Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

Шишкін Вячеслав Олександрович

УДК 612.88: 616.379-008.64/-002

Взаємодія кальцій-регулюючих структур в первинних сенсорних нейронах в нормі та при різних патологічних станах

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник

Доктор біологічних наук, проф., академік НАНУ

Костюк Платон Григорович

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАНУ, директор

Офіційні опоненти:

Федулова С.А., д.б.н., старший науковий співробітник, вчений секретар Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України

Гіммельрейх Н.Г., к.б.н., провідний науковий співробітник, завідувач відділу нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Провідна установа

Інститут експериментальної патології, онкології та радіології

ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Захист відбудеться “11” червня 2002 р. о 13:00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології

ім. О. О. Богомольця НАН України, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту фізіології

ім. О. О. Богомольця, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 11.05.2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої доктор біологічних наук

вченої ради З. О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Регуляція рівня внутрішньоклітинної концентрації кальцію обумовлюється функціональною активністю спеціалізованих структур плазматичної мембрани і внутрішньоклітинних органел. Одним із шляхів збільшення цитозольної концентрації кальцію є звільнення його з внутрішньоклітинних кальцієвих депо. У нейронах заднєкорінцевих гангліїв доведена активна участь мітохондрій і ендоплазматичного ретикулуму в кальцієвій сигналізації, однак багато особливостей функціонування даних органел у залежності від джерела підвищення кальцію в цитозолі ще недостатньо вивчені. Крім цього, лишається недослідженим питання взаємного впливу даних органел при регуляції внутрішньоклітинного кальцію. Зміни у функціонуванні мітохондрій і ендоплазматичного ретикулуму в первинних сенсорних нейронах при різних патологічних станах, таких як діабетична нейропатія і запальний больовий синдром, практично не досліджені. Глибокий аналіз усіх вищеописаних процесів міг би значно розширити наші знання про регуляцію внутрішньоклітинного кальцію й виникнення діабетичних сенсорних нейропатій і больових запальних синдромів. Це, у свою чергу допомогло б у відшуканні шляхів лікування різноманітних нервових дисфункцій при різних патологічних станах. Виходячи з вищесказаного, аналіз взаємної участі внутрішньоклітинних кальцієвих депо в кальцієвому гомеостазі і зміни в їхньому функціонуванні при діабетичних нейропатіях і запаленні представляє безсумнівний науковий інтерес, а також і велике практичне значення.

Мета дослідження. Виявити взаємну участь мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму великих та малих нейронів заднєкорінцевих гангліїв (первинних сенсорних нейронів) ссавців у внутрішньоклітинній кальцієвій сигналізації, а також у визначенні змін кальційрегулюючої активності даних органел за умов запалення та діабетичної нейропатії.

Задачі дослідження.

1. Використовуючи метод флуоресцентної кальційметрії, а також блокатори мітохондріального кальцієвого захоплення й викиду, виявити ступінь і характер участі мітохондрій у формуванні кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією, а також при виведенні кальцію з ріанодинового депо ендоплазматичного ретикулуму в первинних сенсорних нейронах щурів.

2. Порівняти основні характеристики [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в цих нейронах у контрольних тварин і у тварин із стрептозотоцин-індукованим діабетом.

3. Визначити зміни у функціонуванні мітохондріального кальцієвого уніпортера і Na+/Ca2+ обмінника в даних нейронах при розвитку стрептозотоцин-індукованого діабету.

4. Провести порівняння основних характеристик [Ca2+]i транзиєнта, викликаного гіперкалієвою деполяризацією в нейронах заднєкорінцевих гангліїв у контрольних тварин і у тварин із караджениновим запаленням.

5. Визначити зміни у функціонуванні мітохондріального кальцієвого уніпортера і Na+/Ca2+ обмінника в нейронах заднєкорінцевих гангліїв тварин із запаленням.

Наукова новизна роботи. Дослідженням внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації у нервових клітинах і в тому числі в нейронах заднєкорінцевих гангліїв ссавців займаються в багатьох науково-дослідних лабораторіях. Особливе місце в цих дослідженнях займає вивчення участі в цьому процесі внутрішньоклітинних кальцієвих органел - мітохондрій і ендоплазматичного ретикулуму (Berridge 1993; Rizzuto et al. 1992; Usachev et al. 1993). Однак, незважаючи на значний прогрес у цих дослідженнях, у даний час залишаються невивченими багато аспектів функціонування даних органел у залежності від джерела підвищення кальцію в цитозолі. У нейронах заднєкорінцевих гангліїв не досліджений можливий вплив різного просторового розташування мітохондрій і ендоплазматичного ретикулуму в клітині на характер їхньої участі в кальцієвій сигналізації. У даній роботі значно розширено й доповнено новими відомостями розуміння механізмів участь мітохондрій у формуванні кальцієвих сигналів. У ході досліджень нами вперше був показаний взаємний вплив мітохондрій і ендоплазматичного ретикулуму при регуляції внутрішньоклітинного кальцію і запропонований зв'язок особливостей кальцієвого гомеостазу в первинних сенсорних нейронах із просторовим розташуванням досліджуваних органел.

Незважаючи на те що дослідженню діабетичних нейропатій і запаленню приділяється велика увага й опублікована безліч робіт (Hounsom & Tomlinson 1997; Dyck et al. 1987; Dyck et al. 1985), зміна кальцієвого гомеостазу при даних патологіях і його зв'язок із зміною поведінкових реакцій організму і формуванням больових синдромів досліджено недостатньо. У даній роботі нами докладно розглянуті зміни в кальційрегулюючої активності мітохондрій в нейронах заднєкорінцевих гангліїв тварин із запаленням і у тварин із розвинутою діабетичною нейропатією, а також уперше зроблений порівняльний аналіз даних змін.

