Сорокіна Наталія Григорівна

УДК 619:579.842.17

Дисбактеріоз шлунково-кишкового тракту новонароджених телят, методи його корекції та профілактики

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України.

Науковий керівник: | доктор ветеринарних наук, професор Бортнічук Володимир Андронович, Національний аграрний університет, професор кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології

Офіційні опоненти: | доктор ветеринарних наук, професор Івченко Василь Мусійович, Білоцерківський державний аграрний університет, завідувач кафедри лабораторної діагностики інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин

кандидат ветеринарних наук, доцент Павленко Микола Степанович, Центральна лабораторія ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, директор

Провідна установа: | Кримський державний аграрний університет, кафедра мікробіології та вірусології, Міністерства аграрної політики України, м. Сімферополь

Захист дисертації відбудеться “__06__” червня___ 2002 р. о _12:00___год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 в Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ–41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. № 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус №4, кім.41.

Автореферат розісланий “_30___”_квітня____2002 року

Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
| Міськевич С.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Серед захворювань, поширених в тваринницьких господарствах України, одне з перших місць займають хвороби шлунково-кишкового тракту новонароджених телят, які призводять до великих економічних збитків за рахунок захворюваності до 70-100% молодняка та його загибелі у кількості 30%, зниження приростів маси тіла тварин, витрат на проведення ветеринарно-санітарних заходів та ін. (Сидоров М.А., 1987; Волинець Л.К., 1996; Литвин В.П., 1996; Левченко В.І. і співроб., 1997, 1998; Завірюха А.І. і співроб., 1999).

Не дивлячись на те, що вже багато років (більше століття) вчені всього світу, починаючи з Луї Пастера та І.І. Мечнікова, вивчають природу захворювань шлунково-кишкового тракту людей і тварин, проблема нормальної мікрофлори шлунково-кишкового тракту, динаміка її зміни залишається актуальною і на сьогоднішній день, як з позиції гуманної медицини так і ветеринарної науки і практики.

Причини виникнення масових шлунково-кишкових захворювань найрізноманітніші: це і порушення утробного розвитку неонатальних телят, що проявляється екстер’єрними характеристиками та зниженням життєздатності в перші дні життя (Криштофорова Б.В., 1999), порушення обміну речовин, кислотно-лужної рівноваги, системи гомеостазу, адаптаційних процесів (Любецька Т.В., 1998; Любецька Т.В. і співавт., 2001; Мельничук Д.О. і співроб., 1998, 2001); погані умови утримання і годівлі корів-матерів, непристосовані умови утримання новонароджених телят, виникнення у них імунодефіцитного стану та ін. (Яблонська О.В., 2001).

Основною причиною виникнення шлунково-кишкових захворювань новонароджених телят більшість дослідників вважає асоціацію вірусів і активізацію умовнопатогенної мікрофлори. Участь рота- і коронавірусів в етіології гастроентеритів новонароджених телят є беззаперечною, причому віруси, реплікуючись, викликають значну деструкцію ентероцитів й є своєрідним пусковим механізмом розвитку патології (Воронин Е.С., 1998; Головко А.М., Ушкалов В.О., 1998; Міськевич С.В., 1999, 2000).

Потрібно відмітити, що ці процеси в кожному конкретному випадку вивчені поверхнево, не існує завершеного поняття про механізми розвитку дисбактеріозу, динаміки зміни мікрофлори при ньому, не вивчені причини прояву імунодефіциту на фоні дисбактеріозу, є окремі лише повідомлення про методи його корекції та профілактики. З цією метою найчастіше застосовують пробіотики - особливі біологічні препарати, основу яких складають у більшості випадків молочнокислі і біфідобактерії. Одночасно виникає необхідність у конструюванні пробіотиків також на основі нормальної облігатної мікрофлори, яка постійно знаходиться у кишечнику здорових телят, проте досить часто відсутня у телят з розладами функції кишечника.

Підхід до профілактики і лікування шлунково-кишкових хвороб новонароджених телят повинен бути комплексним і поєднувати застосування не тільки пробіотиків, але й препаратів, що регулюють водно-сольовий обмін та імуномодуляторів, здатних вирівнювати імунодефіцит, що розвивається на фоні дисбактеріозу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідної роботи: “Розробити комплекс лікувально-профілактичних заходів при шлунково-кишкових захворюваннях новонароджених телят”, номер держреєстрації 0196 U 007187.

Мета і завдання дослідження. Основна мета дисертаційної роботи полягала у вивченні природи дисбактеріозу шлунково-кишкового тракту новонароджених телят, розробці методів його профілактики та корекції.

