КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Семенов Юрій Володимирович

УДК 577.336(048)

СПЕКТРАЛЬНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ІНДО-1 ПРИ ЗВ'ЯЗУВАННІ

Са2+ В КЛІТИНІ І В БІЛКОВИХ РОЗЧИНАХ

03.00.02 — біофізика

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ — 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біофізики біологічного факультету

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Зима Валентин Леонідович,

професор кафедри біофізики біологічного факультету

Київського національного університету

імені Тараса Шевченка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович

заступник директора з наукової роботи,

завідувач відділу м'язів

Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна

НАН України

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Федулова Світлана Анатоліївна

провідний науковий співробітник

Міжнародного центру молекулярної фізіології

НАН України

Провідна установа: Інститут молекулярної біології

і генетики НАН України, м. Київ

Захист відбудеться 14 травня 2002 р. о 16 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 у Київському національному

університеті імені Тараса Шевченка за адресою:

вул. академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, Київ — 33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка.

Автореферат розісланий 12 квітня 2002 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Давидовська Т. Л.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Іони кальцію виконують важливу роль вторинних посередників, передаючи інформацію від мембрани клітин до внутрішньоклітинних структур. Зміни внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію ([Ca2+]і) обумовлюють м'язове скорочення, вивільнення нейротрансмітерів, вони забезпечують регуляцію динаміки цитоскелету, фоторецепцію, ділення клітини, експресію генів та інші фізіологічні функції клітини. Регуляція рівня [Ca2+]i визначається як функціональною активністю плазматичної мембрани, так і внутрішньоклітинних органел — ендоплазматичного ретикулума, мітохондрій, ядра тощо. Оскільки діючим фактором, регулятором і пусковим механізмом різноманітних клітинних функцій, є концентрація вільного кальцію в цитоплазмі клітини, виникає важлива задача швидкого і точного визначення величини [Ca2+]i в інтактних клітинах.

Найбільш поширеним та перспективним є метод кальційчутливих флуоресцентних зондів. Флуоресцентні зонди індо-1, фура-2, флуо-3, флуо-4, Calcium-Green та інші дають можливість неперервної реєстрації змін рівня [Ca2+]i у клітинах в стані спокою та під час дії різноманітних агоністів. Найчастіше використовуються флуоресцентні зонди індо-1 та фура-2 Це обумовлено тим, що максимуми спектрів цих зондів зміщуються при зв'язуванні з іонами Са2+, завдяки чому, для кількісної оцінки [Ca2+]i використовується двохвильовий параметр R, який дає можливість уникнути багатьох похибок властивих однохвильовим зондам (флуо-3, флуо-4). Проте кількісна оцінка [Ca2+]i ускладнюється певними ефектами внутрішньоклітинного середовища, зокрема, через зв'язування флуоресцентних зондів з цитозольними білками. Не зовсім з'ясована природа зв'язування флуоресцентних зондів з цитозольними білками і не вивчено, як таке зв'язування впливає на спектральні і кальційзв'язуючі характеристики в білкових розчинах та клітинах. Не досліджено вплив температури на кальційзв'язуючі характеристики зондів в білкових розчинах і зміну [Ca2+]i в клітинах.

Значна кількість робіт присвячена природі Са2+-сигналів в збудливих клітинах, але ще не достатньо досліджені зміни цитозольного кальцію [Ca2+]i в незбудливих клітинах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт кафедри біофізики біологічного факультету Київського Національного Університету ім. Тараса Шевченка і виконана у межах теми № 97084, номер державної реєстрації: 0197U003200, “Мембранні та молекулярні механізми скорочення м'язової клітини”, термін виконання: 01.01.1997 — 31.12.2000; та теми № 99008/6, номер державної реєстрації: 0100U003944, “Дослідження структурно-функціонального стану і розробка методів оцінки та корекції м'язової і серцево-судинної системи людини в нормі та патології”, термін виконання 01.01.1999 — 31.12.2001).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дослідити при різних температурах спектральні і кальційзв'язуючі характеристики індо-1 в клітині і розчинах сироваткових альбумінів. Для досягнення цієї мети були сформульовані такі основні задачі:

Створити автоматизовану спектральну установку з комп'ютерною обробкою даних для вимірювання спектральних характеристик індо-1 при різних температурах.

Дослідити спектральні характеристики індо-1 в тимоцитах і з'ясувати участь цитозольних білків тимоцитів в зв'язуванні індо-1.

Вивчити вплив температури на флуоресцентні і кальційзв'язуючі характеристики індо-1 в розчинах сироваткових альбумінів, які зв'язують даний зонд.

Дослідити передачу енергії електронного збудження в комплексі сироватковий альбумін — індо-1 та в тимоцитах.

Провести кількісну оцінку [Ca2+]i методом спектрального розкладання флуоресценції індо-1 в модельних розчинах сироваткових альбумінів при різних температурах.

Дослідити методом спектрального розкладання флуоресценції індо-1 зміни [Ca2+]i в тимоцитах при зміні температури і при дії гіперкалієвого розчину.

Об'єкт дослідження: вплив білкового мікрооточення, температури та рН на флуоресцентні і кальційчутливі характеристики індо-1 в розчинах сироваткових альбумінів і в тимоцитах щура.

Предмет дослідження: кальційчутливий зонд індо-1, тимоцити, сироваткові альбуміни.

