ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ

УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК

ШЕРЕПІТКО ВАЛЕНТИН ВАСИЛЬОВИЧ

УДК 633.34:631.523.4

ГЕНЕТИЧНІ ОСНОВИ АДАПТИВНОЇ СЕЛЕКЦІЇ СОЇ

Спеціальність: 03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті агроекології та біотехнології УААН, м.Київ

Науковий консультант:, Созінов Олексій Олексійович

академік НАН України та УААН,

доктор сільськогосподарських наук, професор

(Інститут агроекології та біотехнології УААН)

Офіційні опоненти: Чекалін Микола Михайлович

доктор біологічних наук, професор

кафедри екології і ботаніки

(Полтавська державна аграрна академія)

Васильківський Станіслав Петрович,

доктор сільськогосподарських наук, професор,

декан агрономічного факультету

(Білоцерківський державний аграрний університет)

Перетятко Віктор Гаврилович

доктор сільськогосподарських наук, професор,

головний науковий співробітник лабораторії

селекції цукрових буряків

(Інститут цукрових буряків УААН)

Провідна установа: Уманська державна аграрна академія Мінагрополітики України

Захист відбудеться 21.05.2002 р. о14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 Інституту агроекології та біотехнології УААН за адресою: 03143, м.Київ-143, вул. Метрологічна, 12

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології

та біотехнології УААН

Автореферат розісланий 20.04.2002 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат хімічних наук /Г.В.Заякіна/

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Серед бобових культур – соя завдяки дуже різноманітному використанню займає виняткове місце. Основною її особливістю є хімічний склад зерна: поряд з високим вмістом білка – від 30 до 45% (залежно від сорту та умов вирощування) соя містить від 16,5 до 24% жиру. Внаслідок такого сприятливого поєднання поживних речовин соя широко застосовується як харчова, кормова і технічна рослина. Крім того, ця культура є одним з кращих попередників у сівозмінах, тому що її рослини в симбіозі з бульбочковими бактеріями фіксують атмосферний азот і збагачують ним ґрунт.

Головною цінністю сої є білок, який за вмістом багатьох амінокислот, в тому числі незамінних, максимально наближений до білка тваринного походження і тому в харчуванні людей успішно замінює його. Широкого використання набуло соєве зерно як сировина для олійної промисловості. Соєва олія використовується в харчовій, миловарній, лакофарбовій та інших галузях промисловості.

В зв'язку з вищесказаним середньорічне виробництво зерна сої в світі збільшується і тільки за останні 10 років зросло з 108,4 до 157,7 млн тон. Серед олійних культур валове виробництво сої в світі стоїть на першому місці і становить 51,8% у порівнянні з 8,2% валового виробництва соняшнику (В.Г.Михайлов, 2000). З іншого боку соя відзначається високою чутливістю до факторів навколишнього середовища, в тому числі температурного режиму та умов вологозабезпечення, що навіть в традиційно соєсіючих країнах за несприятливих погодних умов негативно позначається на її урожайності (H.K. Pawer et al., 1997; В.І. Січкар та ін., 2000).

Актуальність теми. Необхідність використання сої в Україні для виробництва перш за все високоякісних харчових продуктів, а також кормових добавок не викликає сумніву. Однак недостатня адаптивна пластичність використовуваного генетичного матеріалу на практиці негативно позначається на зерновій продуктивності культури при нестабільних погодних умовах, якими характеризується більшість регіонів України.

Виробничі сорти часто відзначаються порівняно високою чутливістю рослин до знижених температур як на ранніх, так і на подальших етапах росту і розвитку, що впливає на їх здатність формувати повноцінний урожай у несприятливих за температурним фактором умовах. До того ж у більшості сортів істотно знижується зернова продуктивність на фоні дії посухи. Умови зрошення також не завжди дозволяють реалізувати потенціал зернової продуктивності. Крім того, реальний збір зерна, як і його якість, нерідко знижуються з причини ураження посівів хворобами. Все це викликає різкі коливання урожайності сої по роках та залежно від місця вирощування і є однією з основних причин того, що протягом вже тривалого періоду в нашій державі не відбулося істотного збільшення частки цієї цінної культури в структурі посівних площ.

Одним із шляхів розв'язання проблеми розширення посівних площ сої є створення і розповсюдження сортів, адаптованих до конкретних умов вирощування. Про важливість селекційних завдань на підвищення адаптивного потенціалу виробничих сортів наголошувалося на "Нараді з координації питань селекції та насінництва зернобобових культур" (20-21 червня 2000 р. на базі Інституту рослинництва ім. В.Я.Юр'єва УААН), на "Третій всеукраїнській конференції по сої (3 – 4 серпня 2000 року на базі Інституту кормів УААН), на Міжнародній науковій конференції "Адаптивна селекція культурних рослин" (20-21 листопада 2001 року на базі Інституту овочівництва та баштанництва УААН). В зв'язку з цим особливої актуальності набувають пошук підходів та розробка селекційних методів створення нових високопродуктивних холодо-, посухо-, жаро- та патогеностійких сортів сої. Поєднання в одному генотипі ознак екологічної стійкості та зернової продуктивності включає проведення добору на продуктивність з паралельним аналізом ознак стійкості до знижених та підвищених температур, водного дефіциту, підвищеного патогенного навантаження тощо. При цьому висока зернова продуктивність рослин за однієї сукупності факторів навколишнього середовища у більшості випадків не дає можливості для прогнозу їх продуктивності в інших умовах. До того ж протягом онтогенезу одні і ті ж умови середовища мають різний вплив на рослину, тобто взаємодія "організм – середовище" – стадіоспецифічна. Тому успіх селекції сої на поєднання продуктивності та екологічної стійкості в значній мірі визначається рівнем дослідження особливості генетичного контролю різних ознак та характеру їх прояву при змінних умовах середовища, а також наявністю морфологічних, фізіолого-біохімічних та молекулярних критеріїв ідентифікації генотипного різноманіття, включно на стадіях спорофіту та гаметофіту. Важливим є вивчення можливостей розширення у створюваних сортів адаптивної здатності шляхом залучення в селекційний процес генотипів напівкультурних та диких форм, які спроможні адекватно реагувати на зміну факторів навколишнього середовища.