Для досягнення мети роботи необхідно було вирішити такі завдання:

- уточнити природу шлунково-кишкових хвороб новонароджених телят і дослідити на цьому фоні динаміку кількісних та якісних змін мікрофлори кишечника;

- у зв’язку з виникненням постійної необхідності в проведенні бактеріологічних досліджень при вивченні змін мікрофлори шлунково-кишкового тракту здійснити серологічну ідентифікацію представників родини Enterobacteriaceae, які найчастіше зустрічаються у вмісту кишечника телят;

- з’ясувати природу дисбактеріозу у новонароджених телят та здійснити його класифікацію;

- визначити фізіологічний стан новонароджених телят та з’ясувати гематологічні і біохімічні показники як у клінічно здорових тварин так і в тварин з розладами функції кишечника;

- визначити вплив дисбактеріозу на систему імунітету у телят та на їх ріст і розвиток;

- розробити методи корекції та профілактики дисбактеріозу з використанням пробіотиків нового покоління, імуномодуляторів та спеціальних водно-сольових розчинів;

- вивчити морфологічні, культуральні, тінкторіальні та біохімічні властивості пробіотика "Бактонорм", розробленого співробітниками кафедри мікробіології та вірусології за нашою участю;

- розробити необхідну науково-технічну документацію (інструкцію, настанову і технічні умови) на препарат "Бактонорм" та здійснити його патентування.

Об’єкт дослідження-новонароджені телята з розладами функції шлунково-кишкового тракту.

Предмет дослідження – кількісний та якісний склад мікрофлори кишечника клінічно здорових новонароджених телят, телят з розладами шлунково-кишкового тракту з розвинутим дисбактеріозом та вплив останнього на показники природної резистентності організму тварин.

Методи дослідження: епізоотологічні, клінічні та лабораторні (вірусологічні – виявлення антитіл в сироватці крові телят до ротавіруса в РТЗК; бактеріологічні; біохімічні; гематологічні; імунологічні – визначення кількості лімфоцитів, субпопуляцій Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів, визначення фагоцитарної активності і інтенсивності фагоцитозу).

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено поліетіологічний характер шлунково-кишкових хвороб новонароджених телят. Визначено природу дисбактеріозу, що розвивається на фоні цих хвороб, охарактеризовано динаміку кількісних та якісних змін мікрофлори. Вперше проведено класифікацію стадій дисбактеріозу у телят. Встановлено, що дисбактеріоз шлунково-кишкового тракту обумовлює виразний імунодефіцит за рахунок зменшення кількості Т- і В-лімфоцитів. Вперше розроблено пробіотик нового покоління "Бактонорм" та вивчено основні біологічні властивості культур, що входять до його складу. Вперше розроблено і впроваджено комплексний метод профілактики і лікування шлунково-кишкових хвороб новонароджених телят з застосуванням пробіотика “Бактонорм”, глутасолу та імуномодулятора. Встановлена можливість серологічної ідентифікації представників родини Enterobacteriaceае з використанням запропонованих нами гіперімунних сироваток.

Практичне значення одержаних результатів. Для профілактики та лікування дисбактеріозу шлунково-кишкового тракту новонароджених телят, рекомендовано пробіотик "Бактонорм", ефективність якого істотно підвищується при одночасному його застосуванні в комплексній схемі разом з імуномодулятором та глутасолом (спеціальний водно-сольовий розчин). Підготовлено і затверджено необхідну документацію, яка регламентує випуск та застосування препарату "Бактонорм". Економічний ефект від застосування цього препарату в одному із тваринницьких господарств склав 3 грн. 70 коп. на 1грн. витрат.

Особистий внесок здобувача. Особисто здобувачем розроблені і виконані в практичних умовах експерименти на телятах щодо комплексного застосування пробіотика "Бактонорм", відібрані необхідні матеріали від контрольних та піддослідних телят з їх обробкою та бактеріологічним дослідженням. Запропонована схема одержання гіперімунних кролячих сироваток для серологічної ідентифікації ентеробактерій, вивчені біологічні властивості культур препарату "Бактонорм", встановлено термін його придатності при різних умовах зберігання. Гематологічні, біохімічні, імунологічні та вірусологічні дослідження проведені на базі спеціалізованих лабораторій Інституту екогігієни НАН України, клінічної лікарні №2 м.Києва та вірусологічної лабораторії факультету ветеринарної медицини НАУ за нашою участю.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались на наукових конференціях професорсько-викладацького складу та аспірантів НАУ у 1997-2002р.р, а також у жовтні 2001 року на науково-практичному семінарі “Впровадження нових прогресивних технологій у виробництві препаратів і лікувальних засобів захисту тварин”, м.Київ.

Публікації. Результати дослідження за темою дисертаційної роботи висвітлені у 7 наукових працях, які опубліковані у збірнику "Науковий вісник Національного аграрного університету" (2), журналі "Ветеринарна медицина України" (2), інформаційному листку Хмельницького ЦНТЕІ (1) та матеріалах конференцій (2).

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалу і методик досліджень, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, пропозицій виробництву, списку використаних літературних джерел та додатків. Робота викладена на 153 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 22 рисунками і 17 таблицями. Список використаних літературних джерел включає 244 джерел, в тому числі –74 іноземних.

Основний зміст

Матеріали і методи досліджень.

Експериментальні дослідження проводили на базі колективної спілки “Селищанське” Баришівського району Київської області. Безпосередньо в умовах ферми проводили клініко-епізоотологічне обстеження хворих та умовно здорових телят, визначали умови утримання, годівлі, проводили лікувальні та профілактичні обробки та визначали ефективність їх проведення.

Дослідні групи формували за принципом аналогів і слідкували, щоб до них не потрапили новонароджені телята з антенатальною гіпотрофією, яка характеризується низькою масою і недостатніми розмірами тіла тварини, незрілістю різних систем організму, запізнілими рефлексами вставання і смоктання (Левченко В.І., Надточій В.П., 1998).

