МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

СТУКАЛОВА ОЛЕНА МИКОЛАЇВНА

УДК 618.39-07-08-035

ДИФЕРЕНЦІЙОВАНИЙ ПІДХІД ДО ДІАГНОСТИКИ ТА КОМПЛЕКСНОЇ ТЕРАПІЇ НЕВИНОШУВАННЯ ВАГІТНОСТІ

14.01.01 – Акушерство та гінекологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі акушерства та гінекології №3 Національного медичного

університету ім.О.О.Богомольця МОЗ України.

НАУКОВИЙ КЕРІВНИК: доктор медичних наук, професор

Голота Владислав Якович,

завідувач кафедри акушерства та гінекології №3 Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця МОЗ України

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ:

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН і НАН України

Степанківська Галина Костянтинівна,

кафедра акушерства та гінекології №1 Національного медичного університету

ім.О.О.Богомольця МОЗ України;

доктор медичних наук, професор,

Дашкевич Валентина Євдокимівна,

Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України,

керівник акушерського відділення екстрагенітальної патології.

ПРОВІДНА УСТАНОВА:

Київська медична академія післядипломної освіти ім.П.Л.Шупика МОЗ України,

кафедра акушерства, гінекології та перинатології

Захист дисертації відбудеться “ 16 ” травня 2002 року о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради (Д 26.003.03) при Національному медичному університеті ім.О.О.Богомольця (01030, м.Київ, бульвар Т.Шевченка, 17).

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця (03057, м.Київ, вул.Зоологічна, 3).

Автореферат розісланий “ 15 ” квітня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук, доцент Я.М.Вітовський

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Незважаючи на численні дослідження та певні успіхи в питаннях діагностики та лікування передчасного переривання вагітності, проблема невиношування залишається і зараз найбільш актуальною в акушерстві (Венцковський Б.М.,1997; Голота В.Я.,2001). Частота невиношування залишається на рівні 10-25% до числа вагітностей та не має тенденції до зниження, в зв’язку з чим виникає необхідність розробки нових методів діагностики та лікування цієї патології (Зиміна І.Л.,1996; Айламазян Э.К.,1997; Сидельникова В.М,1999).

Актуальність проблеми невиношування пов’язана з її соціальним значенням, впливом на рівень народжуваності, перинатальної та ранньої дитячої смертності (Голота В.Я.,1990; Сидельникова В.М.,1999). Біля 25% випадків мимовільного переривання складає звичне невиношування (ЗН) (Кулаков В.И.,1996).

Причини звичного невиношування численні та не можуть рахуватися остаточно розкритими. Найбільший негативний вплив на перебіг вагітності в першому триместрі, коли частіше трапляються викидні у жінок зі ЗН, справляють інфекційні захворювання матері, особливо інфекції TORCH-комплексу, гормональні розлади, генетичні порушення та імунологічні розлади (Самородинова Л.А.,1989; Богатирьова Р.В.,1999; Королева Л.И.,2000; Beer AE,1989; Carp H,2001).

Найбільш складним та потребуючим подальшого вивчення виступає питання імунологічних основ ЗН. Насьогодні відомо, що в основі порушення імунної відповіді матері на антигени плода, що веде до мимовільного переривання вагітності, лежить збіг подружжя за HLA-антигенами (Barrenetxea G, 1995; Kishore R, 1996). Протягом фізіологічної вагітності існує баланс між Т-хелперами (Tх) 1 та 2 типу, найкращі умови для виживання плода створюються при перевазі Tх 2 типу (Clark DA,1999). Тх1 імунна відповідь пов’язана з повторними мимовільними викиднями (Paccini MP, 1996; Raghupathuy R,1999; Jonson PM, 2000). Імунна відповідь розвивається по Тх 2 шляху в результаті розпізнання HLA-антигенів чоловіка (Ekerfelt C,1997). В результаті недостатньої антигенної стимуляції при частковій HLA-сумісності подружжя імунна система вагітної не розвиває необхідні для фізіологічної вагітності захисні реакції, що веде до переваги Т-хелперів 1 типу з наступною активацією цитотоксичної відповіді на антигени плода та реалізацією реакції відторгнення (Hill JA, 1995; Mazzi M, 1996). Незважаючи на велику кількість досліджень, імунологічні механізми виникнення ЗН ще далекі до остаточного розкриття.

Для лікування жінок зі ЗН імунологічного походження, пов’язаним зі збігом подружжя за HLA-антигенами, використовують імунізацію лімфоцитами чоловіка (Говалло В.И.,1982; Daya S,1994; Prigoshin N,1999; Unander AM, 2001). Незважаючи на велику кількість досліджень, до цього часу предметом дискусії виступають питання розкриття механізмів терапевтичного впливу цього методу лікування, визначення показань до його застосування та розробки критеріїв оцінки його ефективності. В сучасній літературі обмаль інформації про вплив імунотерапії на Тх1/Тх2 баланс. Нам вважається, що вивчення цитокінового статусу – продукції цитокінів Тх 1 та 2 типів – дозволить знайти відповіді на ці питання, а це в свою чергу допоможе покращити результати використання цього методу лікування.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Науково-дослідна робота є фрагментом наукової роботи кафедри акушерства та гінекології №3 Національного медичного університету “Прогнозування та профілактика патології репродуктивного здоров’я жінок в сучасних умовах”, номер д.р. № 0101U003042.

Мета і задачі дослідження.

Зниження кількості повторних мимовільних викиднів та підвищення рівня живонароджуваності за рахунок удосконалення методів діагностики та лікування звичного невиношування імунологічного походження із застосуванням імунотерапії лімфоцитами чоловіка.

Для виконання поставленої мети були визначені наступні задачі:

1.Провести клініко-статистичний аналіз перебігу вагітності, пологів та післяпологового періоду у жінок зі ЗН (1995-1999рр).

2.Провести комплексне обстеження вагітних зі ЗН з метою виявлення етіологічних факторів, що призводять до повторного мимовільного переривання вагітності.

