ТАВРІЙСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. В. І. ВЕРНАДСЬКОГО

ШИРЯЄВ МИКОЛА ВАЛЕРІЙОВИЧ

УДК 616.153.96:638.178.8

ОСОБЛИВОСТІ ВЗАЄМОДІЇ ДЕЯКИХ БІЛКІВ ССАВЦІВ

З МЕЛІТИНОМ І ЛІПОФОРИНОМ КОМАХ

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Сімферополь – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Кримському державному медичному університеті ім. С. І. Георгієвського МОЗ України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Єфетов Костянтин Олександрович, Кримський державний медичний університет ім. С. І. Георгієвського МОЗ України, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти:

- доктор біологічних наук, професор Коношенко Світлана Володимирівна, Таврійський національний університет ім. В. І. Вернадського, завідувач кафедри біохімії;

- кандидат біологічних наук, доцент, Руднєва Ірина Іванівна, Інститут біології південних морів ім. О. О. Ковалевського НАН України, старший науковий співробітник відділу іхтіології

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, відділи нейрохімії та біохімії коферментів, м. Київ

Захист відбудеться 24.10.2002 р. об 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 52.051.04 при Таврійському національному університеті ім. В. І. Вернадського за адресою: 95007, м. Сімферополь, вул. Ялтинська, 4

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Таврійського національного університету ім. В. І. Вернадського за адресою: 95007, м. Сімферополь, вул. Ялтинська, 4

Автореферат розісланий 23.09.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мартинюк В. С.

ЗАГАЛЬНА характеристика рОботИ

Актуальність теми. Дія бджолиної отрути на організм людини звично розглядається через призму класичної алергічної реакції на білкові компоненти бджолиної отрути (Рейсмен Р. Е., 2000; Фішер Т., Лолор-молодший Г., 2000). В результаті попередніх ужалень в організмі людини виникає IgE-імунна відповідь на білкові компоненти бджолиної отрути і ці IgE фіксуються на поверхні гладких клітин. При повторному попаданні отрути його антигени взаємодіють з IgE на поверхні гладких клітин, викликаючи вивільнення гістаміну, що призводить в кінцевому підсумку до розвитку системних реакцій на бджолину отруту. Разом з тим, деякі автори вказують на можливість псевдоалергічних реакцій на отруту перетинчастокрилих комах, причому природа цих реакцій до цього часу залишається невстановленою (Пицький В.И., Адріанова Н.В., Артомасова А.В., 1999).

З іншого боку, за останній час одержано дані про те, що основний пептидний компонент отрути бджоли – мелітин – здатний взаємодіяти з IgG, не виступаючи як антиген (Єфетов К.О., Троїцький Г.В., 1993; Єфетов К.О., 1994), а також із сироватковим альбуміном (Ажицький Д.Г., Ажицький Г.Ю., Борисенко С.Н., 1995; Ажицький Д.Г., 1996). Останній білок має також здатність інгібувати мелітин-індукований лізис еритроцитів (Руденко С.В., Нипот Е. Е., 1996). В наших експериментах ми досліджували взаємодію мелітину з IgG і С1q, а також шукали звўязок між наявністю такої взаємодії і виникненням псевдоалергічних реакцій на бджолину отруту. Крім того, великий інтерес викликало вивчення інгібуючого ефекту досліджуваних сироваткових білків (IgG, С1q і сироваткового альбуміну) на мелітин-індукований лізис еритроцитів.

Таким чином, взаємодія сироваткових білків із мелітином із отрути бджоли вивчалась в двох напрямках: 1) досліджувалась можлива роль цих білків в молекулярних механізмах розвитку системних реакцій на бджолину отруту; 2) досліджувалась захисна роль цих білків за літичної дії бджолиної отрути на форменні елементи крові.

Раніше було показано, що імуноглобуліни добре взаємодіють з невеликими ліпідними молекулами (Єфетов К.О., Троїцький Г.В., 1993). На підставі цих даних виникло припущення про те, що імуноглобуліни здатні неспецифічно взаємодіяти з ліпопротеїнами. Для перевірки цієї можливості було обрано модельний ліпопротеїн гемолімфи імаго лускокрилих роду Zygaena Fabricius, 1775 (Lepidoptera, Zygaenidae).

В той же час було зроблено припущення про те, що специфічні взаємодії імуноглобулінів з ліпофорином різних видів роду Zygaena можуть бути використані для вирішення систематичних завдань в межах досліджуваного роду лускокрилих. З цією метою було заплановано одержання мишиних моноклональних антитіл до ліпофорину гемолімфи лускокрилих роду Zygaena.

За останнє десятиріччя біохімічні методи систематики комах стали дуже популярні і плодотворно використовуються в сучасній ентомологічній практиці. Однак, в основному, вказані дослідження зводяться до вивчення ізоферментного спектру десятків ферментів різних видів комах в межах досліджуваного таксону. Випадки використання моноклональних антитіл з метою імуносистематики носять поодинокий характер (Trowell S.C. et al., 2000) і немає прикладів побудови філогенетичних дерев для досліджуваних таксонів. Ось чому було особливо важливо розробити методику, за допомогою якої моноклональні антитіла можна було б широко використовувати для імуносистематичного аналізу в межах самих різних таксонів.

Звўязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках наукових досліджень кафедри біохімії Кримського державного медичного університету ім. С. І. Георгієвського за темами "Використання методів молекулярної імунології і молекулярної біології в комплексі з традиційними підходами для вирішення проблем патохімії білків і біосистематики", № держ.реєстрації – 0100V002029, і "Розробка методів ідентифікації модифікованих при патології імуноглобулінів і виявлення причин модифікації", № держ.реєстрації – 3097 0196V013217.