Під час проведення експериментальних досліджень по темі дисертації було клініко-епізоотологічно обстежено 350 голів великої рогатої худоби, з них 150 голів новонароджених телят. Проведено бактеріологічні дослідження на дисбактеріоз 32-х проб фекалій новонароджених телят, взято 24 проби крові від цих тварин для проведення гематологічних, біохімічних та імунологічних досліджень. Для профілактики і корекції дисбактеріозу було виготовлено 7 серій препарату “Бактонорм”. В процесі досліджень використали 50 білих мишей, 10 кролів і 5 білих щурів, 300 чашок Петрі та 600 пробірок з різними середовищами, виготовили 120 мазків, які фарбували методом Грама.

Антитіла в сироватці крові телят до ротавіруса виявляли в реакції тривалого зв’язування комплемента (РТЗК), в якості антигена в якій використовували очищену і сконцентровану суспензію ротавіруса великої рогатої худоби.

Постановку РТЗК у мікромодифікації здійснювали за загально прийнятою методикою з використанням мікротитратора “Такачі” в об’ємі 0,125см3 (по 0,025см3 кожного компонента). Дослідження проведені на базі науково-дослідної вірусологічної лабораторії при кафедрі мікробіології та вірусології НАУ за участю і під безпосереднім керівництвом доцента С.В. Міськевича.

Дослідження по виявленню наявності антитіл в сироватці крові телят до вірусу діареї великої рогатої худоби проведені аспіранткою С.В. Бондар.

Для визначення кількісного та якісного складу мікрофлори фекалій умовно здорових новонароджених телят та телят з розвинутим дисбактеріозом кишечника відбирали проби фекалій в стерильні, попередньо зважені, бактеріологічні пробірки, починаючи з першої доби від народження і кожної наступної доби протягом 6-ти діб життя. Досліджуваний матеріал (без консервантів) в термосі з льодом протягом 2 годин доставляли в лабораторію кафедри мікробіології та вірусології Національного аграрного університету. Досліджуваний матеріал (проби фекалій) суспензували в ізотонічному розчині натрію хлориду (pH=7,1-7,2) у відношенні 1:10 (з розрахунку 1г фекалій і 9мл NaCl) і висівали на поживні середовища: Плоскирєва, ВСА (вісьмут-сульфіт агар) і Ендо. Наступні дослідження проводили за схемою, показаною на рис.1.

Рис. 1. Схема посіву фекалій на дисбактеріоз.

Для кількісної характеристики аеробної мікрофлори проводили дозований посів на щільні середовища із трьох діагностично значимих розведень вихідного матеріалу (10-3,10-5, 10-7).

Для виділення патогенних і умовно-патогенних ентеробактерій використовували такі середовища:

-

-

-

-

-

-

-

-

Для виділення лакто- і біфідобактерій використовували середовища:

-

-

Морфологічні ознаки виділених культур визначали методом фарбування за Грамом з подальшою мікроскопією їх.

При посіві матеріалу на щільні поживні середовища враховували кількість колоній, розмір ізольованих колоній (діаметр в мм), форму (плоска, випукла), особливості країв (рівні-S-форма, хвилясті-R-форма), поверхні (блискуча, матова), колір, щільність (прозора, мутна) і консистенцію.

На підставі біохімічних властивостей можна зробити попереднє припущення щодо родової належності культури. Для уточнення родової, а інколи і видової належності виділених культур використовували мінімальний диференційований ряд (строкатий ряд ).

Мазки виділених культур фарбували за Грамом і фотографували за допомогою мікрофотоустановки AFM-1 виробництва Чехословаччини.

Ідентифікацію виділених штамів ентеробактерій на основі їх біохімічних властивостей здійснювали за допомогою системи мультимікротестів - Multimicrotest systems for biochemical identification of Enterobacteriaceae (MMTE1).

Для проведення біохімічних, гематологічних та імунологічних досліджень кров відбирали від шести умовно здорових новонароджених телят без клінічних ознак захворювання та телят з розвинутим дисбактеріозом кишечника (5-та доба після народження), а також від шести телят, яким було проведено корекцію дисбактеріозу за допомогою комплексного методу профілактики дисбактеріозу на 7-му добу після народження.

Біохімічні дослідження крові проводили згідно методик, описаних в “Клінічній лабораторній діагностиці” під редакцією Базарнової М.А.(1994). Гематологічні і імунологічні дослідження проводили за допомогою методик, описаних в “Методичних вказівках...” під редакцією Чумаченка В.Ю. і співроб. (1991).

На основі проведених досліджень сконструйований пробіотик нового покоління “Бактонорм”, до складу якого входять представники нормальної облігатної (постійної) мікрофлори кишечного тракту здорових телят, зокрема, Enterobacter cloacae (штам 30/3), Escherichia coli (штам 12/1), Streptococcus cremoris (штам 9/1), у котрих не виявлено таких хвороботворних факторів, як гемолітична, лецитиназна, ДНК-азна активність та патогенність для лабораторних тварин.