Мета та завдання досліджень. Метою досліджень було обґрунтувати генетичні основи синтезу високопродуктивних сортів сої з коадаптованим асоціюванням генів холодо-, посухо-, жаро-, патогеностійкості, пластичності та стабільності шляхом удосконалення та розробки нових методів ідентифікації генотипів за морфофізіологічними та молекулярними критеріями на рівні спорофіту і гаметофіту.

У роботі було поставлено наступні задачі:

- дослідити характер успадковування окремих цінних кількісних ознак рослини на прикладі гібридних популяцій, отриманих від схрещування компонентів культурної (Glycine max) та дикої уссурійської (Glycine soja) сої;

- вивчити вплив особливостей генотипу на фенотипний прояв холодостійкості рослин сої на різних стадіях онтогенезу та провести пошук шляхів екзогенного впливу на спектр доступної добору генотипної мінливості за цією ознакою;

- провести пошук нетрадиційних методичних підходів оцінки та добору генотипів in vivo та in vitro, для чого з'ясувати роль окремих ферментних систем в процесі адаптивних реакцій рослинного організму на дію несприятливих температур, проаналізувати прояв холодо-, жаро- та патогеностійкості на рівні спорофіту і гаметофіту, виявити можливості ідентифікації генотипів на основі маркерів поліморфізму ДНК;

- удосконалити методи прямої оцінки та добору генотипів за ознаками холодо-, посухо-, жаро- і патогеностійкості та відновлювальної здатності;

- вивчити у цієї культури генотипні відмінності за проявом пластичності та стабільності кількісних, в тому числі господарсько-цінних, морфологічних ознак;

- на основі з'ясованих в дослідженнях закономірностей та особливостей генетичного контролю цінних морфобіологічних ознак, удосконаленої методології та методів добору створити значний генофонд перспективних з позицій адаптивної селекції генотипів, провести його вивчення в різних екологічних умовах та перевірку у всіх ланках селекційного процесу і вивести еколого-адаптовані сорти.

Об'єкт дослідження: закономірності прояву і генетичного контролю ознак продуктивності і стійкості до несприятливих абіотичних і біотичних факторів та механізми їх пластичності і гомеостатичності, молекулярні та морфофізіологічні критерії генотипної ідентифікації на рівні спорофіту і гаметофіту як складові біотехнологічних підходів синтезу еколого-адаптованих сортів сої.

Предмет дослідження: значний генофонд культурної (Glycine max) та дикої уссурійської (Glycine soja) сої як залучений із світової колекції, так і отриманий шляхом цілеспрямованої гібридизації (форми, сорти, лінії, гібридні G.max Х G.max і G.max Х G.soja популяції), нові методичні підходи ідентифікації генотипного різноманіття, а також сім'ї, лінії, селекційні номери і нові сорти, виділені на різних етапах адаптивної селекції.

Методи дослідження: генотипні відмінності за проявом різних типів ознак у сої аналізували за допомогою загально прийнятих генетичних, фізіологічних, біохімічних, молекулярних, селекційних та статистичних методик. Розробка нових методів стала предметом досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі гібридологічного аналізу (G.max Х G.soja) вперше розкрито особливості генетичного контролю у сої таких цінних кількісних ознак рослини, як маса бобу, маса бобів з продуктивного вузла та маса насінин у бобі. Встановлено, що фенотипні відмінності в прояві кожної з цих ознак у досліджуваних генотипів культурної (G.max) та дикої уссурійської (G.soja) сої зумовлюються ефектом чотирьох або пяти незалежно успадковуваних головних генів (олігогенів). Алелі, що визначають дикий фенотип цих ознак, домінують. Виявлено, що у диких генотипів порівняно високий ступінь стабільності зернової продуктивності рослин супроводжується зростанням варіабельності (пластичності) таких її компонентів, як число продуктивних вузлів, число бобів та число насінин на рослині. Отримано дані, які свідчать про відносну незалежність у цієї культури генотипних факторів, що контролюють холодостійкість на стадіях проростання насіння, росту і розвитку сходів та формування бобів.

Розроблено нові методичні підходи ідентифікації генотипного різноманіття сої за холодо-, жаро-, посухо-, фузаріозостійкістю. Отримано дані, які дозволяють розцінювати інгібіторно-протеїназну систему як важливу складову регуляції процесів проростання насінин сої. Вперше показана можливість добору холодостійких генотипів за динамікою активності інгібіторів трипсину в органах зародка насінини. Такий методичний підхід добору холодостійких генотипів захищений авторським свідоцтвом (А.с. СССР №1593590 А1; 22.05.1990). З'ясовано, що електрофоретичні спектри пероксидази у цієї культури включають функціонально нерівнозначні з позицій жаростійкості лабільні та стабільні зони. Встановлено, що швидкість та направленість змін активності і термостабільності пероксидази та її ізоформ дозволяють виявляти генотипні відмінності та проводити добір у сої за стійкістю до підвищених температур. Виявлена можливість проведення гаметофітного добору у сої за стійкістю до знижених та підвищених температур, а також фузаріозостійкістю. In vitro показана можливість проведення добору у цієї культури за відновлювальною здатністю рослин. Встановлено, що ідентифікація генотипного різноманіття сої на основі маркерів поліморфізму ДНК розкриває нові перспективи цілеспрямованого добору вихідного матеріалу для адаптивної селекції, включно серед культурної (G. max) та дикої (G. soja) сої.

