беловолова, 1992). Встановлення сенсибілізації до антигену кишкової палички здійснювали за допомогою плантарної проби. Алерген кишкової палички вводили в/шкірно в плантарну поверхню лапки щурів через три доби після закінчення стресу. Оцінка реакції проводилась через 48 годин після ін’єкції алергену візуально та вимірюванням об’єму лапки. Проліферативна активність лімфоцитів периферичної крові оцінювалась за результатами проведення в/шкірної проби з Кон А, (розведення 50 /мл, 0,1 мл у вухо щурів). Реакцію оцінювали через 48 годин порівняльним зваженням вуха з утвореним інфільтратом і контрлатерального вуха. За збільшенням ваги оцінювали мітогенний вплив Кон А.

Оцінку гуморальній імунній відповіді проводили через 5 діб після імунізації мишей еритроцитами барана в дозі 0,2 млрд. клітин в/черевно на 0,2 мл фізіологічного розчину шляхом підрахунку кількості антитілутворюючих клітин (АУК) селезінки та титрів загальних АТ в крові. Титри АТ в сироватці крові визначали методом прямої гемаглютинації в мікротитраторі Токачі, а кількість АУК в селезінці – методом локального гемолізу в гелі агарози (K.N.Jerne, A.A.Nordin, 1963).

Резидентні макрофаги змивали з перитонеальної порожнини декапітованих мишей 5 мл середовища 199 з 100 ОД/мл пеніціліну. Для індукції утворення лімфоцитактивуючого фактора (ЛАФ) використовували Staphylococcus aureus у розрахунку 20-30 вбитих нагріванням мікробних тіл на 1 фагоцит. ЛАФ активність інкубатів мононуклеарних фагоцитів оцінювали за їх здатністю викликати комітогенний вплив на проліферацію тимоцитів, стимульованих субоптимальними дозами лектинів (L.J.Rosenwasser, C.A.Dinarello, 1981). Включення Н3-тимідину в ДНК поділених клітин оцінювали за допомогою сцинтиляційного -лічильника (LKB). За одиницю активності ЛАФ приймали таку його концентрацію (в мл), яка підсилювала проліферацію тимоцитів на 50% відносно її максимальної стимуляції, яка викликається субоптимальною дозою лектину. Для проведення реакції бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ) периферичної крові щурів клітини культивували з Кон А (0,75 мкг/мл) і нативним препаратом ІЛ-1 кроля в дозі 0,06 мкг/мл. Радіоактивність зразків вимірювали за допомогою сцинтиляційного -лічильника (LKB). Пряме визначення концентрації ІЛ-1 в плазмі крові у мишей здійснювали стандартним радіоімунним методом з використанням Interleukin-1 [125I] RIA kit (Amersham, UK).

Визначення вмісту кортикостерону в сироватці крові здійснювали радіоімунним методом (Н.П.Гончаров і інш., 1977). Вміст адреналіну (А), норадреналіну (НА) і дофаміну (ДА) в тимусі, селезінці і мезентеріальних ЛВ вивчали флюорометричним методом (В.В.Меньшиков, 1987).

Вміст цАМФ і цГМФ визначали за допомогою наборів фірми Amercham (UK). Для визначення цАМФ використовували – [125І] RIA KIT Code: R1012; для цГМФ - [125І] RIA KIT Code: R1042. Радіоактивність зразків вимірювали на -лічильнику (LKB). Розмірність концентрації – пмоль/106 лімфоцитів.

