НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

САТАРОВА ТЕТЯНА МИКОЛАЇВНА

УДК 575.1:581.143.6

АНДРОГЕНЕЗ ТА ЕМБРІОКУЛЬТУРА

У КУКУРУДЗИ IN VITRO

03.00.20 — біотехнологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ –2002 рік

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті зернового господарства УААН,

Дніпропетровськ.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Чугункова Тетяна Володимирівна

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Мітрофанова Ольга Володимирівна

Нікітський ботанічний садНаціональний науковий центр

УААН, головний науковий співробітник біотехнології і вірусології

рослин

доктор біологічних наук

Попова Антоніна Федорівна

Інститут ботаніки ім.М.Г.Холодного,

старший науковий співробітник відділу

клітинної біології і цитології

Провідна установа: Національний ботанічний сад ім.М.М.Гришка НАН

України, м.Київ

Захист дисертації відбудеться “__27_” березня____________200 3р. о _____10__годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, 03143, м.Київ, вул.Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою м.Київ, вул.Заболотного, 148.

Автореферат розісланий "___20_" _лютого___________2003 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради, к.б.н. О.А.Кравець

З А Г А Л Ь Н А Х А Р А К Т Е Р И С Т И К А Р О Б О Т И

Актуальність теми. Кукурудза – це культура, яка володіє великими потенційними можливостями в одержанні високих врожаїв, а також різноманіттям господарського використання. Проблема збільшення виробництва її зерна залишається одним з актуальних завдань аграрного виробництва. Головний резерв збільшення валових зборів зерна кукурудзи полягає у підвищенні врожайності на основі ефективного використання генетичних можливостей нових внесених до “Реєстру сортів рослин України” і перспективних гібридів. Їх створення вимагає інтенсифікації селекційного процесу на основі широкого використання результатів досліджень з біотехнології, молекулярної біології, генетичної інженерії.

Відомо, що результати біотехнологічних розробок здатні суттєво впливати на різні сторони селекційного процесу. Це може бути збільшення генетичного різноманіття вихідного матеріалу, оптимізація процесів добору, розмноження цінних генотипів та інші технології, що базуються на використанні методів генетичної та клітинної інженерії (Кучук, Глеба, 1997; Созинов, 1997). Серед цих напрямків особливе місце займають біотехнології, націлені на прискорення процесу селекції. Значне прискорення створення нових ліній і гібридів у кукурудзи може бути досягнуто за рахунок використання явищ андрогенезу і ембріокультури in vitro. Експериментальний андрогенез в культурі пиляків – це комплекс процесів, пов’язаних з переходом пилкового зерна з гаметофітного на спорофітний шлях розвитку. Він полягає в одержанні новоутворень з гаплоїдних пилкових зерен, а з них – рослин-регенерантів, які після обробки поліплоїдизуючими речовинами перетворюються на гомозиготні диплоїдні рослини, що можуть використовуватися в селекції як інбредні лінії. Процес одержання такої лінії традиційними методами потребує 5-7 років, а в разі використання андрогенезу термін створення гомозиготного матеріалу скорочується до одного року. Ембріокультура, тобто культивування ізольованих зародків з метою пророщування на різних етапах їх розвитку, здатна скоротити витрати часу на вирощування рослин в селекційних програмах переведення ліній на цитоплазматичну чоловічу стерильність, проведення насичуючих схрещувань та інших.

На початку нашої роботи існували відомості про можливість культивування пиляків кукурудзи з одержанням рослин-регенерантів, були розроблені склади живильних середовищ та деякі умови культивування (Anon., 401 Research Group, 1975; Genovesi, Collins, 1982; Petolino, Jones, 1986), однак відтворення одержаних результатів виявилося для цієї культури серйозною проблемою. Спроби зрозуміти особливості індукції розвитку пилкових зерен за спорофітним шляхом, процесів калусогенезу, соматичного ембріогенезу та регенерації, які при цьому відбуваються, зіткнулися з відсутністю теоретичного обґрунтування характеру їх протікання та взаємозв’язків на клітинному, тканинному та організменому рівнях.

У теперішній час існують суперечливі думки щодо генетичного контролю ознак, які складають явище андрогенезу in vitro, слабо вивчено вплив зовнішніх і внутрішніх факторів на процеси, що відбуваються при культивуванні пиляків, не визначено співвідношення та характер взаємодії генетичних і середовищних факторів у виникненні і розвитку андрогенних структур. Дискусійним лишається питання про типи розвитку пилкового зерна починаючи з різних етапів генезису пиляка. Не розкриті можливі шляхи морфогенезу, що приводять до регенерації рослин, та інші процеси, які відбуваються в постіндуктивний період. Все це веде до неспроможності оптимізувати параметри процесу андрогенезу і виходу регенерантів. Постає необхідність розробки комплексу умов, спрямованих на збільшення одержання андрогенних рослин, який ув’язував би між собою різні етапи цього процесу. Актуальним завданням стає вивчення усіх перелічених питань для розширеного кола ліній і гібридів. Таким чином, дослідження загальних теоретичних основ процесів соматичного ембріогенезу, калусогенезу та морфогенезу, спрямовані на підвищення ефективності андрогенезу в культурі пиляків кукурудзи, тобто розроблення наукових основ створення біотехнології одержання андрогенних рослин у кукурудзи, є актуальними.