Виявлено нові геноносії різних типів стійкості та створено 8 нових сортів сої, з яких 3 сорти занесено до реєстру сортів України.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Отримані результати стосовно загальних та специфічних змін інгібіторно-протеїназної та ізопероксидазної систем доповнюють наші знання про роль цих систем в адаптивній здатності рослинного організму. Розкриті закономірності генетичного контролю цінних ознак рослини дозволяють чіткіше планувати селекційну роботу на поєднання генотипних факторів та досягнення бажаного їх фенотипного прояву. Розроблені методичні підходи добору генотипів на основі пероксидазного та інгібіторно-протеїназного тестів дозволять за лабораторних умов проводити у порівняно великих обсягах оцінку експериментального матеріалу за термостійкістю. Прискорюють селекційний процес і методи гаметофітної оцінки за холодо-, жаро- та фузаріозостійкістю. Напрацювання з молекулярної генетики (зокрема використання ISSR-маркерів) відкривають перспективи направленого поповнення адаптивного потенціалу культурної сої за рахунок філогенетично віддалених форм. Встановлено, що в першому поколінні певних міжвидових гібридів сої спостерігався досить значний ефект гетерозису за комплексом цінних ознак, що свідчить про перспективність гетерозисної селекції цієї культури. Удосконалені методичні підходи прямої оцінки та добору за холодо-, посухо-, жаростійкістю підвищують результативність селекційної роботи. Виявлено геноносії холодо-, посухо-, жаро- і патогеностійкості, а також продуктивності, скоростиглості, високорослості, стійкості до вилягання. Створено широкий спектр рекомбінантних за комплексом цінних ознак генотипів, адаптованих до грунтово-кліматичних умов України. Ефективно здійснена поетапна оцінка отриманого матеріалу в селекційних ланках з допомогою удосконалених методів в різних екологічних умовах. Внаслідок цієї роботи створено ряд нових еколого-адаптованих сортів сої три з яких (Подільська 1, Подолянка і Подільська 416) занесені до державного реєстру і запроваджуються у виробництво в господарствах Хмельницької, Вінницької, Миколаївської, Київської, Дніпропетровської, Черкаської та інших областей. Сорт Подільська 2000 проходить державне сортовипробовування, інші доопрацьовуються і використовуються в селекційному процесі.

Особистий внесок автора. Нові теоретичні і експериментальні ідеї, викладені в дисертації, в тому числі створення сортів сої Подільська 1, Подолянка, Подільська 416, Ватра, Кам'янчанка і Подільська 2000, а також різноманітний експериментальний матеріал для генетичних досліджень і селекції, належать автору. Постановка проблеми, розробка програм досліджень, одержання й аналіз експериментальних даних виконувалися автором особисто або безпосередньо під його керівництвом. Крім того, дисертантом особисто здійснено інформаційний пошук та оцінку даних літератури, проведено інтерпретацію та узагальнення одержаних результатів, а також формулювання висновків і рекомендацій. Колекційні сортозразки сої були люб'язно надані автору для досліджень співробітниками Всеросійського інституту рослинництва ім. М.І.Вавілова та Всеросійського НДІ сої, яким автор приносить свою щиру вдячність. Автору надавалася допомога у проведенні експериментів, пов'язаних з аналізом поліморфізму ДНК сої, в Інституті агроекології та біотехнології УААН. Ідентифікацію видів та різновидностей фузаріозу проведено в лабораторії імуногенетики Інституту екологічної генетики АН Молдови канд. біол. наук Ж.Г.Простаковою. Для характеристики нових сортів сої, крім власних досліджень, здобувачем використано дані Державної комісії України по випробовуванню та охороні сортів рослин.

Зв'язок роботи з науковими планами та темами. Робота виконувалася згідно з тематичним планом наукових досліджень Інституту агроекології та біотехнології УААН: "Розробити методи та технології у селекції та насінництві на основі використання молекулярно-генетичних маркерів, хромосомної та генетичної інженерії” (№ 0193U036999, 1991 – 1995 рр.), підпрограма "Вивчення господарсько-цінних ознак та адаптивних реакцій рослин сої при змінних умовах середовища; створення сортів цієї культури, пристосованих до умов вирощування на Поділлі" (№ 0193 U036863); "Розробка теоретичних основ і методології використання біотехнології в збереженні генофондів, адаптивній селекції, насінництві рослин та агроекології” (№ 0196U012975, 1996 – 2000 рр.), підпрограма "Генетична природа ознак продуктивності і стійкості сої та створення еколого-адаптованих сортів цієї культури" (№ 0196 U012975-04). Дослідження проводили у відповідності з комплексними державними науково-технічними програмами: на 1991 – 1995 рр. "Продовольство 95" та на 1996 – 2000 рр. "Зернові і олійні культури".