З метою перевірки профілактичної дії пробіотика “Бактонорм” було сформовано чотири групи телят. Першій групі відразу після народження не пізніше 3-4 год. задавали “Бактонорм” в кількості 10 мл і через 24 год. ще 10 мл. Другій групі задавали “ Бактонорм” у поєднанні з “Глутасолом” (водно-сольовий розчин). “Глутасол” задавали у вигляді 49,1% розчину по 35 мл тричі на добу протягом двох діб після народження. Телятам третьої групи задавали “Бактонорм” у комплексі з “Глутасолом” та імуномодулятором у кількості 5 мл один раз на добу протягом двох діб. Телята четвертої групи служили контролем, лікувались за традиційною у господарстві схемою (антибіотики, сульфаніламідні препарати, трав’яні відвари).

Статистичну обробку одержаних цифрових матеріалів проводили на персональному комп’ютері за допомогою програми MS Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Епізоотична ситуація в колективному сільськогосподарському підприємстві “Селищанське” Баришівського району Київської області

Захворюваність телят з розладами функції шлунково-кишкового тракту у господарстві протягом року складала 15% від числа новонароджених, а летальність –9% від числа тих , що захворіли. Телята хворіли на 3-4 добу після народження. Захворювання не носило масовий характер і не характеризувалося певною ензоотичністю (тобто спалахи хвороби спостерігалися як в зимово-стійловий період так і влітку).

При проведенні бактеріологічних досліджень, які одночасно дублювались Баришівською районною лабораторією ветеринарної медицини, виділити збудників найбільш поширених інфекційних хвороб, зокрема, колібактеріозу, сальмонельозу та інших не вдалося. Вірусологічними дослідженнями встановлено, що титр антигена ротавіруса у фекаліях хворих телят на першу добу життя становив 1:32 з поступовим зниженням на 10-ту добу до 1:8. Відповідний показник в умовно здорових телят становив 1:4. Титри антитіл ротавіруса в сироватці крові великої рогатої худоби були в межах 1:32-1:64 і свідчили про постійну циркуляцію віруса в господарстві серед поголів’я великої рогатої худоби різних вікових груп. Одночасно в сироватці крові новонароджених телят виявили наявність антитіл до віруса діареї великої рогатої худоби у високих титрах (1:512 – 1:2024). Позитивні результати зафіксовані при дослідженні 81% проб сироватки крові новонароджених телят. Комплексні вірусологічні та бактеріологічні дослідження показали, що шлунково-кишкові хвороби новонароджених телят за своєю природою є поліетіологічними. На першому етапі в кишечнику розвивається запалення за рахунок рота-, коронавірусів, після чого патологічний процес значно ускладнюється бактеріями і деякими паразитами.

Визначення кількісного і якісного складу мікрофлори фекалій здорових телят та телят з розладами функції шлунково-кишкового тракту

Кількісний та якісний склад мікрофлори кишечника визначали в динаміці з першої по шосту добу після народження. Результати досліджень представлені в таблицях 1, 2 та графіках (рис. 2, 3), з яких видно, що на першу добу у фекаліях хворих та здорових телят загальна чисельність мікроорганізмів була в однакових межах. У наступні дні у хворих телят загальна кількість мікроорганізмів наростала, в той час як кількість біфідобактерій і лактобактерій знижувалась аж до повної відсутності їх. Змінювалися якісні характеристики кишкової палички, наростала кількість мікроорганізмів з гемолітичною активністю, з'являлися бактерії із родів Proteus, Yersinia, Klebsiella, патогенні коки. На 3-4 добу у хворих телят загальна кількість мікроорганізмів збільшилась майже втричі, в той час як біфідобактерії і лактобактерії зникли повністю.

Із таблиці 2 видно, що основну частину мікрофлори шлунково-кишкового тракту здорових телят складають лакто- і біфідобактерії, які створюють у кишечнику кисле середовище, внаслідок чого затримується ріст і розвиток патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, пригнічуються гнильні процеси і синтез вітамінів.

При оцінці загального стану телят з ознаками розладу функції шлунково-кишкового тракту, які відносились до категорії хворих, звертали особливу увагу на виділення лакто- і біфідобактерій із розведень 10-7, 10-8, 10-9. Якщо кількість цих бактерій в 1г фекалій в розведенні 10-7 була відсутня, не дивлячись на їх присутність в розведенні 10-5, то такий стан розцінювався як дисбактеріоз кишечника.

Природа дисбактеріозу та його вплив на організм новонароджених телят

Проведені нами кількісні та якісні дослідження мікрофлори шлунково-кишкового тракту у телят з першої по шосту добу після народження підтвердили існування закономірностей заселення кишечника мікрофлорою, яка у здорових тварин одержала назву нормальної або нормофлори. Видовий склад цієї групи в першу чергу визначається ешеріхіями, які не володіють факторами патогенності, молочнокислими бактеріями та біфідобактеріями. На пізніших стадіях (3-4–та доба після народження) серед нормофлори можна зустріти окрім ешеріхій, інших представників родини ентеробактерій, зокрема, едвардсієли, цитробактер, гафнії і деякі інші.

Із таблиці 2 видно, що у телят з розладами функції шлунково-кишкового тракту, що проявляється діареєю, спостерігається помітна зміна видового складу мікрофлори кишечника, особливо стосовно біфідобактерій, які протягом 3-5-ти діб після народження зовсім не висівались із розведень 10-7-10-8, хоч мікробне число у цей період у них різко збільшувалось (див. табл.1) за рахунок наростання умовно-патогенної мікрофлори. Такий стан нами визначається як дисбактеріоз.