Методи дослідження. Цитозольна концентрація [Ca2+]i визначалася методом флуоресцентних кальційчутливих зондів (індо-1) та методом спектрального розкладання; рН цитозолю тимоцитів визначався за допомогою флуоресцентного рН-чутливого зонду BCECF; спектри збудження та флуоресценції індо-1 та BCECF реєструвалися на спектрофлуориметрі; кальцієві транзієнтні сигнали в тимоцитах та м'язових смужках taenia coli реєструвалися на мікроспектрофлуориметричній установці.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведений детальний аналіз спектральних характеристик індо-1 при зв'язуванні кальцію в розчинах сироваткових альбумінів. Показано, що, крім двох форм індо-1, кальційвільної L і кальційзв'заної LM, в розчині сироватковаго альбуміну реєструється білокзв'язана LP-форма, яка за своїми спектральними характеристиками близька до LP-форми індо-1 в цитозолі тимоцитів. Вперше запропонований метод спектрального розкладання інтегрального спектру флуоресценції індо-1 в тимоцитах дозволив враховувати внесок LP-форми в цей спектр і суттєво покращити кількісну оцінку [Ca2+]i. Встановлено, що індо-1 зв'язується з молекулами сироваткових альбумінів на гідрофобних центрах і відбувається передача енергії електронного збудження від триптофанілів білку на зв'язаний зонд. Передача енергії електронного збудження виявлена в тимоцитах, що свідчить про близький механізм зв'язування індо-1 з цитозольними білками тимоцитів.

Визначені константи дисоціації комплексу індо-1 — Ca2+ в умовах білкового оточення при різних температурах з корекцією на зміну рН. З температурної залежності розрахована ентальпія DН зв'язування комплексу індо-1 — Ca2+. Показано, що молекули САБ, які впливають на спектральні і кальційзв'язуючі характеристики індо-1, не змінювали ентальпію DН цього комплексу.

Встановлено, що при збільшенні температури від 15 до 37 °С спостерігається незначне закислення (~0.1 одиниць рН) цитозолю тимоцитів і зниження базального рівня [Ca2+]i в 1.55 рази. В умовах гіперкалієвого розчину (100 мМ КCl) в тимоцитах реєструвалося швидке збільшення концентрації [Ca2+]i на 60±5 нМ від базального рівня, а далі повільне (за ~15 хв) зниження до початкового рівня.

Практичне значення одержаних результатів. Запропонований метод спектрального розкладання спектру флуоресценції індо-1 в тимоцитах, який враховує внесок білок-зв'язаної LP-форми індо-1, може бути використаний для інших кальційчутливих зондів, які використовуються в лазерній конфокальній мікроскопії, що дозволить більш точно кількісно оцінювати просторовий розподіл цитозольного кальцію [Ca2+]i, та його зміни в часі в різних клітинах.

Одержані результати використовуються при викладанні спецкурсів “Біофізичні методи дослідження. Спектральні методи” і “Біофізика м'язів” на кафедрі біофізики Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Текст дисертації, формулювання основних положень та оформлення роботи виконано безпосередньо автором. Дисертантом особисто здійснені підбір та обробка даних літератури, статистична обробка результатів, а також оформлення рисунків і таблиць. Усі експерименти дисертаційної роботи виконані автором власноручно. Автоматизовані установки для проведення спектральних досліджень створені в співпраці з провідним інженером кафедри біофізики біологічного факультету Чумаковим С. та провідним інженером кафедри біофізики Ляховецьким Р. В. В обговоренні результатів активну участь приймали співавтори друкованих робіт.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на ІІ-му з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998); XIV-й міжнародній школі-семінарі “Spectroscopy of molecules and crystals” (Одеса, 1999); V-й міжнародній конференції “Інформотерапія: теоретичні аспекти і практичне застосування” (Київ, 1999); міжнародній конференції “Physical aspects of the luminescence of complex oxide dielectrics” (Київ, 2001); міжнародній конференції “Physics of liquid matter: modern problems” (Київ, 2001) та всеукраїнській конференції “Актуальні проблеми гастроентерології” (Київ 2001). Результати експериментів також доповідались на конференціях молодих вчених на біологічному факультеті Київського національного університету ім. Тараса Шевченка.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей у фахових наукових журналах та 6 тез доповідей у матеріалах міжнародних та всеукраїнських наукових конференцій.

Обсяг і структура дасертації. Дисертація складається з вступу, п'яти розділів (огляду літератури, опису об'єктів і методів дослідження, результатів власних досліджень, узагальнення результатів досліджень), висновків, списку використаних джерел з 206 найменувань, додатку. Робота представлена на 145 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 24 рисунками та 10 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Методи дослідження

Спектри індо-1 та рН-чутливого зонда BCECF в розчинах та в суспензії тимоцитів, записувались на спектрофлуориметрі СДЛ-2. Флуоресценцію індо-1 збуджували на довжині хвилі lзб=350 нм. Спектри збудження BCECF реєстрували на lф=535 нм. Флуоресценція індо-1 та BCECF реєструвалась під кутом 90° до променя збуджуючого світла з 1 см кювети в спектральному інтервалі від 360 до 600 нм та від 360 до 530 нм, відповідно, з смугою пропускання 0.5 нм на монохроматорі флуоресценції.