Вміст малонового діальдегіду (МДА) в гомогенаті імунокомпетентних органів визначали методом І.Д.Стальної, Т.Г.Гарішвілі (1977); дієнових кон’югатів ненасичених вищих жирних кислот (ДК) - методом В.А.Костюк і спів. (1984), активність супероксиддисмутази (СОД) - методом О.П.Макаревич, П.П.Голікова (1983), каталазну активність - методом М.А.Королюк і спів. (1988). Стан неферментної системи антирадикального захисту (САЗ) оцінювали за вмістом в імунокомпетентних органах токоферолу (Р.Ш.Киселевич, С.И.Скварко, 1972). В ліпідних екстрактах лімфоцитів, отриманих за методом J.Folch (1957), визначали вміст загального холестерину (ХС), фосфоліпідів (ФЛ) та вираховували їх молярне співвідношення. Фракціонування ФЛ проводили методом тонкошарової хроматографії на пластинах “Silufol UV-254” (Чехія), ідентифікували за відомими значеннями Rf. Вміст індивідуальних фракцій – лізофосфатиділхоліну (ЛФХ), сфінгомієліну (СФМ), фосфатиділхоліну (ФХ), кардіоліпіну (КЛ) і фосфатиділетаноламіну (ФЕА) оцінювали за кількістю ліпідного фосфору (В.Л.Зубер, 1982). Окрім того, в лімфоцитах органів імуногенезу вивчали активність аденозиндезамінази – (АДА) (Н.М.Дмитренко і спів., 1980) і 5’-нуклеотідази – (5’-НК) (В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов, 1988).

У піддослідних щурів морфологічно досліджували наднирковики і мезентеріальні ЛВ. Морфологічні зрізи лівого наднирковика проводили точно за центром. Вивчали вміст і характер розподілу ФЛ по Лізону і аскорбінової кислоти (АК) методом Бакхуса. Об’єктом морфометрії були ядра клітин пучкової та сітчастої зони кори і хромафінних клітин мозкової речовини наднирковиків. Каріометрію проводили на фотовідбитках, виготовлених із зрізів, пофарбованих гематоксиліном і еозином при збільшенні у 1000 разів. На кожному фотовідбитку вивчали середню площу перерізу 25 ядер, обраних спонтанно. Ширину коркового шару і мозкової речовини вимірювали за допомогою стереологічної решітки у 10 різних ділянках залози.

Мезентеріальні ЛВ видаляли біля кореня брижі тонкої кишки. На рівні воріт органу робились серійні зрізи товщиною 5-6 мкм, які фарбувались гематоксилін-еозином та азур-2-еозином. Всього виготовлено 808 зрізів, отриманих з 184 ЛВ. Препарати досліджувались методом світлової мікроскопії на МБІ-6 при збільшенні мікроскопа (х 400). Всі вимірювання для кожного спостереження проводили за 3 серединними зрізами та в 5 полях зору. Підрахунок окремих клітинних елементів ЛВ здійснювали за допомогою морфометричної решітки.

Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали за допомогою критерію Ст’юдента та коефіцієнта кореляції на ЕОМ Pentium-2 MMX-233 та пакету програм Microsoft Word, Microsoft Excel, Microsoft Graph 5.0.

Результати дослідження та їх обговорення

1. Стан інтегральних показників неспецифічної і специфічної резистентності організму за умов формування хронічного стресу і провідні патогенетичні механізми їх порушення.