Теоретичне і практичне значення роботи. Отримані в ході даної роботи результати мають як теоретичне, так і практичне значення. Розуміння механізмів формування різних кальцієвих сигналів і регуляції концентрації внутрішньоклітинного кальцію, а також взаємний вплив у даних процесах мітохондрій і ендоплазматичного ретикулуму значно розширює наші знання в галузі кальцієвого гомеостазу нервових клітин. Порівняння роботи внутрішньоклітинних кальційрегулюючих структур при діабеті й запаленні може допомогти в розумінні механізмів виникнення діабетичних нейропатій і больових синдромів і збагатити наші знання, що стосуються даних патологій.

Практичне значення даних результатів полягає в тому, що вони дозволяють зрозуміти, які саме механізми внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу первинних сенсорних нейронів ушкоджуються при розвитку діабетичної нейропатії і при запаленні. Можливо, речовини, що впливають на роботу кальцієвих насосів ендоплазматичного ретикулуму і плазмалеми, а також можливі модулятори кальцієвого уніпортера і Na+/Ca2+ обмінника мітохондрій можуть бути використані при лікуванні сенсорних нейропатій у людей, хворих діабетом, а також для полегшення страждань хворого при гострому і, можливо, хронічному запаленні. Можна також припустити, що істотних змін у передачі сенсорної інформації, у тому числі і больовий, при перерахованих вище патологіям можна буде досягти, яким-небудь образом модулюючи активність ріанодинових рецепторів ендоплазматичного ретикулуму.

Особистий внесок здобувача. Експерименти, що визначають участь внутрішньоклітинних кальцієвих депо – мітохондрій і ендоплазматичного ретикулуму в регуляції внутрішньоклітинного кальцію в первинних сенсорних нейронах ссавців, їхня взаємодія, а також зміни кальційрегулюючої активності даних органел при стрептозотоцин-індукованому діабеті і запаленні проводилися автором особисто.

Досліди по визначенню змін терморецепції у щурів із розвиненим стрептозотоцин-індукованим діабетом, а також по визначенню змін больових реакцій тварин при формаліновому тесті проводилися разом з аспірантами Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця – Кругліковим І.А. і Шутовим Л.П., а також спільно зі старшим науковим співробітником Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця – к.б.н. Сушко Б. С.

Опрацювання і статистичний аналіз усіх результатів проводився автором особисто.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались на наступних наукових конференціях: 29-й щорічній конференції Спілки Нейронаук, Майамі, США, 1999; 5-му Міжнародному конгресі по нейронауках спілки IBRO, Єрусалим, Ізраїль, 1999; 44-й щорічній конференції Біофізичної Спілки, Новий Орлеан, США, 2000; 3-му Європейському біофізичному конгресі, Мюнхен, Німеччина, 2000; спільному "Богомолець-Ненскі" Симпозіумі, Сулєєв, Польща, 2001; Літній школі спілки IBRO, Тіхані, Угорщина, 2001; 34-м міжнародному Конгресі фізіологічних наук, Крайстчерч, Нова Зеландія, 2001; 31-й щорічної конференції Спілки Нейронаук, Сан-Франциско, США, 2001; 37-му щорічному засіданні спілки EASD, Глазго, Великобританія, 2001; а також на семінарах сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця, Київ, Україна, у 2000, 2001 роках. Матеріали дисертації надруковано в 6 статтях та 3 тезах.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел, який включає 177 найменувань. Робота викладена на 133 сторінках (не включаючи списку використаних джерел) та ілюстрована 27 рисунками.

МЕТОДИКА ДОслIджень

Отримання ізольованих нейронів заднєкорінцевих гангліїв. Експерименти виконувалися на свіжеізольованих нейронах заднєкорінцевих гангліїв (ЗКГ) місячних щурів і мишей. Тварину декапітували під легким ефірним наркозом і виділяли грудні і поперекові спинномозкові ганглії, що поміщали в охолоджений до 4°С розчин Тіроде на 15-20 хвилин. Після відмивання ганглії переносили у флакон з 2 мл підігрітого до 36°С розчину Тіроде з додаванням 1 мг/мл протеази (тип XIV, Sigma, США) і 0,5 мг/мл колагенази (Worthington, США) і витримували при 36°С протягом 30 хвилин, забезпечуючи постійне перемішування розчину. Після ферментативної обробки ганглії відмивали розчином Тіроде при 36°С протягом 20 хвилин. Для одержання клітинної суспензії ганглії піпетувалися за допомогою скляних оплавлених Пастерівських піпеток протягом 5 хвилин у 0,5 мл розчину Тіроде. Отриману суспензію розливали в пластикові пляшки Петрі діаметром 35 мм (Nunc, Данія) і витримували в термостаті при 36°С протягом 1 години для прикріплення клітин до дна пляшок.

Фарбування клітин флуоресцентним барвником. Для кількісного визначення концентрації кальцію в нейронах ЗКГ використовували мембранопроникну форму барвника індо-1 (індо-1/АМ). Для його введення в клітини, їх поміщали в розчин Тіроде, який містив естерифіковану форму барвника в концентрації 5-7 мкмоль/л, розчинену в диметилсульфоксиді з додаванням детергенту Плуронік F-127 (0,02%). Клітини фарбували протягом 30-40 хвилин при температурі 35°С. Після фарбування клітини відмивали розчином Тіроде, в якому додатково витримували 30 хвилин для повної деестерифікації зонда індо-1/АМ.