Дослідження проводились на суспензіях тимоцитів самців щурів віком біля 3 місяців. Щури забивались шляхом декапітації. Видалений тимус розміщували в бюкс на льоду з холодним розчином Кребса (+4 - +7 °С) з концентрацією СаCl2 1,2 мМ. Видалений тимус перетирали через ситечко із синтетичного волокна, поливаючи холодним розчином Кребса. Суспензію центрифугували 10 хв. при 1500 об/хв, надосадову рідину зливали і ресуспендували осад. Кількість клітин підраховували в камері Горяєва. Отриману суспензію тимоцитів (50ґ106 кл/мл) навантажували індо-1/АМ. Кінцева концентрація індо-1/АМ в середовищі навантаження становила 5 мкМ. Додавався Pluronic F-127 (0.05% в середовищі навантаження) для покращення розчинення індо-1/АМ. Клітини навантажувались індо-1 0.5 год. при температурі 37 °С. Після навантаження клітини відмивались від позаклітинного індо-1 центрифугуванням (3 рази, 1500об/хв). Для контролю за внутрішньоклітинним рН, тимоцити навантажувались флуоресцентним зондом BCECF/AM. Кінцева концентрація BCECF/AM в середовищі навантаження становила 0.5 мкМ. Навантаження тривало 0.5 год. при 37 °С. Від зовнішнього BCECF/AM клітини відмивались центрифугуванням (3 рази, 1500об/хв). Контроль кількості загиблих клітин проводили підраховуванням зафарбованих трипановим-голубим клітин в камері Горяєва до навантаження індо-1 і після навантаження та відмивання. Кількість пошкоджених клітин в усіх експериментах не перевищувала 10%.

В роботі використовувались препарати taenia coli з товстої кишки морської свинки. Для одержання препаратів використовувались морські свинки вагою 0.2 – 0.25 кг обох статей. Тварини забивались шляхом декапітації. Експерименти проводили на тонких гладеньком'язових смужках taenia coli (довжина 3–5 мм, ширина 1 мм, товщина ~200 мкм) повздовжнього шару товстої кишки морської свинки. Навантаження м'язових смужок флуоресцентним зондом індо-1 (5 мкМ) проводили при 37 °С на протязі 1 год. в розчині Кребса. В середовище навантаження додавався Pluronic F-127 (0.05%). Потім м'язові смужки тричі відмивали свіжим розчином Кребса від індо-1, який не проник в тканину. М'язові смужки закріплювали в спеціальній камері. Початковий натяг задавався за допомогою мікрогвинта. Збудження флуоресценції індо-1 здійснювалось через інтерференційний фільтр з максимумом пропускання на 350 нм. Динаміку Са2+-сигналів від t. coli і суспензії тимоцитів реєстрували на мікроспектрофлуориметрі МФТХ-2м.

Для калібрування in vitro використовувались розчини “EGTA” та “Са2+ — EGTA” такого складу: “EGTA” — KCl 65 мМ, KOH 35 мМ, EGTA 10 мМ, HEPES 20 мМ, m=0.1, рН 7.2 при 22°С; “Са2+-EGTA” — KCl 65 мМ, KOH 35 мМ, EGTA 10 мМ, HEPES 20 мМ, СаСl2 10 мМ, m=0.1, рН 7.2 при 19 °С. При реєстрації спектрів в присутності сироваткових альбумінів САБ чи САЛ, ці білки додавалися в концентраціях 7ґ10-6 М. Для приготування суспензії тимоцитів використовувались розчини з концентраціями кальцію 0 та 2.5 мМ такого складу: 5.9 мМ KCl, 135 мМ NaCl, 1.2 мМ MgCl2, 11.5 мМ глюкози і 11.6 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, m=0.1, рН 7.2 при 22 °С. В експериментах використовувалась деіонізована вода 10 МОм/см.

Розрахунки концентрацій вільного кальцію проводили на ЕОМ за допомогою програми WinMAXC v. 1.70. Дана програма дозволяє розрахувати концентрацію вільного кальцію за заданими загальними концентраціями СаСl2 та EGTA. Програма враховує зміни констант зв'язування EGTA при зміні температури, рН та іонної сили експериментального розчину.

Статистична обробка результатів здійснювалась за допомогою програми Origin на ЕОМ. Числові експериментальні дані приведені як середнє арифметичне ± середнє квадратичне відхилення. Розрахунок констант дисоціації () комплексу Са2+ — індо-1 здійснювався за допомогою методу найменших квадратів для нелінійних функцій. Величини коефіцієнту кореляції r коливались в межах 0.99-0.98. Лінійні залежності на графіках отримані за допомогою лінійного регресивного аналізу.

Результати та обговорення

Вплив білкового мікрооточення і температури на спектральні та кальційзв'язуючі характеристики індо-1. Цитозольні білки клітини зв'язують флуоресцентний кальційчутливий зонд індо-1, завдяки чому змінюються флуоресцентні характеристики індо-1 і погіршується точність визначення внутрішньоклітинної концентрації кальцію [Ca2+]i. Для визначення внутрішньоклітинної концентрації білків, які можуть зв'язувати індо-1 в цитозолі, тимоцити (5ґ106 кл/мл), після навантаження індо-1 та відмивання від позаклітинного зонда, ресуспендувались в середовищі вільному від Са2+. Далі, до суспензії тимоцитів додавався дігітонін (5мкМ), що давало можливість записати спектр флуоресценції індо-1, який являв собою адитивну суму спектрів двох форм індо-1: вільну від Са2+ (L) та зв'язану з внутрішньоклітинними білками (LP) форму. “Ефективну” концентрацію білку [P]i оцінювали за формулою:

. (1)