3.Вивчити імунний та цитокіновий статус вагітних зі ЗН “нез’ясованої” етіології.

4.Провести корекцію виявлених імунних порушень у вагітних зі ЗН шляхом включення в комплексне лікування імунотерапії лімфоцитами чоловіка.

5.Розробити показання до лікування ЗН введенням лімфоцитів чоловіка. Вивчити механізми терапевтичного впливу імуноцитотерапії.

6.Вивчити вплив імунотерапії лімфоцитами чоловіка на клінічний стан, імунний та цитокіновий статус вагітних зі ЗН.

7.Порівняти ефективність схеми комплексної терапії із застосуванням лімфоцитів чоловіка з традиційною терапією невиношування вагітності з точки зору зниження кількості мимовільних викиднів.

Об'єкт дослідження. Вагітні жінки зі звичним невиношуванням в анамнезі.

Предмет дослідження. Диференційований підхід до діагностики та комплексної терапії звичного невиношування.

Методи дослідження. З метою встановлення етіологічного фактору ЗН були використані клінічні, інструментальні (УЗД), мікробіологічні (виявлення збудників TORCH-інфекцій та визначення рівня специфічних антитіл), імунологічні методи дослідження (визначення субпопуляцій лімфоцитів в периферійній крові, вивчення проліферативної відповіді лімфоцитів жінки в змішаній культурі лімцофитів (ЗКЛ) та вимірювання рівнів цитокінів IFN-, TNF, IL-4 в супернатантах ЗКЛ), кольпоцитологія.

Наукова новизна одержаних результатів.

На основі проведеного комплексного клінічного, мікробіологічного, вірусологічного, ультразвукового, гормонального та імунологічного обстеження вагітних зі ЗН виявлена роль різних етіологічних факторів у виникненні повторних мимовільних переривань вагітності на сучасному етапі.

Обгрунтована роль TORCH-інфекцій у виникненні ЗН та встановлено, що TORCH-інфекції виступають провідною причиною ЗН - інфіковано 77,83,1% вагітних зі ЗН.

На підставі вивчення проліферативної відповіді та секреції цитокінів TNF, INF-?, IL-4 в змішаній культурі лімфоцитів (ЗКЛ) з лімфоцитами чоловіка та донора уточнено патогенетичні механізми виникнення повторних викиднів імунологічного походження. Отримані результати свідчать, що функціональна перевага Т-хелперів 1 типу веде до виникнення загрози звичного викидня.

Вперше вивчено вплив імуноцитотерапії на проліферативну відповідь та секрецію цитокінів TNF, IFN-г, IL-4 ? ЗКЛ з лімфоцитами чоловіка та донора, на основі чого розроблені показання до імуноцитотерапії, критерії оцінки ефективності її застосування та розкриті деякі патогенетичні механізми терапевтичного впливу цього методу лікування. Встановлено, що механізм терапевтичного впливу імуноцитотерапії полягає в зрушенні балансу Тх1/Тх2 в бік переваги Т-хелперів 2 типу, підвищені блокуючих властивостей сироватки вагітних.

Практичне значення одержаних результатів.

Результати проведених досліджень дозволили встановити роль різних етіологічних факторів ЗН на сучасному етапі та розробити принципи диференційованого підходу до терапії ЗН.

Визначені найбільш інформативні методи обстеження на TORCH-інфекції з точки зору прогнозування невиношування.

Показано, що імунотерапія лімфоцитами чоловіка є ефективним методом лікування ЗН імунологічного походження та методом профілактики виникнення деяких ускладнень під час вагітності. Розроблені показання до проведення імуноцитотерапії.

Показана висока інформативність такого лабораторного тесту, як визначення співвідношення Тх1/Тх2 за концентрацією IFN-?/IL-4 в ЗКЛ для оцінки ефективності імуноцитотерапії. Співвідношення IFN-?/IL-4 може використовуватись в якості діагностичного та прогностичного критерію загрози звичного невиношування.

Основні результати дисертаційного дослідження впроваджені в клінічну практику пологового будинку №3 м.Києва, Черкаської центральної районної лікарні, Яготинської центральної районної лікарні. Викладені в роботі положення включені в лекційний та практичний курс підготовки студентів на кафедрі акушерства та гінекології №3 НМУ.

Особистий внесок здобувача.

Автором особисто проведено опрацювання літератури, визначена мета та основні задачі дослідження, проведено клініко-лабораторне обстеження 210 вагітних жінок, клініко-статистичний аналіз медичної документації – 817 історій хвороб вагітних зі ЗН. Мікробіологічні дослідження виконано автором спільно зі співробітниками лабораторії мікробіології, вірусології та мікології Інституту урології та нефрології (керівник д.б.н., проф.А.В.Руденко). Імунологічні дослідження виконано автором спільно зі співробітниками лабораторії імунології ІПАГа (керівник д.м.н., проф.В.П.Чернишов). Автор висловлює подяку співробітникам лабораторій за допомогу в проведенні спільних досліджень. Автором особисто проведено статистичну обробку, узагальнення одержаних результатів та їх аналіз.

Апробація результатів дисертації.

Матеріали дисертаційної роботи апробовані на наступних наукових форумах: XI з’їзді акушерів-гінекологів України “Репродуктивне здоров’я населення України: проблеми та шляхи їх розв’язання” (Київ, 2001), II міждисциплінарній науково-практичній конференції “Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика та лікування хламідіозу” (Київ, 2001), І міждисциплінарній науково-практичній конференції “Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика та лікування TORCH-інфекцій” (Київ, 2001), VI з‘їзді Всеукраїнського лікарського товариства (Чернівці, 2001), III міжнародному конгресі “Актуальные вопросы инфектологии в акушерстве и гинекологии” (Одесса, 2000), II міжнародному конгресі “Актуальные вопросы инфектологии в акушерстве и гинекологии” (Донецк, 1999).

Публікації.