Мета і задачі дослідження

Мета – вивчити взаємодію білків сироватки крові ссавців з мелітином і ліпофорином комах для з'ясування нових аспектів патогенної дії бджолиної отрути і розробки нових підходів в імуносистематиці.

Задачі:

1. Вдосконалити методику виділення моноклональних імуноглобулінів і папаїнових фрагментів імуноглобулінів G за допомогою іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-трисакрилі М.

2. Дослідити взаємодію IgG з мелітином, уточнити локалізацію сайта звўязування мелітину на молекулі IgG.

3. Дослідити вплив мелітину на взаємодію антиімуноглобулінових антитіл зі своїми антигенами.

4. Дослідити вплив мелітину на взаємодію IgG з С1q субкомпонентом комплементу як можливу причину псевдоалергічних реакцій на бджолину отруту.

5. Вивчити вплив деяких білків сироватки крові (IgG, C1q і сироваткового альбуміну) на мелітин-індукований лізис еритроцитів.

6. Одержати моноклональні антитіла до ліпофорину гемолімфи імаго Zygaena minos, вивчити їх специфічну взаємодію з антигеном у різних біологічних видів і використовувати одержані результати для створення нового методу імуносистематики.

Обўєкт дослідження – взаємодія білків сироватки крові з мелітином і ліпофорином комах.

Предмет дослідження – неантигенні взаємодії мелітину із бджолиної отрути з білками сироватки крові та їх роль в розвитку системних реакцій у людини на бджолину отруту. Специфічна взаємодія ліпофорину гемолімфи комах з моноклональними антитілами, як основа для створення нового методу імуносистематики.

Методи дослідження. В роботі використано сучасні методи виділення та очищення імуноглобулінів (гель-фільтрація та іонообмінна хроматографія). Взаємодія мелітину з IgG, а також вплив мелітину на IgG (антиген)-IgG (антитіло) і IgG-C1q взаємодію досліджувалась методом твердофазного імуноферментного аналізу. Проводився також мелітин-індукований лізис еритроцитів для визначення впливу ряду сироваткових білків на цей процес. Для одержання моноклональних антитіл до ліпофорину використовувалась гібридомна технологія. Моноклональні антитіла до ліпофорину, які продукуються отриманою гібридомою, були використані в твердофазному імуноферментному аналізі для дослідження їх взаємодії з ліпофоринами різних видів роду Zygaena. На підставі даних імуноферментного аналізу за допомогою компўютерних програм NJTREE і TDRAW було сконструйовано філогенетичне дерево для досліджуваних видів роду Zygaena.

Наукова новизна одержаних результатів

1. Створено нову модифікацію методу іонообмінного розділення папаїнових фрагментів поліклональних IgG людини на колонці з ДЕАЕ-трисакрилом М (LKB, Швеція). За допомогою одержаних папаїнових фрагментів імуноглобулінів уточнено локалізацію звўязування мелітину з молекулою IgG.

2. Вперше показано, що природний пептид мелітин із отрути бджоли підсилює специфічні IgG (антиген)-IgG (антитіло) взаємодії і взаємодію IgG з С1q. На підставі цих результатів висунуто гіпотезу про механізм псевдоалергічних реакцій на бджолину отруту через антигеннезалежну активацію мелітином класичного шляху комплементу.

3. Отримали подальший розвиток уявлення про вплив сироваткового альбуміну на взаємодію мелітину з еритроцитами людини. Показано, що за певних умов, поряд з інгібуючою дією сироваткового альбуміну на мелітин-індукований лізис еритроцитів, спостерігається також його активуючий ефект на витік гемоглобіну із еритроцитів при сублітичних концентраціях мелітину. Цей результат дозволив заключити, що існують принаймні два різних механізми дії мелітину на мембрану еритроцитів.

4. Одержано нову гібридому, яка продукує моноклональні антитіла до ліпофорину гемолімфи імаго лускокрилих роду Zygaena. За допомогою цих моноклональних антитіл розроблено новий метод імуносистематики і запропоновано зміни в систематиці роду Zygaena.

Практичне значення одержаних результатів

1. За допомогою іонообмінної хроматографії на колонці з ДЕАЕ-трисакрилом М (LKB, Швеція) створено нову модификацію методу розділення Fab- і Fc-фрагментів поліклональних IgG людини, яка може бути з успіхом використана в майбутньому для препаративного виділення очищених Fab- і Fc-фрагментів.

2. При вивченні взаємодії мелітину з IgG і С1q отримано нові факти щодо можливих механізмів псевдоалергічних реакцій на бджолину отруту. Це може мати принципове значення для удосконалення профілактики і лікування системних реакцій на бджолину отруту.

3. На основі гібридомної технології і компўютерних методів досліджень розроблено новий метод імуносистематики на прикладі дослідження ліпофорину видів роду Zygaena. Розробка даного методу дозволила нам запропонувати внести конкретні зміни в систематику роду Zygaena.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає у виконанні експериментальної частини роботи, підборі та аналізі літературних даних. Планування експериментів і обговорення їх результатів проведено спільно з науковим керівником. Дисертант також висловлює подяку науковому керівникові за велику допомогу в освоєнні гібридомної технології і постановці підходів для вирішення проблем систематики при дослідженні лускокрилих роду Zygaena.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були повідомлені на Міжнародній науковій конференції, присвяченій 150-річчю з дня народження І. І. Мечнікова "Ідеї І. І. Мечнікова і розвиток сучасного природознавства" (Харків, 1995); Хth Еuropean Congress of Lepidopterology (Miraflores (Madrid), 1996); підсумковій науковій конференції центральної науково-дослідної лабораторії Кримського державного медичного університету ім. С. І. Георгієвського (Сімферополь, 2000); II зўїзді онкологів країн СНД (Київ, 2000); спільному засіданні Кримського відділення Українського біохімічного товариства і профільної медико-біологічної проблемної комісії Кримського державного медичного університету ім. С. І. Георгієвського (Сімферополь, 2002).