Використавши такі калібрувальні параметри =3.98 мкМ; =1.65; =0.101; =1.81 (Зима та ін., 1998), та знайдену в експерименті RL®LP=0.27 ми отримали “ефективну” концентрацію білків [P]i=882±15 нМ, які зв'язують індо-1 в тимоцитах. Визначена нами величина [P]i, була використана для оцінки [Ca2+]i в тимоцитах. Підставивши отримане [P]i і калібрувальні параметри в математичний вираз (Дячок О. М. та ін., 1997), який враховує внесок LP-форми в інтегральний спектр індо-1, ми отримали величину базального рівня [Ca2+]i=184±10 нМ в тимоцитах. Оцінка точності визначення [Ca2+]i за таким методичним підходом була зроблена в дослідженнях, в яких промодельовано зв'язування іонів Са2+ в розчинах САБ (7 мкМ). Проведені розрахунки за формулою Грінкевича-Тсьєна:

(2)

і отриманими в дослідах флуоресцентними параметрами індо-1 показали, що у випадку невеликих концентрацій, близьких до базального рівня, концентрація [Ca2+]i визначається з точністю 6-8%. Похибка в розрахунках [Ca2+]i значно зростає при більш високих концентраціях, коли [Ca2+]i > 500 нМ.

Коли досліджуються Са2+-сигнали в клітинах при різних температурах, не враховується вплив температури на кальційзв'язуючі характеристики зондів, зокрема на константу дисоціації . Для отримання , при різних температурах нами були знайдені залежності двохвильового параметру R=І410/І495 (де І410, І495 — інтенсивність флуоресценції на довжинах хвиль 410 і 495 нм, відповідно) від концентрації [Ca2+]i, яку задавали зміною відношення EGTA до Са2+-EGTA (GrynkiewiczEt al, 1985). Коли вивчався вплив білку, до розчинів “EGTA” та “Са2+-EGTA” додавався САБ (7 мкМ). Залежності параметру R від концентрації [Ca2+]i, (R=f([Ca2+]i)), отримували при чотирьох температурах, 15, 22, 29 і 37 °С. Експериментальні точки добре узгоджувались з теоретичними кривими за формулою (2) з такими величинами : 273±5, 210±3, 153±4, 129±5 нМ (у відсутності САБ) і 412±5, 292±4, 255±4, 184±3 нМ (в присутності САБ) для 15, 22, 29 і 37 °С, відповідно.

Визначені представлені на графіку Арреніуса, як р=f(1/Tґ1000) (рис. 1).

Тангенс кута нахилу цих ліній за рівнянням Вант-Гоффа відповідає — , де R=8.314 Дж/моль— газова постійна, DH — зміна ентальпії комплексу індо-1 — Са2+. З залежності р=f(1/Tґ1000) (рис. 1) ми отримали такі величини DН комплексу індо-1 — Са2+ для безбілкового та білкового розчинів: DН=25.98±0.03 кДж/моль та DН=25.96±0.02 кДж/моль, відповідно. Це свідчить про те, що білок САБ не впливає на ентальпію зв'язування комплексу індо-1 — Са2+. Завдяки тому, що спорідненість індо-1 до Са2+ (=292 нМ при 22 °С у присутності САБ) в 14 раз більша, ніж до САБ (=3.98 мкМ) (Дячок О.М. та ін., 1998) і DН не змінюється у розчині САБ утворюється переважно комплекс індо-1 — Са2+, рідше індо-1 — САБ і не утворюється потрійний комплекс Са2+ — індо-1 — САБ. За рахунок присутності в розчині білку зменшується кількість L-форми зонду і з'являється LP-форма, кількість якої залежить від Kd комплексів індо-1 — САБ та індо-1 — Са2+, а також від концентрації Са2+ і від концентрації L-форми індо-1. Ці дослідження привели нас до висновку, що білок не змінює ентальпію DН зв'язування іонів Са2+ з індо-1, а в розчині є тільки три форми індо-1 з характерними спектрами: кальційвільна L (lmax=477 нм), кальційзв'язана LM (lmax=410 нм) та білокзв'язана LP (lmax=440 нм) і відсутня форма індо-1 потрійного комплексу LMP. Це дає підставу вважати, що інтегральний спектр флуоресценції індо-1 в клітині є адитивна сума спектрів цих трьох форм і отже для аналізу такого спектра можна застосувати метод спектрального розкладання.

Ми провели експерименти для виявлення передачі енергії збудження в комплексі індо-1 — сироватковий альбумін. За теорією резонансної диполь-дипольної передачі енергії ефективність передачі енергії Е залежить від відстані r-6 між донором і акцептором (Лакович Дж., 1986)

(3)

де r0 — критична відстань передачі енергії або фьорстеровський радіус який визначається, як: r0=9.79102(K2n-4jдJ)1/6 (нм) (K2 — фактор, який визначає орієнтацію дипольних моментів донора і акцептора; n — показник заломлення; jд — квантовий вихід флуоресценції донора; J — інтеграл перекриття спектру флуоресценції донора і спектру поглинання акцептора). Ефективність передачі енергії в комплексі індо-1 — САБ і індо-1 — САЛ оцінювалась зі спектрів збудження флуоресценції акцептора енергії (індо-1) у відсутності і при наявності в розчині донорів САБ чи САЛ. При реєстрації флуоресценції індо-1 (lф=410 нм або lф=495 нм), де триптофаніли білків не випромінюють, в спектрі збудження комплексу індо-1 — САБ і індо-1 — САЛ спостерігається нова смуга збудження (lmax=280нм) (рис. 2), яка відсутня в спектрі збудження індо-1. Це вказує на передачу енергії від триптофанілів САБ і САЛ на зв'язаний індо-1. За цією смугою оцінюється ефективність передачі енергії Е:

(4)