За темою кандидатської дисертації опубліковано 12 наукових праць, в тому числі 7 - у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК, 5 – як статті у збірниках та матеріали наукових конференцій, з’їздів.

Структура та обсяг дисертації.

Дисертація викладена на 137 сторінках машинопису та складається з наступних розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, чотири розділи власних досліджень, обговорення результатів дослідження, висновки та практичні рекомендації. Робота ілюстрована 21 таблицею та 17 малюнками, які займають 9 сторінок. Список використаних джерел налічує 95 вітчизняних та 113 зарубіжних роботи.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. З метою вивчення розповсюдженості ЗН, виявлення основних чинників, які призводять до повторного мимовільного переривання вагітності, вивчення особливостей перебігу вагітності у жінок зі ЗН в анамнезі та оцінки організаційних заходів, що були застосовані до цієї групи вагітних, здійснено клініко-статистичний аналіз 817 історій хвороб вагітних зі ЗН, що знаходилися в пологовому будинку №3 протягом 1995-1999 рр.

На другому етапі дослідження з метою вирішення поставлених в роботі задач комплексно обстежено 210 вагітних жінок в терміні до 12 тижнів. 180 вагітних із загрозою переривання вагітності та ЗН в анамнезі склали основну групу, 30 соматично та гінекологічно здорових жінок з фізіологічною вагітністю увійшли до контрольної групи.

Для обстеження жінок з метою встановлення етіологічного фактору ЗН використані клінічні, інструментальні, лабораторні методи дослідження. Для виявлення TORCH-інфекцій проведено бактеріоскопію (забарвлення за Романовським-Гімза, за Грамом), визначення в матеріалі із цервікального каналу та уретри C.trachomatis методом прямої імунофлюоресценції (ПІФ)(“Хлами-Слайд”,Москва) за методикою фірми-виробника; визначення Ur.urealyticum та M.hominis культуральним методом (Мавров И.И, 1994); визначення рівня специфічних антитіл (IgG) до C.trachomatis, Toxoplasma gondiї, Cytomegalovirus, Herpes simplex virus I/II типу в периферійній крові методом твердофазного імуноферментного аналізу (ІФА) з використанням наборів реактивів фірм “Orgenics” (Ізраїль), “Sanofi diagnostics Pasteur” (Франція), “Labsystems” (Фінляндія), “Equipar” (Італія), ЗАО “Вектор-Бест” (Росія) за методикою виробника на ІФА-аналізаторі “Labsystems” (Фінляндія).

Гормональний статус вагітних оцінювався за даними гормональної кольпоцитології, використовувався монохромний метод забарвлення гематоксилін-еозіном (Липкан Г.Н., 1992).

Для виявлення ознак істміко-цервікальної недостатності та загрози переривання вагітності проводилося ультразвукове дослідження в динаміці вагітності на апараті “Aloka” SSD-630 та “Siemens” SL-1.

З метою діагностики хромосомних аномалій (ХА) у ембріона в 9-14 тижнів вагітності проводили при УЗД вимірювання комірцевого простору (КП) (Сопко Н.И., 2000).

Після проведення комплексного обстеження вагітних зі ЗН в анамнезі на підставі відсутності анатомічних, інфекційних, ендокринних, генетичних причин невиношування була виділена група жінок з невиношуванням “нез’ясованої” етіології, яка склала 27 вагітних. З метою виявлення етіологічного фактору цим жінкам та жінкам контрольної групи проведено імунологічне обстеження.

Оцінка імунного статусу вагітних включала визначення субпопуляцій лімфоцитів в периферійній крові методом двокольорової проточної цитометрії (Jackson A, 1990) з використанням моноклональних антитіл фірми Becton-Dickinson (США) на проточному цитофлуориметрі FACScan з використанням програмного забезпечення FACScan Research Software (Becton-Dickinson). Підраховували показники відносного (%) та абсолютного (кількість клітин в 1 мкл крові) вмісту наступних субпопуляцій лімфоцитів: Т-лімфоцити (CD3+), В-лімфоцити (CD19+), природні кілери (CD3-CD16+CD56+), T-хелпери (CD3+CD4+), Т-кілери/супресори (CD3+CD8+), ефекторні, цитотоксичні Т-лімфоцити (CD3+CD56+), активовані Т-лімфоцити (CD3+HLA-DR+).

27 жінкам зі ЗН “нез’ясованої” етіології в схемі комплексного лікування загрози переривання вагітності проводилася імунізація лімфоцитами чоловіка (основна група). Для оцінки ефективності запропонованої комплексної терапії проводилося спостереження за перебігом вагітності у жінок, що були імунізовані, та у 30 вагітних зі ЗН “нез’ясованої” етіології, які отримували традиційну терапію (група порівняння).

Алогенні лімфоцити для імунізації виділяли з 100 мл крові чоловіка шляхом центрифугування крові на градієнті фікол-ізопак з щільністю 1,078 г/мл за методикою А.Boyum (1968). Отримані мононуклеарні клітини ресуспендували у 2 мл ізотонічного розчину хлоріду натрію та вводили в день отримання вагітним внутришкірно в 8-10 точок плеча в загальній кількості 100-150 млн клітин. Імунізацію проводили одноразово в 6-12 тижнів вагітності. Попередньо чоловіки були обстежені на наявність СНІДу, сифілісу, вірусних гепатитів, цитомегаловірусної інфекції та лише при відсутності цих захворювань кров використовувалася для імунізації.

12 жінкам, що отримали імунотерапію, та 14 вагітним з контрольної групи до та через два тижні після імунізації, крім вищезгаданих методів, проведено поглиблене імунологічне обстеження, яке включало вивчення проліферативної відповіді лімфоцитів жінки в змішаній культурі лімфоцитів (ЗКЛ) та визначення рівнів цитокінів IFN-, TNF, IL-4 в супернатантах ЗКЛ.