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 4 статтях в наукових журналах і в 3 тезах доповідей на міжнародних наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, пўяти розділів, висновків і списку використаної літератури. Повний обсяг дисертації включає 156 сторінок, в дисертацію входять 8 таблиць і 21 рисунок. Список використаної літератури включає 264 джерела вітчизняних і зарубіжних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В першому розділі наведено літературні дані щодо вивчення IgG ссавців. Особливу увагу приділено специфічним і неспецифічним взаємодіям IgG з макромолекулами і низькомолекулярними речовинами.

У другому розділі наведено літературні дані про структурно-функціональні особливості досліджуваних молекул комах – мелітину із отрути бджоли і ліпофорину із гемолімфи комах.

В третьому розділі висвітлюються

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

В експериментах використовувався препарат мелітину, виділений Г. Ю. Ажицьким із бджолиної отрути методом іонообмінної хроматографії з наступною рехроматографією на зворотно-фазовому сорбенті (Ажицький Г.Ю., Ажицький Д.Г., 1993). Препарат очищеного C1q людини був представлений А. М. Іщенком, НДІ особливо чистих біопрепаратів Головмікробіопрому РФ (Санкт-Петербург). В експериментах використовувався препарат бичачого сироваткового альбуміну фірми “Serva” (Німеччина).

Для одержання моноклональних антитіл до мелітину і IgG людини використовувались гібридоми, отримані раніше в нашій лабораторії. Як джерело моноклональних антитіл IgG1 M2F9 до мелітину використовували розведену асцитну рідину. Моноклональні антитіла IgG1 2F11 до IgG людини виділяли з асцитної рідини мишей шляхом осадження в 17,5 %-ному розчині сірчанокислого амонію з наступною іонообмінною хроматографією на ДЕАЕ-трисакрилі М (LKB, Швеція).

Поліклональні IgG сироватки крові людини, а також IgG- і IgA-парапротеїни сироватки крові хворих парапротеїнемічним гемобластозом виділяли шляхом осадження в 17,5 %-ному розчині сірчанокислого амонію з наступною іонообмінною хроматографією на ДЕАЕ-трисакрилі М (LKB, Швеція). Чистоту одержаних білкових препаратів визначали за допомогою диск-електрофорезу в 7,5 %-ному поліакриламідному гелі за стандартною методикою (Маурер Г., 1971).

Для одержання Fab- і Fc-фрагментів використовувались поліклональні IgG людини. Для цього проводили гідроліз (Фримель Г., 1987) за допомогою папаїну фірми “Sigma” (США), гель-фільтрацію через колонку з ультрагелем АсА44 (LKB, Швеція) і подальшу іонообмінну хроматографію на колонці з ДЕАЕ-трисакрилом М. Чистоту отриманих препаратів Fab- і Fc-фрагментів визначали методом твердофазного імуноферментного аналізу.

Взаємодію IgG та його папаїнових фрагментів з мелітином визначали за допомогою діалізу і твердофазного імуноферментного аналізу. Діаліз проб суцільних IgG або їх фрагментів, проінкубованих з мелітином протягом доби при +4°С, проводили через целофанову мембрану проти ЗФР (0,005 М фосфатного буферу, рН 7,4, який містить 0,15 М NaCl). Діаліз відбувався протягом пўяти діб з відбором проб для аналізу за схемою: вихідна проба, 1 доба, 3 доби і 5 діб діалізу. Кількість мелітину, який не звўязувався із суцільним IgG людини або його фрагментами, оцінювали за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу. Дослідження проводилось в кілька етапів із відмиванням планшету між етапами: 1) досліджувана суміш білок:мелітин; 2) 1%-ний бичачий сироватковий альбумін; 3) моноклональні антитіла миші IgG1 M2F9 до мелітину; 4) овечі антитіла до IgG миші, конўюговані з пероксидазою хріну; 5) субстратна суміш (2, 2'-азино-ди-[3-етил-бензтиазолін сульфонат (6)] і пероксид водню в цитрат-NaOH буферному розчині, рН 4,0). По закінченні експерименту вимірювали оптичну щільність лунок планшету із субстратною сумішшю при довжині хвилі 405 нм з використанням вертикального спектрофотометра.

Вплив мелітину на специфічні взаємодії (антиген-антитіло) імуноглобулінів аналізували за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу. Дослідження проводили в кілька етапів із відмиванням планшету між етапами: 1) поліклональний IgG людини; 2) 1%-ний бичачий сироватковий альбумін; 3) моноклональні антитіла миші IgG1 2F11 до IgG людини; 4) овечі антитіла до IgG миші, конўюговані з пероксидазою хріну; 5) субстратна суміш. Мелітин вносили в планшет перед додаванням IgG1 2F11, разом з IgG1 2F11 або разом з овечими антитілами. При внесенні мелітину перед IgG1 2F11 між другим і третім етапом вводився додатковий мелітиновий етап. На першій стадії замість поліклональних IgG людини вносили його Fab- або Fc-фрагменти, а також виділені нами парапротеїни людини.