Рис. 2. Коливання загальної кількості мікроорганізмів (м.ч.) у здорових і телят з розладами функції кишечника (розведення 10-7)

Рис. 3. Динаміка зміни біфідо- і лактобактерій у здорових (I) і телят з розладами функції кишечника (II).

Таблиця 1 - Динаміка зміни кількісного складу мікрофлори у фекаліях
здорових та хворих з ознаками діареї новонароджених телят (M?m, n=6, P<0,01)

Таблиця 2 - Коливання кількості біфідо- і лактобактерій у фекаліях новонароджених здорових і телят з розладами функції кишечника
(M?m, n=6, P<0,01)

Доба | Фізіологічний cтан телят

після | здорові | хворі

народження | біфідобактерії | лактобактерії | біфідобактерії | лактобактерії

1 | 0 | 0 | 0 | 0

2 | (1?????????? | ???????????? | (1?????????? | (1??????????

3 | (1?????????? | ???????????? | ???????????? | 0

4 | (1?????????? | (2?????????? | ? | 0

5 | (2?????????? | (2?????????? | 0 | 0

6 | ???????????? | ???????????? | 0 | 0

З метою з’ясування негативного впливу дисбактеріозу на імунну систему організму новонароджених телят ми провели гематологічні, біохімічні та імунологічні дослідження крові умовно здорових телят, у яких за наслідками мікробіологічних досліджень склад мікрофлори кишечника наближався до норми, та телят, у яких бактеріологічні дослідження вказували на наявність дисбактеріозу.

Таблиця 3 - Гематологічні показники крові новонароджених телят
(5-та доба після народження, M?m, n=6, Р<0,01)

Показники | І група
(клінічно хворі) | II група
(клінічно здорові)

Гемоглобін, г/л | 88,40±5,46 | 93,8±6,62

Еритроцити, Т/л | 5,10±0,29 | 5,40±0,76

Лейкоцити, Г/л | 7,14±0,45 | 6,66±0,90

Гемограма

Гранулоцити | Паличкоядерні, % | 6,80±0,13* | 5,40±0,35

Сегментоядерні, % | 29,80±1,38 | 28,80±1,03

Еозинофільні, % | 6,0±0,52 | 5,40±0,30

Базофільні, % | 0 | 0

Лімфоцити, % | 49,60±1,74 | 50,80±1,96

Моноцити, % | 7,80±0,26* | 9,60±0,35

ШОЕ, мм/год | 0,70±0,06 | 0,70±0,06

* - показник достовірності у порівнянні клінічно хворих новонароджених телят до клінічно здорових.

Порівняно з хворими телятами першої групи, кількість гемоглобіну у телят другої групи була на 5,8% вищою і складала 93,8±6,62г/л. Кількість еритроцитів у телят другої групи також була вищою на 5,6%. Кількість лейкоцитів у тварин першої групи на 6,8% перевищувала цей показник у телят другої групи, що свідчить про наявність запальних процесів в організмі останніх. Як видно із табл. 3, є деякі розбіжності у гемограмі телят першої і другої груп. У телят першої групи (клінічно хворих) збільшений відсоток паличкоядерних, сегментоядерних, еозинофільних гранулоцитів, що буває при запальних процесах і підвищеній реактивності організму.

Таблиця 4 характеризує біохімічні показники крові новонароджених телят клінічно здорових та клінічно хворих з розвинутим дисбактеріозом кишечника.

Таблиця 4 - Біохімічні показники крові новонароджених телят
(5-та доба після народження, M?m, n= 6, P<0,01)

Показники |

I група
(клінічно хворі) |

II група
(клінічно здорові)

Сечовина, ммоль/л | 7,14±0,45* | 4,19±0,79

Креатинін, ммоль/л | 0,10±0,03 | 0,08±0,03

Діастаза, мг/ч.мл | 17,44±1,49 | 14,89±1,84

Аспарагінова трансаміназа (АсАТ), ммоль/л | 0,63±0,07* | 0,14±0,09

Аланінова трансаміназа (АлАТ), ммоль/л | 0,73±0,06* | 0,39±0,05

Білірубін загальний, мкмоль/л | 29,56±1,29* | 19,94±1,65

Калій, ммоль/л | 3,88±0,58* | 6,46±0,12

Натрій, ммоль/л | 133,26±5,05* | 146,60±4,80

Хлор, ммоль/л | 81,30±1,82* | 88,42±1,36

Загальний білок, г/л | 56,74±2,65* | 66,98±1,50

Альбуміни, % | 29,76±1,13 | 30,78±1,77

Глобуліни, % | 70,24±2,00 | 69,22±2,34

????% | 15,68±1,65* | 19,22±1,02

????% | 18,10±1,05* | 12,54±0,94

????% | 15,04±1,05 | 12,28±1,77

???% | 21,42±1,17* | 25,18±1,40

Альбумін/глобулін, А/Г | 0,42±0,03 | 0,45±0,01

* - показник достовірності у порівнянні клінічно хворих новонароджених телят до клінічно здорових.

