Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

Шкриль В'ячеслав Михайлович

УДК 612.273.2:577,352

Активність високопорогових кальцієвих каналів гіпокампу щура при зменшенні напруги кисню в зовнішньоклітинному розчині

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, КОСТЮК Платон Григорович

директор Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук Веселовський Микола Сергійович, заступник директору Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України, м. Київ.

Доктор біологічних наук Костерін Сергій Олексійович, заступник директора по наук. роботі Інституту біохімії ім. О. М. Палладіна НАН України, м. Київ.

Провідна установа: Національний Університет ім. Т. Г. Шевченка, біологічний факультет, кафедра біофізики

Захист відбудеться "30" квітня 2002 р. о " 1000 " годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

Автореферат розісланий "26" березня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним із традиційних напрямків фізіології та біофізики є вивчення ролі кисню в забезпеченні нормальної життєдіяльності нервової клітини. Кисень потрібен для виживання більшості життєвих форм через його центральну роль як акцептора електронів у мітохондріальному дихальному ланцюгу, що робить можливим синтез ATP у реакції окисного фосфорилювання. Умова достатнього постачання кисню до тканини є фундаментальною фізіологічною ознакою, тому навіть перехідний процес обмеження надходження кисню може призводити до незворотного клітинного ушкодження. Здатність до адаптивних реакцій на гіпоксію, що допомагає мінімізувати ефекти, які пов'язані з дефіцитом кисню, існують у всіх організмах від бактерій до ссавців.

Нервові клітини, а особливо гіпокамп, є дуже чутливими до змін напруги кисню (pO2) навколишнього середовища (Krnjevic, 1999). У людини гострі гіпоксичні епізоди закінчуються нервовим ушкодженням мозку, що може стимулювати мозковий параліч, олігофренію й епілепсію.

В останні кілька років було встановлено, що іонні канали плазматичної мембрани являють собою своєрідні молекулярні сенсори кисню, які відповідають за рецепцію зміни вмісту кисню в навколишньому середовищі й реалізацію відповідної електричної відповіді нейрону. Іншими словами, починає формуватися точка зору про те, що активність принаймні потенціал-залежних іонних каналів може модулюватися змінами рО2 у міжклітинному просторі і, таким чином, кисень-чутливі іонні канали можуть відігравати ключову роль у регуляції кисневого гомеостазу клітини (Jiang et al., 1994; Small et al., 1997; Pisani et al., 1998; Mironov & Richter, 1999; Mironov & Richter, 2000). Механізми впливу недостачі кисню на властивості іонного каналу практично невідомі. Можливо, що зміна процесів активації/інактивації іонного каналу при зрушенні ступеню оксигенації обумовлена недостатнім утворенням киснем координаційних комплексів з амінокислотами білкових субодиниць каналів і, отже, змінює конформаційний стан білкової молекули. Також відомо, що прямим сенсором кисню є мембранно-зв'язана НАДФ-оксидаза, яка може впливати на окислювально-відновний стан амінокислот в іонному каналі. Виявлено, що викликані гіпоксією процеси в нейронах можуть бути обумовлені, головним чином, інгібуванням різних типів K+ каналів. У результаті спостерігається деполяризація мембрани й посилення притоку іонів кальцію в клітину під час гіпоксії (Bickler & Buck, 1998; Budd, 1998; Haddad & Liu, 2000). Не виключено, що крім прямої дії на канал, ефект гіпоксії реалізується через ряд медіаторів чи за допомогою вторинних посередників, що регулюють активність каналів при гіпоксії.

Накопичення кальцію в клітині може бути основним процесом загибелі нервової клітини при гіпоксії. Однак усе ще не з'ясовано, чому відбувається збільшення внутрішньоклітинного кальцію: за рахунок деполяризації мембрани, внаслідок інгібування калієвих каналів; чи через зміну активності кальцієвих каналів при гіпоксії. Незважаючи на актуальність даного питання, поки що практично відсутні дані про клітинні та молекулярні механізми дії гіпоксії на Са2+ канали у нейронах гіпокампу. Вияснення змін, пов'язаних із кисень-чутливими іонними каналами плазматичної мембрани клітини, допоможе пояснити різну чутливість до гіпоксії різних типів нейронів і градації клітинних відповідей на зміну рівня pО2 навколишнього середовища. Пояснення механізму збільшення внутрішньоклітинного кальцію при гіпоксії допоможе знайти нові фармакологічні інструменти ефективного лікування хвороб, викликаних дефіцитом кисню, таких як ішемія й гіпоксія.

Зв'язок роботи з науковими роботами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової програми відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: "Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функції різних мозкових структур. Дослідження впливу гіпоксії на внутрішньоклітинний кальцієвий і натрієвий гомеостаз нейронів гіпокампу."

Мета дослідження. З огляду на вищевикладене, ціль даної роботи полягала в дослідженні активності високопорогових кальцієвих каналів нейронів гіпокампу при зменшенні напруги кисню зовнішньоклітинного розчину.

Завдання дослідження.

1. Розробити методику виділення функціонально повноцінних ізольованих нейронів гіпокампу; освоїти й застосувати до них метод "петч-клемп" у конфігурації фіксації потенціалу для реєстрації струму через кальцієві канали нейронів гіпокампу.

2. Визначити властивості платинового кисень-чутливого електрода в "петч-клемп" експерименті й можливість його застосування в "петч-клемп" експерименті при полярографічному методі визначення вмісту кисню в зовнішньоклітинному розчині.

3. З'ясувати зміну активності високопорогових кальцієвих каналів нейронів гіпокампу при модулюванні умов гіпоксії з використанням внутрішньопіпеткового розчину з 10 мМ EGTA.