де А1 (з донором) і А2 (без донора) — амплітуди в спектрі збудження на lmax=280 нм; eа і ed — коефіцієнти молярної екстинції акцептора і донора, відповідно. Використовуючи експериментальні дані А1 і А2 та відношення eа/ed, ми знайшли, що в комплексі індо-1 — САБ ефективність передачі енергії Е становить 0.12, а в комплексі індо-1 — САЛ Е=0.16. Встановлено, що при додаванні в розчин 160 нМ [Ca2+]i смуга 280 нм в спектрі збудження індо-1 значно зменшувалась (рис. 2). Це вказує на те, що за ефективнішого зв'язування індо-1 з іонами Са2+, ніж зв'язування індо-1 з молекулами САБ, порушується комплекс індо-1 — сироватковий альбумін і передача енергії збудження зменшується. Ми визначили інтеграл перекривання (J) спектрів і знайшли r0=3нм. Використовуючи виміряне значення E=0.16 і розраховане r0=3нм, ми оцінили відстань r=4нм між донором енергії (Trp214) і акцептором енергії індо-1, зв'язаним на молекулі САЛ.

Досліджено вплив температури на ефективність передачі енергії електронного збудження. З підвищенням температури від 15 до 37 °С спостерігалось зростання максимуму при 280 нм. Ми знайшли, за формулою (4), що ефективність передачі енергії Е за такого підвищення температури збільшувалась на 25%. Таке збільшення Е вказує на зменшення r, що свідчить про конформаційну зміну САЛ і утворення більш щільного комплексу САЛ — індо-1.

Дослідження вільного кальцію [Ca2+]і в білкових розчинах і тимоцитах методом спектрального розкладання флуоресценції індо-1. В калібрувальному розчині, який містить в певному співвідношенні [Ca2+]i, індо-1 та сироватковий альбумін, буде знаходитись одночасно три форми (L, LM, LP) індо-1. Спектральний внесок кожної форми в інтенсивність флуоресценції інтегрального спектра флуоресценції можна знайти за такими рівняннями:

(5)

де , , — інтенсивність флуоресценції L-, LM- i LP-форми зонду на довжині хвилі l, відповідно; a, b і g — коефіцієнти внесків цих форм в інтегральний спектр флуоресценції, відповідно.

З метою дослідження впливу LP-форми індо-1 на кількісну оцінку [Ca2+]i в буферний розчин додавався САБ, який добре зв'язує індо-1. Оскільки індо-1 значно слабше зв'язується з САБ (константа дисоціації =3.98 мкМ при 22 °С) ніж з Са2+ (=210 нМ), важко досягти насичення молекул САБ молекулами індо-1. Тому в розчин індо-1 (5 мкМ) додавалась насичуюча концентрація САБ (50мкМ), яка значно перевищувала концентрацію індо-1. Нами були записані спектри флуоресценції індо-1 в буферних розчинах з постійними концентраціями Са2+ (204 нМ) та САБ (7 мкМ) при температурах 15, 22, 29, 37 °С. На рис. 3 представлений такий спектр флуоресценції індо-1 при t=22 °C (спектр 1). На цьому ж рисунку представлені також спектри флуоресценції “чистих” форм (L, LM, LP) за допомогою яких проводилось спектральне розкладання інтегрального спектра індо-1 з використанням трьох рівнянь (5). Були визначені величини внесків трьох форм в інтегральний спектр флуоресценції індо-1 (a — для L-форми, b — для LM-форми і g — для LP-форми) при різних температурах (таблиця 1).

Таблиця 1

Внески різних форм індо-1 в інтегральний спектр флуоресценції зонду

При збільшенні температури, на фоні практично незмінного внеску LP-форми, відбувається перерозподіл між внесками L- та LM- форм. Це дало нам змогу припустити, що при концентраціях вільного кальцію в середовищі 500 нМ, зміни концентрації Са2+ приводять до перерозподілу величин внесків L- та LM- форм в інтегральний спектр флуоресценції на фоні практично незмінного внеску LP-форми. Додатковим підтвердженням незначної зміни спектрального внеску (g) LP-форми в інтегральному спектрі при різних температурах може свідчити постійність співвідношення b/a двох форм. Порівнювалось відношення b/a, знайдене за допомогою спектрального розкладання, в безбілковому розчині та в присутності 7 мкМ САБ при температурах 15, 22, 29 та 37 °С. Як видно з отриманих даних (таблиця 2), величина b/a збільшується зі зростанням температури, але для кожної з температур, незалежно від того присутній в розчині білок чи ні, b/a має постійне значення (похибка не більше 5% для всього температурного інтервалу).

Таблиця 2.

Співвідношення b/a при різних температурах

З наведених вище результатів можна зробити кілька важливих висновків. По перше, спектральне розкладання дає змогу коректно вилучати з інтегральних спектрів флуоресценції внесок LP-форми і точно знаходити внески L- і LM-форм в інтегральний спектр індо-1. В невеликих інтервалах змін [Ca2+]i (до 200 нМ) чутливим параметром є відношення спектральних внесків b/a цих форм. По друге, при оцінці [Ca2+]i з використанням двохвильових параметрів R, які визначаються зі спектрів флуоресценції індо-1 після вилучення з цих спектрів внеску LP-форми, можна використовувати константи дисоціації , які знаходяться при калібруванні in vitro в безбілкових розчинах.