Внаслідок проведених досліджень встановлено, що зміни в системі неспецифічного захисту, які виникають на тлі формування хронічного стресу залежать від тривалості його дії і мають стадійний характер. На початкових етапах стресу спостерігається пригнічення деяких гуморальних (лізоцимна та комплементарна активність крові) та клітинних (показники фагоцитозу і метаболічної активності нейтрофілів в сНСТ-тесті) факторів на тлі перших ознак мобілізації гранулоцитарної ланки резистентності., що проявляє себе тенденцією до збільшення вмісту ЛКБ, їх міграцією за межі клітин та зростанням СПА сироватки крові. Подібне короткочасне зниження резистентності є необхідною передумовою, що виконує роль сигналу для наступного включення адаптивних процесів, спрямованих на компенсацію виявлених порушень (Ф.З.Меерсон, М.Г.Пшенникова, 1988, Т.І.Коляда і спів., 1995). На подальших етапах стресу спостерігається включення компенсаторних механізмів та активація факторів неспецифічного захисту, які проявляють себе перерозподілом лейкоцитів, підсиленням гранулоцитопоезу та гранулоцитарною реакцією, активацією метаболізму нейтрофілів в сНСТ і аНСТ-тестах, стимуляцією фагоцитозу, збільшенням вмісту КБ у нейтрофілах та активацією ДНК-зв’язуючої здатності сироваткових білків. Подібна реакція є адаптивною, оскільки направлена на підвищення бактерицидності крові (П.Д.Горизонтов і спів., 1983). Разом з тим, надмірна активація процесів неспецифічного захисту, яка спостерігається на подальших етапах стресу, з механізму адаптації переходить до ланки патогенезу імунологічних розладів. Зокрема поглиблення лімфопенії та надмірна активація деяких клітинних факторів неспецифічного захисту (особливо метаболічної активності нейтрофілів), призводить до “респіраторного вибуху”, накопичення вільних радикалів, метаболітів кисню, активації ЛКБ. Це супроводжується генералізованою мембранодеструкцією та значним підвищенням рівня ЕІ. Зниження резервного потенціалу нейтрофілів в аНСТ-тесті, яке спостерігається через три доби хронічного стресу, свідчить про початок виснаження у цьому періоді їх метаболічної активності. Це додатково підтверджується пригніченням фагоцитозу та зменшенням резерву ЛКБ в гранулоцитах кісткового мозку. Подальший розвиток хронічного стресу відображає стадію виснаження, яка супроводжується глибоким пригніченням майже всіх показників резистентності. У цьому періоді реєструється найбільш виразна лімфопенія, нейтрофільний лейкоцитоз, зниження лізоцимної активності, активності комплементу, -лізінів і ДНК-зв’язуючої активності білків сироватки крові, зниження вмісту ЛКБ як в гранулоцитах периферичної крові, так і кісткового мозку, різке пригнічення метаболічної і фагоцитарної активності нейтрофілів на тлі подальшого зростання СПА, яка є маркером мембранодеструкції та ЕІ. Початковий етап післястресового періоду (з першої по третю добу) характеризується подальшим погіршенням стану окремих клітинних факторів неспецифічного захисту (показники фагоцитозу, метаболізм нейтрофілів в сНСТ-тесті і аНСТ-тесті, вміст в них ЛКБ), які у цьому періоді досягають свого мінімального рівня, та подальшим зниженням активності -лізінів і ДНК-зв’язуючої активності. Навіть через 14 діб після припинення дії стресових факторів в крові піддослідних тварин ще зберігалися високий рівень СПА і ЛІІ, що свідчить про збереження порушеного гомеостазу. Отже, на тлі формування стрес-синдрому найбільш “критичними” періодами зниження неспецифічної резистентності є четверта доба хронічного стресу, яка відповідає стадії виснаження, та перших три доби післястресового періоду.

За умов хронічного стресу суттєво змінюється й специфічна резистентність організму, зокрема фактори клітинного імунітету. Абсолютний вміст та питома вага лімфоцитів на тлі хронічного стресу зменшуються вже після першої доби стресу, переважно за рахунок Е-РУК, вміст яких у стадії виснаження досягає 23,11,6 % порівняно з 42,12,8 % в контролі (Р< 0,05), у той час як достовірне зниження вмісту ЕАС-РУК спостерігається лише під час стадії виснаження. У післястресовому періоді характерне подальше пригнічення показників Т-клітинного імунітету та їх неповна стабілізація, у той час як вміст ЕАС-РУК відновлюється значно швидше. Вже на початкових етапах стресу порушується експресія рецепторів Е-РУК до теофіліну. Вміст теофілінчутливих Е-РУК протягом стресу зменшувався більш ніж у сім разів. Коефіцієнт ТФЧ/ТФР, який відображає функціональну активність Т-клітин зменшувався відповідно до 0,08 проти 0,31 у інтактних тварин (Р<0,05). Порушення проліферативної активності Т-клітин підтверджується й результатами досліджень з внутрішньошкірним уведенням Кон А. Т-лімфоцити підданих стресу щурів не відповідали проліферацією у відповідь на мітогенний вплив Кон А, що полягало у суттєвому зменшенні ваги утвореного інфільтрату у місці уведення мітогену, порівняно з аналогічним у інтактних тварин. Отже, кількісні зміни вмісту Е-РУК і ЕАС-РУК, порушення експресії рецепторів до теофіліну та проліферативної активності Т-лімфоцитів відображають стан клітинних механізмів імунної системи і вказують на більш глибоке пригнічення за стресу Т-клітинної ланки, що, в цілому, відповідає загалу інших досліджень (S. Cochen, 1993; О.Д.Ягмуров, 1997).