Рівень сечовини в сироватці крові у телят першої групи (клінічно хворих) майже вдвічі вищий (на 42%), ніж у телят другої групи (клінічно здорових), що свідчить про серцево-судинну декомпенсацію, зневоднення організму внаслідок діареї з профузним проносом, а також зниження клубочкової фільтрації нирок, і розвиток паренхімотозного і токсичного гепатиту у телят першої групи з розвинутим дисбактеріозом кишечника.

Підвищення рівня екскреції креатиніну у телят першої групи на 20% свідчить про гострі запальні процеси у внутрішніх органах новонароджених тварин.

Рівень діастази у сироватці крові телят першої групи становить 17,44±1,49мг/ч.мл, що на 14,6% вище, ніж у телят другої групи.

Серед глобулінових фракцій у першій групі (клінічно хворі) помітне збільшення ?2- і ?- глобулінів. Такий стан спостерігається у тварин при всіх видах гострих запальних процесів. Зменшення у першій групі ?-глобулінів порівняно з другою групою на 15% свідчить про захворювання організму новонародженого теляти і виснаження його імунної системи, оскільки ?-глобуліни є основними носіями антитіл імуноглобулінів класів G, A, M, що забезпечують гуморальний захист організму.

Імунологічні показники крові новонароджених телят п’ятиденного віку клінічно хворих з розвинутим дисбактеріозом кишечника і умовно здорових приведені в таблиці 5.

Таблиця 5 - Імунологічні показники крові новонароджених телят
5-денного віку (M?m, n=6, Р<0,01)

Показники | Групи новонароджених телят

I група
(клінічно хворі) | II група
(клінічно здорові)

Т-лімфоцити, % | 32,40±1,74* | 38,00±1,61

Т-хелпери, % | 21,80±1,45* | 30,60±1,35

Т-супресори, % | 10,60±1,69 | 7,40±0,96

В-лімфоцити, % | 13,40±1,13* | 17,80±1,72

О-лімфоцити, % | 54,20±1,43* | 44,20±1,53

ФА (фагоцитарна активність), % | 26,00±1,46* | 34,30±1,72

Індекс фагоцитозу, мк.кл. | 5,00±0,46 | 5,20±0,26

* - показник достовірності у порівнянні клінічно хворих новонароджених телят до клінічно здорових.

Встановлено, що показники імунної системи хворих та умовно здорових тварин характеризувалися значним зниженням абсолютної або відносної чисельності більшості субпопуляцій лімфоцитів. У деяких тварин спостерігався підвищений вміст Т-супресорів.

Фагоцитарна активність лейкоцитів крові телят першої групи на 24,2% нижча ніж у телят другої групи. Індекс фагоцитозу у другій групі становив 5,2±0,26 мк.кл., тобто не суттєво вищий порівняно з першою групою.

Результати досліджень імунокомпетентних клітин свідчать, що кількість Т-лімфоцитів у крові телят другої групи дорівнювала 38,0±1,61%, що на 14,8% вища ніж у першій групі.

На підставі експериментальних досліджень і даних наукової літератури пропонуємо дисбактеріоз шлунково-кишкового тракту розділити на такі форми:

1. Дисбактеріоз початкової стадії (легка форма). Характеризується домінуванням анаеробної флори над аеробною, біфідобактерії виділяються із вмісту кишечника в розведеннях 10-7-10-8, умовно патогенні висіваються в розведеннях 10-4-10-2, їх не більше двох видів.

2. Дисбактеріоз середньої важкості: співвідношення між анаеробами і аеробами приблизно однакове, умовно патогенні види виділяються із розведень 10-6-10-7.

3. Дисбактеріоз тяжкої форми. Характеризується домінуванням аеробів, лакто- і біфідобактерії відсутні, титр умовно патогенних мікроорганізмів високий.

Вивчення впливу дисбактеріозу кишечника телят на їх ріст і розвиток

У хворих телят з розвинутим дисбактеріозом кишечника середньодобовий приріст живої маси складав 77 г, в умовно здорових –323 г, а після комплексного методу профілактики дисбактеріозу- 398 г.

Міжродова диференціація ентеробактерій, виділених із вмісту кишечника новонароджених телят

З метою скорочення строків проведення бактеріологічних досліджень, у виконанні яких виникає необхідність при уточненні діагнозу в процесі появи шлунково-кишкових захворювань у телят в перші дні життя, нами зроблено спробу одержання гіперімунних діагностичних О–аглютинуючих сироваток, використання яких прискорить ідентифікацію і диференціацію представників родини ентеробактерій.

В роботі використані штами ентеробактерій, виділені нами від хворих телят господарств Київської та Івано-Франківської областей.

Із таблиці 6 видно, що титр аглютинінів до гомологічного антигену сягав величини 1:1024, в той час як до гетерологічних антигенів відповідні титри були досить низькими. Найбільш тісні антигенні зв’язки у гафній встановлені з Yersinia enterocolitica та Citrobacter diversus. Антигени у них аглютинувались сироваткою 6/1 у титрах 1:64 та 1:32 відповідно. Антитіла до антигенів інших ентеробактерій були порівняно низькими і не перевищували показників 1:8-1:16. Досить близькими за значеннями були титри аглютинінів до гетерологічних антигенів і в інших гіперімунних сироватках. Зокрема, сироватка 7/3 проти Citrobacter diversus обумовлювала аглютинацію в розведенні 1:32, Yersinia enterocolitica - в розведенні до 1:16, антигени інших ентеробактерій лише в титрах 1:4–1:8. Не виявлено антигенних зв’язків між Citrobacter diversus та Shigella sonnei. Наявність перехресних антитіл в сироватці 34/1 проти Shigella sonnei по відношенню до Citrobacter diversus антигенів в розведенні 1:4 з інтенсивністю реакції аглютинації тільки на один плюс (+) можна розцінювати як недостовірний показник.