Реакцію Змішаної культури лімфоцитів (ЗКЛ) виконували відповідно референс-протоколу, затвердженому секцією з репродуктивної імунології на 11 міжнародній нараді з питань гістосумісності (Koyama M,1991) з модифікаціями. Для кожної жінки ЗКЛ виконувалася в чотирьох варіантах:

1.

2.

3.

4.

де МНК-мононуклеарні клітини. В якості контрольної сироватки використовувалася сироватка, отримана від 6 здорових донорів-чоловіків з IV (АВ) групою крові.

Концентрацію цитокінів TNF, IFN-, IL-4 визначали в культуральних супернатантах ЗКЛ методом ІФА. Фактор некрозу пухлин (TNF) визначали кооперативним ІФА (Водяник М.А.,2001). Інтерферон- (IFN-) та інтерлейкін-4 (IL-4) визначали комерційними ІФА наборами реактивів за методикою фірми-виробника (CLB, Нідерланди).

Статистична обробка отриманих результатів проводилася на персональній ЕОМ за допомогою пакету програм “Statistica”, для визначення вірогідності розбіжностей величин використовувся критерій Стьюдента.

Результати дослідження та їх обговорення. Проведений клініко-статистичний аналіз виявив, що невиношування вагітності за останні роки не має тенденції до зниження та становить 21,2%. Серед всіх випадків невиношування 9,6% перепадає на звичне невиношування. Нами встановлено, що показник невиношування вагітності серед жінок, що вже мали викидні, в 2,8 разів перевищує загальний показник невиношування та складає 60,4%. Лише 39,6% жінок зі ЗН мають термінові пологи, 7% - передчасні. На основі проведеного аналізу нами доведена залежність між числом попередніх переривань вагітності та ризиком повторного викидня : після двох попередніх переривань вагітності ризик втрати вагітності складає 27%, після трьох –38%, після чотирьох та більше – 60%.

Найбільш поширеними медичними чинниками невиношування вагітності за даними клініко-статистичного аналізу є запальні захворювання жіночих статевих органів: у жінок зі ЗН, які народили дітей, частота хр.аднекситу становила 35,4%, у жінок зі ЗН, які втратили вагітність знов – 44,8%, у жінок зі стійкою загрозою переривання – до 75,7%. Незважаючи на високий рівень запальних захворювань в анамнезі та обтяжений гінекологічний анамнез, переважна більшість жінок не обстежена на наявність інфекцій, що передаються статевим шляхом. У 24-38% жінок етіологічний фактор невиношування вагітності за даними рутинного обстеження, наведеними в історіях хвороб, виявити не вдалося. Це вказує на необхідність додаткового пошуку, можливо, дослідження імунних та аутоімунних процесів в організмі матері.

При аналізі перебігу вагітності у жінок зі ЗН в анамнезі було виявлено, що найбільш поширене ускладнення вагітності – це загроза передчасного її переривання (у 32-51%) та фето-плацентарна недостатність (ФПН) (у 42%). Для вагітних зі ЗН характерно несвоєчасне відходження навколоплідних вод (у 76%), що, скоріше, пов’язано з високою частотою інфекційних захворювань статевих шляхів.

Результати клініко-статистичного аналізу продемонстрували необхідність проведення поглибленого обстеження вагітних зі ЗН з метою встановлення етіологічних факторів повторних переривань вагітності з урахуванням провідної ролі запальних захворювань статевих органів та ряду нез’ясованих причин.

Комплексне обстеження вагітних жінок зі ЗН дозволило визначити роль різних етіологічних факторів у виникненні цього ускладнення на сучасному етапі. Провідною причиною ЗН насьогодні виступають інфекційні захворювання матері, а саме інфекції TORCH-комплексу - інфіковані 140 (77,8%) жінок зі ЗН. Порівняно з ними достовірно нижче виявилася інфікованість збудниками TORCH-інфекцій вагітних з контрольної групи та склала 43,3%. Характерним для жінок зі ЗН є поєднання декількох інфекцій у однієї жінки: моноінфекцію мали лише 8 (4,5%) жінок. Результати дослідження виявили, що найбільший негативний вплив на перебіг вагітності справляють C.trachomatis (інфіковані 61,7%) та Cytomegalovirus (інфіковані 66,7%). 48,9% жінок інфіковані вірусом герпесу, 42,2% - токсоплазмами та 35,5% - уреаплазмами. Для діагностики хламідійної інфекції необхідно використовувати як виділення антигенів C.trachomatis із цервікального каналу та уретри, так і визначення рівня специфічних антитіл в крові, тільки за таких умов можна виявити усі випадки захворювання. Отримані результати демонструють, що найбільша вірогідність завершення вагітності мимовільним перериванням існує при виявленні антигенів C.trachomatis та високих титрів специфічних антитіл. Ризик втрати вагітності у жінок зі ЗН в цьому випадку складає 80,4%. Ризик втрати вагітності при виявлені лише діагностичного рівня IgG до С.trachomatis дорівнює 55,6%, тоді як при виявленні лише антигенів С.trachomatis – 36,8%. Результати наших досліджень дозволяють стверджувати, що виявлення високого рівня специфічних антитіл до C.trachomatis, CMV, HSV говорить про розвиток активного інфекційного процесу та супроводжується високим ризиком виникнення ускладнень вагітності.

Проведений аналіз перебігу вагітності у жінок зі ЗН на фоні TORCH-інфекцій дозволив виявити, що для хламідійної інфекції найбільш характерним варіантом переривання вагітності є мимовільний викидень в пізні та ранні терміни. При активації хронічної CMV та HSV-інфекції вагітність частіше переривається за механізмами вагітності, що не розвивається.