Вивчення факторів гуморального імунітету дозволило нам встановити наявність специфічних механізмів у патогенезі стресових розладів імунітету. З’ясовано, що за умов запропонованої моделі хронічного стресу у стадії напруження активуються аутоімунні процеси. Зокрема в крові піддослідних тварин на тлі зменшення рівня ЦІК суттєво підвищуються титри АТ до нДНК і дДНК. Подібний факт, з позиції гіпотези про існування нормальних (природних) АТ, розцінюється як адаптивна реакція організму, оскільки ці аАТ, реагуючи з аАГ, сприяють їх елімінації (Р.А.Беловолова, 1992). Співставлення динаміки зміни рівня ЦІК, активності ДНК-зв’язуючих білків сироватки крові та титрів АТ, що реагують з ДНК, виявили синхронність зміни цих показників. Аналіз подібних змін дозволив припустити, що збільшення вмісту природних АТ до ДНК відбувається переважно за рахунок їх вивільнення з ЦІК. Це підтверджується тим, що у стадії виснаження стресу та на ранніх етапах післястресового періоду, коли спостерігається виразне зменшення вмісту ЦІК, титри аАТ також починають знижуватись. Логічно припустити, що збільшення вмісту природних аАТ, реагуючих з ДНК у розпалі стрес-реакції, виступає як природний механізм резистентності. Якщо ж ці реакції стають неадекватними у випадку надмірного утворення аАГ, що має місце в умовах виснажливого стресу, розвиваються патологічні аутоімунні процеси. Встановлено, що в стресових механізмах зростання ЕІ, окрім неспецифічних, важливу роль відіграють і специфічні фактори, зокрема ендотоксини кишкової флори. За зростанням титру АТ до гліколіпіду А E.Coli нами оцінювалась наявність ендотоксину в крові піддослідних тварин та ендотоксинзв’язуюча здатність сироватки крові. Показано, що під час стадії резистентності стресу титри АТ до гліколіпіду А E.Coli в крові у піддослідних тварин зростають більш ніж втричі, що свідчить про напруження резервів антитоксичної системи організму, у той час як повне зникнення титрів АТ у стадії виснаження вказує на неспроможність цих механізмів. Швидше всього, це пояснюється накопиченням в крові ендотоксинів E.Coli у кількості, яка перевищує ендотоксинзв’язуючі можливості крові. Отже, нами показано, що за титром АТ до гліколіпіду А E.Coli в умовах хронічного стресу можна кількісно оцінювати ендотоксинемію та перехід стресу у стадію виснаження, яка характеризується повним зникненням АТ і неспроможністю природних детоксикаційних механізмів крові. З іншого боку, позитивна плантарна проба на алерген кишкової палички, яка проводилась у післястресовому періоді, свідчить про розвиток сенсибілізації організму, формування реакції гіперчутливості, що також негативним чином впливає на показники резистентності. Таким чином, за функціональної неспроможності захисних ендотоксинзв’язуючих реакцій, роль ендотоксинів у механізмах стресової та післястресової імуносупресії підвищується. Отже, якщо у патогенезі порушень імунітету за гострого впливу стресу переважають неспецифічні механізми (Т.І.Коляда і інш., 1995), то на тлі хронічного стресу, особливо під час стадії виснаження, значно підсилюється роль специфічних факторів.

Стан гуморального імунітету також оцінювали за динамікою первинної імунної відповіді на Т-залежний АГ (ЕБ). За впливом стресу до імунізації на вміст АУК у селезінці та показники антитілогенеза, було встановлено, що хронічний стрес може не впливати на гуморальну імунну відповідь (на ранніх етапах), стимулювати її (у стадії резистентності), та виразно пригнічувати (у стадії виснаження і на ранніх етапах післястресового періоду). Стадія виснаження характеризувалась зменшенням вмісту АУК у селезінці більш ніж утричі та майже повним зникненням антитіл.