Флуоресцентна кальційметрія. Барвник збуджували світлом з довжиною хвилі 360 нм. Флуоресцентний сигнал реєстрували на довжинах хвиль 395-405 нм та 490-510 нм. Реєструючи відносну зміну інтенсивності флуоресценції (R) на зазначених довжинах хвиль, можна розрахувати [Ca2+]i у цитозолі за формулою Грінкевіча (Grynkiewicz G. et al. 1985):

[Ca2+]i = Kd · B · (R - Rmin) / (Rmax - R).

Значення констант, що входять у формулу (Kd, B, Rmin, Rmax), одержували за допомогою процедури калібрування (Grynkiewicz G. et al. 1985).

Експериментальна установка для двохвильового вимірювання концентрації цитозольного кальцію. Основними елементами установки були: джерело світла, мікроскоп, фотоелектронні помножувачі (ФЕП), модуль попередньої обробки сигналу та комп'ютер. Оптична система установки була змонтована на базі інвертованого мікроскопа Люмам-И3, Росія. Використовуючи як джерело світла ртутну лампу, об'єкт дослідження освітлювався через фільтр за допомогою сферичного дзеркала та високоапертурного імерсійного об'єктива (40х) світлом довжиною хвилі 360 нм. Флуоресцентний сигнал, випущений барвником, за допомогою системи призми й фільтрів реєструвався двома ФЕП на довжинах хвиль 395-405 та 490-510 нм. За допомогою модуля попередньої обробки сигналу компенсували автофлуоресценцію, а також визначали рівень фарбування клітин та значення відношення довжин хвиль R, яке давало змогу оцінити рівень кальцію в клітині на протязі експерименту. Після попередньої обробки сигнал оцифровувався та зберігався на комп'ютері за допомогою цифрового інтерфейсу TIDA (Гейдельберг, Німеччина).

Методи встановлення наявності діабетичних нейропатій. Для встановлення наявності відхилень в роботі нервової системи діабетичних тварин використовували метод "формалінового тесту" та "гарячої поверхні". Перший метод використовувався для дослідження поведінкових реакцій тварин при гострому болі, другий метод дозволяв досліджувати больові реакції щурів на термічний стимул, а також визначати поріг больової температурної чутливості.

В першому випадку ноцицептивний стимул викликали підшкірним введенням 20 мкмолей 5% розчину формаліну в задню кінцівку контрольних та діабетичних тварин. Потім протягом півтори години реєстрували з використанням комп'ютера поведінкові больові реакції щура (лизання та посмикування ушкодженої кінцівки).

У другому випадку ноцицептивний стимул створювали завдяки поміщенню тварини на поверхню, розігріту до температури, яка здатна викликати у неї больову реакцію. Характеристикою больової чутливості вважався проміжок часу до появи характерної больової реакції – лизання задніх кінцівок.

Розчини та реактиви. Базовим позаклітинним розчином, який використовувався для ізолювання нервових клітин, перфузії експериментальної камери й приготування всіх інших позаклітинних розчинів був модифікований розчин Тіроде наступного складу (у ммолях): NaCl - 140, KCl - 2, MgCl2 - 2, CaCl2 - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10. Для деполяризації мембрани нейронів використовували гіперкалієвий розчин, що містив (у ммолях): NaCl – 92, KCl – 50, MgCl2 – 2, CaCl2 – 2, HEPES – 10, глюкоза – 10. Значення рН для всіх позаклітинних розчинів дорівнювало 7.35. Температура розчину для перфузії експериментальної камери підтримувалась на рівні 32°С. Безкальцієвий позаклітинний розчин отримували з базового розчину шляхом еквімолярної заміни CaCl2 на MgCl2 та додаванням хелатора Са2+ – EGTA (1 ммоль). Індо-1/АМ була одержана від компанії Molecular Probes (Eugene, OR, Ізраїль); ТРР+ від компанії Tocris-Cookson Ltd. (Брістоль, Великобританія); усі інші реагенти – від компанії Sigma-Aldrich Chemie GmbH. (Deisenhofen, Німеччина).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕНЬ

Кальцієві сигнали, викликані деполяризацією нейрона. Деполяризація нейронів викликалася позаклітинним додатком гіперкалієвого розчину, що містив 50 мМ KCl. Деполяризація тривалістю більш 3 секунд як у нейронах великого, так і малого діаметра викликала значне транзиєнтне підвищення [Ca2+]і, яке мало характерну форму, що не змінювалася від експерименту до експерименту. Викликаний деполяризацією кальцієвий транзиєнт мав складну кінетику: протягом перших 3 секунд концентрація кальцію швидко наростала від базового рівня до величини 702 ± 62 нМ (n=19) у великих нейронах і 526 ± 81 нМ (n=15) у малих (рис. 1А,Б). Після досягнення даної величини, концентрація цитозольного Са2+ далі не збільшувалася і починався спад кальцієвого транзиєнта. Цей спад мав складну багатофазну кінетику. У першій фазі концентрація цитозольного Ca2+ протягом перших 1-3 секунд швидко зменшувалася. Потім швидкість спаду сильно знижувалася і рівень [Ca2+]і залишався досить високим протягом хвилини і більше. Найчастіше ця повільна фаза мала вигляд "плато" (рис. 1А,Б). Через 1-2 хвилини рівень [Ca2+]i повертався до базового. Збільшення часу деполяризації не впливало на амплітуду сигналу та форму його спаду. Більш того, не змінювався рівень виникнення плато, змінювалася лише його тривалість.