Ембріокультуру, як основу технологій прискорення селекційного процесу, у кукурудзи не досліджено, не розроблено теоретичні та методичні засади проростання ізольованих зародків різного віку і одержання з них проростків та дорослих рослин, а також не розкриті потенційні можливості використання цього процесу в селекції. Отже актуальною є розробка основних принципів одержання рослин кукурудзи з ізольованих незрілих зародків та залучення їх до генетико-селекційних досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у лабораторії біотехнології Інституту зернового господарства Української академії аграрних наук відповідно до тематичних планів досліджень:

“Ввести кукурузу в культуру in vitro и разработать теоретические основы воспроизводимой системы “растение-клетка-растение” с целью использования в селекции” (1986-1990 р.р., N держреєстрації 01870042463),

“Розробити методи вирощування кукурудзи в культурі in vitro, створити на їх основі біологічні технології в селекції і впровадити ці технології в селекційні програми” (1992-1995 р.р., N держреєстрації UA01000781P) в рамках етапів - Н3. “Розробити методики і технології одержання гаплоїдних і дигаплоїдних ліній за допомогою культури пиляків кукурудзи” і Н4. “ Використати метод ембріокультури кукурудзи для одержання додаткових генерацій на рік при створенні стерильних аналогів”,

“Створити і впровадити в селекційний процес біологічні (клітинні) технології селекції високоврожайних, стійких до хвороб, шкідників і абіотичних стресів форм кукурудзи, які базуються на використанні культури ізольованих органів, тканин і клітин” (1996-2000р.р., N держреєстрації 0197U000089) в рамках етапу – 02. “Розробити і впровадити в селекційні програми біологічні технології відбору високоврожайних, стійких до хвороб, шкідників і абіотичних стресів форм кукурудзи, які базуються на використанні культури гаплоїдних тканин та клітин”.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначено розроблення теоретичних основ андрогенезу та ембріокультури у кукурудзи in vitro та створення біологічних технологій одержання рослин в культурі пиляків та зародків.

Виходячи з цієї мети було визначено задачі дослідження:

1.

-

-

-

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

Об’єкт дослідження – процеси андрогенезу та ембріокультури in vitro.

Предмет дослідження – процеси андрогенезу та ембріокультури у різних генотипів кукурудзи in vitro.

Методи дослідження. Основним методом, використаним у роботі, є метод культури клітин, тканин та органів на штучному живильному середовищі. На базі цього методу досліджувалося широке коло питань функціонування ізольованих пиляків та зародків різних генотипів кукурудзи. При вивченні особливостей успадкування застосовували генетичний аналіз. Для з’ясування структурно-функціональних закономірностей генезису пилкових зерен, ембріоїдів, калусів та рослин-регенерантів на клітинному та тканинному рівнях використовували цитоембріологічний та гістологічний методи, а для контролю за процесами росту та розвитку різноманітних структур – морфометричний метод спостережень. Цитологічний метод було вжито для підрахунку кількості хромосом у регенерантів. Біохімічний метод прикладали для аналізу гетерогенності потомства пилкових регенерантів.

Вирощування донорних рослин та потомства рослин-регенерантів проводили польовим методом, а також в умовах вегетаційного досліду у теплицях та камерах штучного клімату. Для одержання конкретного генотипу донорних рослин, а також для апробації та застосування результатів роботи у селекційному процесі використовували методи селекції – гібридизацію та відбір.

Методи варіаційної статистики було використано для оцінки достовірності та імовірності прояву тих чи інших закономірностей.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено аналіз андрогенетичної здібності вісімдесяти генотипів кукурудзи. Дістало подальший розвиток обґрунтування особливостей генетичної обумовленості андрогенетичних процесів in vitro у кукурудзи. Вперше здійснено вивчення успадкування здатності до індукції андрогенезу в системі діалельних схрещувань. Вперше аналіз генетичного контролю індукції новоутворень в культурі пиляків кукурудзи проведено за участю вихідного матеріалу андрогенетичного походження. Визначено комбінаційну здатність самозапилених ліній у відношенні андрогенезу. Показано, що індукція новоутворень та регенерація рослин визначаються адитивною, домінантною дією алельних генів, а також взаємодією неалельних генів, причому умови зовнішнього середовища здатні суттєво впливати на наявність та силу прояву окремих генних ефектів.

Вивчено вплив різноманітних факторів на індукцію андрогенезу і охарактеризовано роль та співвідношення впливу генотипу, паратипових факторів та їх взаємодії. Вперше детально вивчено дію умов вирощування донорних рослин у польовий і тепличний періоди на ефективність культивування пиляків різних генотипів, визначено оптимальні умови холодової передобробки та оптимальну стадію експлантації пиляків. Вперше показано різний характер андрогенетичної активності пиляків кукурудзи при культивуванні на контрастних за консистенцією живильних середовищах, вивчено характер дії таких регуляторів росту як 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота та аміпрофосметил.