Апробація результатів досліджень. Результати досліджень були представлені і доповідалися на конференціях: "Екологічна генетика рослин і тварин" (Кишинів, 1987), "Методи добору за комплексом ознак в селекції рослин" (Сімферополь,1989), "Онтогенетика вищих рослин" (Кишинів, 1989), “Науково-виробнича конференція по вирощуванню, переробці та використанню сої" (Вінниця, 1990), "Соя: генетика, селекція, технологія вирощування та використання на харчові і кормові цілі" (Одеса, 1993), "Сучасні проблеми виробництва і використання кормового зерна і сої" (Вінниця, 1993), "Молекулярно-генетичні маркери і селекція рослин" (Київ, 1994), Науково-методична конференція професорсько-викладацького складу Кам'янець-Подільського СГІ (Кам'янець-Подільський, 1994), "Корми і кормовий білок" (Вінниця, 1994), "Електромагнітні випромінювання в біології та практичне використання їх позитивних ефектів" (Біла Церква, 1996), Міжнародна конференція по агробіотехнології рослин і тварин" (Київ, 1997), "Виробництво, переробка і використання сої на кормові та харчові цілі" (Вінниця, 2000), "Адаптивна селекція культурних рослин" (Мерефа, 2001).

Публікації результатів досліджень. Основні положення дисертації висвітлені у 52 наукових працях, з яких 1 монографія, 17 статей у фахових виданнях та 4 авторських свідоцтва.

Обсяг та структура роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, п'яти розділів отриманих власних результатів досліджень і їхніх обговорень, висновків, рекомендацій для практичної селекції і виробництва, списку цитованої літератури. Дисертаційна робота включає 97 таблиць, 31 рисунків, 5 додатків. Перелік цитованої літератури включає 428 джерел. Дисертаційну роботу викладено на 328 сторінках друкованого тексту.

Основний зміст

Умови, вихідний матеріал та методика досліджень

Дисертаційна робота виконана в Інституті агроекології та біотехнології Української академії аграрних наук. Дослідження проводилися на Україні в умовах Подільського краю, а також в умовах центральної та південної екозон Молдови.

Як в умовах Молдови, так і в умовах Подільського краю на Україні основний строк сівби насіння різних генотипів сої приходився на кінець квітня – початок травня. Крім того, використовували ранній строк сівби (кінець березня – початок квітня) в ролі провокаційного фону для виявлення у цієї культури генотипних відмінностей за холодо-, заморозко- та фузаріозостійкістю. З метою виявлення генотипних відмінностей за посухостійкістю сівбу проводили в умовах суходолу у південній екозоні Молдови, де майже щорічно мають місце літні посухи тривалістю 30-50 днів, під час яких відсутність опадів поєднується з високими денними та нічними температурами, низькою відносною вологістю повітря, а також суховіями.

Вихідним матеріалом для досліджень виступали різні генотипи культурної (Glycine max L. Merrill) та дикої уссурійської (Glycine soja Sieb.and Zucc.) сої з диплоїдним набором хромосом (2n=40). Колекційні сорти, лінії та селекційні номери (всього 523 генотипи) отримали з ВІРа (Росія). Генотипи колекційної сої, що вивчалися, були інтродуковані з різних держав світу (США, Канада, Японія, Корея, Польща, Румунія, Молдова, Білорусія та ін.). Форми дикої уссурійської сої (ДУ-5, ДУ-6, ДУ-9, ДУ-9А, ДУ-10, ДУ-11, ДУ-16, ДУ-19, ДУ-Б) отримали із Всеросійського НДІ сої. Окремі колекційні генотипи (Добруджанка 18, Добруджанка 37, Добруджанка V, Венгерка) класифікували як напівкультурну сою – Glycine gracilis Skv. and Kors.

При закладанні польових дослідів використовували загальноприйнятий спосіб сівби сої – широкорядний з шириною міжряддя 45 см. Насіння заробляли в ґрунт на глибину 2 – 4 см (залежно від погодних умов), а відстань між насінинами в рядку в середньому складала 3 см. Фенологічні спостереження, оцінки та біометричні обліки проводили за загальноприйнятими методичними вимогами.

Протягом 1986 – 2000 рр. щорічно вивчали від 3000 до 10000 індивідуальних і масових доборів, а також 100 – 250 селекційних номерів, отриманих на основі міжсортових (G.max X G.max) гібридних популяцій, що охоплювали 80 – 150 комбінацій схрещування. У гібридному розсаднику протягом 1991-2000 рр. створювали та вивчали міжвидові (G.max X G.soja) гібридні популяції, що включали, як прямі, так і зворотні (беккросні) комбінації схрещування.

Насіння батьківських форм та відповідних їм гібридів F1 – F4 висівали вручну, рядками довжиною 1 - 3 м при ширині міжряддя 45 см (комбінації схрещування G.max X G.max) або 90 см (G.max X G.soja). Кожний ярус ділянок обсівали з усіх боків захисним рядком одного із колекційних або виробничих сортів з відомим проявом морфологічних ознак рослини.

Отримували гібриди F1 шляхом штучної гібридизації. Схрещування проводили у зимово-весняний період в тепличних умовах, а літом – на дослідному полі. Ідентифікували гібридні рослини за фенотипним проявом одного із генів W1 (фіолетовий колір пелюсток квітки) чи Т (рудий колір опушення рослини). Слід відзначити, що після штучних схрещувань у сої як типового самозапилювача спостерігалось значне опадання квіток і бобів, внаслідок чого отримання гібридів F1 було кількісно обмеженим.

Генетичний контроль кількісних ознак у рослин сої вивчали на прикладі міжвидових (G.max X G.soja) гібридних популяцій F1 – F3. По материнській лінії виступали білоквіткові культурні сорти Київська 451 і Чернівецька 8 (G.max), а по чоловічій – фіолетовоквіткові форми дикої уссурійської сої ДУ-9, ДУ-16 і ДУ-19 (G.soja).