Кальцієві сигнали, викликані активацією ендоплазматичного ретикулуму. Ріанодинове депо ендоплазматичного ретикулуму великих ЗКГ нейронів активувалося додатком кофеїну. Позаклітинний додаток 20 мМ кофеїну викликав транзиєнтне підвищення [Ca2+]i. Амплітуда кальцієвої відповіді складала в середньому 420 ± 51 нМ (n=16) (рис. 1В). Після деполяризації, середня амплітуда кальцієвої відповіді на кофеїн складала 1008 ± 96 нМ (n=19). Це явище зв'язане з тим, що при викликаній деполяризацією відповіді значна кількість Са2+ закачується в ендоплазматичний ретикулум. Форма кофеїн-індукованого кальцієвого транзиєнту істотно відрізнялася від такої у випадку деполяризації, що видно на рис. 1В. Спад у випадку кофеїнової відповіді був монофазним і було відсутнє характерне плато.

Зміна кінетики кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією, при блокуванні мітохондріального уніпортера. Для дослідження впливу мітохондрій на кальцієву сигналізацію використовувалася позаклітинна аплікація роз'єднувача протонного градієнта на мембрані мітохондрій - СССР. Додаток СССР на клітину викликав лише невелике підвищення [Ca2+]і, яке сягало 47 ± 9 нМ (n=13) у великих і 48 ± 10 нМ (n=13) у малих нейронах. Якщо на фоні додатка 10 мкМ СССР деполяризувати клітину, то це приводило до значного підвищення [Ca2+]і. Як видно на рис. 2 амплітуда даного підвищення значно перевищувала амплітуду кальцієвого транзиєнта у відповідь на контрольну деполяризацію (без СССР) і досягала величини, рівної 1065 ± 105 нМ (n=14) у малих і 1460 ± 181 нМ (n=14) у великих ЗКГ нейронах. Збільшення було достовірним із P<0,005 у малих і з P<0,00001 у великих ЗКГ нейронах. На спаді зникало плато, і спад приймав монофазну форму (рис. 2). Виявлялося також помітне уповільнення початкової "швидкої" фази. У великих нейронах на фоні СССР величина часу половинного спаду t0,5 склала 18 ± 3 сек (n=14) у порівнянні з 5 ± 1 сек (n=15) у контролі, а в малих її значення дорівнювало 19 ± 4 сек (n=14) на фоні СССР у порівнянні з 6 ± 1 сек (n=19) у контролі (P<0,001).

Якщо СССР прикладався через 3 секунди після припинення аплікації KCl, то це приводило до генерації додаткового підвищення [Ca2+]i (рис. 3) з амплітудами 235 ± 42 % (n=12) від амплітуди вихідного кальцієвого сигналу у великих і 134 ± 22 % (n=8) у малих ЗКГ нейронах. Чим пізніше додавався СССР після піка кальцієвого транзиєнта, тим менше була амплітуда СССР-індукованого кальцієвого викиду. Коли [Ca2+]i поверталася до базального рівня, додаток СССР викликав лише незначне підвищення концентрації цитозольного кальцію.

Зміна кінетики кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією, при блокуванні Na+/Ca2+ обмінника мітохондрій. Для дослідження механізмів звільнення Са2+ із мітохондрій і їхнього впливу на кальцієву сигналізацію ми застосували блокатор Na+/Ca2+ обмінника тетрафенілфосфоніум ТРР+.

Додаток ТРР+ саме по собі не змінював базального рівня [Ca2+]і, отже в спокої робота Na+/Ca2+ обмінника мітохондрій не робить помітного впливу на Са2+ гомеостаз. Деполяризація нейронів на фоні додатка ТРР+ у концентрації 25 мкМ приводила до транзиєнтного підвищення [Ca2+]і значно меншої амплітуди, ніж у відсутності ТРР+. Парні експерименти на ЗКГ нейронах показали зменшення амплітуди деполяризаційних Са2+ транзиєнтів від 1075,6±63,3 нМ до 696,1±64,5 нМ у великих нейронах (n=14, Р < 0,05) і від 400,3±79,4 нМ до 288,6±54,3 нМ у малих нейронах (n=7, Р < 0,05).

Більш істотні зміни спостерігалися в кінетиці спаду [Ca2+]і транзиєнта, викликаного деполяризацією на фоні ТРР+. Застосування ТРР+ не приводило до достовірних змін початкової фази спаду [Ca2+]і транзиєнта. Однак на фоні ТРР+ величина залишкового рівня [Ca2+]і, нормована до одиниці, вірогідно зменшувалася як у великих (від 1,0 ± 0,2 до 0,18 ± 0,08, n=14, P < 0,001), так і в малих ЗКГ нейронах (від 1,0 ± 0.36 у контролі до 0,08 ± 0,04 у присутності ТРР+, n=7, P<0,05). Для прямого дослідження ефекту блокування виведення Са2+ із мітохондрій за допомогою Na+/Ca2+ обмінника була проведена серія експериментів за участю СССР. Описаний вище викид кальцію при додатку СССР на спаді деполяризаційного кальцієвого транзиєнта був значно знижений при преаплікації 25 мкМ ТРР+ (рис. 4). На фоні ТРР+ відносна амплітуда СССР-індукованого кальцієвого викиду вірогідно зменшувалася від 235 ± 42 % (n=12) до 62 ± 19 % (n=10, Р < 0,005) у великих ЗКГ нейронах і від 134 ± 22 % (n=8) до 53 ± 12 % (n=15, Р < 0,005) у малих ЗКГ нейронах.