На цитоембріологічному рівні з’ясовано процеси, що відбуваються у пилкових зернах під час холодової передобробки. Дістало подальший розвиток уявлення про морфофізіологічні процеси, що мають місце у проембріональний та ембріональний періоди розвитку пилкових зерен за спорофітним шляхом. Вперше охарактеризовано гістологічні особливості будови різних типів пилкових ембріоїдів.

Вперше вивчено вплив внутрішніх та зовнішніх факторів на процеси калусогенезу і регенерації в постіндуктивний період розвитку пилкових ембріоїдів. Виявлено різноманіття шляхів морфогенезу в постіндуктивний період та запропоновано їх класифікацію, охарактеризовано гістологічні особливості різних типів калусів пилкового походження. Оптимізовано комплекс умов культивування, направлений на підвищення індукції новоутворень і регенерації, та представлено технологію одержання андрогенних рослин в культурі пиляків кукурудзи.

Вперше охарактеризовано вплив генотипу та віку незрілих зародків кукурудзи на проростання в умовах in vitro. Розроблено оптимальні режими культивування для одержання міцних проростків. Розроблено технологію скорочення періоду вирощування рослин та одержання додаткових генерацій, запропоновано шляхи використання ембріокультури кукурудзи в генетико-селекційних дослідженнях.

Практичне значення одержаних результатів. Виділено генотипи, які можуть служити донорами високої здатності до індукції андрогенезу. Виявлений характер успадкування та інші запропоновані методи оцінки дозволяють прогнозувати андрогенетичну здатність селекційних форм кукурудзи, вести відбір на підвищення цієї ознаки. Виявлені шляхи морфогенезу в культурі пиляків можуть бути застосовані в програмах з одержання гаплоїдів, клонування, сомаклональної мінливості. Запропоновано до практичного використання комплекс оптимальних умов передобробки, склади живильних середовищ для індукції соматичного ембріогенезу, калусогенезу, регенерації, умови культивування пиляків, ембріоїдів, калусів, регенерантів, терміни експлантації та трансплантації, що складає технологію одержання андрогенних рослин. Розроблений метод ембріокультури дозволяє скорочувати період вирощування рослин кукурудзи і на цій базі одержувати додаткові генерації протягом року, що значно скорочує селекційний процес. Розроблені методи використовуються в селекційних програмах Інституту зернового господарства УААН та рекомендовані науковим установам, що займаються селекцією кукурудзи.

Вихідний матеріал андрогенетичного походження використовується в селекційних програмах Інституту зернового господарства. Гібриди кукурудзи Дніпровський 335 МВ та Дніпровський 453 СВ, створені з використанням ембріокультури, передано до системи Держсортовипробування. Гібрид Дніпровський 335 МВ за підсумками випробувань 2001 року визнано перспективним, випробування гібрида Дніпровський 453 СВ тривають.

Результати, одержані в роботі, розвивають уявлення про генетичний контроль, співвідношення генотипової та паратипової мінливості ознак, структурно-функціональні особливості та різноманіття морфогенетичних процесів у розвитку андрогенезу та ембріокультури in vitro і вносять вклад в розробку генетичних та фізіологічних основ теорії культивування ізольованих клітин, тканин та органів квіткових рослин, зокрема злаків.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто досліджені генетичні, екологічні та морфофізіологічні аспекти індукції андрогенних структур і регенерації рослин в культурі пиляків та зародків різних генотипів кукурудзи, розроблено комплекс оптимальних умов культивування, запропоновано шляхи впровадження результатів досліджень в селекційний процес. Автор приймав безпосередню участь у плануванні, проведенні експериментів та аналізі результатів лабораторних і польових досліджень. Окремі види аналізів виконано спільно зі співробітниками лабораторій біотехнології, селекції, штучного клімату та біохімії Інституту зернового господарства УААН.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідалися на Міжнародній конференції “Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибірськ, 1988), IV Всесоюзній науковій конференції “Экологическая генетика растений, животных и человека” (Кишинів, 1991), Всесоюзній конференції з сільськогосподарської біотехнології (Цілиноград, 1991), VI з’їзді Українського товариства генетиків та селекціонерів (Полтава, 1992), XII Міжнародному конгресі зі статевої репродукції у рослин (Коламбус, 1992), XIII Міжнародному конгресі зі статевої репродукції у рослин (Відень, 1994), Міжнародній конференції з агробіотехнологій рослин та тварин (Київ, 1997), II Міжнародному Симпозіумі з рослинної біотехнології (Київ, 1998), Міжнародній конференції, присвяченій 90-річчю від заснування Інституту рослинництва імені В.Я.Юр’єва УААН (Харків, 1999), Науково-практичній конференції Придніпровського наукового центру “Аграрна наука – виробництву” (Дніпропетровськ, 2000), Міжнародній конференції “Достижения и проблемы использования гаплоидии в селекции кукурузы” (Краснодар, 2000), I Всеукраїнській науково-практичній конференції “Україна наукова, 2001” (Дніпропетровськ, 2001), VII з’їзді Українського товариства генетиків та селекціонерів (Крим, 2002), на наукових семінарах відділу селекції Інституту зернового господарства УААН і кафедри фізіології рослин та екології Дніпропетровського національного університету.