Гібридологічний аналіз кількісних ознак проводили методами класичної генетики. Виходили з того, що полігенність генетичних систем кількісних ознак не суперечить можливості аналізу їх класичними (менделівськими) методами генетики (R.Fisher, 1918; L.Powers, 1951; А.С.Серебровський, 1970; Е.Х.Гінзбург, З.С.Нікоро, 1982 та ін.). Використовували розподіл фактичних значень кількісних ознак у батьківських форм для виділення відповідних їм генотипів з гібридних популяцій F2 і F3. Побудову робочої гіпотези про генетичний контроль досліджуваної ознаки проводили таким чином: якщо на долю рецесивної батьківської форми приходилася 1/4, 1/16, 1/64 і т.д. частка популяції F2, то це відповідало відмінності батьківських форм за 1, 2, 3 і т.д. генами (олігогенами). У такий спосіб формулювали робочу гіпотезу за даними розщеплення у F3. Відповідність фактичних і теоретичних чисельностей у F2 і F3 перевіряли на основі критерію c2.

Аналізували прояв досліджуваних ознак як, зокрема, в кожній комбінації схрещування (Київська 451 Х ДУ-9, Київська 451 Х ДУ-16, Київська 451 Х ДУ-19 і Чернівецька 8 Х ДУ-9), так і на рівні гібридної популяції G.max X G.soja, що поєднувала ці комбінації схрещування. Зібрані за комбінаціями схрещування насінини з рослин F1 повністю використовувалися для отримання рослин F2. Гібридну популяцію F3 формували, випадково відбираючи по одній насінині з кожної рослини F2. Після повного дозрівання рослин у них проводили біометрію кількісних ознак.

В комбінаціях схрещування, що не підлягали гібридологічному аналізу, застосовували відомий метод добору однієї насінини для потомства. Суть методу зводиться до того, що в другому–четвертому поколіннях з кожної рослини відбирається по одній насінині, а з п'ятого покоління відбираються кращі сім'ї. Дослідження в ланках селекційного процесу проводили згідно з загально-прийнятими методиками.

Генетичний поліморфізм серед генотипного різноманіття сої вивчали методом ISSR маркерів (В.І.Глазко та ін., 1999). ДНК виділяли з чотири денних пророслих насінин (F.M.Asubel et al., 1996). Полімеразну ланцюгову реакцію проводили, використовуючи ампліфікатор "Master Cycler Gradient" (Eppendorf).

Електрофорез білків проводили в пластинах 12,5 або 18% поліакріламідного гелю за методикою Лемлі (з додецилсульфатом натрію та меркаптоетанолом), модифікованою нами стосовно сої. Білки екстрагували із сухих сім'ядолей 0,05 М трис-гліцинованим буфером рН 6,8.

Активність інгібіторів трипсину та хімотрипсину визначали спектрофотометричним методом (Л.С.Павлова, В.В.Саянова, 1979). Жаростійкість різних генотипів сої вивчали за ізоферментними спектрами пероксидази. Електрофорез листкових екстрактів проводили в ПААГ за методикою Девіса. Сканування ізопероксидазних електрофоретичних спектрів виконували у автоматизованій системі АРМ-1 "Денситометр" (І.А.Прейгель, Т.Я.Кібенко, 1984). Крім того, активність окремих ізопероксидаз визначали за методикою Е.Н.Liu (1973).

In vitro як експланти використовували сім'ядольний та примордіальний вузли, котрі поміщали на агарове поживне середовище (В5), з додаванням регуляторів росту (6-БАП, НУК), дотримуючись відповідних методичних вимог (Ф.Л.Калінін та ін., 1980). Життєздатність пилкових зерен визначали методом пророщування їх на штучному поживному середовищі, вміст якого включав 20% цукрози та 0,006% борної кислоти (В.О.Лях, 1985).

Експерименти по вивченню генотипних відмінностей за холодостійкістю у період проростання насіння проводили в камерах штучного клімату (TBV-1000, TBV-2000) та холодних вегетаційних кімнатах. При знижених (12, 7, 6, 5, 3оС) та оптимальній (23оС) середньодобових температурах насіння пророщували в чашках Петрі (по 30 шт. в кожній) згідно з методичними вимогами (А.П.Лаханов, 1988). Холодостійкість генотипного різноманіття сої у період сходів та на репродуктивних стадіях розвитку вивчали в клімокамерах KTLK-1250, KTLK-20000 та ВКШ, де моделювали відповідні холодні та оптимальні температурні режими, а інтенсивність освітлення складала 25000 лк. при тривалості світлового дня 14 год. У період сходів холодними температурними умовами були 10/8, 12/8 та 13/8оС, а на репродуктивних стадіях розвитку – 14/14 та 17/12оС (в чисельнику приводиться денна, а в знаменнику – нічна температури). Рослини вирощували у вегетаційних посудинах методом рулонної або ґрунтової культури. За контрольованих умов вивчали генотипні відмінності у сої за посухо- та жаростійкістю, для чого моделювали перехід від оптимальних до стресових умов за схемою: поєднання дефіциту вологи в ґрунті (70 – 75% НВ ® 30 – 40% НВ) та повітрі (65 – 70% ® 35 – 40%) з високою температурою повітря (25/20оС ® 40/30оС, день/ніч). Після цього умови доводили знову до оптимуму для оцінки відновлювальної здатності рослин.