Зміна кінетики кофеїн-індукованих кальцієвих сигналів при блокуванні мітохондріального уніпортера. Викид Са2+ з ендоплазматичного ретикулуму в цитозоль викликався шляхом активації ріанодинових рецепторів великих ЗКГ нейронів. Як видно на рис. 5, амплітуда відповіді на 20 мМ кофеїну в контролі не відрізнялася від такої на фоні 10 мкМ СССР (1112 ± 170 нМ, n=10 у контролі і 948 ± 129 нМ, n=10 на фоні СССР). При цьому спостерігалося істотне уповільнення спаду [Ca2+]i. Час половинного спаду t0,5 збільшилося від 1,8 ± 0,2 сек (n=10) у контролі до 4,6 ± 0,7 сек (n=10) на фоні СССР (P < 0,05).

Додаток 10 мкМ СССР на спаді кофеїн-індукованої кальцієвої відповіді викликав додаткове підвищення [Ca2+]і, аналогічне тому, що спостерігалося на спаді деполяризаційного транзиєнта (рис. 5). СССР-індукована відповідь зберігалася і при використанні позаклітинного розчину, що не містив Са2+. Амплітуда СССР-індукованого підвищення [Ca2+]і в даному випадку була істотно нижче, ніж у випадку деполяризаційного транзиєнта (93 ± 7 %, n=7 у порівнянні з 235 ± 42 %, n=12, Р < 0,05).

Зміни кальцієвої сигналізації в ЗКГ нейронах за умов стрептозотоцин-індукованого діабету. Порівняння кальцієвих сигналів, викликаних короткочасною (3 сек) деполяризацією ЗКГ нейронів великого і малого діаметрів за умов діабету, показало відсутність достовірних відмінностей їхніх основних характеристик, а саме: базального рівня [Ca2+]i, амплітуди й швидкості наростання кальцієвого транзиєнта, часу напівспаду (t0,5), а також рівня залишкового кальцію в цитозолі через 60 сек після закінчення деполяризації (R60).

При збільшенні тривалості деполяризації до 5 секунд, виявилося достовірне підвищення рівня залишкового кальцію на спаді [Ca2+]i транзиєнту в ЗКГ нейронах малого діаметра (рис. 6). Величина R60 у нейронах діабетичних тварин склала 15 ± 3 % (n=9), тоді як у нейронах контрольних тварин його значення було 10 ± 1 % (n=37, Р < 0,05). У великих ЗКГ нейронах не було виявлено ніяких змін навіть при збільшенні тривалості деполяризації.

Зміни, зв'язані за участю мітохондрій у кальцієвій сигналізації при діабеті. Для виявлення можливих змін у Са2+ регуляції, яка здійснюється мітохондріями в ЗКГ нейронах діабетичних тварин, ми застосували розглянутий вище метод із використанням блокатора мітохондріального кальцієвого захоплення – СССР.

На фоні 10 мкМ СССР у малих ЗКГ нейронах зберігався підвищений рівень залишкового кальцію на 60 сек спаду [Ca2+]i. При діабеті величина R60 склала 33 ± 14 % (n=5) у порівнянні з 10 ± 3 % (n=15) (Р < 0,05) у контролі. У великих ЗКГ нейронах рівень R60 залишався без змін.

При порівнянні кальцієвих відповідей на деполяризацію в контрольних умовах і на фоні 10 мкМ СССР, ми знайшли, що в малих ЗКГ нейронах при діабеті зникає достовірна відмінність в амплітудах даних [Ca2+]i транзиєнтів (рис. 7). У нормі амплітуда кальцієвої відповіді на фоні СССР збільшувалася від 702 ± 62 нМ (n=19) до 1065 ± 105 нМ (n=14) (P<0,05); при діабеті відповідні амплітуди дорівнювали 799 ± 100 нМ (n=7) у контролі і 938 ± 142 нМ на фоні СССР. У великих ЗКГ нейронах дані амплітуди вірогідно відрізнялися як у контролі так і при діабеті (Р < 0,05).

У випадку, якщо СССР додавався на спаді кальцієвого транзиєнта, то за умов діабету, так само як і в нормі, відбувався додатковий викид Са2+, який був запасений мітохондріями під час підвищеної концентрації [Ca2+]і. І у великих і в малих ЗКГ нейронах ми знайшли значне пригноблення цього викиду при діабеті (рис. 8). Так, у великих ЗКГ нейронах амплітуда СССР-індукованого викиду зменшилася від 235 ± 42 % (n=12) до 62 ± 20% (n=10) (P<0,005), а в малих ЗКГ нейронах її значення в нормі становило 134 ± 22% (n=8), а при діабеті знизилося до 68 ± 12% (n=6) (Р < 0,05).

Зміни кальцієвої сигналізації в ЗКГ нейронах за умов карадженинового запалення. Порівняння кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією ЗКГ нейронів великого і малого діаметрів у нормі й при запаленні, показало відсутність достовірних відмінностей їхніх основних характеристик: базального рівня [Ca2+]i, амплітуди й швидкості наростання кальцієвого транзиєнта, часу напівспаду (t0,5), а також рівня залишкового кальцію в цитозолі на 60 сек спаду деполяризаційного транзиєнта (R60).

Для більш глибокого дослідження можливих змін у впливі внутрішньоклітинних кальцієвих депо ЗКГ нейронів на кальцієву сигналізацію при запаленні ми застосували ті ж експериментальні процедури, що використовували при діабеті.