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 39 друкованих роботах, в тому числі в 27 статтях (20 в фахових виданнях), 11 матеріалах і тезах конференцій, одержано 1 авторське свідоцтво на винахід.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 537 сторінках машинописного тексту. Вона складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, двох розділів (п’яти підрозділів), що вміщують власні дослідження та їх обговорення, висновків та переліку використаних джерел літератури. До тексту дисертації входять 137 таблиць та 45 малюнків. Перелік використаних джерел вміщує 514 найменувань.

О С Н О В Н И Й З М І С Т

В огляді літератури розглядаються публікації щодо культивування пиляків та зародків кукурудзи in vitro з різноманітними цілями, аналізується стан вивченості проблем андрогенезу та ембріокультури, обґрунтовується вибір мети та задач дослідження.

Матеріали та методи

Матеріалом для дослідження служили різні генотипи кукурудзи (Zea mays L.), серед яких були лінії, гібриди і популяції. Випробування і впровадження розроблених технологій проведено на матеріалі, що входить у селекційні програми Інституту зернового господарства УААН. Основним експериментальним матеріалом були ізольовані пиляки і незрілі зародки кукурудзи.

Вирощування донорних рослин і рослин-регенерантів проводили польовим методом, а також в теплицях і камерах штучного клімату відповідно до методики В.С.Столяренка та ін. (1991, 1992). Холодову передобробку волотей і пиляків здійснювали при температурі 8оС протягом 14 діб. У залежності від задач дослідження до культивування залучали пиляки від стадії вакуолізованої мікроспори до стадії молодого 2-клітинного пилкового зерна. Основними середовищами у культурі пиляків були середовища YP за A.Genovesi, G.Collins (1982) та N6 за C.Chu et al. (1975), різні модифікації яких представлено в описах відповідних експериментів. Спостереження за розвитком пилкових зерен, ембріоїдів і калусів проводили на тимчасових та постійних мікроскопічних препаратах, виготовлених за загально прийнятою методикою (Паушева, 1970). Вивчення аномалій розвитку пилку до і після холодової передобробки проводили на свіжому нефіксованому матеріалі. Розвиток пилкових зерен, ембріоїдів і калусів in vitro вивчали на матеріалі, фіксованому фіксаторами FAA і Карнуа. Тимчасові препарати пилку фарбували гематоксиліном за Генденгайном та фуксинсірчистою кислотою за Фьольгеном. Постійні препарати фарбували фуксинсірчистою кислотою за Фьольгеном, гематоксиліном за Генденгайном, Ерліхом, сафраніном за Картисом, алціановим синім. Для виявлення запасних речовин використовували реактив Люголя для фарбування крохмалю і проціонові барвники для одночасного забарвлювання білків і вуглеводів за В.Б.Івановим і Т.К.Литинською (1967). Число хромосом у клітинах корінців регенерантів підраховували після фарбування ацетоорсеїном. Електрофоретичний аналіз запасних білків – зеїнів у потомства пилкового регенеранту і вихідних форм проводили за методикою Ф.А.Поперелі та ін. (1989).

Зародки кукурудзи у віці 12 – 21 доби після запилення висаджували на живильне середовище MSзар., яке вміщувало неорганічні компоненти MS, 0,25 мг/л тіаміну, 0,25 мг/л піридоксину, 1,30 мг/л нікотинової кислоти, 0,25 мг/л пантотенату кальцію, 7,70 мг/л гліцину, 30 г/л цукрози та 3,5 г/л агару і на базі якого проводили оптимізацію одержання проростків у ембріокультурі.

Вирощування регенерантів проводили при температурі 22-27оС і 16- годинному фотоперіоді.

Основними показниками, за якими характеризували період індукції в культурі пиляків кукурудзи, були “частота реакції пиляків (%)” і “кількість новоутворень на 100 культивованих пиляків (шт.)”. “Частоту повної регенерації (%)” визначали як процентне відношення кількості ембріоїдів, що утворили пагін і корінці, до числа трансплантованих ембріоїдів. В окремих випадках регенерацію характеризували ще і за кількістю рослин на 100 експлантованих або чутливих пиляків.

Генетичний аналіз успадкування здатності до індукції андрогенезу і регенерації рослин за половинною діалельною схемою та для потомств двох батьківських ліній здійснювали за М.О.Федіним та ін.(1980), К.Мазером, Дж.Джинксом (1985) та П.П.Літуном, М.В.Проскурніним (1992). Визначення комбінаційної здатності вели за методами 2 і 4 B.Griffing (1956) у викладенні Н.В.Турбіна та ін. (1966) і П.П.Літуна, Н.В.Проскурніна (1992).

Математичну обробку методами дисперсійного та кореляційного аналізу проводили за Б.О.Доспєховим (1965), М.О.Плохінським (1970), Г.П.Лакіним (1990). При визначенні кореляційного зв’язку між здатністю до андрогенезу і погодними умовами року користувалися даними, наданими метеостанцією м.Дніпропетровська. Основні терміни культури клітин, тканин та органів in vitro вжито згідно з (Калинин, Сарнацкая, Полищук, 1980; Терминология роста и развития высших растений, 1982; Батыгина, 1984).

АНДРОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРІ ПИЛЯКІВ КУКУРУДЗИ

Особливості індукції андрогенезу in vitro

Генетичні особливості процесу індукції новоутворень

Оцінку здатності до індукції андрогенезу у різних генотипів кукурудзи проводили при дотриманні однакових умов культивування (польове вирощування донорних рослин, холодова передобробка волотей протягом 14 діб при 8 С, тверде живильне середовище індукції YP).

В результаті досліджень встановлено, що здатність до індукції новоутворень в культурі пиляків кукурудзи значною мірою детермінується генотипом. З 84 досліджених генотипів новоутворення були одержані у 52, що складає 61,9%. Приблизно 70% реагуючих генотипів у зазначених умовах були низькочутливими. Лінії в цілому мали дуже слабку здатність до індукції новоутворень або взагалі їх не давали. Виняток склала лише лінія андрогенетичного походження And44. Пиляки донорних рослин гібридної природи були більш чутливими, ніж лінійний донорний матеріал, а гібриди, складені з двох нечутливих ліній, були здатні продукувати новоутворення. Середньо- і високочутливими генотипами визначено В14Wf9 (максимальна “частота реакції пиляків” і “кількість новоутворень на 100 пиляків”, відповідно, 17,70 % і 38,46 шт.), And046 (В14 Wf9) (7,00 % і 9,67 шт.), Wf9 LН148 (5,68 % і 8,40 шт.), And44 (12,14 % і 29,57 шт.), Wf9 В14 (10,99 % і 28,13 шт.), Wf9 And44 (4,41 % і 8,32 шт.) та деякі інші. Гібридні комбінації, складені з чутливих простих гібридів, були чутливими, хоч мали показники індукції нижчі або інколи на рівні батьківських гібридів. Одержана через культуру пиляків лінія And44 мала підвищену у порівнянні з вихідним гібридом здатність до андрогенезу (за даними 1995 року “частота реакції пиляків” And44 — 12,14%, “кількість новоутворень на 100 пиляків” — 29,57 шт., вихідного гібрида H99xWf9, відповідно, 1,32% і 1,70 шт.). Порівняння показників індукції новоутворень для And44, батьківського гібрида та її гібридів із самозапиленими лініями (табл.1) свідчить про ефективність відборів на підвищену андрогенетичну здатність через культуру пиляків і про можливість розширення генетичної бази андрогенезу за рахунок гібридів між одержаною в культурі пиляків лінією і самозапиленими лініями.

Таблиця 1.

Індукція новоутворень в культурі пиляків лінії кукурудзи андрогенетичного походження And44 і гібридів за її участю

Генотип | 1993 рік | 1995 рік

Частота реакції пиляків, % | Кількість новоутворень на 100 пиляків, шт. | Частота реакції пиляків, % | Кількість новоутворень на 100 пиляків, шт.

And44 | 0,64c* | 0,64c | 12,14a | 29,57a

And44 LH59 | 0,10a | 0,10a––

LH59 And44–– | 1,52be | 2,88d

And44 LH148 | 1,07b | 1,32b | 2,78def | 6,85c

And44 3633–– | 1,15b | 2,31bd

Wf9 And44 | 0,21a | 0,24a | 4,41cd | 8,32c

H99 Wf9** | 0a | 0a | 1,32bf | 1,70bd

F/F0,01 | 3,00 | 3,81 | 13,65 | 45,90

* - дані в одній колонці з однаковою літерою недостовірно розрізняються на рівні значущості 0,01; ** - гібрид, в культурі пиляків якого було одержано лінію And44.

Під час аналізу показників індукції андрогенезу прямих та зворотних гібридів реципрокний ефект відмічено лише в окремих комбінацій в окремі роки. У одних і тих же реципрокних гібридів в різні роки позитивний материнський ефект виказували різні батьківські лінії, при цьому перевищення показників за рахунок реципрокних ефектів було незначним (для “частоти реакції пиляків” воно становить 0,34-4,07%, для “кількості новоутворень на 100 пиляків” — 0,34 – 9,87 шт.). Все це вказує на нестабільність реципрокного ефекту і на головну роль ядерних генів у визначенні андрогенетичної здатності.

Аналіз успадкування здатності до індукції андрогенезу в культурі пиляків кукурудзи проведено в системі діалельних схрещувань з одночасним визначенням комбінаційної здатності ліній, а також на основі оцінки середніх потомств, одержаних від схрещування двох вихідних форм.

Генетичний аналіз в системі діалельних схрещувань 5 ліній — And44, Wf9, B14, LH148 i H99 проводився за ознаками “частота реакції пиляків” і “кількість новоутворень на 100 пиляків” для ліній і прямих гібридів F1. Він включав визначення компонентів генетичної мінливості, графічний аналіз регресії (Wr/Vr) та визначення генетичних параметрів. В нашому експериментальному матеріалі батьківські форми були представлені інбредними лініями. Інформація щодо впливу цитоплазматичних генів на андрогенетичну активність кукурудзи в літературі відсутня, а в наших дослідженнях реципрокний ефект був нестабільним. Дані щодо множинного алелізму та порушень розщеплення у мейозі відсутні. Об’єднаний коефіцієнт регресії коваріанси на варіансу (Wr/Vr) для кожного параметра був суттєвим (b=0,84±0,14 для “частоти реакції пиляків”, b=0,65±0,16 для “кількості новоутворень на 100 пиляків”, t0,01=5,8 при df=n—2=3) і достовірно не відрізнявся від одиниці, тобто, ефекти неалельної взаємодії та залежного розподілу генів відсутні.Таким чином, обидві ознаки у даній експериментальній схемі визначаються адитивно-домінантною генетичною системою.