Результати проведеного дослідження демонструють, що більш ніж кожний третій випадок ЗН пов’язаний з дією на жіночий організм декількох етіологічних факторів, які підсилюють патологічний вплив один одного та викликають більш глибоке ураження репродуктивної системи. У 77 (42,8%) вагітних зі ЗН серед причин невиношування були виявлені лише інфекційні захворювання, у інших жінок у виникненні цього ускладнення крім інфекцій приймали участь інші чинники. Так, у 34 (18,9%) жінок крім TORCH-інфекцій були виявлені гормональні розлади; у 12 (6,6%) – гормональні розлади та істміко-цервікальна недостатність; у п’яти (2,8%) – істміко-цервікальна недостатність, у 12 (6,7%) – розширення комірцевого простору (можливі ХА).

Гормональні розлади посідають друге місце серед причин ЗН на сучасному етапі: у 59 (32,7%) жінок виявлені різні форми гормональної недостатності. Характерним було поєднання гормональних розладів з іншими причинами невиношування: з інфекціями в 18,9% випадків, з ІЦН в 1,1%, з інфекціями та ІЦН в 6,6%, з можливими ХА – в 1,1%. Гормональна недостатність виступала єдиною причиною мимовільних переривань вагітності у 9 (5%) жінок.

Істміко-цервікальна недостатність як одна з причин ЗН зустрічалася у 19 (10,5%) жінок. У всіх цих вагітних були виявлені ще й інші етіологічні фактори мимовільного переривання вагітності: у переважної більшості жінок (17) це були TORCH-інфекції, у двох вагітних ІЦН розвинулась на фоні гормональної недостатності.

Виявлене у ембріонів 14 (7,7%) вагітних з основної групи розширення КП свідчить про можливі ХА у цих ембріонів. Таким чином, переривання вагітності, що розвинулося у 12 з цих жінок, може бути пов’язано з ХА. Але ця цифра не відображає повністю роль генетичних порушень тому, що більша кількість викиднів, пов’язаних з ХА, відбувається в найбільш ранні терміни, коли вимірювання КП ще неможливе.

Звертає на себе увагу, що комплексне обстеженння вагітних зі ЗН дозволило виявити причини невиношування у 85% жінок, у 27(15%) жінок причина виникнення цього ускладнення залишилася нез’ясованою. Враховуючи істотну роль імунологічних розладів у виникненні повторних мимовільних переривань вагітності, ми вирішили продовжити діагностичний пошук саме в цьому напрямку.

Імунологічне обстеження 27 вагітних зі ЗН “нез’ясованої” етіології та 30 здорових вагітних виявило зміни в субпопуляційному складі лімфоцитів периферійної крові у вагітних зі ЗН: підвищеня абсолютної кількості лейкоцитів, гранулоцитів, лімфоцитів за рахунок субпопуляції Т-лімфоцитів (табл.1). Звертає на себе увагу достовірне збільшення абсолютної кількості Т-кілерів/супресорів (CD3+CD8+), а серед них абсолютної та відносної кількості цитотоксичних (CD56+) лімфоцитів – основних ефекторних клітин, що здійснюють лізіс клітин-мішеней. У жінок зі ЗН збільшена не лише кількість CD3+CD8+, а й підвищена їх функціональна активність, про що свідчить збільшення серед них кількості клітин з поверхневим маркером активації HLA-DR+. Виявлені зміни демонструють зростання цитотоксичного потенціалу периферійної крові у вагітних із загрозою звичного викидня та готовність до реалізації реакції відторгнення ембріона.

Генерація цитотоксичних лімфоцитів залежить від продукції цитокінів, що секретують Тх 1 типу. За нашими даними у вагітних зі ЗН відсутнє специфічне до антигенів чоловіка пригнічення функції Тх 1 типу, яке характерне для фізіологічної вагітності. Про це свідчить збільшення концентрації TNF та IFN- в ЗКЛ з контрольною сироваткою у відповідь на лімфоцити чоловіка порівняно з відповіддю на лімфоцити донора (табл.2). Була виявлена тенденція до зростання лімфоцитарної продукції TNF та IFN- у жінок зі ЗН порівняно зі здоровими вагітними. Сироватка жінок зі ЗН, як і при фізіологічній вагітності, за рахунок речовин, що вона містить, достовірно знижує продукцію TNF та IFN-. Звертає на себе увагу той факт, що концентрація IFN- у вагітних зі ЗН в присутності аутосироватки в 15,3 разів нижча, ніж з контрольною сироваткою (4849982 та 35972 пг/мл відповідно), в той час як при фізіологічній вагітності рівень IFN- нижче в 3,8 раза (р<0,001).

Вивчення продукції цитокіну IL-4, який продукується Т-х 2 типу, виявило, що у вагітних зі ЗН рівень IL-4 на лімфоцити чоловіка в присутності аутосироватки дорівнює 8414 пг/мл та виявляється вище, ніж з контрольною сироваткою - 579 пг/мл, але не досягає рівня IL-4 у

Таблиця 1.

Імунний статус вагітних зі звичним невиношуванням та здорових вагітних

Показники | Вагітні зі звичним невиношуванням (n=27) | Здорові вагітні

(n=30) |

p

Абсолютна кількість клітин в 1 мкл, Мm | Pm, % | Абсолютна кількість клітин в 1 мкл, Мm | Pm, %

Лейкоцити | 8208749 | - | 6072337 | Р1-3<0,05

Гранулоцити | 5316570 | 64,382,3 | 3904252 | 64,21,5 | P1-3<0,05

P2-4>0,05

Моноцити | 31431 | 3,80,3 | 24225 | 40,4 | P1-3>0,05

P2-4>0,05

Еозінофіли | 21990 | 2,51,0 | 17748 | 30,8 | P1-3>0,05

P2-4>0,05

Лімфоцити | 2357243 | 29,32,9 | 1748140 | 28,71,3 | P1-3<0,05

P2-4>0,05

Т-лімфоцити (CD3+):

-

-

32763

20759 | 74,80,6

18,72,8

10,82,1 | 1209116

17020

708 | 68,82

14,41,6

6,41 | P1-3<0,05

P2-4>0,05

P1-3<0,01

P2-4>0,05

P1-3<0,05

P2-4<0,05

Т-хелпери (CD3+CD4+) | 93674 | 40,83,4 | 74079 | 41,81,9 | P1-3>0,05

P2-4>0,05

Т-кілери/супресори (CD3+CD8+) | 65594 | 27,52,1 | 44646 | 25,61,5 | P1-3<0,05

P2-4>0,05

Тх/Тс відношення | - | 1,50,3 | - | 1,70,2 | P2-4>0,05

В-лімфоцити (CD19+) | 20341 | 8,51,3 | 17320 | 100,9 | P1-3>0,05

P2-4>0,05

ПК-клітини(CD3-CD16/56+) | 30854 | 12,91,4 | 30049 | 17,22,4 | P1-3>0,05

P2-4>0,05

Таблиця 2.