Зміни, зв'язані за участю мітохондрій у кальцієвій сигналізації при запаленні. Для визначення того, як змінюється ефективність функціонування мітохондрій при запаленні, ми порівняли амплітуди деполяризаційних [Ca2+]і транзиєнтів у контрольних умовах і на фоні 10 мкМ СССР. При цьому для всіх типів клітин не спостерігалося змін у співвідношенні амплітуд даних Са2+ відповідей при запаленні в порівнянні з нормою. Однак аплікація 10 мкМ СССР на спаді кальцієвого транзиєнта при запаленні викликала Са2+ викид набагато меншої амплітуди, ніж у контрольних експериментах (рис. 9). Для великих ЗКГ нейронів амплітуда СССР-індукованого кальцієвого викиду при запаленні склала 38 ± 9 % (n=21) у порівнянні з контрольними 71 ± 10 % (n=25), P < 0,05; для малих ЗКГ нейронів відповідно 49 ± 6 % (n=35) при запаленні в порівнянні з 84 ± 15 % (n=22) у контролі, P < 0,05.

Усі перераховані вище експерименти на ЗКГ нейронах мишей за умов карадженинової моделі запалення були повторені на нейронах, узятих із мишей, яким робилася контрольна ін'єкція 0,9 % розчину NaCl того ж об'єму, але без карадженину. Усі без винятку результати в обох типах клітин співпали з тими, котрі були отримані на нейронах здорових тварин.

Обговорення результатів досліджень

Дослідження останніх років довели активну участь мітохондрій у регуляції внутрішньоклітинного кальцію в різних типах клітин у фізіологічних умовах (Toescu et al. 1992; Duchen 1990; Budd & Nicholls 1996). У роботі (Friel & Tsien 1994) була показана роль мітохондрій в уповільненні деполяризаційних [Ca2+]i транзиєнтів у симпатичних нейронах жаби. Аналогічні дослідження були проведені на ЗКГ нейронах мишей. Однак у цих роботах не досліджувалася участь мітохондрій у регуляції цитозольного рівня Са2+ при його викиді з ендоплазматичного ретикулуму, тобто не був досліджений взаємний вплив цих двох органел.

У даній роботі ми проводили дослідження внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації в первинних сенсорних нейронах (ЗКГ нейронах) місячних щурів. Докладний аналіз показав, що досить тривала деполяризація клітини (більш 3 сек) приводила до генерації [Ca2+]i транзиєнта, що мав характерні кінетичні особливості: швидкий ріст до певної величини і наступний спад складної форми. Спад складався зі швидкої й повільної фази, яка мала вигляд плато. Ми показали, що подібні [Ca2+]i транзиєнти виникають і у випадку викиду кальцію з ендоплазматичного ретикулуму при активації ріанодинових рецепторів 20 мМ кофеїну. Однак форма даних сигналів відрізняється від деполяризаційних транзиєнтів. При тій ж самій амплітуді кальцієвої відповіді, на спаді [Ca2+]i було відсутнє плато. Описана форма кальцієвого сигналу, викликаного деполяризацією знайдена в багатьох типах клітин (Friel & Tsien 1994; Wang & Thayer 1996). Форма кофеїн-індукованої відповіді в ЗКГ нейронах збігається загалом із такою у нейронах заднього рогу спинного мозку (Kostyuk et al. 2001). Однак у симпатичних нейронах жаби на спаді кофеїн-індукованої кальцієвої відповіді також спостерігалося плато (Friel & Tsien 1992).

Для дослідження ролі мітохондрій у регуляції кальцієвого сигналу, викликаного деполяризацією, ми використовували блокатор мітохондріального кальцієвого захоплення СССР. На фоні 10 мкМ СССР ми деполяризували клітину і порівнювали з контролем амплітуди [Ca2+]i транзиєнтів і характер зниження рівня кальцію в цитозолі. Для доказу активної участі мітохондрій у формуванні кінетики спаду [Ca2+]i після деполяризації, ми прикладали СССР після піка [Ca2+]i транзиєнта. Дані експерименти потім повторили на фоні блокатора Na+/Ca2+-обмінника ТРР+.

Підсумовування всіх отриманих результатів дозволило сформулювати участь мітохондрій у генерації кальцієвого сигналу, викликаного деполяризацією в ЗКГ нейронах щурів у вигляді наступної схеми: 1) під час росту [Ca2+]i мітохондрії активно поглинають кальцій з цитозолю; 2) після припинення [Ca2+]i росту мітохондрії продовжують акумулювати кальцій, що приводить до швидкого падіння його концентрації в цитозолі до “безпечних” для клітини значень порядку 200-500 нМ; 3) при подальшому зниженні [Ca2+]i співвідношення сил змінюється – процес виводу кальцію через Na+/Ca2+-обмінник починає переважати над процесом кальцієвого захоплення і мітохондрії поступово звільняються від накопиченого кальцію, підтримуючи при цьому якийсь час його концентрацію в цитозолі на підвищеному рівні (плато); 4) до моменту повернення [Ca2+]i до базового рівня мітохондрії практично спустошені і уся система знову готова до генерації Са2+ сигнали.