Достовірність середніх квадратів a i b (табл.2) свідчить про наявність адитивності і домінування. Несуттєвість b1 вказує на те, що ефекти домінування неоднонаправлені. Достовірність b2 свідчить, що домінантні гени неоднаково розподілені між лініями. Звідси, середній квадрат a включає не тільки адитивну варіансу, але і долю варіанси, пов’язану з ефектами домінування. Достовірність b3 вказує на існування специфічних для кожного схрещування домінантних ефектів, які не пов’язані з b1 i b2.

Таблиця 2

Дисперсійний аналіз даних діалельної таблиці

показників індукції андрогенезу в культурі пиляків кукурудзи

Компоненти генетичної варіації | Частота реакції пиляків | Кількість новоутворень на 100 пиляків

Середній квадрат | Fфакт./F0,01 | Середній

квадрат | Fфакт./F0,01

a | 1,08* | 40,47 | 3,35* | 14,41

b | 0,22* | 11,23 | 0,93* | 5,32

b1 | 0,002 | 0,03 | 0,001 | 0,004

b2 | 0,23* | 8,78 | 0,60* | 2,57

b3 | 0,26* | 10,64 | 1,38* | 6,42

П | 0,01 | 0,39 | 0,03 | 0,13

Пt | 0,01 | 0,06

* - достовірно для рівня значущості 0,01.

Графіки регресії Wr/Vr для ознак “частота реакції пиляків” і “кількість новоутворень на 100 пиляків” представлено на рис.1 і 2. Так як лінії регресії на графіках перетинають позитивну частину осі Wr, середній ступінь домінування за усіма локусами неповний, причому сила його прояву дещо розрізняється для двох досліджуваних ознак. Середній ступінь домінування вказує, що в успадкуванні здатності до індукції андрогенезу у даної групи ліній визначену роль відігріють адитивні ефекти, хоч і не дуже велику, оскільки лінії одиничного нахилу перетинають позитивну частину осі Wr на невеликій відстані від початку координат, тобто, домінування наближається до повного (проходження лінії через початок координат свідчить про наявність повного домінування). На графіках точки ліній H99, LH148 і Wf9 розташовані на початку ліній регресії таким чином, що співвідношення між домінантними і рецесивними алелями у них наближається до 100:0. Для “частота реакції пиляків” у B14 таке співвідношення дещо менше за 50:50, а у And44 наближається до 25:75. Для “кількості новоутворень на 100 пиляків” у B14 і And44 співвідношення домінантних і рецесивних генів близьке до 25:75. Лінія And44 несе найбільшу частку рецесивних алелів, які визначають збільшення індукції андрогенезу, на що вказує, зокрема, розташування її координатних точок на найбільш віддаленій ділянці регресії.

Рис.1. Графік регресії Wr/Vr для ознаки Рис.2. Графік регресії Wr/Vr для ознаки

“частота реакції пиляків” (1 - And44, 2 - “кількість новоутворень на 100 пиляків” (1 - Wf9, 3 - B14, 4 - LH148, 5 - H99) And44, 2 - Wf9, 3 - B14, 4 - LH148, 5 - H99)

Розрахунок генетичних параметрів для двох досліджуваних ознак (табл.3) показує, що для “частоти реакції пиляків” відношення H1/D незначно менше одиниці, тобто має місце неповне домінування, але різниця між “повним” і “неповним” його проявом невелика. Ще менша вона в кожному локусі (vH1/D=0,92), тобто, домінування наближається до повного. Для “кількості новоутворень на 100 пиляків” значення H1/D і vH1/D навіть дещо перевищують одиницю, що свідчить про наявність повного домінування і навіть про незначне зверхдомінування. На провідну роль ефектів домінування вказує і значна різниця між коефіцієнтами спадкоємності в широкому та вузькому розумінні. Величина ?F/vD(H1-H2) для обох параметрів відрізняється від одиниці, тобто рівень домінування змінюється в різних локусах. Оскільки параметри H1 і H2 не дорівнюють один одному, домінантні і рецесивні алелі, що впливають на ознаки, нерівномірно розподілені між батьківськими лініями. Асиметрія їх розподілення підтверджується відхиленням відношення H2/4H1 від 0,25 і достовірністю середнього квадрату b2. Позитивний знак F свідчить про перевищення кількості або ефектів домінантних алелів над рецесивними в даному наборі ліній і гібридів.