4. Дослідити зміну активності високопорогових кальцієвих каналів нейронів гіпокампу при зменшенні напруги кисню з використанням внутрішньопіпеткового розчину з фіксованим значенням концентрації кальцію.

Наукова новизна роботи. У дисертаційній роботі досліджена зміна активності високопорогових кальцієвих каналів нейронів гіпокампу при зменшенні напруги кисню зовнішньоклітинного розчину. Уперше показано, що активність високопорогових кальцієвих каналів нейронів гіпокампу модулюється зниженням напруги кисню зовнішнього середовища у відсутності глюкози в зовнішньоклітинному розчині, як субстрату енергетичного метаболізму. Проведені дослідження на гостроізольованних нейронах зони СА1 гіпокампу показали, що наявність вільного внутрішньоклітинного кальцію призводить до потенціювання високопорогового кальцієвого струму при зменшенні напруги кисню зовнішньоклітинного розчину. Цей ефект практично не залежить від концентрації вільного внутрішньоклітинного кальцію. Гіпоксичний ефект потенціювання Са2+ струму, з одного боку, залежить від концентрації зовнішньоклітинного кальцію: при зменьшенні напруги кисню зовнішньоклітинного розчину відбувається збільшення кальцієвого струму на 97% при [Ca2+]out=2 мМ і на 26% при [Ca2+]out=5 мМ. З іншого, кількість кальцію, що додатково входить у клітину при деполяризації мембрани, з умов гіпоксії практично не залежить від концентрації зовнішньоклітинного кальцію.

Показано, що L- та N- типи кальцієвих каналів модулюються умовами гіпоксії. В даній роботі, також прохарактеризовано внесок різних типів струмів через високопорогові кальцієві канали у гіпоксичній реакції потенціювання останніх: L-тип Са2+ струму, є найбільш чутливим до умов гіпоксії, величина збільшення струму склала 210%; N-тип збільшувався тільки на 61%; сумарний внесок P+Q- типів струму на 40%, при [Ca2+]out=2 мМ.

Зменшення напруги кисню до 15 мм.рт.ст. призводить до значного посилення стаціонарної інактивації кальцієвих каналів і практично не змінює стаціонарну активаційну характеристику кальцієвих каналів. Збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію при гіпоксії з однієї сторони призводить до кальцій-залежної інактивації кальцієвого струму, з іншої – стимулює кальцій-залежне потенціювання каналів за допомогою системи вторинних посередників. Уперше показано, що антагоніст кальмодулін-залежної протеінкінази – хлорпромазін знімає гіпоксичний ефект потенціювання кальцієвого струму у нейронах гіпокампу, що може свідчити про залучення кальмодулін-залежної протеінкінази у процес потенціювання кальцієвих каналів при гіпоксії. Така модуляція кальцієвих каналів відіграє істотну роль у механізмі регуляції нервових клітин на зменшення напруги кисню зовнішньоклітинного середовища.

Теоретичне та практичне значення роботи. Результати дисертаційної роботи насамперед мають фундаментальний інтерес, оскільки отримані принципово нові дані про зміну активності високопорогових кальцієвих каналів нейронів гіпокампу при модулюванні умов гіпоксії. Встановлено, що всі високопорогові кальцієві канали нейронів гіпокампу модулюються зниженням напруги кисню зовнішнього середовища у відсутності глюкози в зовнішньоклітинному розчині, як субстрату енергетичного метаболізму. Представлені результати розкривають деякі аспекти збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію при гіпоксії – внаслідок зміни властивостей кальцієвих каналів при даному впливі, що може допомогти знайти нові фармакологічні інструменти, що будуть ефективні в лікуванні хвороб, викликаних дефіцитом O2. У даній роботі вперше продемонстровано адекватність використання платинового, киснень-чутливого електроду при полярографічному методі визначення напруги кисню в зовнішньоклітинному розчині біля поверхні досліджуваної нервової клітини в "петч-клемп" експерименті.

Особистий внесок. Робота по збору й налагодженню електрофізіологічної установки для експериментів, виділення гостроізольованних нейронів, електрофізіологічні дослідження змін активності кальцієвих каналів нейронів гіпокампу, обробка експериментального матеріалу, аналіз і узагальнення результатів дослідження, було виконано особисто автором. Здобувач приймав активну участь у розробці концепцій роботи, обговоренні й редагуванні результатів та формуванні висновків.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідалися й обговорювалися на 1000-ої конференції Фізіологічного Суспільства (Університет м. Бирмингем, Великобританія, 20-22 грудня 1999 р.), на конференції “Bogomoletz-Nencki Meeting” (Сулейов, Польща, 7-8 травня 2001 р.) і на семінарах відділу ВФНС Інституту фізіології ім. А.А. Богомольця НАН України (1998-2001 р.).

Публікації. За результатами роботи опубліковано три статті й тези двох доповідей у наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 269 найменувань. Робота викладена на 170 сторінках та ілюстрована 42 рисунками.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Для дослідження зміни активності Са2+ каналів нейронів гіпокампу при зменшенні напруги кисню в зовнішньоклітинному розчині використовувалися такі методичні підходи:

а) культивування нейронів гіпокампу;

б) виділення гостроізольованних клітин із зрізів гіпокампу при використанні методу вібродисоціації нервових клітин;

в) метод "петч-клемп" у конфігурації "ціла клітина" для реєстрації кальцієвого струму;

с) полярографічний метод визначення напруги кисню в зовнішньоклітинному розчині. Умови гіпоксії модулювалися зменшенням pО2 до 10 мм.рт.ст. в зовнішньоклітинному розчині, що не містив глюкози.