Точність методу спектрального розкладання флуоресценції індо-1 в тимоцитах залежить від того, наскільки спектр LP-форми індо-1 в білкових розчинах буде співпадати зі спектром LP-форми, яка реєструється в інтегральному спектрі індо-1 в тимоцитах. Ми показали, що спектр флуоресценції індо-1 у розчині сироваткового альбуміну людини САЛ (у відсутності іонів кальцію [Са2+]i=0) після вилучення з нього спектру L-форми має lmax=444нм і цей спектр близький до спектру LP-форми індо-1 в тимоцитах. Про коректність спектрального розкладання свідчить збіг спектру, який синтезований з чистих L- та LM-форм з використанням коефіцієнтів a та b, зі спектром флуоресценції індо-1 в тимоцитах після вилучення з нього “чистої” LP-форми (за наявності у розчині САЛ) перемноженої на коефіцієнт g.

Для виявлення резонансної передачі енергії електронного збудження від цитозольних білків до індо-1 нами записувались спектри флуоресценції та збудження індо-1 в суспензії тимоцитів (5ґ106кл/мл) за умов знаходження тимоцитів в безкальцієвому розчині Кребса (1мМ EGTA) та в розчині з нормальним вмістом кальцію (2.5мМ CaCl2). Виявилось, що в спектрі збудження індо-1 в тимоцитах (lф=410 нм), як і в білкових розчинах САБ та САЛ, з'являється нова інтенсивна смуга збудження з максимумом біля 280-290 нм. Оскільки коефіцієнт молярної екстинції водорозчинних білків цитоплазми тимоцитів та точна величина інтенсивності флуоресценції акцептора енергії (індо-1) в цитоплазмі у відсутності донора (білків) невідомі, ми не змогли оцінити ефективність E передачі енергії електронного збудження в клітинах і запропонувати більш коректну модель взаємодії індо-1 з цитозольними білками. У випадку флуоресценції індо-1 в білкових розчинах і у випадку флуоресценції даного зонда в клітинах, спостерігається резонансна передача енергії електронного збудження, яка обумовлена зв'язуванням індо-1 до цитозольних білків, які мають у своїй структурі гідрофобні “кишені”. У білкових розчинах і в тимоцитах при збільшенні в середовищі концентрації кальцію спостерігається зменшення ефективності передачі енергії електронного збудження, що може бути пов'язаним з значним зменшенням кількості індо-1, який зв'язується з білками.

Збільшення температури може призвести, до зміни внутрішньоклітинного рН, а це, в свою чергу, може вплинути на [Ca2+]i. Ми дослідили вплив температури на внутрішньоклітинний рН ([рН]і) тимоцитів за допомогою рН-чутливого зонду BCECF. Калібрувальні експерименти з BCECF були проведені при 15, 22, 29, 37 °С. Концентрація протонів [рН]і в калібрувальних розчинах знаходилась за математичним виразом:

???

де Rў=I490/I410 — двохвильовий параметр, який визначався з спектру збудження BCECF. Були отримані калібрувальні параметри для BCECF при цих температурах: при 15 °С (RA=1.97, RB=10.26, j=1, рКd=7.09±0.029); 22 °С (RA=1.74, RB=9.68, j=1 рKd=7.04±0,069) 29 °С (RA=1.9, RB=9.7, j=1, рКd=6.92±0.033); 37 °С (RA=1.82, RB=9.58, j=1, рКd=6.95±0.028). Калібрувальні параметри були використані для оцінки [pH]i цитозолю тимоцитів при різних температурах. Нами було показано, що при збільшенні температури від 15 до 37 °С спостерігається незначне закислення (”0.10±0.05 (n=4) одиниць рН) цитозолю тимоцитів. Таке закислення практично не впливає на флуоресцентні та кальційзв'язуючі характеристики індо-1. Встановлено, що в розчині з САБ (7мкМ) константа дисоціації рКd BCECF має таку ж саму величину рKd=7.04±0.055, як в безбілковому розчині. Отже, на відміну від індо-1 рН-чутливий індикатор не зв'язується з білками цитоплазми тімоцитів.

Внутрішньоклітинний рівень [Ca2+]i, який підтримується завдяки роботі специфічних мембранних структур, є важливою фізіологічною характеристикою збудливих і незбудливих клітин. Відхилення від базального рівня [Ca2+]i можуть характеризувати фізіологічну активність клітин або давати певну інформацію про паталогічний стан біологічних об'єктів. Зміни [Ca2+]i, через деполяризацію мембрани чи дію гормонів, мітогенів тощо, відіграють головну роль в механізмах сигнальної трансдукції, яка призводить до різних фізіологічних відповідей, — рухливості, секреції, нейротрансмісії, проліферації або диференціації клітин. Часто зміни [Ca2+]i супроводжуються змінами [pH]i. Ми провели дослідження впливу температури на базальний рівень [Ca2+]i в тимоцитах, навантажених індо-1 (5 мкМ). Для контролю зміни [pH]i ці ж клітини навантажувались рН-чутливим зондом BCECF (0.5 мкМ). Для оцінки базального рівня [Ca2+]i в тимоцитах при різних температурах ми провели розкладання інтегральних спектрів, що дозволило знайти спектральні внески (a, b, і g) трьох форм (L, LM i LP) індо-1 (табл. 3). Як видно з таблиці спектр флуоресценції LP-форми майже не змінюється, про що свідчить сталість середньої величини g в досліджуваному температурному інтервалі: g=0.27±0.03. На фоні незмінної LP-форми, чітко спостерігається спектральний перерозподіл між LM- i L-формами, — зі зростанням температури збільшується внесок b кальційзв'язаної LM-форми і зменшується внесок a кальційвільної L-форми індо-1. Співвідношення b/a цих двох форм майже в 2 рази збільшується при зростанні температури від 15 до 37 °С (табл. 3).

Таблиця 3.