Взаємодію моноклональних антитіл миші IgG1 2F11 і С1q субкомпоненту комплементу в присутності мелітину аналізували за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу. Дослідження проводили в кілька етапів з відмиванням планшету між етапами: 1) С1q субкомпонент комплементу людини; 2) 1%-ний бичачий сироватковий альбумін; 3) мелітин; 4) моноклональні антитіла миші IgG1 2F11; 5) овечі антитіла до IgG миші, конўюговані з пероксидазою хріну; 6) субстратна суміш. Для вивчення впливу мелітину на взаємодію мишиних моноклональних антитіл з С1q на четвертому етапі замість моноклональних антитіл вносили сироватку крові миші в розведенні 1:800 в ЗФР.

Всі експерименти з еритроцитами здійснювали в ізотонічному 0,0045 М веронал-NaOH буферному розчині з Са2+ і Mg2+, рН 7,4. Еритроцити людини отримували із свіжовзятої венозної крові здорових донорів шляхом центрифугування при 1500 g протягом 15 хвилин. Ступінь гемолізу еритроцитів під впливом мелітину визначали шляхом центрифугування проби при 1500 g протягом 15 хвилин і наступного виміру екстинкції супернатанту в 1 см кюветі на фотоелектричному фотометрі КФК-3 при довжині хвилі 412 нм (Е412). Для одержання стійких результатів суміш мелітину та еритроцитів інкубували у повітряному термостаті протягом години при +37 °С.

Одержання гібридоми до ліпофорину гемолімфи імаго Zygaena minos ([Denis & Schiffermьller], 1775) здійснювали шляхом злиття в присутності поліетиленгліколю 4000 (Merk, Німеччина) клітин мишиної мієломи Sp2/0 з лімфоцитами селезінки мишей лінії BALB/c, імунізованих гемолімфою. Гемолімфу імаго Zygaena minos, а також деяких інших видів збирали у представників різних популяцій, що мешкають на території Криму. Отримана в кінцевому підсумку гібридома продукувала моноклональні антитіла IgG Z1C3, які реагували в твердофазному імуноферментному аналізі із жовтозабарвленою електрофоретичною фракцією ліпофорину і не реагували ні з однією іншою білковою фракцією гемолімфи Z. minos.

Для побудови філогенетичного дерева видів роду Zygaena Fabricius, 1775 (Lepidoptera, Zygaenidae) за допомогою твердофазного імуноферментного методу аналізували взаємодію ліпофоринів гемолімфи різних видів лускокрилих з одержаними нами моноклональними антитілами IgG Z1C3. Дослідження проводили в кілька етапів з відмиванням планшету між етапами: 1) гемолімфа певного виду, розведена в 500 разів; 2) 1%-ний бичачий сироватковий альбумін; 3) моноклональні антитіла миші IgG Z1C3; 4) овечі антитіла до IgG миші, які конўюгували з пероксидазою хріну; 5) субстратна суміш. Дані імуноферментного аналізу (оптична щільність вмісту лунок при довжині хвилі 405 нм, яка характеризує рівень взаємодії моноклональних антитіл з ліпофорином імаго різних видів роду Zygaena) використовували для вивчення філогенетичних взаємовідносин між досліджуваними видами за допомогою компўютерних програм NJTREE і TDRAW. NJTREE застосовувалась для розрахунку неукоріненних філогенетичних дерев на основі “neighbor-joining” методу (Saitou N., Nei M., 1987). За допомогою цієї програми обчислювались патристичні дистанції між досліджуваними видами (Nei M., 1987). “Neighbor-joining” дендрограми створювались за допомогою програми TDRAW. Вони характеризують ступінь споріднення різних таксономічних одиниць (Sneath P.H.A., Sokal R.R., 1973).

В четвертому розділі дисертації наведені

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Для вивчення взаємодії мелітину з поліклональними IgG людини, а також з його папаїновими фрагментами, необхідно було розділити суміш Fab- і Fc-фрагментів. З цією метою нами була розроблена оригінальна методика розділення Fab- і Fc-фрагментів поліклональних IgG людини на колонці з ДЕАЕ-трисакрилом М. Суміш Fab- і Fc-фрагментів вносили на колонку в 0,035 М трис-НСl буферному розчині без NaCl, рН 8,8, а потім проводили елюцію білків тим же буферним розчином із ступенево зростаючим градієнтом концентрації NaCl. У вихідному буферному розчині з колонки знаходяться чисті Fab-фрагменти. Буферним розчином з 0,035 М NaCl з колонки вимивається суміш Fab- і Fc-фрагментів, а в буферному розчині, який містить 0,057 М NaCl, виявляються чисті Fc-фрагменти.

Проведені дослідження показали, що моноклональні антитіла миші IgG1 M2F9, специфічні до мелітину, не виявляли, принаймні, значну частину мелітину, звўязаного з IgG або з його папаїновими фрагментами. Це свідчило про те, що за допомогою IgG1 M2F9 в досліджуваних в ході імуноферментного аналізу пробах визначається тільки мелітин, не звўязаний з білками.

На рис. 1 показано, що при пўятиденному діалізі проти ЗФР концентрація мелітину за відсутністю білків знизилась лише вдвічі, що може бути повўязано з перебуванням мелітину в ЗФР переважно в тетрамерній формі, для якої використана нами целофанова мембрана непроникна. У присутності білків виявлена концентрація мелітину падала в значно більшій мірі – приблизно в 6 разів в присутстності Fab-фрагментів і приблизно в 16 разів в присутності суцільних IgG або Fc-фрагментів. Отже, майже весь мелітин, що залишився в турбочці для діалізу, виявився в звўязаному з білками стані, причому ціла молекула IgG або її ізольований Fc-фрагмент звўязують мелітин значно ефективніше, ніж ізольований Fab-фрагмент молекули IgG. Очевидно, що головний сайт звўязування мелітину на молекулі IgG людини розташований в межах Fc-сегменту молекули IgG, має негативний заряд і, можливо, гідрофобну кишеню для гідрофобного “хвоста” мелітину. Цю умову добре задовольняє порожнина між двома СH2 доменами IgG молекули, в якій розташовуються два негативно заряджених вуглеводних компоненти.