Зниження напруги кисню зовнішньоклітинного розчину здійснювалося насиченням розчину N2. Гіпоксичний і контрольний розчин замінювався безпосередньо біля поверхні досліджуваної клітини при протоці розчину через систему протоку на основі мікро-клапанів (Компанія Lee, США). Швидкість потоку розчину була приблизно 0.5 мл/хвилин, що дозволило змінювати розчини в близькій відстані від клітини. Кисень-чутливий електрод розташовувався безпосередньо біля поверхні досліджуваної клітини, що дозволило визначати точну величину напруги кисню біля її поверхні. Для полярографічних досліджень використовувався саморобний полярограф, з'єднаний з комп'ютерною системою збору даних. При полярографічному визначенні кисню використовувався платиновий закритий електрод із діаметром платини 0.5 мМ. Електрод був відкаліброван по двом відомим значенням вмісту кисню. Робочий потенціал вибирався на плато полярографічної кривої, що відповідає значенню -650 ё-780 мВ.

Культура клітин гіпокампу. Первинна культура нейронів гіпокампу готувалась з новонароджених щурів лінії Вістар. Процедура декапітації проводилася при дотриманні правил використання піддослідних тварин Національної Академії Наук України. Зрізи гіпокампу товщиною 450ё550 мкМ оброблялись ферментативно 10-хвилин (0.025% трипсином) при 34°С. Для підтримання життєдіяльності клітин використовувалось середовище Ігла (Sigma) із додаванням кінської сироватки (10%) (Gibco). Для електрофізіологічних експериментів відбирались, за допомогою візуального контролю, пірамідні нейрони гіпокампу.

Отримання гостроізольованних нейронів гіпокампу. Для виділення окремих, ізольованих нервових клітин із зрізів гіпокампу застосовувалась модифікована методика вібродисоціації клітин із тканини, запропонована Воробйовим (Vorobjev, 1991), при цьому для експериментів брались щури Вістар віком 13-15 діб. Нами ще застосовувалась ферментативна обробка зрізу 0.1% пронази та 0.1% трипсину (Sigma, США). Ферментативна обробка проводилась при 30°С протягом 10 хвилин. Отримані ізольовані нейрони зберігали невелику частину апікальних і базальних дендритів, мали діаметр 15ё20 мкМ і довжину клітини 30ё50 мкМ.

Електрофізіологічні вимірювання. Для реєстрації Ca2+ струму у культивованих нейронах гіпокампу використовувалися наступні розчини, у мМ: зовнішньоклітинний розчин – NaCl 100, MgCl2 2, KCl 3, CaCl2 10, TrisCl 20, TTX 0.001, pH 7.4; внутрішньоклітинний розчин – CsCl 100, TrisCl 50, MgCl2 2, ATP 5, EGTA 10, pH 7.2. Склад розчинів для реєстрації Ca2+ струму від гостроізольованних нейронів гіпокампу в мМ: внутрішньоклітинний розчин – із низькою концентрацією кальцію CsCl 56, Cs2SO4 47, MgCl2 1, ATP 4, GTP 0.3, EGTA 0.5, CaCl2 0.2, HEPES 20, pH 7.2; із високою концентрацією кальцію CsCl 56, Cs2SO4 47, MgCl2 1, ATP 4, GTP 0.3, EGTA 0.5, CaCl2 0.4, HEPES 20, pH 7.2; зовнішньоклітинний розчин для реєстрації кальцієвого струму – [Ca2+]out=15 мМ містив NaCl 95, TeaCl 10, MgCl2 2, 4-AP 5, KCl 3, CaCl2 15, HEPES 20, TTX 0.001, pH 7.4; [Ca2+]out=5 мМ містив NaCl 100, TeaCl 20, MgCl2 2, 4-AP 5, KCl 3, CaCl2 5, HEPES 20, TTX 0.001, pH 7.4; [Ca2+]out=2 мМ містив NaCl 100, TeaCl 25, MgCl2 2, 4-AP 5, KCl 3, CaCl2 2, HEPES 20, TTX 0.001, pH 7.4.

Са2+ струм реєструвалися за допомогою стандартної методики "петч-клемп" у конфігурації "ціла клітина". Скляні мікропіпетки виготовлялися з боросилікатного скла, при використанні витягувача P-97 фірми Sutter Instruments. Для реєстрації кальцієвого струму використовувався підсилювач Dagan pc-one, (Dagan Corp., США). Вихідний сигнал підсилювача фільтрувався при частоті зрізу 3 КГц фільтром Бесселя та 10 КГц цифровим фільтром. Комп'ютерна система забезпечувала також генерацію командних імпульсів. Збір даних здійснювався за допомогою програми для "петч-клемп" експерименту; аналіз даних проводився з використанням програми Origin, версія 6.0 (MicroCal Software, США). Статистичні розходження були оцінені дисперсійним аналізом (ANOVA) із рівнем значимості P.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Характеристики платинового кисень-чутливого електрода.

Для застосування кисень-чутливих електродів у "петч-клемп" експерименті було проведено ряд експериментів по визначенню його властивостей при різних умовах.

Рис. 1. Зміна властивостей платинового електроду в залежності від температури розчину. Графік залежності Id від температури був отриманий при потенціалі -650 мВ із відповідних полярографічних кривих.

Був досліджений вплив температури розчину на властивості кисень-чутливих електродів. Як видно з рис. 1, існує лінійна залежність граничного дифузійного струму (Id) від температури.

Температурний ефект легко пояснити дифузійними процесами надходження O2 до активної поверхні робочого електрода.