Концентрація вільного кальцію та перерозподіл спектральних внесків флуоресценції індо-1 в тимоцитах щура при різних температурах реєстрації спектрів флуоресценції зонду

Для кількісної оцінки [Ca2+]i ми вилучали спектр LP-форми з інтегральних спектрів флуоресценції індо-1. З отриманих, після вилучення спектрального внеску LP-форми, спектрів був знайдений двохвильовий параметр R, за яким ми знайшли [Ca2+]i в тимоцитах при різних температурах (табл. 3). При розрахунках [Ca2+]i враховувалося те, що константа дисоціації зменшується більш ніж в 2 рази при зростанні температури від 15 до 37 °С. Отримані дані показують, що базальний рівень [Ca2+]i в тимоцитах при 37 °С помітно нижчий ніж при кімнатній температурі. Можливо, це обумовлено тим, що при зростанні температури збільшується швидкість роботи Са2+-помпи і Na+-Ca2+-обмінників плазматичної мембрани і Са2+-помп ендоплазматичного ретикулума, що сприяє підтримуванню концентрації Са2+ на більш низькому рівні.

Хоча тимоцити відносяться до незбудливих клітин, відомо, що діючи агоністами на рецептор-керовані канали плазматичної мембрани чи деполяризуючи плазматичну мембрану за допомогою гіперкалієвого розчину, можна спричинити повільні зміни концентрації вільного кальцію в цитозолі. Ми використовували гіперкалієвий розчин (100мМ KCl) щоб активувати зміни [Ca2+]i в цитозолі клітин. Досліди були виконані на мікроспектрофлуориметрі МФТХ-2М, який дозволяє реєструвати в часі в автоматичному режимі зміни двохвильового параметра R. Записувалась кінетика збільшення Са2+ в цитозолі тимоцитів за зміною двохвильового параметру R (рис. 4, А).

Отримані [Ca2+]i-сигнали тимоцитів у відповідь на гіперкалієвий розчин порівнювалась з [Ca2+]i-сигналами при К+-деполяризації м'язових смужок taenia coli, виділених з морських свинок (рис. 4, Б). При деполяризації мембрани гіперкалієвим розчином в суспензії тимоцитів спостерігалось швидке збільшення [Ca2+]i на 60±5нМ від базального рівня (140 нМ), а потім повільне (на протязі 15 хв) зменшення концентрації вільного кальцію до початкового рівня. Кальцієвий сигнал у м'язових смужках мав більшу амплітуду ([Ca2+]i збільшувався до 5 мкМ) і більш швидшу кінетику. За формою Са2+-сигнал в тимоцитах був близький до Са2+-сигналу гладеньком'язових клітин. З певним наближенням можна припустити, що за регуляцію [Ca2+]i в тимоцитах відповідають внутрішньоклітинні структури подібні до таких в гладеньких м'язах.

З огляду вище встановлених фактів, надзвичайно важливо кількісно оцінювати рівень [Ca2+]i та його динаміку в інтактних клітинах. Запропонований нами метод спектрального розкладання дозволяє більш точно кількісно оцінювати базальний рівень [Ca2+]i, а також його зміни при активації клітин під дією фізичних факторів (зміна температури).

ВИСНОВКИ

У модельних експериментах методом спектрального розкладання досліджено вплив білкового мікрооточення і змін температури на спектральні і кальційзв'язуючі характеристики флуоресцентного зонда індо-1. Вивчено зміну спектральних внесків (a, b, g) трьох форм (кальційвільної L, кальційзв'язаної LM та білокзв'язаної LP) в інтегральних спектрах флуоресценції індо-1 в розчинах сироваткових альбумінів і тимоцитах при різних температурах. Методом спектрального розкладання інтегральних спектрів індо-1 і вилученням з них некальцієвої LP-форми досліджено внутрішньоклітинний вільний кальцій [Ca2+]i в тимоцитах при різних температурах та зміни [Ca2+]i в тимоцитах при дії гіперкалієвого розчину.

На оброблених дігітоніном (5мкМ) мембранопроникних тимоцитах отримана ефективна концентрація [P]i цитозольних білків ([P]i=0.88±15 мкМ), які зв'язують індо-1, в результаті чого утворюється характерна за спектром некальцієва LP-форма індо-1.

Встановлено, що константа дисоціації комплексу індо-1 — Са2+ зменшується більше ніж в 2 рази зі зростанням температури від 15 до 37 °С (273 нМ при 15 °С і 129 нМ при 37 °С). З температурної залежності отримана величина зміни ентальпії DН=25.96 кДж/моль при зв'язуванні Са2+ з індо-1. За наявності в розчині сироваткового альбуміну бика (САБ) уявна збільшується в 1.4 рази (при 22 °С =210 нМ у відсутності САБ і 292 нМ за наявності САБ, 7 мкМ), але не змінюється DН.

Показано, що індо-1 зв'язується з сироватковими альбумінами завдяки гідрофобним взаємодіям і відбувається передача енергії електронного збудження від триптофанілів білку до зв'язаного індо-1. Знайдена з спектрів збудження ефективність E передачі енергії від триптофанілів (донори енергії) до індо-1 (акцептор енергії) становила для комплексу САБ — індо-1 Е=0.12 і для комплексу САЛ — індо-1 Е=0.16. За теорією резонансної диполь-дипольної передачі енергії в комплексі САЛ — індо-1 оцінена ефективна відстань r=4 нм між донором енергії (Trp214) і зв'язаним індо-1. Передача енергії електронного збудження виявлена при зв'язуванні індо-1 з цитозольними білками тимоцитів.