Блокування мітохондріального кальцієвого захоплення за допомогою СССР у випадку кофеїн-індукованих кальцієвих транзиєнтів виявило трохи інший характер участі мітохондрій у даному процесі. Ми показали, що мітохондрії захоплюють значно менше Са2+ у випадку кофеїн-індукованих відповідей, у порівнянні з деполяризаційними [Ca2+]і сигналами, при цьому їхня дія запізнюється за часом. Це може бути зв'язане з тим, що в цитозолі великих ЗКГ нейронів мітохондрії і кальцієве депо ендоплазматичного ретикулуму просторово віддалені одне від одного. Тому при викиді Са2+ за допомогою активації ріанодинових рецепторів йому доводитися дифундувати на досить велику відстань для досягнення мітохондрій і велика його частина відразу знову захоплюється ендоплазматичним ретикулумом за допомогою SERCA, а також виводитися назовні насосами плазматичної мембрани (рис.10). У випадку деполяризаційних кальцієвих транзиєнтів, кальцій практично відразу й у великих кількостях захоплюється мітохондріями, що може говорити про їхню просторову близькість до кальцієвих каналів плазматичної мембрани (рис. 10). Необхідність такої близькості для значної акумуляції кальцію було показано для окремої мітохондрії в симпатичних нейронах (Pivovarova et al. 1999). Подібне розташування мітохондрій і відповідний вплив на регуляцію кальцію описані в хромафінних клітинах наднирників (Giovannucci et al. 1999) і гонадотропних клітинах (Hehl et al. 1996), однак у клубочкових клітинах наднирників кальцій, що входить через Т-канали плазматичної мембрани виявляється зовсім недосяжним для мітохондрій (Rossier et al. 1996). Описані відмінності у формі різних по своїй природі кальцієвих сигналів і розходження у взаємній участі внутрішньоклітинних органел у цих процесах може дати відповідь на питання, чому кальцієві сигнали різної природи приводять до різних, часом навіть протилежним ефектам у внутрішньоклітинній діяльності.

При вивченні впливу патологій на ефективність роботи внутрішньоклітинних кальцієвих депо були виявлені значні зміни у функціонуванні мітохондрій. При стрептозотоцин-індукованому діабеті, як і у випадку карадженин-індукованого запалення спостерігалося зниження амплітуди СССР-індукованих відповідей на спаді деполяризаційних кальцієвих транзиєнтів в обох типах ЗКГ нейронів. Порівняння амплітуд деполяризаційних транзиєнтів у контролі і на фоні СССР не виявило помітних відмінностей при запаленні, а у великих нейронах і при діабеті, що говорить про те, що ефективність кальцієвого захоплення мітохондріями істотно не змінюється. Отже, при запаленні, а особливо при діабеті ми бачимо значне пригноблення роботи Na+/Ca2+-обмінника. Причиною цього може бути зміна рівня внутрішньоклітинного Na+ (Hothet et al. 1997), що може бути викликано ацидозом. У випадку діабету може розвиватися кетоацидоз, що може приводити до значного закислення цитозолю і до пригнічення роботи Na+/Ca2+-обмінника (Hoyt & Reynolds 1998). Закислення є також однією з характерних рис запалення, що також може впливати на рівень цитозольного Na+, а отже, і на роботу обмінника (Millan 1999). Оскільки участь мітохондрій у постетанічній потенціації й у виділенні нейротрансмітерів було показано в роботах (Melamed-Book & Rahamimoff 1998; Stanton & Schanne 1986), тому зміни при порушенні роботи мітохондрій можуть відігравати істотну роль у виникненні діабетичних нейропатій. Значення пригнічення роботи Na+/Ca2+-обмінника мітохондрій при запаленні практично не вивчено, однак можна припустити, що воно також буде приводити до метаболічних змін у внутрішньоклітинних процесах і можливо впливати на викиди медіатора й секрецію різних речовин, у тому числі простагландинів. Це, у свою чергу, може вплинути на потенціацію як первинних, так і вторинних сенсорних нейронів і пояснювати виникнення болючого синдрому і гіпералгезії (Minami et al. 1997; Ferreira & Lorenzetti 1996).

При розгляді малих ЗКГ нейронів було виявлено, що в діабеті відсутня достовірна різниця в амплітудах деполяризаційних кальцієвих транзиєнтів у контролі і на фоні СССР, що може говорити про пригнічення захоплення кальцію мітохондріями даних нейронів. Це явище може бути обумовлено зниженням активності процесів окислювання глюкози при цукровому діабеті, що веде до зниження рівня протонного градієнта на внутрішній мітохондріальній мембрані і супроводжується зменшенням поглинання Са2+ мітохондріями за допомогою уніпортера (Duchen et al. 1998; Grinblat et al. 1998).

Таким чином, отримані нами результати свідчать про значні зміни участі мітохондрій в кальцієвій сигналізації, зокрема в роботі Na+/Ca2+-обмінника і мітохондріальний уніпортера при діабеті й запаленні в первинних сенсорних нейронах ссавців (рис. 11).

ВИСНОВКИ

1. При дослідженні змін внутрішньоклітинного рівня вільних іонів Са2+ методом флуоресцентної кальційметрії з використанням роз'єднувача протонного градієнта на мембрані мітохондрій (СССР) в ізольованих нейронах заднєкорінцевих гангліїв щурів показана функціонально різна участь мітохондрій у модуляції двох різних типів кальцієвих сигналів.

2. При порівнянні кальцієвих транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією, у цих нейронах у контролі і при стрептозотоцин-індукованому діабеті виявлене достовірне уповільнення виводу Ca2+ із цитозолю в нейронах малого діаметра, на відміну від нейронів великого діаметра. У нейронах як великого, так і малого діаметра контрольних і діабетичних тварин не виявлено достовірних змін у базальному рівні [Ca2+]i, в амплітуді деполяризаційних транзиєнтів, а також у швидкості наростання Ca2+ сигналу.