Рис.1. Залежність концентрації мелітину, яка виявляється у твердофазному імуноферментному аналізі, від часу діалізу вихідних проб: 1 – чистий мелітин; 2 – IgG: мелітин = 1 : 5 (молярне співвідношення); 3 – Fab : мелітин = 2 : 5; 4 – Fc : мелітин = 1 : 5; n – розведення мелітину, яке визначається в імуноферментному аналізі; n=1 при концентрації мелітину 0,041 мг/мл.

Вивчення характеру впливу мелітину на специфічні взаємодії (антиген-антитіло) імуноглобулінів методом твердофазного імуноферментного аналізу показало, що в присутності мелітину досягається підсилення взаємодії мишиних моноклональних антитіл IgG1 2F11 з овечими антитілами до IgG миші (рис. 2).

Разом з тим, мелітин в тих же концентраціях не викликає помітної взаємодії поліклональних IgG людини з овечими антитілами до IgG миші. При розтитруванні мишиних моноклональних антитіл IgG1 2F11 у відсутності мелітину було виявлено, що при внесенні мелітину в концентрації 12,5 мкг/мл досягається підсилення взаємодії мишиних моноклональних антитіл IgG1 2F11 з овечими антитілами до імуноглобулінів миші приблизно еквівалентне двадцятикратному збільшенню концентрації IgG1 2F11. Даний експеримент свідчить про те, що мелітин підсилює взаємодію антитіл до імуноглобулінів із своїми антигенами і практично не викликає неспецифічної взаємодії імуноглобулінів.

Мелітин також підсилював взаємодію поліклонального IgG людини, його папаїнових фрагментів або IgG парапротеїнів людини з мишиними моноклональними антитілами IgG1 2F11, специфічними до IgG людини (P<0,01). Причому, у випадку взаємодії поліклонального IgG с IgG1 2F11 в присутності мелітину підсилення було більш значним, ніж у випадку, коли тільки поліклональний IgG був проінкубований з мелітином, а вже потім добавлений IgG1 2F11.

Рис.2. Залежність рівня взаємодії овечих антитіл, специфічних до IgG миші, з мишиними моноклональними антитілами IgG1 2F11 в імуноферментному аналізі від концентрації мелітину (А) і IgG1 2F11 (B):

А – розтитрований мелітин, n – розведення мелітину (концентрація в нерозведеному зразку – 50 мкг/мл), 1 – IgG1 2F11 в концентрації 1,25 мкг/мл (з=0,99); 2 – ЗФР замість IgG1 2F11. Пунктиром показано рівень взаємодії овечих антитіл з мишиними IgG1 2F11 за відсутності мелітину;

В – мелітин відсутній, розтитрований IgG1 2F11 (з=0,99), n – розведення IgG1 2F11 (концентрація в нерозведеному зразку – 80 мкг/мл). Пунктиром показано відмінність у рівні взаємодії овечих антитіл з мишиними IgG1 2F11 за відсутності (I) і в присутності (12,5 мкг/мл) (II) мелітину.

Аналізуючи послідовність амінокислотних залишків мелітину, ми виявили, що його гідрофільна кінцева послідовність ...-Lys(21)-Arg(22)-Lys(23)-Arg(24)-Gln(25)-Gln(26)-CONH2 містить два “дзеркальних” сайти ...-Gln(25)-X-Lys(23)-Y-Lys(21)-... і ...-Gln(26)-X-Arg(24)-Y-Arg(22)-... . Ці сайти приблизно можуть імітувати сайт на СH2 домені IgG людини або миші, який відповідальний за фіксацію C1q субкомпоненту першого чинника комплементу: ...-Glu(318)-X-Lys(320)-Y-Lys(322)-... (Duncan A.R., Winter G., 1988). Ми припустили, що гідрофільна С-кінцева послідовність мелітину служить не тільки для заякорювання пептиду в ліпідних мембранах (Костржевська О.Г. та співавт., 1992), але й для можливої специфічної взаємодії мелітину з С1q. Для перевірки цього припущення було вивчено вплив мелітину на взаємодію С1q з моноклональними і поліклональними антитілами миші.

На рис. 3 показано, що із збільшенням концентрації мелітину спостерігається пропорціональний ріст взаємодії мишиних моноклональних антитіл IgG1 2F11 з C1q в порівнянні з рівнем їх взаємодії за відсутності мелітину.

Рис.3. Залежність рівня взаємодії IgG1 2F11 з імобілізованим на планшеті C1q в імуноферментному аналізі від концентрації мелітину (А) і IgG1 2F11 (В):

А – розтитрований мелітин, n – розведення мелітину (концентрація в нерозведеному зразку – 100 мкг/мл); 1 – IgG1 2F11 в концентрації 1,25 мкг/мл (з=0,97); 2 – ЗФР замість IgG1 2F11. Пунктиром показано рівень взаємодії IgG1 2F11 і C1q за відсутності мелітину;

В – мелітин відсутній, розтитрований IgG1 2F11 (з=0,99), n – розведення IgG1 2F11 (концентрація в нерозведеному зразку – 20 мкг/мл). Пунктиром показано відмінність у рівні взаємодії мишиних IgG1 2F11 з C1q в присутності (100 мкг/мл) (I) і за відсутності (II) мелітину.