Вивчення механізмів зазначених змін імунологічної резистентності дозволило встановити, що провідними з них є порушення клітинно-цитокінної регуляції, характеру медіаторного забезпечення органів імуногенезу та лабілізація мембран ІКК.

Стан клітинно-цитокінної регуляції оцінювався за функціональною активністю СМФ, яка є однією з головних клітинних ефекторів забезпечення резистентності і яка, завдяки секреції імунорегуляторних пептидів, здійснює безпосередній контроль за проліферацією і диференціюванням ІКК (А.Н.Маянский, О.Д.Пикуза, 1993). На тлі формування стрес-синдрому поглинальна і бактерицидна активність перитонеальних макрофагів зазнає фазних зрушень і у стадії виснаження виразно пригнічується. Паралельне дослідження секреторної активності цих клітин показало, що, незалежно від стадії, стрес стимулює продукцію ЛАФ перитонеальними макрофагами піддослідних тварин та підвищує в крові рівень ІЛ-1 та кортикостерону. За умов хронізації стресу тривалість продукції ЛАФ і кортикостерону збільшується. З огляду на антагоністичний характер взаємовідносин між ІЛ-1 і глюкокортикоїдами (F.Berkenbosch et al., 1991; E.G.Rybakina et al, 1995; R.Brattsand, M.Linden, 1996), підвищення рівня ІЛ-1 та стрес-індуковану продукцію ЛАФ макрофагами слід розцінювати як прояв мобілізації специфічних механізмів захисту, оскільки таким чином ІЛ-1 компенсує негативний вплив надмірної кортикостеронемії на ІКК.

Разом з тим, тривала продукція ЛАФ, яка має місце у стадії виснаження, може викликати пошкоджуючий вплив на ІКК (C.A.Dinarello, 1993; C.A.Dinarello, S.M.Wolff, 1993). Характерною ознакою стадії виснаження стресу було парадоксальне зменшення продукції ЛАФ макрофагами стресованих щурів після їх додаткової стимуляції Staphylococcus aureus за умов in vitro, тоді як у інтактних тварин та на початкових етапах стресу після додаткової стимуляції, продукція ЛАФ збільшувалась (рис.1). Це вказує на те, що у стадії виснаження стрес виразно зменшує відповідну секреторну реакцію макрофагів на вплив мікробних агентів. Подальше дослідження механізмів імуносупресивного впливу хронічного стресу дозволило встановити, що окрім зменшення функціонального резерву продукції ЛАФ клітинами СМФ, стрес викликає майже повну втрату чутливості лімфоцитів периферичної крові в РБТЛ до комітогенного впливу ІЛ-1: під час стадії виснаження включення Н3-тимідину до ДНК лімфоцитів під впливом ІЛ-1 за умов in vitro, зменшувалось у 7,32 рази (рис.2). Отже, основою порушення клітинно-цитокінних регуляторних механізмів є стресова дисфункція СМФ, яка полягає у зменшенні ЛАФ-активності перитонеальних макрофагів після їх додаткової стимуляції стафілококами, та одночасній втраті чутливості лімфоцитів до їх комітогенного впливу. Встановлений факт зниження функціонального резерву продукції ЛАФ набуває важливого практичного значення, оскільки дозволяє використовувати показники нестимульованої і стимульованої продукції ЛАФ клітинами СМФ разом з показниками РБТЛ у якості маркерів важкості стресу, з метою уточнення його стадії та можливих наслідків.