Таблиця 3

Генетичні параметри, що характеризують успадкування

індукції андрогенезу in vitro у кукурудзи

Генетичні параметри |

Частота реакції пиляків | Кількість новоутворень на 100 пиляків

D | 0,18 | 0,52

H1 | 0,16 | 0,71

H2 | 0,12 | 0,58

F | 0,11 | 0,32

E | 0,01 | 0,06

H1/D | 0,85 | 1,36

vH1/D | 0,92 | 1,17

ЅF/vD(H1-H2) | 0,69 | 0,61

H2/4H1 | 0,19 | 0,20

Спадкоємність в широкому розумінні |

0,93 |

0,89

Спадкоємність в вузькому розумінні |

0,58 |

0,47

Оцінка типів ефектів генів у розвитку тієї чи іншої ознаки може також бути проведена на основі аналізу середніх значень ознаки у двох вихідних форм, їх гібридів першого і другого поколінь та двох беккросних генерацій. В роботі було використано дві інбредні батьківські лінії: Wf9 (P1) і And44 (P2), а також їх гібриди F1 i F2 та два беккроси — F1xP1 (B1) i F1xP2 (B2). В даній експериментальній системі визначали типи ефектів генів в контрастних екологічних умовах, а саме за культивування пиляків на твердому та рідкому живильних середовищах, які суттєво розрізняються за впливом на інтенсивність андрогенезу (Сатарова, 1999), та за вирощування донорних рослин в різні роки (2000 р. і 2001 р.), коли умови польового вирощування донорів відрізнялися. Перевірка отриманих даних за тестами масштабності Мазера показала, що тести А, В, і С суттєво відрізняються від нуля. Тим самим, адитивно-домінантна модель, яка враховує тільки ефекти адитивності та домінування, виявляється неадекватною. В табл.4 представлено оцінки ефектів генів за моделлю, яка враховує наявність взаємодії неалельних генів. Для “частоти реакції пиляків”, яка визначалася за культивування на твердому середовищі, достовірними були негативні ефекти гомозиготно-гетерозиготної і позитивні ефекти гетерозиготно-гетерозиготної взаємодії (j- і l-ефекти). Для “кількості новоутворень на 100 пиляків” розвиток ознаки на твердому середовищі визначався негативним домінуванням, значними негативними j-ефектами і позитивними l-ефектами. Оскільки знаки параметрів [h] i [l] протилежні, в даній експериментальній системі треба констатувати дуплікатний епістаз, тобто той тип взаємодії неалельних генів, який супроводжується зниженням рівня домінування (термін “дуплікатний епістаз” надається у відповідності до термінології, прийнятій у (Мазер, Джинкс, 1985)). Порівняння дії ефектів генів для “кількості новоутворень на 100 пиляків” на рідкому середовищі у різні роки (“частоту реакції пиляків” на рідкому середовищі визначити неможливо) показує стабільний характер успадкування, а саме наявність стійкої негативної адитивності, відсутність домінування, наявність позитивних i-ефектів і негативних j-ефектів. Умови року впливали лише на наявність або відсутність l-ефектів.

Таблиця 4

Оцінки ефектів генів для ознак, що характеризують індукцію андрогенезу in vitro у кукурудзи

Генетичні параметри | Частота реакції пиляків |

Кількість новоутворень на 100 пиляків

Тверде

середовище,

2001 р. | Тверде

середовище,

2001 р. | Рідке середовище

2001 р. |

2000 р.

m | 0,27±0,02** | 0,52±0,12**– | 0,25±0,13 | 0,45±0,02**

[d] | 0,003±0,02 | -– | 0,17±0,02*– | 0,49±0,03**

[h]– | 0,12±0,09– | 0,60±0,28* | 0,32±0,30 | -

[i] | -– | 0,13±0,12 | 0,64±0,13** | 0,58±0,04**

[j]– | 0,74±0,08**– | 0,99±0,01**– | 0,52±0,07**– | 0,44±0,10**

[l] | 0,17±0,08** | 0,54±0,17** | 0,86±0,18** | -

ч2 | 0,004 | 0,17 | 1,76Е-24 | 0,92

ч20,01 | 6,649 | 6,64 | - | 9,21

*, ** - ефект є достовірним відповідно для рівнів значущості 0,05 і 0,01.

Порівняння характеру генетичного контролю андрогенезу на твердому та рідкому середовищах за показником “кількість новоутворень на 100 пиляків” показує, що стабільними факторами у розвитку даної ознаки є негативні ефекти гомозиготно-гетерозиготної взаємодії ( j-ефекти), а характерними лише для рідкого середовища – відсутність домінування, активізація позитивних i-, l-ефектів та зниження частки негативних j-ефектів, що і приводить до збільшення даної ознаки на рідкому середовищі у порівнянні з твердим.

Таким чином, аналіз успадкування різними методами в цілому засвідчує, що індукція новоутворень в культурі пиляків кукурудзи визначається різним співвідношенням адитивності і домінування, а також взаємодією неалельних генів, причому умови зовнішнього середовища здатні впливати на наявність та силу прояву окремих ефектів генів.