У досліджуваних генотипів сої визначали вміст білка (методом Кельдаля) та жиру (за Рушковським). Оцінку ураження рослин сої хворобами проводили згідно з відповідними методичними рекомендаціями: фузаріозом (Ж.Г.Простакова та ін., 1986), бактеріозом (Б.О.Терещенко, А.Т.Фартушняк, 1994), пероноспорозом та вірусною мозаїкою (В.В.Рожкован, 1994).

Для здійснення математико-статистичного аналізу відповідних баз експериментальних даних використовували пакет програм БІОСТАТ, розроблений в Інституті екологічної генетики АН Молдови (А.Б.Король, І.А.Прейгель, 1990). При розробці програмного забезпечення БІОСТАТ врахована специфіка генетико-селекційних досліджень. Алгоритми цього програмного забезпечення основані на стандартних методах статистичного аналізу (Г.Ф.Лакін, 1980; Б.А.Доспєхов, 1985, та ін.).

Автор висловлює глибоку подяку своїм вчителям, академікам – О.О.Созінову і О.О.Жученко та доктору с.-г. наук Н.М.Балашовій. Щиру вдячність автор висловлює науковим працівникам Інституту екологічної генетики АН Молдови, докторам наук – А.Г.Жакоте, П.К.Кінті, В.М.Лисікову, А.М.Кравченко, В.В.Бужоряну, А.Б.Королю, кандидатам наук – Т.М.Балашову, Н.Г.Бардієр, Л.С.Павловій, О.Б.Будаку Ж.Г.Простаковій, Г.І.Суружіу, Л.В.Голишкіній, А.І.Бронштейн, І.Д.Коцофану і Г.А.Лупашку та науковим працівникам Інституту агроекології і біотехнології УААН, доктору с.-г. наук В.І.Глазко, кандидатам біол. наук Т.Т.Глазко і С.П.Крітенко за співпрацю й допомогу.

Особливості генетичного контролю

морфобіологічних ознак, що підлягали дослідженню

В міру ускладнення селекційних завдань зростають вимоги до повноти інформації в області генетики ознак продуктивності та стійкості рослин. Розкриття характеру успадковування різних типів ознак сприяє цілеспрямованому використанню генотипної мінливості в селекційному процесі.

Відсутність відмінностей за числом хромосом у культурної (G. max) та дикої уссурійської (G. soja) сої при наявності високого ступеня гомології між гомеологічними хромосомами (М.І.Корсаков, 1973; Т.Hymovitz, 1979; C.A. Moyekens et al., 1995) дозволяє шляхом штучних схрещувань без особливих ускладнень отримувати міжвидові гібриди, потомство яких відзначається широким фенотипним різноманіттям. Слід відзначити, що міжвидові гібридні популяції (G.max X G.soja) виступають більш вдалим об'єктом в порівнянні з внутрішньовидовими з точки зору можливості розподілу гібридного потомства за кількісними ознаками на фенотипні класи за подібністю (чи неподібністю) до батьківських форм.

Вивчаючи на прикладі міжвидових гібридних популяцій F1–F3 та їх батьківських форм характер генотипного прояву таких кількісних ознак рослини, як маса бобу, маса насінини, маса насінин в бобі, маса бобів з продуктивного вузла (в середньому з рослини), ми намагалися визначити число головних генотипних факторів, що зумовлюють фенотипні відмінності за кожною з ознак у батьківських форм.

Виявлено, що середня вираженість досліджуваних ознак у гібридів F1 в кожній з аналізованих комбінацій схрещування мала проміжний характер прояву по відношенню до батьківських форм. Методом гістограм проведено розподіл гібридних рослин F2 та F3 за фактичними значеннями кожної з ознак на три фенотипних класи, а саме: подібні до культурного компоненту схрещування (Р1), подібні до дикого компоненту схрещування (Р2) і проміжний клас (значення ознаки менші ніж у Р1, і більші, ніж у Р2). Зокрема, відносна частота рослин F2, подібних в значеннях маси бобу до дикого компоненту, в комбінації схрещування Київська 451 Х ДУ-19 складала 7,33%, а в комбінації Чернівецька 8 Х ДУ-9 – 30,24 %. На долю гібридних рослин з проміжним фенотипом приходилося від 69,42 % (Чернівецька 8 Х ДУ-9) до 91,89 % (Київська 451 Х ДУ-19).

Аналізом розподілу рослин F2 за кольором пелюсток квітки у кожній комбінації схрещування зокрема та разом на рівні гібридної популяції G.max Х G.soja виявлено погодження фактичних і теоретичних частот, що відповідали моногенному характеру розщеплення (c2факт. < c205).

В результаті побудови кривих розподілу рослин F2 і F3 на рівні гібридних популяцій G.max Х G.soja за фактичними значеннями, наприклад, маси бобу виявлено зростання в F3 по відношенню до F2 частоти рослин, подібних в значеннях ознаки до дикої батьківської форми (G.soja) і водночас зменшення частоти рослин, що відносилися до проміжного фенотипного класу (рис.1). Крім того, відмічено появу гібридних рослин, подібних в значеннях маси бобу до культурної батьківської форми, з частотою 0,32% в F2 (4 рослини із 1271) та з частотою 3,81% в F3 (12 рослин із 315), що послужило основою для прийняття робочої гіпотези: відмінність за даною ознакою у батьківських форм зумовлюється невеликим числом головних генетичних факторів (олігогенів) з домінантним ефектом алелей, що визначають дикий фенотип ознаки. Подібним чином було прийнято робочі гіпотези стосовно генетичного контролю таких досліджуваних ознак, як маса бобів з продуктивного вузла та маса насінин в бобі. Водночас показано низьку інформативність фактичних значень маси насінини для прийняття відповідної робочої гіпотези.