За допомогою калібровочної прямої було встановлено, що при концентрації мелітину 100 мкг/мл досягається підсилення взаємодії мишиних моноклональних антитіл IgG1 2F11 з C1q, приблизно еквівалентне двадцятикратному збільшенню концентрації IgG1 2F11. Оскільки в даному експерименті підсилення взаємодії могло бути досягнуто тільки за рахунок мелітину, який звўязується з С1q, факт взаємодії мелітину з С1q можна вважати доведеним. В подальшому було показано, що взаємодія поліклональних IgG миші з C1q також підсилюється в присутності мелітину. Одержані результати свідчать про те, що ефект мелітину на C1q-IgG взаємодії носить інтенсифікуючий і, ймовірно, універсальний характер. На підставі наведених даних було зроблено висновок, що при попаданні бджолиної отрути в кровўяне русло людини мелітин здатний викликати утворення стійких IgG-IgG і IgG-C1q імунних агрегатів, які можуть активізувати систему комплементу по класичному шляху. Можливо також, що дія мелітину опосередковується через утворення С3а і С5а чинників комплементу, які викликають вивільнення гістаміну із базофілів крові і швидкий розвиток анафілактоїдної реакції при дії бджолиної отрути. Дана гіпотеза дозволяє пояснити випадки тяжких анафілактоїдних реакцій на укус бджоли, коли постраждалі ніколи раніше із бджолиною отрутою не контактували і, отже, не може бути й мови про звичну алергічну реакцію на бджолину отруту.

В дослідженнях мелітин-індукованого лізису еритроцитів було показано, що годинна предінкубація мелітину (0,4–1,4 мкг/мл) з розведеною в 30 разів сироваткою крові повністю інгібувала лізис при наступному додаванні еритроцитів. Спроба приурочити даний інгібуючий ефект до дії певних білків сироватки показала, що при концентрації мелітину 1,0 мкг/мл 25 мкг/мл поліклонального IgG людини або 10 мкг/мл C1q людини дуже слабко інгібували мелітин-індукований лізис еритроцитів (85 %-ний і 95 %-ний лізис еритроцитів відповідно), тоді як 12 мкг/мл бичачого сироваткового альбуміну мали виражену інгібуючу дію (22 %-ний лізис еритроцитів, Р < 0,01).

Особливо цікаву інформацію про поведінку сироваткового альбуміну при мелітин-індукованому лізисі еритроцитів дають досліди із “проінкубованими” еритроцитами, які до використання в експерименті зберігались при +4°С 10–11 днів, але не демонстрували після зберігання значного спонтанного лізису. Наряду з інгібуючим ефектом бичачого сироваткового альбуміну (100 мкг/мл) при дії літичних доз мелітину (0,6–1,0 мкг/мл) спостерігався виражений активуючий ефект його на витік гемоглобіну із еритроцитів при сублітичних дозах мелітину (0,2–0,4 мкг/мл). Даний результат дозволяє заключити, що існує принаймні два принципово різних механізми дії мелітину на еритроцитарну мембрану, на які сироватковий альбумін впливає протилежним чином.

З метою розширення сучасних уявлень про формування комплексу антиген-антитіло і для дослідження філогенетичного споріднення видів роду Zygaena Fabricius, 1775 (Lepidoptera, Zygaenidae) вивчалась специфічна взаємодія одержаних нами моноклональних антитіл миші IgG Z1C3 з ліпофоринами різних видів роду Zygaena. Методом твердофазного імуноферментного аналізу нами досліджена гемолімфа ряду видів лускокрилих: Z. (Mesembrynus) punctum Ochsenheimer, 1808; Z. (M.) minos ([Denis & Schiffermьller], 1775); Z. (M.) purpuralis (Brьnnich, 1763); Z. (Agrumenia) sedi Fabricius, 1787; Z. (Zygaena) loti ([Denis & Schiffermьller], 1775); Z. (Z.) viciae ([Denis & Schiffermьller], 1775); Z. (Z.) dorycnii Ochsenheimer, 1808; Z. (Z.) filipendulae (Linnaeus, 1758); Z. (Z.) lonicerae (Scheven, 1777).

Моноклональні антитіла до ліпофорину майже з однаковою інтенсивністю взаємодіяли з гемолімфою імаго Zygaena minos і Zygaena purpuralis, що свідчить про філогенетичну близкість вищеназваних видів. В той же час ступені взаємодії моноклональних антитіл з гемолімфою різних видів підродини Zygaeninae значно відрізнялись. Рівень взаємодії був найбільш високий у випадку видів підроду Mesembrynus Hьbner, 1819, до якого належить і вид Zygaena minos. Відповідні показники для видів підродів Zygaena Fabricius, 1775 і Agrumenia Hьbner, 1819 були значно нижчі. За допомогою методу подвійної радіальної імунодифузії показано відсутність дуг преципітації при взаємодії одержаних моноклональних антитіл та очищеного ліпофорину гемолімфи імаго Zygaena purpuralis. Одне із імовірних пояснень даного факту – наявність єдиної антигенної детермінанти, яка виявляється моноклональним антитілом IgG Z1C3 на поверхні молекули ліпофорину. Ось чому різниця у рівнях взаємодії моноклональних антитіл з ліпофорином різних видів повўязується нами з наростанням відмінностей в структурі виявленої антигенної детермінанти ліпофорину по мірі зростання філогенетичної віддаленості "порівнювального" виду від "еталонного" (Zygaena minos).

Рис.4. Дендрограма, сконструйована за допомогою програм NJTREE і TDRAW, яка відображує патристичні дистанції між видами роду Zygaena за результатами взаємодії одержаних моноклональних антитіл з ліпофоринами різних видів (пояснення в тексті).