Важливими патогенетичними факторами дестабілізації імунологічної резистентності в умовах стресу стають також виразні нейро-гормональні зміни, опосередковані напруженням ГГАКС та порушенням катехоламінового забезпечення органів імуногенезу. Це впливає на вміст та співвідношення ЦН в лімфоцитах органів імуногенезу і змінює таким чином напрямок імунологічних реакцій. На основі біохімічних та морфо-гістохімічних досліджень з’ясовано, що функціональна активація наднирковиків на початкових етапах стресу змінюється їх пригніченням у стадії виснаження. При цьому в наднирковиках зменшується вміст А і ДА та збільшується вміст НА. В органах імуногенезу, незважаючи на деякі органоспецифічні відмінності, напрямок цих змін був протилежним і визначався переважним накопиченням в них А, зниженням вмісту НА в тимусі і мезентеріальних ЛВ, паралельним накопиченням в них ДА та збільшенням вмісту НА в селезінці. У післястресовому періоді характерним було загальне зниження вмісту НА та відповідне збільшення рівня ДА, особливо характерне для ЛВ і селезінки. Аналіз виявлених змін катехоламінового забезпечення дозволив припустити, що накопичення А в органах імуногенезу пов’язане з його переважною елімінацією з крові, тим більш що здатність лімфоїдної тканини підсилено адсорбувати КА з крові відома (Г.В.Гущин, 1992), у той час як порушення медіаторного балансу швидше всього визначаються зміною місцевих механізмів обміну КА. Виявлені порушення медіаторного балансу можуть свідчити про можливе переключення їх обміну з норадренергічного на дофамінергічний шлях регуляції, який філогенетично є більш древнім і відображає розвиток аварійного рівня регуляції функцій (С.А.Еремина, Е.И.Белякова, 1987). Факт переважного накопичення ДА в лімфоїдних органах за умов стресу є досить важливим, оскільки зміна концентрації цього медіатора може безпосередньо впливати на імунну відповідь (B.Fuchs et al., 1989; S.Cabib et al., 1996). Таким чином, виявлені зміни вмісту КА в лімфоїдних органах, незважаючи на їх адаптивний характер, відображають зміни нейро-гуморальної регуляції, які порушують умови функціонування ІКК і їх участь у захисних реакціях організму. З іншого боку, дисбаланс спектру КА в лімфоїдних органах визначає різні шляхи впливу адреномедіаторів на функціональну активність ІКК, показником якої є вміст та співвідношення ЦН. ЦН виконують роль посередника в активації клітин під впливом лігандів та нейротрансмітерів (И.Ф.Фёдоров, 1990; Г.В.Гущин, 1992). В динаміці розвитку хронічного стресу вміст та співвідношення ЦН в лімфоцитах органів імуногенезу зазнає суттєвих змін, які носять фазний та органоспецифічний характер. Наявність даних про вплив підвищення рівня цАМФ на уповільнення швидкості проліферації лімфоцитів, збільшення кількості супресорних клітин та підсилення їх функціональної активності дозволяють трактувати цАМФ-залежні механізми в якості негативних регуляторів імунологічних процесів. Збільшення ж рівня цГМФ - навпаки, супроводжується підсиленням проліферації лімфоцитів і відображає позитивну регуляцію імунних процесів (J.W.Hadden, 1983). Якщо розцінювати результати наших досліджень саме з цієї точки зору, то загальна тенденція до зростання відносного рівня цАМФ за умов стресу, характерна для ЛВ та тимусу, свідчить про перевагу імуносупресивних механізмів і корелює з динамікою пригнічення імунної відповіді. Зростання ж рівня цГМФ, яке переважно спостерігалось в стадії резистентності стресу і у післястресовому періоді, відображає перевагу проліферативних процесів в органах імуногенезу та поступову реабілітацію імунної системи. У лімфоцитах селезінки, порівняно з клітинами тимусу і ЛВ, подібні зрушення вмісту ЦН набували зворотного напрямку. Проведення кореляційного аналізу дозволило встановити наявність на початкових етапах стресу позитивного зв’язку між рівнем цАМФ і А (r = +0,52) та рівнем цГМФ і НА (r = +0,64) в лімфоцитах тимуса. У післястресовому періоді зміна вмісту цГМФ позитивно корелює з концентрацією НА (r = +0,55) і ДА (r = +0,75) в мезентеріальних ЛВ і концентрацією НА (r = +0,69) та ДА (r = +0,58) в лімфоцитах тимуса. Наявність цих зв’язків підтверджує участь КА в активації ЦН в