Також були зняті полярографічні криві при різному pH розчину. Зміна pH від 5.5 до 7.8 не призводить до значної зміни граничного дифузійного струму, але змінює потенціал виділення водню, що можна пояснити електрохімічними процесами гідролізу води (рис. 2.А). Ці експерименти показали, що зміна pH розчину не впливає на властивості платинового електрода в робочій зоні полярографічної кривої.

Також було досліджено вплив серотоніну, що належить до класу електрохімічно-активних речовин, на властивості кисень-чутливого електрода. Як видно з рис. 2.Б, серотонін у різних концентраціях викликає зміну полярограми. У малих концентраціях, до 10 мкМ, не спостерігається значної зміни полярографічної кривої, а при більшій концентрації спостерігається лише зміна потенціалу виділення водню та початкового струму, але граничний дифузійний струм практично не змінюється.

Рис. 2. А – полярографічні криві, зняті при різному значенні pH; Б – властивості платинового електрода в присутності серотоніну. Зміну Id було отримано з полярографічних кривих при потенціалі -650 мВ.

У такий спосіб показано, що при зміні pH, температури, у присутності електрохімічно-активних речовин відбувається зміна потенціалу виділення водню. Вибір робочого потенціалу диктується не тільки областю плато дифузійного струму і максимальною чутливістю, але і необхідністю попередження можливості в біологічному середовищі каталітичного виділення водню. У кожному конкретному випадку необхідно робити повну реєстрацію полярограми у середовищі, в якому будуть зроблені наступні експерименти. Отриману залежність граничного дифузійного струму від температури необхідно враховувати при визначенні кисню.

Дослідження активності високопорогових кальцієвих каналів нейронів гіпокампу щура при нульовій концентрації внутрішньоклітинного кальцію при модулюванні умов гіпоксії. Були проведені експерименти при 10 мМ EGTA у внутрішньопіпетковому розчині, що дозволяє зафіксувати внутрішньоклітинну концентрацію кальцію на нульовому рівні й уникнути дії внутрішньоклітинного кальцію безпосередньо на кальцієвий канал. Дані експерименти були проведені на культивованих нейронах гіпокампу з пірамідальною морфологією після 10-13 дня культивування. Підтримуючий потенціал у цих експериментах був -70 мВ.

Ca2+ струм вимірювався у контрольних і гіпоксичних умовах із декількох клітин. Приклад реєстрації Ca2+ струму у контрольних умовах представлено на рис. 3.А. Як видно, зменшення амплітуди Ca2+ струм відображає "run-down" Ca2+ струму, що характерний для "петч-клемп" експерименту. При модулюванні умов гіпоксії Ca2+ струм реєструвався спочатку в контролі, після зняття чотирьох значень, з інтервалом 30 секунд зовнішній розчин замінявся гіпоксичним розчином. В усіх досліджених клітинах зменшення напруги кисню до 50 мм.рт.ст. протягом 10ё20 хвилин не призводило до значної змінам величини максимального Ca2+ струму (рис. 3.Б). Однак поступове зменшення максимального Ca2+ струму гіпоксією відображало зменшення "run-down" Ca2+ струму. Також було проведено експерименти при зменшенні напруги кисню до 6 мм.рт.ст., вибіркова реєстрація представлена на рис. 4. Ці експерименти були проведені по такому ж протоколу реєстрації, як і попередні. Можна помітити, що зменшення напруги кисню до 6 мм.рт.ст. не стимулює ніяких помітних змін у величині Ca2+ струму.

Рис. 3. Зміна кальцієвого струму культивованих нейронів гіпокампу при помірній гіпоксії: А – зміни максимального Са2+ струму в контрольних умовах; Б – зміна максимального Са2+ струму при зміні вмісту кисню в зовнішньоклітинному розчині; В – зміна парціального тиску кисню під час реєстрації. Рис. 4. Зміна кальцієвого струму культивованих нейронів гіпокампу при зменшенні рО2 до 6 мм.рт.ст.: А – зміна парціального тиску кисню під час реєстрації; Б – зміна максимального Са2+ струму при зміні вмісту кисню в зовнішньоклітинному розчині; В – вольтамперні характеристики Са2+ струму при різному парціальному тиску кисню, нормалізовані до їх пікових значень; Г – оригінальні записи Са2+ струмів, нормалізовані до їхніх пікових значень.

На рис. 4.В і Г показані вольтамперні характеристики й оригінальні записи Са2+ струмів, нормалізовані, щоб уникнути внеску "run-down", в момент часу, позначений номерами на рисунку. У деяких клітинах спостерігалося більш швидке зменшення величини Ca2+ струму після реоксигенації. Повторне зменшення напруги кисню також призводило до уповільнення "run-down" Са2+ струму (що відповідає номеру 6 на рис. 4.Б). При гіпоксії не спостерігалося зсуву максимуму вольтамперної характеристики кальцієвого струму (рис. 4.В).

Уповільнення "run-down" Ca2+ струму при модулюванні умов гіпоксії. Щоб оцінити зміну "run-down" при модулюванні умов гіпоксії, було вирахувано час (T50), за який пікове значення Ca2+ струму зменшується на 50% від початкового рівня. Абсолютні значення T50 відрізнялись в різних експериментах, тому величина T50 нормалізувалась до середнього значення, виміряного в контролі в той же день експерименту. Середнє значення T50 збільшувалося на 27.5% ± 15.7%, n=19 при зменшенні напруги кисню до 50 мм.рт.ст. і на 39%±13%, n=9 при зменшенні напруги кисню до 6 мм.рт.ст. у порівнянні з величиною, що спостерігається в контролі. Таке збільшення середнього T50 вказує на те, що при гіпоксії існує тенденція уповільнення "run-down" Ca2+ струму.