Одержана за результатами імуноферментного аналізу дендрограма (рис. 4) відображує взаємовідношення видів, згідно до імунологічного критерію, в цілому відповідає сучасній систематиці роду Zygaena Fabricius, 1775. Числа, наведені на гілках дендрограми, характеризують патристичні дистанції (еволюційна відстань, яка відділяє даний таксон від найближчого загального предка з найбільш близькоспорідненим йому таксоном). Числа в квадратних дужках характеризують патристичні дистанції для окремих видів. Разом з тим, види підродів Zygaena і Agrumenia, з одного боку, і види підроду Mesembrynus, з другого, формують дві компактні групи на представленій дендрограмі.

Дані результати є додатковим аргументом на користь обўєднання підродів Zygaena Fabricius, 1775 і Agrumenia Hьbner, 1819 в один підрід Zygaena Fabricius, 1775. Можна заключити, що моноклональні антитіла можуть бути успішно використані для вирішення складних систематичних проблем, особливо у випадку вивчення філогенетичних взаємовідносин порівняно близькоспоріднених таксонів.

В пўятому розділі із посиланням на сучасну літературу детально обговорюються одержані результати досліджень, на підставі яких сформульовані наступні

ВИСНОВКИ

1. За допомогою іонообмінної хроматографії на колонці з ДЕАЕ-трисакрилом М створено нову модифікацію методики розділення папаїнових фрагментів поліклональних імуноглобулінів G людини. Одержано чисті препарати імуноглобулінів і папаїнових фрагментів імуноглобулінів, які використано для вивчення їх взаємодії з мелітином із отрути бджоли.

2. Показано, що мелітин взаємодіє з поліклональними IgG сироватки крові та їх папаїновими фрагментами. Результати експериментів свідчать про те, що мелітин звўязується переважно з Fc-фрагментом молекули IgG.

3. За допомогою твердофазного імуноферментного аналізу продемонстровано, що мелітин впливає на специфічну взаємодію антиімуноглобулінових антитіл зі своїми антигенами. При цьому не виявлено неспецифічної взаємодії імуноглобулінів під впливом мелітину.

4. Мелітин взаємодіє з Clq субкомпонентом комплементу, що призводить до значного підсилення реакції Clq з IgG, яку можна зареєструвати методом імуноферментного аналізу. Показано залежність підсилення мелітином специфічних IgG (антиген)-IgG (антитіло) і Clq-IgG взаємодій від рН та іонної сили буферного розчину. Висловлено припущення про значення підсилення мелітином вказаних взаємодій у виникненні у людини системних реакцій на бджолину отруту.

5. Показано, що сироватковий альбумін інгібує мелітин-індукований лізис еритроцитів, a IgG і Clq не проявляють значного інгібуючого ефекту. Разом з тим, сироватковий альбумін також активує витік гемоглобіну із еритроцитів (проінкубованих 10–11 днів при +4°С) під впливом сублітичних концентрацій мелітину. Це свідчить про наявність принаймні двох незалежних механізмів дії мелітину на еритроцитарну мембрану.

6. Одержані нами мишині моноклональні антитіла до ліпофорину гемолімфи імаго Zygaena minos з різною інтенсивністю взаємодіють з ліпофоринами різних видів роду Zygaena, що звўязано з відмінностями в структурі антигенної детермінанти, яка виявляється у цих ліпофоринів.

7. За результатами вивчення антигенної специфічності одержаних моноклональних антитіл створено оригінальний метод побудови філогенетичних дерев з використанням імунохімічних критеріїв. Застосування даного методу імуносистематики дозволило запропонувати внесення змін в сучасну систематику роду Zygaena Fabricius, 1775 (Lepidoptera, Zygaenidae).

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Получение моноклональных антител к липофорину гемолимфы Zygaena minos ([Denis & Schiffermьller], 1775) (Lepidoptera, Zygaenidae) // Таврический медико-биологический вестник. – 1998. – № 1–2. – С. 12–15.

2. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Изучение филогенетических взаимоотношений видов рода Zygaena Fabricius, 1775 (Lepidoptera, Zygaenidae) c помощью моноклональных антител к липофорину // Таврический медико-биологический вестник. – 1998. – № 3–4. – С. 44–48.

3. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Изменение антигенсвязывающей функции антител в присутствии мелиттина из яда пчелы (Apis mellifera L.) // Таврический медико-биологический вестник. – 2001. – № 1–2.– С. 108–114.

4. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Усиление взаимодействия IgG c C1q в присутствии мелиттина как возможная причина анафилаксии при действии пчелиного яда // Укр.биохим.журн. – 2001. – Т.73, № 5. – С. 49–54.

5. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Методика очистки моноклональных иммуноглобулинов на ДЭАЭ-Трисакриле М // Идеи И. И. Мечникова и развитие современного естествознания: Тез. докл. Междужнар. науч. конф., посвященной 150-летию со дня рожд. И. И. Мечникова. – Харьков. – 1995. – С. 110–111.

6. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Очистка миеломных парапротеинов методом ионообменной хроматографии // Тез. докл. II съезда онкологов стран СНГ (Онкология 2000). – Киев: Экспериментальная онкология. – 2000. – Vol. 22, Suppl. – N 227.

7. Efetov K. A., Shiryayev N. V. Monoclonal antibodies to lipophorin of Zygaena minos ([Denis & Schiffermьller], 1775) (Lepidoptera: Zygaenidae) // Abstracts of X th European Congress of Lepidopterology. – Miraflores de la Sierra (Madrid, Spain). – 1996. – P. 76.

Анотація

Ширяєв М. В. Особливості взаємодії деяких білків ссавців з мелітином і ліпофорином комах. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Таврійський національный університет ім. В. І. Вернадського, Сімферополь, 2002.