Оцінка комбінаційної здатності в системі діалельних схрещувань ліній And44, Wf9, B14, LH148 i H99 проводилася за методами 2 і 4 Гріффінга (за методом 2 до експериментальної схеми включаються батьківські лінії та прямі гібриди F1, а за методом 4 — лише прямі гібриди F1). В нашому дослідженні високими ефектом ЗКЗ і варіансою СКЗ володіла лінія And44, яка підтвердила свою здатність до індукції у різних гібридних сполученнях. Лінії, які мають одночасно високий або середній ефект ЗКЗ та низьку варіансу СКЗ, рекомендується використовувати при створенні синтетичних популяцій для проведення нових циклів відборів (Домашнев, Дзюбецкий, Костюченко, 1992). Такими лініями у нашому дослідженні були В14 та Wf9. Лінії And44 та Wf9, варіанса СКЗ котрих більша за варіансу ЗКЗ, в гібридних комбінаціях можуть перевищувати значення, що очікуються на основі середньої цінності ліній. Порівняння результатів аналізу комбінаційної здатності за методами 2 і 4 Гріффінга в цілому дало однаковий прогноз у виборі ліній для специфічних високогетерозисних комбінацій та створення синтетичних популяцій, але виявило розходження для окремих ліній в оцінках ефектів ЗКЗ і варіанс СКЗ. Включення в аналіз батьківських форм значно збільшувало варіанси ЗКЗ та СКЗ, особливо для “частоти реакції пиляків”. Оскільки вихідним матеріалом для одержання андрогенних регенерантів слугують перш за все гібридні комбінації, у подальшому аналіз комбінаційної здатності слід проводити за методом 4, який і розрахований на використання саме прямих гібридів діалельної схеми.

В обговоренні до даного пункту на основі аналізу та порівняння власних та літературних даних обговорюються особливості розподілу генотипів, чутливих в культурі пиляків, серед генофонду кукурудзи, пропонується пояснення різкого розходження чутливості у рослин інбредної і гібридної природи, порівнюється характер успадкування андрогенетичної здатності у кукурудзи та інших культур, обговорюються можливі шляхи розширення кола чутливих генотипів та збільшення андрогенетичної здатності у комерційної зародкової плазми кукурудзи, що витікають з отриманих автором результатів.

Вплив різноманітних факторів на індукцію новоутворень

в культурі пиляків кукурудзи

Процес одержання новоутворень в культурі пиляків визначається не тільки періодом культивування експлантата in vitro, а і передкультуральним періодом – періодом вирощування донорних рослин. Тому усі фактори, що так чи інакше зачіпають процес індукції, можна поділити на фактори, що діють на донорну рослину, і умови, що впливають безпосередньо на експлантат in vitro.

З факторів передкультурального періоду ми вивчали вплив умов вирощування донорних рослин, холодової передобробки та стадії розвитку пилкового зерна на індукцію андрогенезу.

В ході роботи з культивування пиляків деякі генотипи вивчалися нами протягом 5-7 років в однакових умовах, що дозволяє характеризувати мінливість індукції андрогенезу залежно від погодних факторів, які складалися у тому чи іншому році. Дисперсійний аналіз засвідчив достовірний вплив такого фактора як “рік досліджень” на показники індукції новоутворень у вивчених генотипів. Було показано наявність суттєвого позитивного зв’язку показників індукції з дією таких складників погоди як максимальна температура повітря червня (r=0,7) i сума опадів за січень – квітень (r=0,8), негативного зв’язку з сумою опадів за травень – липень (r= –0,7), а також комплексного впливу цих погодних факторів.

Порівняння результатів тепличного і польового вирощування донорів показало, що в зоні проведення експериментів рослини кукурудзи, вирощені у осінньо-зимовий тепличний період, дають знижену індукцію новоутворень, а рослини зимово-весняної тепличної генерації мають високу андрогенетичну здатність не тільки у порівнянні з рослинами осінньо-зимової тепличної, але і в порівнянні з рослинами польової генерацій. Аналіз ефективності різних джерел освітлення у період тепличного вирощування показав, що використання лампи ДРЛ-700 з максимумами випромінювання в областях 545 і 577 нм негативно відбивалося на розвитку донорних рослин і приводило до відсутності андрогенетичної реакції. Освітлення лампами ДНаТ-400 (з максимумами в області 560 – 610 нм), ДНаТ-400 + ДНаТЦ-400 (з максимумами в областях 620, 670 і 700 нм) і ДРИ-2000-6 (з максимумами в областях 450, 530, 580 – 590 нм) за здатністю викликати індукцію в культурі пиляків наближається до природного.

Вивчення впливу способу холодової передобробки температурою 80С протягом 14 діб на індукцію новоутворень показало, що для переважної більшості досліджених генотипів холодова передобробка пиляків (після посадки) була більш ефективною, ніж холодова передобробка волотей ( до посадки).

Дослідження впливу стадії розвитку пилкового зерна на процес індукції новоутворень виявило, що пиляки на стадії 1-клітинного вакуолізованого пилкового зерна хоч і більш чутливі, ніж на стадіях невакуолізованої мікроспори і вакуолізації, однак у переважної більшості генотипів дають невелику кількість новоутворень. Набагато ефективнішою виявилася стадія молодого 2-клітинного пилкового зерна (табл.5). На цій стадії були вищими мінімальні та максимальні значення показників частоти реакції і