Дослідження активності високопорогових Ca2+ каналів при різній концентрації внутрішньоклітинного Ca2+ при модулюванні умов гіпоксії. Подальші експерименти по визначенню чутливості кальцієвих каналів до гіпоксії полягали в дослідженні чутливості Са2+ каналів до даного впливу при фіксованому значенні внутрішньоклітинного кальцію ([Са2+]in). Зовнішньоклітинна концентрація кальцію в цих експериментах складала 5 мМ.

Рис. 5. Зміна амплітуди Са2+ струму при зменшенні рО2 зовнішньоклітинного розчину: А – відповідає вибірковій реєстрації при [Са2+]in=75 нМ; Б – відповідає вибірковій реєстрації при [Са2+]in=410 нМ. Під графіками зміни струму (1) представлені значення парціального тиску кисню (2).

Було обрано два значення внутрішньопіпеткової концентрації кальцію: приблизно 75 нМ і 410 нМ. Дані концентрації були розраховані за допомогою програми, що враховує зв'язування кальцію EGTA при даному pH, внутрішньопіпетковій концентрації ATP, MgCl2 і Ca2+.

Спочатку Ca2+ струм реєструвався в контрольних умовах; після того як Са2+ струм стабілізувався, реєструвалось 5 значень, з інтервалом 20 с; після цього зовнішній розчин замінювався розчином із низьким вмістом кисню. Са2+ струм отримувався при деполяризуючому імпульсі до +5 мВ, тривалістю 50 мс, відносно підтримуваного потенціалу -80 мВ. Приклад вибіркової реєстрації зміни максимального значення Ca2+ струму при [Са2+]in=75 нМ представлено на рис. 5.А та при [Са2+]in=410 нМ на рис. 5.Б. Як видно, при наявності вільного [Са2+]in зменшення pО2 на ~86% (приблизно до 20 мм.рт.ст) викликає поступове збільшення Ca2+ струму. При низькій концентрації внутрішньоклітинного кальцію ефект збільшення амплітуди струму був більш виражений, ніж при високій концентрації. Після реоксигенації кальцієвий струм відновлювався до початкової величини.

У попередніх дослідженнях було показано, що при використанні 10 мМ EGTA у внутрішньопіпетковому розчині, спостерігається лише уповільнення "run-down" Са2+ струму, і амплітуда Са2+ струму адекватно не змінюється на зменшення рО2 зовнішньоклітинного розчину. У цих же експериментах проявився ефект потенціювання Са2+ струму при гіпоксії, якого раніше не спостерігалося. У чому причина?

Рис. 6. Усереднені значення максимального Ca2+ струму вимірювані при [Са2+]in=75 нМ (А) і при [Са2+]in=410 нМ (Б) при зменшенні рО2 зовнішньоклітинного розчину. Під графіками зміни струму (1) представлені усереднені значення парціального тиску кисню (2) у тих же часових координатах, отримані з реєстрацій при відповідній концентрації [Са2+]in.

На рис. 6 представлено усереднені значення максимумів струмів (n=4), які були вимірювані в контрольних умовах і модульованих умовах гіпоксії при відповідній внутрішньопіпетковій концентрації кальцію. Як видно з рис. 6, в контрольних умовах спостерігається звичайний "run-down" Са2+ струму, що сильніше проявляється при високій концентрації внутрішньопіпеткового кальцію. Стимулюючий гіпоксичний ефект менш виражений при високій концентрації внутрішньоклітинного кальцію, тому що він маскується ефектом "run-down" Са2+ струму (див. рис. 6). Значення Ca2+ струму, зафіксоване на 240 секунді реєстрації при рО2=15 мм.рт.ст. нормоване к значенню струму в контрольних умовах при цьому ж часі реєстрації склало: 25.7±3.8% та 26.8±3.2% при [Са2+]in 75 нМ і 410 нМ відповідно (n=4). Таким чином, ефект потенціювання Са2+ каналів при гіпоксії практично не залежить від концентрації внутрішньоклітинного кальцію.

В наших експериментах було встановлено, що початок гіпоксичного ефекту спостерігається при рО2=80 мм.рт.ст.. Значне збільшення амплітуди кальцієвого струму починається при рО2<30 мм.рт.ст., максимум розвитку ефекту відповідає значенню 16 мм.рт.ст..

Вольтамперна характеристика Са2+ струму при гіпоксії.

Рис. 7. Вольтамперні характеристики в контролі і при гіпоксії .

Оскільки максимальний ефект гіпоксії не залежить від початкової внутрішньоклітинної концентрації вільного Ca2+, у всіх наступних експериментах використовувався внутрішньоклітинний розчин, що містить [Са2+]in=75 нМ.

Були зареєстровані вольтамперні характеристики в контролі і при модулюванні умов гіпоксії; рО2 зменшувалось на 86% (pО2=20 мм.рт.ст.). На рис. 7 представлено усереднені й нормалізовані вольтамперні характеристики Ca2+ струмів отримані при аналізі п'яти клітин. Як видно з рис. 7, при гіпоксії не відбувається зсуву максимуму вольт-амперної характеристики.

Прискорення кінетики інактивації Ca2+ струму при модульовані умов гіпоксії. З представлених на рис. 8.А оригінальних реєстрацій Са2+ струмів, нормованих до одиниці, видно, що при гіпоксії відбувається прискорення кінетики інактивації кальцієвого струму.

Рис. 8. Зміна кінетики інактивації кальцієвого струму.

Кінетика інактивації Са2+ струму добре апроксимується двома експонентами: швидкою (tf) та повільною (ts).? На рис. 8.Б представлено приклад апроксимації кінетики кальцієвого струму. У контрольних умовах tf=40±4 мс, ts=534±64 мс, n=5, при гіпоксичних умовах tf=31±2 мс ts=361±40 мс, n=5.