Рис.1. Характер розподілу рослин батьківських форм та гібридів F2 (А) і F3 (Б): по вертикалі – відносна частота, %; по горизонталі – маса бобу в середньому з рослини, г; 1–G.max (Р1); 2–G.soja (Р2); 3–гібрид (Р1 Х Р2)

Перевірку робочих гіпотез здійснювали шляхом співставлення в F2 та F3 фактичних і теоретичних чисельностей між двома групами рослин. Перша – рослини культурного типу (теоретично рецесивні гомозиготи) і друга – рослини дикого та проміжного типів (теоретично домінантні гомо- та гетерозиготи). Теоретичні чисельності розраховували для одного, двох, трьох і більше незалежно успадковуваних генотипних факторів (олігогенів), передбачувано контролюючих кожну з аналізованих ознак, і порівнювали їх з фактичними за допомогою критерію c2 (табл.1).

Таблиця 1

Відповідність фактичних (f) і теоретичних (F) чисельностей рослин F2 (G.max X G.soja), розподілених за масою насінин в бобі

Показник Чисельність рослин c2

культурний тип дикий та про-міжний типи

4-генна модель успадковування

перевірочне співвідношення 1 255

f 8 1263

F 4,98 1266,02 1,838

c205 = 3,84

За результатами гібридологічного аналізу встановлено участь чотирьох або п'яти головних незалежно успадковуваних генотипних факторів, що зумовлюють відмінність у вихідних батьківських форм за фенотипним проявом стосовно кожної із наступних ознак: маса бобу, маса бобів з продуктивного вузла та маса насінин в бобі (c2факт. < c205). Тобто, із 20 пар хромосом, які містить генотип як культурних сортів (G.max), так і диких форм (G.soja) сої, чотири або п'ять пар виявляють головний вплив на фенотипний прояв кожної з цих ознак.

Крім того, у гібридів першого покоління, отриманих від схрещування G.max X G.soja, виявлено прояв гетерозисного ефекту за такими цінними ознаками, як число насінин, число бобів та маса насінин з рослини. В окремих комбінаціях схрещування встановлено збільшення середньої вираженості цих ознак в 4 рази і більше у гібридів F1 по відношенню до кращої батьківської форми (табл.2). Наявність високого гетерозисного ефекту у гібридів першого покоління свідчить про доцільність роботи по створенню гібридної сої.

Таблиця 2

Число зерен та їх маса з рослини у батьківських форм та гібридів F1

Батьківська форма, гібрид Ознака рослини

число насінин маса насінин, г

95%-ий довірчий інтервал 95%-ий довірчий інтервал

С121-88 (+ ) 73,75 38,52-108,98 13,29 8,66-17,92

ДУ-16 (> ) 49,78 38,03-61,33 1,16 0,0-4,79

F1(C121-88 Х ДУ16) 839,67 720,02-959,32 56,64 49,08-64,20

Показано, що подібність значень окремих кількісних ознак рослини у гібридів F1 (G.max X G.soja) по відношенню до культурного компоненту схрещування (G.max) зростає за умови зближення кривих розподілу фактичних значень цих ознак у вихідних компонентів схрещування.

З метою зменшення частки генетичного матеріалу дикого типу у гібридних генотипів проведено беккросні схрещування за схемою, коли материнські рослини культурної сої опилили пилком з гібридних рослин першого покоління: F1(G.max X G.soja), BC1(G.max X G.soja). На основі беккросних гібридних популяцій виділено рослини, у яких збільшення числа насінин в бобі (в середньому з рослини) відбувалося як за рахунок зростання кількості трьох і чотирьох насінних бобів, так і появою п'яти насінних бобів. Виділені рослини залучено до селекційного процесу.

В дослідженнях з різними генотипами культурної (G.max) сої стосовно стійкості їх до знижених температур залежно від стадії онтогенезу отримано дані, які свідчать про відносну незалежність генетичних факторів, що контролюють холодостійкість цієї культури на стадіях проростання насінин, росту і розвитку сходів та формування бобів. Досліджували генотипи, у яких особливості характеру успадковування стійкості до знижених температур в період проростання насіння були попередньо вивчені (В.В.Шерепітко, Т.М.Балашов, 1985). Показано, що холодостійкі у період проростання насіння генотипи проявляли чутливість до знижених температур на подальших стадіях онтогенезу і навпаки. Тому оцінку та добір перспективного за холодостійкістю вихідного матеріалу необхідно проводити диференційовано з метою поєднання вказаних властивостей на рівні одного генотипу.

Рис.2. Розподіл сімей F3 (Скинтея Х Кишинівська 16) за здатністю насіння до проростання при 6оС: по вертикалі – відносна частота, %; по горизонталі – схожість насіння, %; 1–контроль; 2–варіант з гамма-опроміненням рослин F1.

Крім того, з'ясовано, що при міжсортових схрещуваннях екзогенна обробка рослин F1 у фазі цвітіння гамма-променями в порівняно невеликій дозі (0,5–0,8 крад) сприяла в F2–F3 у окремих комбінаціях розширенню спектра доступної добору мінливості за холодостійкістю (рис.2).

Пошук нетрадиційних методичних підходів

ідентифікації генотипного різноманіття сої

Враховуючи те, що селекція культурних рослин за багатьма господарсько-цінними ознаками підійшла до біологічних меж підвищення зернової продуктивності (О.О.Жученко, 1993, 2000; О.О.Созінов, 1993), головним сьогодні стає якість продукції та підвищення стійкості та пристосованості рослин сої до несприятливих факторів середовища. Традиційні методи добору стають недостатніми для досягнення успіху і тому виникає необхідність пошуку нових методичних підходів, включаючи молекулярні критерії ідентифікації генотипів на рівні спорофіту та гаметофіту.