Рівні цитокінів в ЗКЛ у здорових вагітних та у вагітних зі звичним невиношуванням до та після лікування, (пг/мл)

Цитокіни | Групи жінок | ЗКЛ з лімфоцитами чоловіка | ЗКЛ з лімфоцитами донора |

Р

1 з контрольною сироваткою | 2 з сироваткою вагітної | 3 з контрольною сироваткою | 4 з сироваткою вагітної

TNF | I Здорові вагітні | 42252 | 31233 | 52173 | 34467 | P1-20,01 P3-40,001

P1-30,01 P2-4>0,05

II Вагітні зі ЗН до лікування | 57484 | 35972 | 42974 | 29855 | P1-2<0,01 P3-4>0,05

P1-3<0,01 P2-4<0,05

III Вагітні зі ЗН після лікування | 485124 | 372123 | 35461 | 25462 | P1-2>0,05 P3-4>0,05

P1-3>0,05 P2-4>0,05

PI-II>0,05

PII-III>0,05

PI-III>0,05 | PI-II>0,05

PII-III>0,05

PI-III>0,05 | PI-II>0,05

PII-III>0,05

PI-III<0,05 | PI-II>0,05

PII-III>0,05

PI-III>0,05

IFN- | IV Здорові вагітні | 4305677 | 1397234 | 46641163 | 1669442 | P1-2<0,001 P3-4<0,01

P1-3>0,05 P2-4>0,05

V Вагітні зі ЗН до лікування | 4849982 | 35972 | 34571279 | 1674898 | P1-2<0,01 P3-4<0,01

P1-3>0,05 P2-4>0,05

VI Вагітні зі ЗН після лікування | 1580294 | 19764 | 1578583 | 23477 | P1-2<0,01 P3-4>0,05

P1-3>0,05 P2-4>0,05

PIV-V>0,05

PV-VI<0,01

PIV-VI<0,001 | PIV-V<0,001

PV-VI<0,01

PIV-VI<0,001 | PIV-V>0,05

PV-VI>0,05

PIV-VI<0,05 | PIV-V>0,05

PV-VI>0,05

PIV-VI<0,01

IL-4 | VII Здорові вагітні | 494 | 10622 | 626 | 575 | P1-2<0,05 P3-4>0,05

P1-3<0,05 P2-4<0,05

VIII Вагітні зі ЗН до лікування | 579 | 8414 | 5613 | 6215 |

P1-2<0,05 P3-4>0,05

P1-3>0,05 P2-4>0,05

IX Вагітні зі ЗН після лікування | 10014 | 599 | 487 | 5911 | P1-2>0,05 P3-4>0,05

P1-3<0,05 P2-4>0,05

PVII-VIII>0,05

PVIII-IX0,001

PVII-IX<0,01 | PVII-VIII>0,05

PVIII-IX<0,05

PVII-IX<0,05 | PVII-VIII>0,05

PVIII-IX>0,05

PVII-IX>0,05 | PVII-VIII>0,05

PVIII-IX>0,05

PVII-IX>0,05

здорових вагітних. Таким чином, сироватка вагітних зі ЗН, як і при фізіологічній вагітності, посилює функцію Tх 2 специфічно у відповідь на антигени чоловіка, але цього недостатньо для адекватного пригнічення Tх 1 відповіді. Якщо при фізіологічній вагітності аутологічна сироватка збільшує концентрацію ІЛ-4 в 2,5 раза, то у жінок зі ЗН лише в 1,5 раза. Отримані дані наводять на думку, що вагітні зі ЗН не розвивають необхідного рівня посилення Тх2 відповіді, а для встановлення балансу Тх1/Тх2 йдуть по шляху пригнічення продукції IFN-?.

Таким чином, фізіологічна вагітність супроводжується зрушенням балансу Tх1/Tх2 в бік посилення функції Тх 2 типу та зниженням функції Тх 1 типу. Посилення Tх 2 відповіді специфічно по відношенню до антигенів чоловіка. Нами вперше встановлено регулюючий вплив факторів сироватки на посилення функції Tх 2 типу при фізіологічній вагітності. Для загрози звичного викидня характерне посилення функції Тх 1 типу з підвищенням продукції IFN- та TNF, зниження функції Tх 2, що співзвучно даним літератури (Hill JA,1995; Matsuzaki N,1992; Raghupathuy R,1999).

Враховуючи центральну роль в імунорегуляції Т-хелперів 1 та 2 типу, ми припустили, що співвідношення Tх1/Tх2 має певне прогностичне та діагностичне значення та визначили його за співвідношенням концентрації IFN-(в ЗКЛ з контрольною сироваткою)/IL-4(в ЗКЛ з аутосироваткою) у вагітних основної та контрольної груп. У здорових вагітних співвідношення IFN-/IL-4 дорівнювало 34,86, коливання співвідношення IFN-/IL-4 склало 23-47. У вагітних зі ЗН цей показник дорівнював 62,812,9, що достовірно вище, ніж у здорових вагітних (p<0,05). Зростання співвідношення IFN-/IL-4 свідчить про зрушення балансу між Tх1 та Tх2 відповіддю в бік посилення функції Tх 1 типу. Отримані дані дозволяють зробити висновок, що збільшення співвідношення IFN-/IL-4 вище 47 говорить про загрозу звичного викидня. Ми пропонуємо використовувати визначення співвідношення IFN-/IL-4 в умовах ЗКЛ як діагностичний та прогностичний показник загрози звичного викидня.