Дослідження активаційної та інактиваційної характеристик високопорогових Са2+ каналів при модулюванні умов гіпоксії. На рис. 9.А представлено активаційні характеристики кальцієвого струму у контролі і при гіпоксії. Криві були апроксимовані рівнянням Больцмана. У контрольних умовах активаційна характеристика відповідає даним, коли потенціал половинної активації (VЅ) дорівнює 3.36±0.45 мВ та фактор нахилу (k) дорівнює 5.34±0.39 мВ (n=5); у гіпоксичних умовах – даним, коли VЅ=5.02±0.44 мВ і k=5.11±0.38 мВ (n=5).

Рис. 9. А – активаційна характеристика; Б – інактиваційна характеристика високопорогових Ca2+ каналів в контрольних умовах і при гіпоксії.

Таким чином, при зменшенні рО2 до 15 мм.рт.ст. практично не змінюється активаційна характеристика високопорогових Са2+ каналів нейронів гіпокампу.

Інактиваційна характеристика Са2+ струму реєструвалась в контрольних умовах і при гіпоксії. Амплітуди струму були нормовані до максимальної амплітуди струму й апроксимовано функцією Больцмана (рис. 9.Б). У контрольних умовах інактиваційна крива добре описувалася функцією Больцмана, коли потенціал половинної інактивації (Vh0.5) дорівнює -35,4±1,0 мВ і фактор нахилу (kh) дорівнює 11,0±0,9 мВ, відповідно (n=6). Для умов гіпоксії Vh0.5 і kh дорівнює -46,6±0,6 мВ і 13,3±0,4 мВ, відповідно (n=6). Ці дані свідчать про те, що стаціонарна інактивація Са2+ каналів значно посилюється при гіпоксії (на 11 мВ).

Дослідження ефекту гіпоксії при різному вмісті зовнішньоклітинного кальцію. Також було досліджено вплив зовнішньоклітинної концентрації Са2+ на гіпоксичний ефект потенціювання Са2+ каналів. У попередніх експериментах, проведених при [Са2+]out=5 мМ, встановлено, що гіпоксичний ефект потенціювання Са2+ каналів склав 26%.

Рис. 10. А – Залежність гіпоксичного ефекту від зовнішньоклітинного кальцію. Б – Зміна інтеграла Са2+ струму, нормованого на ємність клітини при модулюванні умов гіпоксії; *відповідає P<0.05, **відповідає P<0.01, ***відповідає P<0.001.

В цих експериментах було досліджено ще дві концентрації зовнішньоклітинного кальцію: 2 мМ та 15 мМ. Встановлено, що при даних умовах також відбувається потенціювання кальцієвого струму, при реоксигенації кальцієвий струм відновлювався до початкового рівня. При [Са2+]out=2 мМ були отримані вольтамперні характеристики в контрольних умовах і при гіпоксії. При даних модульованих умовах гіпоксії також не відбувалось зсуву максимуму вольт-амперної характеристики.

З представленої діаграми залежності гіпоксичного ефекту потенціювання Са2+ каналів видно (рис. 10.А), що даний ефект залежить від концентрації зовнішньоклітинного кальцію. Так, при фізіологічній концентрації [Са2+]out=2 мМ ефект був найбільш виражений та склав 94%, тоді як при підвищенні концентрації [Са2+]out = 15 мМ він склав 30%. На рис. 10.Б представлена зміна інтегралу Са2+ струму, нормованого до ємності клітини (n=5) для [Са2+]out: 2 мМ та 5 мМ, в контролі та при модулюванні умов гіпоксії. Як видно з рис. 10.Б, при гіпоксії інтеграл кальцієвого струму збільшувався на 91% при [Са2+]out=2 мМ і на 23% при [Са2+]out=5 мМ відносно відповідної величини, отриманої в контрольних умовах, що відповідає зміні Са2+ струму при відповідній концентрації кальцію. Але, інтеграл кальцієвого струму при гіпоксії не залежить від зовнішньоклітинного кальцію при гіпоксії і є практично постійною величиною.

Дослідження різних типів високопорогових кальцієвих каналів при модулюванні умов гіпоксії. Також були проведені експерименти в присутності селективних блокаторів кальцієвих каналів L- і N- типів, при модулюванні умов гіпоксії.

Рис. 11. Діаграма залежності гіпоксичного ефекту потенціювання кальцієвого струму у присутності селективних блокаторів N- і L- типів кальцієвих каналів, **відповідає P<0.01.

Дані експерименти були виконані на гостроізольованних нейронах гіпокампу щура, зовнішньоклітинний розчин містив 2 мМ кальцію, умови гіпоксії модулювались таким само чином, як і в попередніх випадках.

Для блокування кальцієвого струму L-типу нами використувався нифедіпін у концентрації 20 мкМ у зовнішньоклітинному прикладенні та wCTx-GVIA у концентрації 500 нМ для блокування N-типу Са2+ струму.

На рис. 11 представлена діаграма залежності гіпоксичного ефекту потенціювання кальцієвого струму в присутності селективних блокаторів кальцієвих каналів L- и N- типів. Як видно, гіпоксичний ефект потенціювання кальцієвого струму в присутності нифедіпіну склав 39.9±4.0%, n=5, та в присутності wCTx-GVIA – 63.8±1.5%, n=5.