Розробка та застосування пробіотика “Бактонорм”

Співробітниками кафедри мікробіології та вірусології НАУ за нашою участю розроблений новий пробіотик “Бактонорм”. Метою винаходу є своєчасне заселення шлунково-кишкового тракту телят у перші години після народження представниками нормальної мікрофлори для попередження розвитку

Таблиця 6 - Наявність антитіл проти Hafnia alvei 6/1 в гіперімунній
сироватці до гомологічного і гетерологічних антигенів

Антигени
| Розведення сироватки

1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 | 1:512 | 1:1024 | 1:2048

6/1
Hafnia alvei | ++
++ | ++
++ | ++
++ | ++
++ | ++
++ | ++
+ | ++
+ | ++
| ++
| +

7/3 Citrobacter diversus | ++
++ | ++
+ | ++
| ++
| +
| -
| -
| -
| -
| -

4/1 Yersinia enterocolitica | ++
++ | ++
+ | ++
+ | ++
| ++
| +
| -
| -
| -
| -

3/2 Citrobacter freundii | ++
| +
| -
| -
| -
| -
| -
| -
| -
| -

26/5 Klebsiella pneumoniae | ++
+ | ++
+ | ++
| +
| -
| -
| -
| -
| -
| -

21/2 Edwardsi-ella tarda | ++
| ++
| +
| -
| -
| -
| -
| -
| -
| -

34/1 Shigella sonnei | ++
+ | ++
| +
| -
| -
| -
| -
| -
| -
| -

дисбактеріозів, що, як правило, переходять в гастроентероколіти з ускладненими наслідками.

До складу запропонованого пробіотика “Бактонорм” увійшли такі штами культур: 12/1 Escherichia coli, 30/3 Enterobacter cloacae, 9/1 Strеptococcus cremoris у процентному співвідношенні 30:30:40.

Нами було вивчено основні біологічні, адгезивні властивості культур препарату, умови їх зберігання.

Середній показник адгезії (СПА) для культури E.coli (штам 12/1) склав 2,4, що розцінюється як адгезивність середнього ступеня (за методикою від 2,01 до 4,0); СПА для культури Enterobacter cloacae склав 2,8; для Strеptococcus cremoris - 2,2 (адгезивність середнього ступеня).

Умови зберігання пробіотика “Бактонорм”

Пробіотик “Бактонорм” найкраще зберігається в умовах морозильника: протягом 10 діб кількість мікроорганізмів залишається сталою, через 20 діб їх кількість зменшується на 0,5%, через 1 місяць – на 2%, через 2 місяці – на 4,2%, через 4 місяці – на 8,4% і через 6 місяців – на 19%. В умовах побутового холодильника препарат зберігається гірше: протягом 10 діб кількість колоній зменшується на 0,8%, через 20 діб – на 1,5%, через 1 місяць – на 7%, через 2 місяці – на 22,4%, через 4 місяці – на 40,5% і через 6 місяців – на 50%.

При кімнатній температурі в шафі препарат зберігається погано: протягом 10 діб кількість колоній зменшується на 3%, через 20 діб – на 6,1%, через 1 місяць – на 16,3%, через 2 місяці – на 30,7%, через 4 місяці – на 53, 1% і через 6 місяців – на 74%.

Корекція і профілактика дисбактеріозу кишечника новонароджених телят

Із таблиці 7 видно, що у першій і другій експериментальній групі хворіло лише по одній тварині. Захворювання перебігало в легкій формі і всі тварини одужали. При застосуванні комплексного методу профілактики дисбактеріозу в третій експериментальній групі з ознаками розладу травлення не хворіла жодна голова. Тварини контрольної групи мали ознаки діареї середньої і важкої форми. Загибель тварин у цій групі склала 20%.

Таблиця 7 - Вплив різних методів профілактики дисбактеріозу
на перебіг шлунково-кишкових захворювань у новонароджених телят

Форма перебігу хвороби | Експериментальні групи | Контрольна група

І

(“Бактонорм”) | ІІ

(“Бактонорм,

“Глутасол”) | ІІІ (“Бактонорм”, “Глутасол”, імуномодулятор )

n=10 | n=10 | n=10 | n=10

Не хворіло | 9 | 9 | 10 | 4

Захворіло: | 1 | 1 | 0 | 6

Легка
форма | 1 | 1 | 0 | 1

Середня форма | 0 | 0 | 0 | 3

Важка форма | 0 | 0 | 0 | 2

Одужало | 1 | 1 | 0 | 4

Загинуло | 0 | 0 | 0 | 2

Після застосування комплексного методу профілактики дисбактеріозу покращились гематологічні показники: вміст гемоглобіну збільшився на 15,4%, зменшився відсоток паличкоядерних, сегментоядерних гранулоцитів та еозинофілів. Біохімічні дослідження крові свідчать про поліпшення обміну речовин: зниження у двічі рівня сечовини, білірубіну, активності АсАТ і АлАТ, підвищення вмісту ?-глобулінів. Покращився імунобіологічний статус новонароджених телят, у третій дослідній групі тварин підвищилася відносна чисельність більшості субпопуляцій лімфоцитів. Середньодобовий приріст живої маси тварин по цій групі склав 398 г. Економічний ефект від застосування пробіотика “Бактонорм” на одну гривню витрат склав 3,70 грн. Всі ці дані свідчать на користь застосування пробіотиків взагалі та у поєднанні з дегідратантами і імуномодуляторами.