Методом спектрального розкладання проведена оцінка спектральних внесків (a, b, g) трьох форм (L, LM i LP) в інтегральних спектрах флуоресценції індо-1 в розчинах САБ при 15, 22, 29 і 37 °С. Показано, що за незмінного внеску LP-форми (g=0.275±0.022) при зростанні температури від 15 до 37 °С зменшується внесок a L-форми і збільшується внесок b LM-форми. Метод спектрального розкладання дозволив коректно вилучати з інтегрального спектру LP-форму і за співвідношенням спектральних внесків L- та LM-форм та отриманим двохвильовим параметром R більш точно кількісно оцінювати концентрацію вільного кальцію [Ca2+]i.

Методом спектрального розкладання встановлено, що в тимоцитах реєструється спектр флуоресценції LP-форми з lmax=443-445 нм, який добре моделюється спектром флуоресценції LP-форми індо-1 в розчині САЛ. Вилучення спектру LP-форми з інтегрального спектру індо-1 в тимоцитах дозволило отримати при 22 °С базальний рівень цитозольного [Ca2+]i в нормальному розчині Кребса ([Ca2+]i=140±10 нМ) і у відсутності іонів Са2+ в позаклітинному розчині ([Ca2+]i=70±13 нМ).

Встановлено, що зростання температури від 15 до 37 °С приводить до незначного закислення (@0.1 одиниць рН) цитозолю тимоцитів і до помітного зниження в 1.55 рази базального рівня [Ca2+]i (при 15 °С [Ca2+]i=179±12 нМ і при 37 °С [Ca2+]i=115±10 нМ. Такі температурні зміни [Ca2+]i, можливо пов'язані з більш ефективною роботою Са2+-помп і Na+-Ca2+-обмінника мембранних структур при 37 °С.

Показано, що в гіперкалієвому розчині (100 мМ KCl) спостерігаються Са2+-сигнали, які за формою мають фазу швидкого збільшення [Ca2+]i на 60±5 нМ від базального рівня і повільне (за 15 хв) зменшення [Ca2+]i до базального рівня.

Список опублікованих за темою дисертації робіт

Зима В. Л., Семенов Ю. В., Дячок О. М., Ганчурін В. В. Флуоресцентні характеристики індо-1 при взаємодії з сироватковими альбумінами // Фізика живого. — 1998. — 6, № 2. — С. 30-39.

Ветров О. П.,. Дячок О. М, Зима В. Л. Ляховецький Р. В., Мельничук І. В., Семенов Ю.В. Метод коригування спектрів флуоресценції Са2+-чутливих зондів // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. — 1998. — Вип. 28. — С. 7-10.

Зима В.Л., Семенов Ю.В. Влияние температуры на флуоресцентные характеристики индо-1 при взаимодействии с сывороточными альбуминами и ионами кальция // Фізика живого. — 1999. — 7, № 1. — С. 48-53.

Зима В. Л., Мірошниченко М. С., Чумаков С. П., Семенов Ю. В., Биць О. В. Автоматизований мікроспектрофлуориметр для вимірювання флуоресцентних характеристик біооб'єктів // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. — 2000, — Вип. 31. — С. 6-8.

Семенов Ю. В., Ганчурін В.В., Залоїло І.А. Вплив температури на флуоресцентні і кальційзв'язуючі характеристики індо-1 Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. — 1999, — Вип. 29. — С. 11-12.

Семенов Ю. В., Зима В. Л., Артеменко О. Ю., Ганчурін В. В. Дослідження методом спектрального розкладання флуоресценції індо-1 в білкових розчинах і тимоцитах // Фізика живого. — 2001. — Т. 9, № 1. — С. 35-44.

Зима В. Л., Дячок О. М., Семенов Ю. В. Флуоресцентні і кальцій-зв'язуючі характеристики індо-1 при взаємодії з білками // ІІ з'їзд українського біофізичного товариства — 1998., 29 червня 3 липня, Харків, Україна.

Zyma V. L., Semenov Yu. V. Fluorescence energy transfer in indo-1 — serum albumin complex // XIV International School-Seminar “Spectroscopy of molecules and crystals” — 1999., 7-12 June, Odessa, Ukraine.

Семенов Ю. В., Зима В. Л. Кальцієва сигналізація: реєстрація і кількісна оцінка // V Міжнародна конференція “Інформотерапія теоретичні аспекти і практичне застосування” — 1999, 14-18 грудня, Київ, Україна.

Zyma V. L., Semenov Yu. V., Miroshnichenko M. S. Fluorescence indo-1 in the thymocytes and at binding with serum albumin // International Conference “Physics of liquid matter: modern problems”. — 2001. — 14-19 September, Kyiv, Ukraine.

Zyma V. L., Semenov Yu. V., Miroshnychenko M. S., Prylutskyy Yu. I. Temperature effect on the fluorescent properties of Ca2+ — indo-1 complex // International Workshop “Physical aspects of the luminescence of complex oxide dielectrics”. — 2001. — 24-26 September, Kyiv, Ukraine.

Зима В. Л., Семенов Ю. В., Артеменко О. Ю., Ганчурін В. В. Кальційзв'язуючі та флуоресцентні характеристики індо-1 у клітині. // Тези доповідей всеукраїнської наукової конференції “Актуальні проблеми гастроентерології”. – 2001. – 2-21 грудня, Київ – С.20.

Семенов Ю.В. Спектральні характеристики індо-1 при зв'язуванні Са2+ в клітині і білкових розчинах. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02. — біофізика. — Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Дисертація присвячена вивченню