Для з'ясування ступеню внеску різних типів Са2+ струмів у гіпоксичний ефект потенціювання Са2+ струму було запропоновано наступну систему рівнянь:

ALBL+ ANBN+ A(P+Q)B(P+Q)=94.1*100% (1.1)

ANBN+ A(P+Q)B(P+Q)=39.9*100% (1.2)

ANBN+ A(P+Q)B(P+Q)=63.8*100% (1.3)

де AL, AN, A(P+Q) – ваговий коефіцієнт внеску в гіпоксичний ефект потенціювання кальцієвого струму, який приходиться на відповідний кальцієвий струм;

де BL, BN, B(P+Q) – процентне відношення відповідних кальцієвих струмів із сумарного кальцієвого струму.

В даній роботі було розділено кальцієвий струм на компоненти: 49.4±3.8%, 25.8±1.7%, 15.8±1.4%, 8.9±1.7% відповідно N-, L-, Q-, P- типи. Таким чином, BL=25.8, BN=49.4, B(P+Q)=24.7.

Розв'язуючи систему рівнянь 1.1ё1.3, отримуємо, що: AL=210%; AN=61%; A(P+Q)=40%. Таким чином, чутливість кальцієвих струмів к модульованим гіпоксичним умовам складає: L>>N>Q+P.

Дослідження впливу кальмодулін-залежної протеінкінази на активність високопорогових кальцієвих каналів гіпокампу при модульовані умов гіпоксії. Нами було досліджено вплив хлорпромазіну (CPZ) на пікові значення кальцієвого струму при гіпоксії (CPZ є антагоністом кальмодулін-залежної протеінкінази). Дані експерименти були виконані на гостроізольованних нейронах гіпокампу при використанні зовнішньоклітинного розчину з [Ca]out=5 мМ.

Рис. 12. Зміна пікового значення кальцієвого струму в присутності антагоніста кальмодулін-залежної протеінкінази CPZ у концентрації 5 мкМ при зменшенні напруги кисню зовнішньоклітинного розчину.

На рис. 12 представлено вибіркову реєстрацію зміни пікової величини кальцієвого струму при зменшенні напруги кисню в зовнішньоклітинному розчині в присутності CPZ у концентрації 5 мкМ. У цих експериментах модулювались умови гіпоксії у присутності CPZ. Дані експерименти були виконані при таких само умовах, як і попередні – напруга кисню знижувалась до 15 мм.рт.ст., зовнішньоклітинний розчин не містив глюкози.

Як видно з рис. 12, в присутності 5 мкМ CPZ зменшення pО2 зовнішньоклітинного розчину не призводить до потенціювання кальцієвого струму. Зменшення напруги кисню в присутності CPZ призводить тільки до збільшення "run-down" кальцієвого струму, і при цьому не спостерігається потенціювання кальцієвого струму, що можна пояснити пригніченням CPZ фосфорилювання кальцієвих каналів.

Також були проведені експерименти при використанні CPZ у концентрації 20 мкМ. В цих експериментах, у присутності CPZ у концентрації 20 мкМ також не спостерігається ефекту потенціювання кальцієвого струму при зменшенні pО2 зовнішньоклітинного розчину. Відсутність потенціювання Ca2+ струму при модулюванні умов гіпоксії у даних експериментах свідчить про залучення в процес потенціювання кальмодулін-залежної протеінкінази, яка була інгібована CPZ.

Обговорення результатів досліджень

В даній роботі проведені дослідження зміни активності високопорогових кальцієвих каналів нейронів гіпокампу при модулюванні умов гіпоксії.

Для дослідження активності високопорогових кальцієвих каналів гіпокампу нами була обрана така модель гіпоксії: зменшення напруги кисню до 10ё15 мм.рт.ст. в зовнішньоклітинному розчині, що не містив глюкози. Відсутність глюкози в зовнішньоклітинному розчині необхідна для запобігання включення тих протекторних механізмів, що можуть захистити клітину на ранній стадії. В даних дослідженнях нами використовувалися розчини, які містять блокатори калієвих і натрієвих каналів, що дозволило виключити внесок даних каналів у відповідь нейрона на гіпоксію.

Деякі з авторів вважають однією з головних і первинних причин порушення діяльності клітини в результаті впливу гіпоксії – падіння рівня ATP через порушення процесу окисного фосфорилювання (Raichle, 1983) внаслідок недостатку кисню – акцептора електронів. Припинення електричної активності кори мозку щурів спостерігалося при зниженні ATP на 20ё30 відсотків від початкового рівня після початку гіпоксії. Однак у ряді робіт, виконаних на зрізах гіпокампу, показано, що вміст ATP у клітині знижується несуттєво (Whittingham & Lipton, 1981; Kass & Lipton, 1982). Для запобігання внеску зміни ATP у зміну активності високопорогових кальцієвих каналів при гіпоксії у наших експериментах був обраний внутрішньопіпетковий розчин, що містив фіксоване значення ATP (5 мМ).

Перші наші експерименти полягали в дослідженні активності високопорогових кальцієвих каналів при модулюванні умов гіпоксії з використанням внутрішньоклітинного розчину з нульовим вмістом кальцію. Ці експерименти були виконані на культивованих клітинах гіпокампу (8ё12 день культивування). Кальцієвий струм через високопорогові кальцієві каналі у цих клітинах був представлений 64% L-типом і 31% N-типом струмом. Нами показано, що амплітуда Ca2+ струму, в цих клітинах істотно не змінюється при зниженні pО2 зовнішньоклітинного розчину до 6 мм.рт.ст. протягом короткого періоду впливу (10ё20 хвилин). У той же час гіпоксія викликала уповільнення "run-down" Са2+ струму приблизно на 27.5% при 50 мм.рт.ст. і на 39% при 6 мм.рт.ст. рО2. У цих експериментах використовувався внутрішньоклітинний розчин, що містив 10 мМ EGTA. Дана концентрація EGTA цілком зв'язує вільний кальцій у клітині і запобігає взаємодії внутрішньоклітинного вільного кальцію з молекулою кальцієвого каналу. Гіпоксичне уповільнення "run-down" Са2+ струму, що спостерігається в наших експериментах, може вказувати на метаботропну залежність цього ефекту й зміну процесів фосфорилювання кальцієвого каналу при гіпоксії при даних експериментальних умовах. Уповільнення "run-down" Са2+ струму було також показано Міроновим і Ріхтером у клітинах дихальних центрів при модулюванні умов гіпоксії, що підтверджує наші дані (Mironov & Richter, 1998).