В основі мимовільних викиднів імунологічного походження лежить збіг батька та матері за HLA-антигенами (Barrenetxea G, 1995; Kishore R, 1996). Чим більше спільних HLA-антигенів у подружжя, тим меньшу проліферативну відповідь буде виявлено в реакції ЗКЛ з контрольною сироваткою. В нашому дослідженні було виявлено, що у вагітних зі ЗН проліферативна відповідь на лімфоцити чоловіка склала 7650610926 імпульсів/хв, що достовірно нижче, ніж на лімфоцити стороннього донора - 8937013292 (з контрольною сироваткою). При обстеженні здорових вагітних достовірної різниці між рівнем проліферації у відповідь на лімфоцити чоловіка (801258943) та донора (7339711293) виявлено не було. Ці дані свідчать, що жінки зі ЗН більше збігаються за HLA-антигенами зі своїми чоловіками, ніж зі сторонніми донорами. На нашу думку, саме вивчення проліферативної відповіді лімфоцитів вагітної в ЗКЛ на специфічні (лімфоцити чоловіка) та неспецифічні антигени (лімфоцити донора) дозволяє відібрати жінок, викидні у яких пов’язані зі збігом HLA-антигенів подружжя. В якості критерію відбору цієї категорії жінок ми пропонуємо використовувати індекс збігу (ІЗ), що підраховується за формулою:

де Х (донор) – рівень проліферації в ЗКЛ на неспецифічні антигени (лімфоцити донора) в присутності АВ сироватки, кількість імпульсів/хв;

Х (чоловік) – рівень проліферації в ЗКЛ на специфічні антигени (лімфоцити чоловіка) в присутності АВ сироватки, кількість імпульсів/хв.

У вагітних з контрольної групи ІЗ дорівнює 2111%, у вагітних зі ЗН він визначається на рівні –177% . Таким чином, якщо ІЗ знаходиться в межах від –1% до +43% та вище, то подружжя має легку ступінь збігу за HLA-антигенами, що з вірогідністю 95% забезпечує нормальний перебіг вагітності. ІЗ, значення якого знаходяться в межах від –3% до – 31% та нижче, говорить про більш виражений збіг подружжя за HLA-антигенами, що з вірогідністю 95% веде до мимовільного переривання вагітності. Зменшення ІЗ до –3% та нижче виступає показанням для проведення імунотерапії.

Корекція імунологічних порушень при невиношуванні вагітності в ранні терміни з використанням імунотерапії лімфоцитами чоловіка. Для лікування жінок зі ЗН на фоні HLA-збігу ще з 70-х років застосовують імунотерапію лімфоцитами чоловіка (Говалло В.И.,1979; Beer AE, 1988; Higuchi K, 1995; Unander AM, 1991), але до цього часу предметом дискусій виступають питання розробки критерію оцінки ефективності цього методу лікування, вивчаються механізми його терапевтичного впливу.

Для вирішення цих завдань ми провели комплексне лікування загрози звичного викидня з використанням імунізації лімфоцитами чоловіка у 27 вагітних зі ЗН “нез’ясованої” етіології, які склали основну групу, та 30 вагітних, що отримували традиційну терапію.

Спостереження за клінічним станом жінок та проведення УЗД в динаміці вагітності виявило, що застосування імунотерапії для лікування вагітних зі ЗН “нез’ясованої” етіології більш ефективно в лікуванні загрози переривання вагітності до 12 тижнів, ніж традиційні схеми лікування. Проведена комплексна терапія з використанням імунізації лімцофитами чоловіка дозволила пролонгувати вагітність до 12 тижнів 26 жінкам зі ЗН “нез’ясованої” етіології (96,3%), в той час як традиційна терапія виявилася ефективною в лікуванні загрози переривання вагітності до 12 тижнів тільки у 23 (76,7%; р<0,05) вагітних даної категорії.

Дослідження імунного статусу та цитокінової продукції до та через 2 тижні після імунотерапії дозволили зробити висновки: імунізація лімфоцитами чоловіка достовірно зрушує баланс Tх1/Tх2 в бік переваги Тх 2 типу, про що свідчить збільшення продукції IL-4 до 10014 пг/мл (р<0,001) в присутності контрольної сироватки, над Тх 1 типу, що супроводжується зменшенням продукції IFN- до 19764 пг/мл в присутності аутосироватки (р<0,01), до 1580294 пг/мл в присутності контрольної сироватки (р<0,01) (табл.2). Вагітні зі ЗН досягають після лікування переваги Tх 2 відповіді над Tх 1 відповіддю за механізмами, що відрізняються від діючих при фізіологічній вагітності. Якщо при фізіологічній вагітності посилення функції Tх 2 типу виявляється в присутності аутосироватки, тобто залежить від впливу сироваткових факторів, то у жінок зі ЗН після імунотерапії посилення Тх 2 відповіді виявляється в присутності контрольної сироватки, де відсутня дія сироваткових факторів, а рівень цитокінів характеризує безпосередньо синтез їх лімфоцитами. Таким чином, посилення Tх 2 відповіді пов’язане з впливом терапії на продукцію IL-4 безпосередньо лімфоцитами вагітної. Ми виявили, що посилення Tх 2 відповіді після імуноцитотерапії є специфічним по відношенню до антигенів чоловіка. Якщо в літературі зустрічаються повідомлення про підвищення синтезу цитокінів Tх 2 типу IL-4 та IL-10 під впливом імунотерапії (Chaouat G, 1995), то дані відносно механізмів посилення Tх 2 відповіді після імунізації отримані нами вперше.