Дисертація присвячена вивченню взаємодії мелітину із отрути бджоли і ліпофорину гемолімфи комах з білками сироватки крові ссавців. В роботі показано, що мелітин звўязується переважно з Fc-фрагментом молекули IgG. Мелітин також підсилює специфічну взаємодію антиімуноглобулінових антитіл зі своїми антигенами і взаємодію С1q субкомпоненту комплементу з IgG. Дані ефекти в умовах in vivo, можливо, призводять до активації класичного шляху комплементу і розвитку анафілактоїдних реакцій на бджолину отруту. Показано, що сироватковий альбумін інгібує мелітин-індукований лізис еритроцитів (на відміну від IgG і С1q), але активує витік гемоглобіну із еритроцитів (проінкубованих 10–11 днів при +4°С) під впливом сублітичних концентрацій мелітину. Вивчено антигену специфічність моноклональних антитіл до ліпофорину гемолімфи імаго Zygaena minos. За результатами досліджень розроблено оригінальну методику побудови філогенетичних дерев з використанням імунохімічних критеріїв і запропоновано зміни в систематиці роду Zygaena Fabricius, 1775 (Lepidoptera, Zygaenidae).

Ключові слова: імуноглобуліни, С1q, альбумін сироватковий, моноклональні антитіла, мелітин, ліпофорин, взаємодія.

Аннотация

Ширяев Н. В. Особенности взаимодействия некоторых белков млекопитающих с мелиттином и липофорином насекомых. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Таврический национальный университет им. В. И. Вернадского, Симферополь, 2002.

Диссертация посвящена изучению взаимодействия мелиттина из яда пчелы и липофорина гемолимфы насекомых с белками сыворотки крови млекопитающих. В ходе выполнения работы создана новая модификация методики выделения папаиновых фрагментов поликлональных IgG человека с помощью ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-трисакрилом М (LKB, Швеция). Полученные чистые препараты иммуноглобулинов и папаиновых фрагментов иммуноглобулинов были использованы для изучения их взаимодействия с мелиттином из яда пчелы. Методом твердофазного иммуноферментного анализа было показано, в частности, что цельный поликлональный IgG человека или его изолированный Fc-фрагмент связывают большее количество мелиттина, чем изолированные Fab-фрагменты. Таким образом, основной сайт связывания мелиттина на молекуле IgG находится в области ее Fc-сегмента.

Изучение характера влияния мелиттина на специфические (антиген-антитело) взаимодействия иммуноглобулинов методом твердофазного иммуноферментного анализа показало, что в присутствии мелиттина достигается многократное усиление взаимодействия мышиных моноклональных антител IgG1 2F11 с овечьими антителами к IgG мыши. Вместе с тем, мелиттин в тех же концентрациях не вызывает заметного взаимодействия поликлональных IgG человека с овечьими антителами к IgG мыши. Мелиттин также усиливал взаимодействие поликлонального IgG человека, его папаиновых фрагментов или IgG парапротеинов человека с мышиными моноклональными антителами IgG1 2F11, специфичными к IgG человека. Таким образом, мелиттин изменяет специфическое взаимодействие антииммуноглобулиновых антител со своими антигенами и практически не вызывает неспецифического взаимодействия иммуноглобулинов.

Гидрофильная концевая последовательность мелиттина содержит два “зеркальных” сайта, которые, предположительно, могут имитировать сайт на СН2 домене IgG человека или мыши, ответственный за фиксацию С1q субкомпонента комплемента. Методом твердофазного иммуноферментного анализа показано, что с увеличением концентрации мелиттина наблюдается пропорциональный рост взаимодействия мышиных моноклональных антител IgG1 2F11 или поликлональных IgG мыши с С1q субкомпонентом комплемента по сравнению с уровнем их взаимодействия в отсутствие мелиттина. Полученные данные позволяют предположить, что попадание пчелиного яда в кровяное русло человека вызывает образование прочных IgG-IgG и IgG-C1q иммунных комплексов, которые могут активировать систему комплемента по классическому пути и приводить к развитию анафилактоидной реакции на пчелиный яд.

Опыты по ингибированию белками сыворотки крови мелиттин-индуцированного лизиса эритроцитов показали, что ингибирующее влияние цельной сыворотки крови может быть связано с действием сывороточного альбумина (ингибирующий эффект 78%, Р<0,01), в то время как поликлональный IgG и C1q не проявляют значительного ингибирующего эффекта. Вместе с тем, сывороточный альбумин активирует утечку гемоглобина (Р<0,01) из эритроцитов (проинкубированных 10–11 дней при +4°С) под влиянием сублитических концентраций мелиттина. Это свидетельствует о наличии по меньшей мере двух независимых механизмов действия мелиттина на эритроцитарную мембрану.

В результате изучения антигенной специфичности полученных нами моноклональных антител мыши IgG Z1C3 к липофорину гемолимфы имаго Zygaena minos разработана оригинальная методика построения филогенетических древ с использованием иммунохимических критериев. Степень взаимодействия моноклональных антител IgG Z1C3 с липофоринами разных видов рода Zygaena Fabricius, 1775 (Lepidoptera, Zygaenidae) в твердофазном иммуноферментном анализе значительно различалась. Уровень взаимодействия был наиболее высок в случае видов подрода Mesembrynus Hьbner, 1819, к которому принадлежит и вид Zygaena minos. Соответствующие показатели для видов подродов Zygaena Fabricius, 1775 и Agrumenia Hьbner, 1819 были значительно ниже. Полученная по результатам иммуноферментного анализа с помощью компьютерных программ