ВИСНОВКИ

1. Шлунково-кишкові хвороби новонароджених телят, виникнення яких знаходиться в прямій залежності від впливу на організм як телят, так і тільних корів несприятливих факторів зовнішнього середовища, значно поширені в господарствах України. Встановлено, що віруси (рота-, корона-, ентеровіруси, вірус діареї великої рогатої худоби), як облігатні внутрішньоклітинні паразити, дають початок патологічному процесу в кишечнику, інтенсивність якого ускладнюється бактеріями, особливо представниками родини Enterobacteriaceae (патогенними ешеріхіями, протеєм, єрсиніями, клебсіелами та ін.).

2. Шлунково-кишкові захворювання новонароджених телят супроводжуються таким явищем як дисбактеріоз, виникнення якого має безпосередній зв’язок з кількісними та якісними змінами мікрофлори кишечника. При цьому мікробне число вмісту кишечника збільшується за рахунок умовно-патогенних видів та гнильної мікрофлори з одночасним зменшенням молочнокислих, пропіонових та біфідобактерій. Відсутність останніх видів у розведенні 10-7 навіть при їх наявності в нижчих розведеннях розцінюється як дисбактеріоз.

3. Дисбактеріоз зумовлює негативний вплив на організм телят в цілому. У хворих тварин значно нижчими були гематологічні, біохімічні показники крові, встановлено зменшення кількості Т- і В-лімфоцитів, порушення водно-сольового та загального обміну, що призводить до помітного відставання телят у рості і розвитку. Зокрема, середньодобовий приріст живої маси у хворих телят склав 77 г при відповідному показнику 398 г у тварин без ознак дисбактеріозу.

4. Розроблено пробіотик нового покоління “Бактонорм”, який показав високу лікувально-профілактичну ефективність при його виробничих випробовуваннях в ряді господарств Івано-Франківської та Київської областей. На препарат затверджено відповідну технічну документацію на його виробництво та застосування –ТУУ 46.15.438-99, інструкцію, настанову.

5. З’ясовані морфологічні, тінкторіальні, культуральні та біохімічні властивості культур, що входять до складу препарату “Бактонорм” та визначені терміни його придатності при різних режимах зберігання. Встановлено, що препарат може зберігатись в морозильній камері побутового холодильника протягом 6 місяців, при температурі +4oС протягом 4-х місяців, при кімнатній температурі протягом 2-х місяців.

6. Виходячи з концепції про поліетіологічну природу шлунково-кишкових хвороб новонароджених телят, в організмі яких порушується загальний та водно-сольовий обмін, знижується активність системи імунітету, розроблено комплексний метод профілактики та лікування цих хвороб з одночасним застосуванням пробіотика “Бактонорм”, препарату “Глутасол” та імуномодулятора. Економічний ефект від застосування пробіотика “Бактонорм” склав 3,70 грн на 1грн витрат. Економічний ефект від застосування комплексного методу склав 6,62 грн на 1 грн витрат.

7. Розроблено метод ідентифікації найбільш поширених родів ентеробактерій шляхом постановки пробіркової РА з О-аглютинуючими гіперімунними сироватками, одержаними нами за спеціальними схемами.

пропозиції ВИРОБНИЦТВУ

1. Для практичного застосування рекомендується пробіотик нового покоління “Бактонорм” для лікування та профілактики масових шлунково-кишкових хвороб новонароджених телят, на який розроблена і затверджена необхідна науково-технічна документація на його виробництво та застосування: ТУУ 46.15.438-99, настанова та інструкція.

2. Для профілактики шлунково-кишкових хвороб новонароджених телят запропоновано комплексний метод лікування з використанням нового пробіотика “Бактонорм”, водно-сольового розчину (глутасол) та імуномодулятора.

3. З метою прискорення ідентифікації і диференціації представників родини ентеробактерій запропоновано набір діагностичних О-аглютинуючих сироваток.

CПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Сорокіна Н.Г. Дисбактеріоз шлунково-кишкового тракту новонароджених телят, методи його корекції та профілактики. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 -ветеринарна мікробіологія та вірусологія.- Національний аграрний університет, Київ, 2002.

Дисертація присвячена вивченню природи дисбактеріозу шлунково-кишкового тракту новонароджених телят, розробці методів його профілактики та корекції.

При проведенні досліджень було вивчено кількісний та якісний склад мікрофлори кишечника клінічно здорових новонароджених телят та телят з розладами функції шлунково-кишкового тракту. Показано, що у телят з розладами функції кишечника змінюється кількісний і якісний склад мікрофлори. Зокрема, наростає загальна чисельність мікроорганізмів з