Зазнало змін під впливом імунізації і співвідношення Tх1/Tх2 (за IFN-/IL-4 в ЗКЛ). Через 2 тижні після лікування воно зменшилось до 31,37 та достовірно не відрізнялося від цього показника у здорових вагітних. Отримані дані дозволили нам зробити висновок, що співвідношення IFN-/IL-4 може використовуватися для оцінки ефективності проведеної імунізації лімфоцитами чоловіка. Зменшення цього показника нижче 47 свідчить про ефективність проведеної терапії.

Спостереження за перебігом вагітності та пологів у жінок зі ЗН після застосування імунотерапії виявило, що у вагітних основної групи порівняно з жінками, які лікувались традиційно, зменшилася частота загрози переривання вагітності у ІІ триместрі (23% та 60,9% відповідно) та ФПН (15,3% та 43,4% відповідно). Проведення імунотерапії дозволило зменшити кількість як ранніх, так і пізніх мимовільних викиднів: в основній групі лише дві жінки (7,4%) втратили вагітність в другому триместрі, а в групі порівняння – чотири (13,3%). За рахунок цього у жінок після імунотерапії суттєво збільшилась кількість своєчасних пологів та дорівнювала 85,2% на відміну від 56,7% у вагітних, що лікувалися традиційно. У однієї жінки з основної групи (3,7%) та у двох з групи порівняння (6,7%) відбулися передчасні пологи. Середня маса новонароджених від строкових пологів у жінок після імуноцитотерапії склала 3475,4105,2г. та виявилася достовірно вище, ніж у вагітних, що лікувалися традиційно – 3105,594,6г. (p<0,05). Імунотерапія не тільки не мала негативного впливу на стан новонароджених, а й зменшила кількість захворювань в ранній неонатальний період. При аналізі перебігу пологів ми виявили, що у 17 (80,8%) жінок після імуноцитотерапії спостерігалося своєчасне відходження навколоплідних вод, що було достовірно вище, ніж у жінок, які отримували традиційну терапію – 7 (36,8%).

Враховуючи отримані результати, ми пропонуємо включати до схеми комплексного лікування ЗН імунологічного походження імунізацію лімфоцитами чоловіка, що дозволить покращити результати лікування та зменшити частоту невиношування вагітності.

ВИСНОВКИ

В роботі вирішена актуальна медична задача – зниження кількості повторних мимовільних викиднів та підвищення рівня живонароджуваності за рахунок удосконалення комплексу методів діагностики (додаткового включення імунологічних досліджень) та підвищення ефективності лікування вагітних зі ЗН імунологічного походження із використанням в комплексній терапії імунізації лімфоцитами чоловіка.

1. Звичне невиношування складає 9,6% серед всіх випадків невиношування. Частота невиношування вагітності серед жінок, що вже мали викидні, дорівнює 60,4% та в 2,8 разів перевищує загальний показник невиношування. Ризик повторного мимовільного переривання зростає зі збільшенням числа попередніх викиднів, що мала жінка, та складає 27% після двох, 38% після трьох, 60% після чотирьох та більше попередніх переривань вагітності.

2. TORCH-інфекції виступають провідною причиною ЗН – 77,8% вагітних зі ЗН інфіковано різними збудниками, при чому характерним є поєднання декількох інфекцій у однієї жінки. Найбільший негативний вплив на перебіг вагітності справляють C.trachomatis (виявлена у 61,7% жінок) та СMV (виявлений у 66,7%). Для хламідійної інфекції найбільш характерним варіантом переривання вагітності є мимовільний викидень в пізні та ранні терміни, при CMV та HSV-інфекціях вагітність частіше переривається за механізмами вагітності, що не розвивається.

3. Прогностично неблагоприємним є виявлення як антигенів C.trachomatis, так і діагностичного рівню специфічних антитіл – ризик втрати вагітності у жінок зі ЗН в цьому випадку складає 80,4%. Виявлення діагностичного рівня специфічних IgG до C.trachomatis, CMV, HSV при вагітності говорить про розвиток активного інфекційного процесу та супроводжується високим ризиком виникнення ускладнень під час вагітності.

4. При загрозі звичного викидня до 12 тижнів зростає цитотоксичний потенціал периферійної крові: достовірно збільшується кількість лейкоцитів, лімфоцитів, Т-лімфоцитів (CD3+), активованих (HLA-DR+) та цитотоксичних (CD56+) Т-лімфоцитів, Т-кілерів/супресорів (CD3+CD8+). У вагітних із загрозою звичного викидня в ранні терміни виявлено достовірне зростання концентрації IFN-, TNF в змішаній культурі лімфоцитів, достовірне зменшення концентрації IL-4, що говорить про функціональну перевагу Т-хелперів 1 типу.

5.Механізм терапевтичного впливу імуноцитотерапії полягає в зрушенні балансу Tх1/Tх2 в бік переваги Т-хелперів 2 типу, про що свідчить збільшення продукції IL-4, над Т-хелперами 1 типу, що супроводжується зменшенням продукції IFN-?; підвищенні блокуючих властивостей сироватки вагітних. При фізіологічній вагітності посилення функції Tх2 типу залежить від впливу сироваткових факторів, у жінок зі ЗН імунотерапія безпосередньо збільшує лімфоцитарну продукцію IL-4. Посилення Tх2 відповіді специфічне по відношенню до антигенів чоловіка.

6. Специфічним критерієм відбору жінок зі ЗН імунологічного походження, яким показано проведення імунізації лімфоцитами чоловіка, може виступати Індекс збігу.

7. Імунотерапія лімфоцитами чоловіка є ефективним методом лікування ЗН імунологічного походження. Залучення імунотерапії в комплекс лікувально-профілактичних міроприємств по збереженню вагітності дозволило 88,9% жінок зі ЗН народити життєздатних дітей та достовірно зменшило частоту загрози переривання вагітності, ФПН під час вагітності.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Обстеження на наявність C.trachomatis, Ur.urealyticum, M.hominis, Cytomegalovirus, Herpes Simplex virus, Toxoplasma gondii є обов’язковим для жінок зі ЗН.

2.

3.