Аналізували активність інгібіторів трипсину (АІТ) у сім'ядолях та несім'ядольній частині зародку насінин сої. Експерименти проводили з колекційними сортами, лініями та селекційними номерами, а також гібридними популяціями, отриманими від схрещування холодостійких на ранніх стадіях онтогенезу сортів (Амурська 41, Comet) з чутливим до холоду сортом Gieso.

Виявлено генотипні відмінності в розподілі інгібіторів трипсину між органами зародку (сім'ядолі та несім'ядольна частина) насінин в стані спокою, а також в метаболізмі інгібіторів сім'ядоль та зародкових корінців пророслих насінин сої (табл.3). Зокрема, порівняно стійкі до знижених температур генотипи сої на відміну від чутливих характеризуються вищою інгібіторною активністю в несім'ядольній частині зародку насінин в стані спокою, ніж в сім'ядолях. Встановлено кореляційний зв'язок між величиною відношення: АІТ несім'ядольної частини зародку/ АІТ сім'ядолей та схожістю насіння за холодних температурних умов. Залежно від умов року вегетації рослин значення коефіцієнтів кореляції між цими показниками визначалися в межах 0,5–0,8. Виявлена закономірність лягла в основу розробки захищеного авторським свідоцтвом (Л.С.Павлова, В.В.Шерепітко, Т.М.Балашов, 1990) лабораторного методу добору сої за холодостійкістю у період проростання насінин.

Таблиця 3

Активність інгібіторів трипсину (іо/г) в органах зародку насінин різних за холодостійкістю генотипів сої

Генотип Варіант Насінини в стані спокою Пророслі насінини

23оС 7оС

Амурська41 Сім'ядолі 45,6 52,2±1,07 48,0±1,44

Несім'ядольна частина зародку 52,5 16,2±0,87 28,9±1,45

Comet Сім'ядолі 38,9 43,4±1,07 40,0±1,31

Несім'ядольна частина зародку 54,4 20,7±0,53 32,3±0,46

Gieso Сім'ядолі 41,8 34,7±0,71 30,0±1,00

Несім'ядольна частина зародку 36,0 14,4±0,47 28,7±1,71

Крім того, встановлено тісний від'ємний кореляційний зв'язок між АІТ зародкового корінця та схожістю насіння при температурі пророщування 7оС у гібридних популяціях (аналізували насіння F3 з рослин F2) Амурська 41 Х Gieso (r = -0,79±0,10) і Gieso Х Comet (r = -0,66±0,09), а також між АІТ зародкового корінця та його довжиною (r = -0,72±0,11 і r = -0,58±0,09). Експериментальні дані достовірні за t-критерієм Ст'юдента. Виявлені критерії АІТ також можна успішно використовувати для добору холодостійких генотипів сої на ранніх стадіях онтогенезу.

Як відомо, багаточисельні молекулярні форми окислювально-відновлювальних ферментів, зокрема ізопероксидази, відіграють важливу роль в механізмах адаптації рослин до несприятливих температурних умов, в зв'язку з чим досліджували ізопероксидазні електрофоретичні спектри перших простих (в період сходів) та трійчастих (в період цвітіння та дозрівання рослин) листків. Виявлено, що на ранніх фенофазах експресуються гени, що контролюють переважно низькомолекулярні ізозими. На подальших стадіях онтогенезу спостерігається ускладнення спектра за рахунок нагромадження спершу середньомолекулярних, а потім високомолекулярних ізоформ пероксидази.

Оцінено внесок окремих ізопероксидаз з точки зору формування стійкості даної ферментної системи до дії високих температур і відповідно жаростійкості генотипу. З'ясовано, що високою стабільністю із збереженням активності на фоні високотемпературної дії (70оС) характеризуються середньомолекулярні ізоформи пероксидази з відносною електрофоретичною рухомістю (ВЕР) 0,36–0,44. Істотною зміною активності у відповідь на дію стресових температур відзначаються низькомолекулярні ізоформи пероксидази з ВЕР 0,52–0,54, які повністю деактивуються протягом 2 год впливу температури 50оС. Виявлено, що деактивація цих ізоформ пероксидази мала місце у всіх генотипів сої, що досліджувалися, але порівняно жаростійкі генотипи (Hodgson, Дорінца) відзначаються нестрімким, а поступовим спадом їх активності.

Особливої уваги заслуговують високомолекулярні ізоформи пероксидази з ВЕР 0,08–0,25, у яких підвищується активність на фоні високотемпературної дії. Зокрема виявили, що активація ізопероксидази 3 (ВЕР 0,12) проходила в інтервалі температур 55–70оС і мала сортоспецифічний прояв. Встановлено, що ізопероксидаза 3 (ВЕР 0,12) та ізопероксидаза 11 (ВЕР 0,36), які активуються за умови високих температур, в значній мірі впливають на зміну загальної активності ферменту, а тому можуть виступати найбільш інформативними компонентами при оцінці генотипної мінливості сої за жаростійкістю. Показано, що за рахунок зростання активності саме цих ізопероксидаз проходить стабілізація та підвищення загальної пероксидазної активності у окремих генотипів (Hodgon) на фоні дії високих температур. В контрольованих умовах рекомендовано генотипні відмінності за жаростійкістю у сої виявляти за швидкістю реагування рослин у період репродуктивного розвитку на