Наступні експерименти полягали в дослідженні чутливості Са2+ каналів при використанні внутрішньопіпеткового розчину з фіксованим значенням кальцію. Дані експерименти були проведені на гостроізольованних нейронах СА1 зони гіпокампу. У даних клітинах кальцієвий струм представлений: 25% L-тип, 49% N-тип, 16% P-тип 9% Q-тип.

У цих експериментах було досліджено два значення внутрішньопіпеткової концентрації кальцію – приблизно 75 нМ і 410 нМ. Уперше показано, що збільшення внутрішньоклітинного кальцію викликає ефект гіпоксії, що стимулює збільшення кальцієвого струму приблизно до 26% при [Са2+]out=5 мМ, що не спостерігалося в наших експериментах із використанням 10 мМ EGTA у внутрішньопіпетковому розчині. Характерно, що ефект потенціювання Са2+ каналів при гіпоксії практично не залежить від початкової концентрації внутрішньоклітинного кальцію: при 75 нМ збільшення амплітуди складало 25.7%, а при 410 нМ – 26.8%. Таким чином можна припустити, що гіпоксичний ефект потенціювання кальцієвих каналів є кальцій-залежним процесом.

У наступних наших експериментах нами було виявлено залежність гіпоксичного ефекту потенціювання кальцієвих каналів від концентрації зовнішньоклітинного кальцію. Так, при фізіологічній концентрації [Са2+]out=2 мМ ефект був більш виражений (склав 94%), ніж при підвищенні концентрації [Са2+]out (при 5 і 15 мМ він склав приблизно 26% і 30% відповідно). Гіпоксія призводить до збільшення кількості кальцію, що входить у клітину при деполяризації, на 91% при [Са2+]out=2 мМ і на 23% при [Са2+]out=5 мМ відносно величини, отриманої у контрольних умовах. Проте, кількість кальцію, яка входить у клітину при гіпоксії, не залежить від рівню зовнішньоклітинного кальцію. Даний висновок, отриманий відповідно до зміни інтеграла кальцієвого струму, нормованого до ємності клітини. Це можна пояснити можливістю залучення внутрішньоклітинних механізмів, що регулюють провідність кальцієвих каналів при гіпоксії до певного рівня. Таким чином, за даних умов гіпоксії відбувається зміна активності кальцієвих каналів, що призводить до збільшення входу кальцію в клітину внаслідок модуляції кальцієвих каналів.

Критичні величини напруги кисню в тканинах головного мозку або так званий “ішемічний поріг” коливаються, за даними різних авторів, від 19ё23 мм.рт.ст. (Doppenberg et al., 1998) до 10 мм.рт.ст. і нижче (Charbel et al., 1997; Baunach et al., 1998). За “нормальний рівень” рО2 приймається величина 33±11 мм.рт.ст. На жаль, такі дані про нейрони гіпокампу не приводились раніше. Відомо, що зниження напруги кисню в зовнішньому середовищі до 10ё20 мм.рт.ст. викликає зміну електричних властивостей мембрани в нейронах СА1 зони гіпокампу (Fujiwara et al., 1987; Krnjevic & Leblond, 1987). У наших експериментах встановлено, що гіпоксичний ефект потенціювання кальцієвого струму спостерігається при зменшенні напруги кисню до 30 мм.рт.ст. з максимальним значенням ефекту при 16 мм.рт.ст., що відповідає критичним величинам для нормального існування нервової клітини.

Недавно було показано, що блокатори L-, N- і P – кальцієвих каналів значно зменшують нейронне ушкодження, викликане тривалою гіпоксією в культивованих нейронах гіпокампу (Kimura et al., 1998). Також відомо, що аплікація wCTx-MVIIA призводить до зменшення ушкодження, викликаного ішемією, що було показано на нейронах СА1 зони гіпокампу (Azimi-Zonooz et al., 2001), і що SNX-111 синтетичний аналог wCTx-MVIIA також послаблює ушкодження нервових клітин при гіпоксії (Perez-Pinzon et al., 1997). Також відомо про нейрозахисну дію антагоністів L- і N – типу Ca2+ каналів від ішемії на зрізах гіпокампу (Pringle et al., 1996).

В наших експериментах досліджено, що L- і N – типи кальцієвих каналів модулюються умовами гіпоксії. Було прохарактеризовано внесок різних кальцієвих струмів у гіпоксичну реакцію останніх. Як було з'ясовано L-тип кальцієвого струму є найбільш чутливим до даного впливу – Са2+ струм потенціюється на 210%, N – тип Са2+ струму потенціюється лише на 61% та сумарний P+Q струм на 40%. В даній роботі не було прохаректизовано точно вклад P- та Q- типу кальцієвого струму, так як їх внесок у сумарному струмі невеликий, їхній вклад було просумовано. Вармінг із співавторами охарактеризував внесок різних типів Ca2+ каналів у нервову смерть внаслідок недостатку кисню й глюкози. Ними було встановлено, що всі високопорогові кальцієві канали є чутливими до даного впливу (Varming et al., 1996). Ґрунтуючись на описаних вище відомих і отриманої нами даних, можна стверджувати, що при гіпоксії відбувається модуляція усіх високопорогових