3. В експериментах з використанням роз'єднувача протонного градієнта СССР у нейронах великого й малого діаметра виявлене значне пригнічення роботи Na+/Ca2+ обмінника мітохондрій при стрептозотоцин-індукованому діабеті. У нейронах малого діаметра виявлене зменшення здатності мітохондрій акумулювати кальцій, а також показане, що уповільнення виводу кальцію з цитозолю зберігається при заблокованих мітохондріях.

4. При порівнянні кальцієвих транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в даних нейронах у контролі і при карадженин-індукованому запаленні, не виявлено достовірних відмінностей у базальному рівні [Ca2+]i, в амплітуді деполяризаційних транзиєнтів, у швидкості наростання Ca2+ сигналу, а також у кінетиці спаду [Ca2+]i.

5. В експериментах з використанням роз'єднувача протонного градієнта СССР у нейронах великого й малого діаметра виявлене достовірне пригнічення роботи Na+/Ca2+ обмінника мітохондрій при карадженин-індукованому запаленні без зміни швидкості захоплення кальцію мітохондріями.

6. Отримані результати показують провідну роль взаємодії між кальційрегулюючими структурами (мітохондріями й ендоплазматичним ретикулумом) у внутрішньоклітинній сигналізації в первинних сенсорних нейронах, порушення якого є однією з причин змін передачі сенсорних сигналів при запальному болючому синдромі і діабетичній нейропатії.

Перелік статей, опублікованих за матеріалами дисертації:

1. Kostyuk P.G., Svichar N.V., Voitenko N.V., Shishkin V.O. and Kostyuk E.P. (1998) Role of mitochondria in Calcium Signalling in Mammalian Sensory Neurons // Neurophysiology, 30 (4/5), 191-193.

2. Nataliya Svichar, Vyacheslav Shishkin and Platon Kostyuk (1999) Mitochondrial participation in the modulation of calcium transients in DRG neurons. // NeuroReport, 10 (6), 1-5.

3. Н.В.Войтенко, О.П.Костюк, І.А.Кругліков, Н.В.Свічар, В.О.Шишкін (1999) Зміни кальцієвої сигналізації в ноцицептивних нейронах ссавців за умов цукрового діабету. // Фізілогічний журнал, 45(4), 48-54.

4. E.Kostyuk, N.Svichar, V.Shishkin and P.Kostyuk (1999) Role of mitochondrial dysfunction in calcium signalling alterations in dorsal root ganglion neurons of mice with experimentally-induced diabetes // Neuroscience, 90 (2), 535-541.

5. Kruglikov, I.A., Shutov, L.P., Shishkin, V.O., Kostyuk, E.P., Potapenko, E.S., and Voitenko, N.V. (2001) Intracellular mechanisms of changes in the functioning of rat sensory neurones with streptozotocin-induced diabetes mellitus // Phyziol Journ (Kiev), 47 (5), 18-25.

6. E. Kostyuk, N. Voitenko, I. Kruglikov, A. Shmigol, V. Shishkin, A. Efimov, P. Kostyuk (2001) Diabetes-induced changes in calcium homeostasis and the effects of calcium channel blockers in rat and mice nociceptive neurons // Diabetologia, 44 (10), 1302-1309.

Перелік тез доповідей, опублікованих за матеріалами дисертації:

1. Shishkin V., Kostyuk P., Klishin A., Voitenko N. (2000) Changes in calcium homeostasis of murine primary sensory neurons under inflammation. 44 th Annual Meeting of Biophysical Society. New Orleans, LU, USA. Biophysical Journal, 78 (1), p190A.

2. Vyacheslav Shishkin, Platon Kostyuk, Nana Voitenko (2000) Intracellular calcium stores in primary sensory neurons under inflammation // European Biophysics Journal 29 (4-5), p.353.

3. О.П.Костюк, В.О.Шишкін, Н.В.Войтенко (2001) Вплив ніфедипіну на кальцієвий гомеостаз у нейронах при експериментальному цукровому діабеті // Ендокринологія 2001, Т.6, додаток, с.153.

АНОТАЦІЇ

Шишкін В.О. Взаємодія кальцій-регулюючих структур в первинних сенсорних нейронах в нормі та при різних патологічних станах. – Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидату біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України. Київ-2002.

Дисертація присвячена дослідженню внутрішньоклітинної кальцієвій сигналізації в ЗКГ нейронах в нормі та в паталогічних станах, таких як стрептозотоцин-індукований діабет та карадженин-індуковане запалення. Робота виконана на ізольованих нейронах ЗКГ дорослих щурів та мишей. Результати отримані за допомогою сучасного методу флуоресцентного вимірювання цитозольної концентрації кальцію за допомогою барвника indo-i. З використанням блокатору мітохондріального Са2+ захвату СССР та кальцієвого викиду ТРР+ була продемонстрована участь мітохондрій у модулюванні деполяризаційної кальцієвої відповіді. Було показано, що мітохондрії приймають участь у регулюванні кальцієвих викидів з ендоплазматичного ретикулуму зі значною затримкою та більш повільніше. Виявлено достовірні зміни в Са2+ сигналізації за умов діабету та запалення. Було винайдено, що значно зменшується викид кальцію з мітохондрій. В малих ЗКГ нейронах було показано зменшення акумуляції Са2+ в мітохондрії за умов діабету, а також можливе зменшення активності АТФаз. Знайдені зміни активності Са2+-регулюючих структур за умов діабету та запалення можуть бути головною причиною відхилень нервової чутливості та появи больових синдромів.

Ключові слова: