НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ім. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

ТОВКАЧ ФЕДІР ІВАНОВИЧ

УДК 578.262.8:579.842.24

ЛІЗОГЕНІЯ І БАКТЕРІОФАГИ ERWINIA CAROTOVORA

03.00.06 - вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора

біологічних наук

КИЇВ - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі вірусів мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Менджул Михайло Іванович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, завідувач відділу вірусів водоростей

доктор біологічних наук, професор, академік УААН Бойко Анатолій Леонідович, Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, завідувач кафедри вірусології

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Швед Анатолій Давидович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу молекулярної вірусології

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В.Громашевського АМН України.

Захист відбудеться “18” грудня 2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м.Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий 4 листопада 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сутність явища лізогенії полягає в структурно-фізіологічній взаємодії між помірним бактеріофагом і бактерією-господарем. За певних обставин геном бактеріофага стає складовою частиною бактеріального геному і успадковується бактерією як профаг. Лізогенія притаманна всім бактеріям і виражає найвищий ступінь пристосування паразита до умов оточуючого середовища. Лізогенний стан є унікальним в кожному конкретному випадку і детально досліджений лише для небагатьох бактеріально-фагових систем. Стан профага потенційно небезпечний не тільки для бактерії-носія. Помірні бактеріофаги переносять генетичні детермінанти патогенності і зумовлюють вірулентність бактерій. З іншого боку, вони суттєво впливають на біотехнологічні процеси, викликаючи непередбачуваний фаголізис продуцентів важливих мікробних продуктів. Отже, дослідження конкретних лізогенних систем є актуальним як в теоретичному, так і в практичному аспектах.

Пошук і дослідження нових бактеріофагів мають не менше значення, ніж вивчення лізогенії. Фаги – найпростіші живі істоти, про походження яких невідомо до цього часу, а концепція “виду” для них не сформульована остаточно. Бактеріофаги завжди виступають як прості модельні об'єкти молекулярної біології і мають велике практичне значення, як неперевершені інструменти в молекулярно-генетичних дослідженнях бактерій.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках НДР відділу вірусів мікроорганізмів за темами: “Структурно-функціональний аналіз генів та генетичних модулів помірних фагів Erwinia carotovora, 01.9.10_057062 (виконавець); “Вивчити вплив епісом на патогенні властивості пектолітичних ервіній з метою прогнозування та попередження хвороб сільськогосподарських рослин”, 0196U003718 (керівник); “Природні популяції мікроорганізмів, що включають пектолітичні ервінії: взаємовідношення членів популяції – бактерій, бактеріофагів, бактеріоцинів і плазмід”, 0195U027808 (керівник); “Полілізогенія і помірні бактеріофаги пектолітичних фітопатогенних ервіній”, 0195U027809 (виконавець); “Т7–подібні бактеріофаги у бактерій роду Ервінія: властивості та використання”, 0197U015460 (керівник).

Мета і задачі дослідження. Проблема, яка вирішувалася в ході виконання роботи – явище лізогенії у практично важливих фітопатогенних пектолітичних бактерій Erwinia carotovora, збудників м'якої гнилі рослин.

Мета роботи – виявити і визначити природу лізогенного стану та дослідити бактеріофаги E.carotovora, а також встановити зв'зок між лізогенією, бактеріоциногенністю і позахромосомними факторами (плазмідами) у цих бактерій.

Для досягнення мети передбачалося розв'язати наступні задачі:

- дослідити поширення та вивчити загальні властивості бактеріоциногенності у E.carotovora;

- визначити тип лізогенії та її взаємозв'язок з бактеріоциногенністю E.carotovora;

- знайти та охарактеризувати життєздатні бактеріофаги і встановити причини підвищеної стійкості пектолітичних ервіній до літичної дії фагів;

- провести порівняльне вивчення близькоспоріднених помірних ервініафагів 49 і 59;

- дослідити позахромосомні фактори і розглянути їх відношення до лізогенного стану E.carotovora;

- визначити вплив лізогенії, бактеріоциногенності і плазмід на популяційну дисоціацію штамів пектолітичних ервіній;

- розглянути можливість застосування бактеріофагів, бактеріоцинів та плазмід у дослідженнях молекулярної генетики фітопатогенних ервіній.

Об'єктом дослідження були фітопатогенні пектолітичні бактерії E.carotovora та таксономічно близькі до них аміловороподібні фітопатогени E.horticola.

Предмет дослідження: SOS-індуковані клітинні фактори – помірні бактеріофаги та бактеріоцини (каротоворіцини); вірулентні бактеріофаги; внутріклітинні позахромосомні фактори (плазміди).

Наукова новизна одержаних результатів. Результати роботи суттєво доповнюють наукові уявлення про лізогенію як невід'ємну рису бактеріального світу й унікальне явище для кожного виду бактерій.

В роботі вперше виявлена дефектна полілізогенія, біологічним проявом якої є бактеріоциногенність пектолітичних фітопатогенних бактерій E.carotovora. Дефектна полілізогенія - видова ознака цих бактерій. В межах одного і того ж штаму дефектний лізогенний стан пектолітичних ервіній є множинним і визначається кількома різними неповними бактеріофагами. Експресія генів дефектних профагів цих бактерій призводить не до утворення цілісної фагової частки, а до синтезу окремих її компонентів – головки, хвостового відростка і базальної пластинки. Хвостові відростки дефектних фагів (макромолекулярні бактеріоцини) E.carotovora виступають основними кілерними факторами щодо споріднених бактерій.

Встановлено, що бактеріоциногенність E.carotovora визначається бактеріоцинами двох видів – макромолекулярними каротоворіцинами (MCTV) і коліцинподібними каротоворіцинами (CCTV). На основі взаємопов'язаних показників лізисної активності та бактеріоциночутливості штамів-носіїв проведена класифікація MCTV E.carotovora. Запропоновано оригінальний метод виявлення макромолекулярних каротоворіцинів (біологічно активних дефектних бактеріофагів) необмеженої кількості штамів пектолітичних ервіній. Суть методу полягає в застосуванні набору бактеріальних мутантів, стійких до дії налідіксової кислоти, як бактеріоциночутливих індикаторів. Показано, що хвостові відростки дефектних бактеріофагів – зручна модельна система для вивчення самозбирання елементарних біологічних структур in vitro. Її використання привело до відкриття центрів самоорганізації (полімеризації) нових надмолекулярних структур вірусної природи.

Вперше було знайдено новий життєздатний помірний бактеріофаг ZF40, який здатний обумовлювати справжню лізогенію у E.carotovora. З його допомогою у пектолітичних ервіній виявлено три основні причини фагостійкості: обмеження розвитку фагів на рівні адсорбції, заборону внутріклітинного розвитку системою рестрикції клітини-господаря і обмеження за рахунок розповсюдження гомоімунних помірних бактеріофагів у E.carotovora.

Результати одержані при порівнянні двох помірних ервініафагів 49 і 59 підтвердили їх рекомбінаційне походження і дали можливість наблизитись до розуміння справжньої лізогенії у бактерій роду Erwinia.

Вперше отримані достовірні дані стосовно плазмідного складу E.carotovora. Показано, що біля 30% штамів цих бактерій несуть позахромосомні ДНК різного розміру. Ці елементи пектолітичних ервіній не беруть участі у формуванні стійкості до антибіотиків і не мають генетичних детермінант для синтезу хвостових відростків дефектних бактеріофагів та коліцинподібних каротоворіцинів.

Вперше встановлено, що при тривалому зберіганні штамів, особливо підвиду atroseptica, відбувається популяційна дисоціація E.carotovora. При цьому спостерігається множинна зміна фенотипу, яка стосується антибіотикостійкості та росту клітин на певних селекційних середовищах. Зрідка дисоціація стосується зміни синтезу CCTV. Показано, що гетерогенність популяції не обумовлена втратою криптичних плазмід і, скоріше за все, пов'язана із перебудовою бактеріального геному E.carotovora.

В процесі пошуків вперше виявлено новий вірулентний фаг F44, який здатний репродукуватися в клітинах різних представників родів Erwinia і Pseudomonas, а також - в E.coli. Важливим є те, що фаг F44 може інфікувати пектолітичні фітопатогенні ервінії з певними порушеннями в синтезі ліпополісахариду (ЛПС) зовнішньої клітинної оболонки. Вперше здійснено застосування оригінальної модельної системи фаг F44 – E.horticola, яке привело до вивчення позаклітинної супресії у ервіній.

В роботі вперше показано, що рецепторами для фагів і каротоворіцинів є ЛПС клітинної оболонки. Для адсорбції частинок фага ZF40 і хвостових відростків дефектних фагів рецептором виступає О–ланцюг ЛПС, тоді як місця прикріплення вірулентних фагів F44 і Т7 розміщені у коровій частині молекули (R –ЛПС).

Науково-практичне значення результатів, приведених у дисертації. В результаті проведеної роботи створено підґрунтя для вивчення молекулярної генетики важливих фітопатогенних бактерій із застосуванням їх власних генетичних елементів – бактеріофагів, бактеріоцинів і плазмід. Наступний етап досліджень E.carotovora може включати вирішення проблеми впливу лізогенії і помірних бактеріофагів різної природи на патогенний процес. З наукової точки зору перспективним є вирішення проблеми функціональної та структурної організації часток дефектних бактеріофагів E.carotovora. Виявлені нами центри самоорганізації нових надмолекулярних утворів MCTV можуть мати самостійне наукове значення для вирішення проблеми самозбирання елементарних біологічних структур in vitro. Біологічно активні хвостові відростки дефектних бактеріофагів можуть служити важливими інструментами для біоконтролю фітопатогенів в оточуючому середовищі. Запропонована в роботі загальна схема бактеріоцинотипування поряд з визначенням пектолітичної активності може бути рекомендована для ідентифікації E.carotovora з метою попередження хвороб сільськогосподарських рослин та виробничих втрат рослинної продукції.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу сплановано і виконано автором особисто. Здобувач – одноосібний автор центрального положення дисертації про те, що бактеріоциногенність E.carotovora є біологічним проявом її дефектних помірних бактеріофагів (дефектної лізогенії). Ідеї, гіпотези і наукові положення, а також теоретична розробка нових методичних положень повністю належить здобувачу. Дослідження в рамках планових та грантових НДІ проводились за керівництва та особистою участю здобувача. Отримані результати обговорено та опубліковано в спільних роботах. Автор висловлює подяку за плідне співробітництво соїм колегам: кандидатам біологічних наук Ю.А.Григоряну, В.І.Рубану, Т.Ю.Горб, М.С.Муквичу, С.М.Мороз, О.О.Дідик, М.В.Яговдик, С.К.Воцелко, А.О.Бондарчук; інженерам Т.В.Шевченко та І.І.Ромасю; студенту А.Ф.Товкачу. Автор висловлює вдячність за постійну увагу і зацікавленість до роботи, а також за участь у дослідженнях бактеріофагів і бактеріоцинів д.б.н., професорам Р.І.Гвоздяку та В.В.Данилейченку. Автор щиро вдячний К.П.Гущі, С.І.Бардакову і Н.І.Шевченко за кваліфіковану технічну допомогу. Автор глибоко вшановує пам'ять д.б.н., професора Я.Г.Кішко, який започаткував вивчення лізогенії і бактеріофагії на Україні і був ініціатором цих досліджень.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на: IV з'їзді Українського мікробіологічного товариства (м. Донецьк, 1984 р.); Всесоюзному Симпозіумі, присвяченому 60-річчю Тбіліського НДСВС (м.Тбілісі, 1984 р.); Х конгресі мікробіологічного товариства Угорщини (м.Сегед, 1987 р.); XII Міжнародній конференції по електронній мікроскопії (м.Дрезден, 1988 р.); Міжнародному конгресі “Молекулярна організація біологічних структур” (м. Москва, 1989 р.); Республіканській конференції “Фітонциди. Бактеріальні хвороби рослин” (м. Львів, 1990 р.); Всесоюзній конференції “Мікробіологічні і біотехнологічні основи інтенсифікації рослинництва і кормовиробництва” (м. Алма-Ата, 1990), Міжнародній конференції “Мікробіологія і біотехнологія XXI століття” (м. Мінськ, 2002 р.)

Публікації. За темою дисертації опубліковано 35 наукових праць, в тому числі 23 статті у фахових виданнях. Пошукач – автор 10 особистих публікацій в центральних фахових журналах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, основної частини, яка включає 5 розділів власних досліджень і розділ “Об'єкти, матеріали і методи досліджень”, та висновків. Роботу викладено на 297 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 45 таблицями і 50 рисунками. Список використаних джерел містить 316 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

РОЗДІЛ 1. ЛІЗОГЕНІЯ І БАКТЕРІОЦИНОГЕННІСТЬ БАКТЕРІЙ (ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ)

Огляд літератури складається з двох підрозділів, які містять сучасну інформацію про лізогенію і віруси бактерій. У підрозділі “Бактеріальні віруси” розглянуто розповсюдження, класифікацію, спорідненість, походження та еволюцію бактеріофагів. Підвищену увагу приділено способам реалізації фагових генетичних програм (стратегія фагового геному), особливостям лізогенних систем та лізогенній фаговій конверсії. Другий підрозділ огляду стосується дефектної лізогенії і бактеріоциногенності у бактерій. На основі аналізу літературних джерел показано актуальність теми дисертаційної роботи та обгрунтовано доцільність проведення досліджень лізогенії і бактеріофагів важливих фітопатогенних бактерій E.carotovora.

РОЗДІЛ 2. ОБ'ЄКТИ, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В роботі використано 104 штами фітопатогенних пектолітичних бактерій E.carotovora і 7 штамів аміловороподібних бактерій E.horticola. Для різнопланових дослідів застосовані лабораторні штами ентеробактерій, псевдомонад, ксантомонад та агробактерій. Фаги ентеробактерій Е105, T2L, T4D, Т4amH11, Т7М, цII, P22, MS2, TuIIb, Ox2, л(papa), лCI857S7 і P1ctsCMr виступали як допоміжні об'єкти при вивченні лізогенії E.carotovora.

В роботі прийняті наступні позначення. Для штамів: E.carotovora підвидів . “carotovora” і “atroseptica”, а також E.aroideae - ECA, EAT і EAR, відповідно. Назви “макромолекулярний каротоворіцин” і “коліцинподібний каротоворіцин” позначені нами як “MCTV” і “CCTV”, відповідно. Для штамоспецифічних макромолекулярних каротоворіцинів вжито термін, який включає назву роду (E – Erwinia), підвиду (ca – carotovora, at – atroseptica, sp – підвид невідомий), а також номер штаму. Якщо вид MCTV ідентифіковано як бактеріоцин типу фагового хвостового відростка (хвостовий відросток дефектного бактеріофага), застосовано позначення TLCA (for tail-like carotovoricins).

Клітини E.carotovora культивували в повноцінних рідких середовищах LB, №1 і мінімальному середовищі А, або А з 1% пектином. Температура росту для E.carotovora, Erwinia spp., Pseudomonas spp., Xanthomonas spp. і Agrobacterіum spp. (LB-середовище) складала 25оС. Клітини Escherichia coli вирощували добу в середовищі LB при 37оС. Бактеріальні мутанти, лізогени та дисоціанти клонували не менше 2-х разів на відповідному агаризованому середовищі - LB, №1, АП і МПА. Фенотипові ознаки перевіряли в процесі отримання чистих ліній бактерій та їх мутантних форм.

Бактеріофаги титрували методом двошарового агару. Чисті лінії фагів одержували з окремих негативних колоній. Кожна лінія була результатом не менше ніж 5 пасажів фага на чутливому штамі.

Для індукції каротоворіцинів добову культуру (2 – 4х109 кл/мл) розводили в 20 разів у середовищі А, вирощували ще 3 год без аерації і додавали відповідний індуктор - мітоміцин С (МС), або налідіксову кислоту (НК). Кінцеві концентрації МС і НК складали 1 і 20 мкг/мл, відповідно. Лізати обробляли хлороформом, освітлювали центрифугуванням і зберігали при 4оС. Концентрацію бактеріоцинів виражали в плямоутворюючих одиницях на мл (ПУО/мл), або визначали за процентом клітин, які виживали після лізису каротоворіцинами (летальна доза – LD37%). Одиниця летальної дози відповідала кілерній активності MCTV - Aе.

В роботі запропоновано принципово новий підхід для вивчення бактеріоциногенності у E.carotovora. Як і у випадку бактеріофагів, каротоворіцини досліджували методом двошарового агару. Нижній шар містив 1,2%-ний агар LB, а верхній – м'який агар (0,5%), НК і клітини індикатора Nalr (чашки НКК). Досліди проводили за такою схемою. Налідіксову кислоту (20 мкг/мл) і суспензію клітин Nalr–мутанта додавали до м'якого разплавленого агару. Суміш ретельно перемішували і нашаровували на чашку з нижнім агаром. Клітини ервіній висівали за 2-3 доби до проведення досліду на звичайні LB-чашки. Бактерії переносили з матричних чашок на чашки НКК голковими реплікаторами. Використовували також рідкі суспензії клітин тестованих штамів. Суспензії (5х108 - 4х109 клітин/мл) або їх розведення об'ємами по 3 - 5 мкл наносили на чашки НКК і інкубували при 25 оС. Результати дослідів ураховували через 18 – 24 год.

Частки дефектних фагів E.carotovora концентрували й очищали дворазовим ультрацентрифугуванням (ротор SW28, Spinco L8-70, 24000 об/хв, 80 хв) і зберігали в 1 мл буферу SТ (10 мМ NaCl, 50 мМ Трис-НСl, рН 7,5).

Вивчення біологічних властивостей лізогенії і бактеріофагів проводили з використанням стандартних методів (Миллер, 1976). Коло бактерій-господарів для фагів встановлювали з використанням максимально можливого набору бактеріальних штамів.

Бактеріофаги 49, 59, Е105, F44, ZF40, Т2, Т4, цII, Т7, Ох2, ТuIIb і MS2 отримували методом зливного лізису в концентраціях 1–5х1011 БУО/мл. Помірні коліфаги л і Р1 виділяли методом термоіндукції.

Фагові частки концентрували центрифугуванням (26000 об/хв, ротор SW-28, 60 хв). Віріони очищали з допомогою ступінчатого й ізопікнічного центрифугування в хлористому цезії. Для фага ZF40, крім очищення в ступінчатому градієнті (1,4 і 1,6 г/см3, ротор SW-55, 40000 об/хв, 5 год), використовували дворазове диференційне центрифугування, метод освітлення лізатів (Девис с соавт., 1984) та гельфільтрацію на колонці з сефарозою 2В (8х200 мм). Частки фага ZF40 зберігали в буферах STM (50 мм NaCl, 50 мМ Трис-НСl, рН 7,5, 20 мМ MgSO4,) або STMG (STM + 100 мкг/мл желатини).

При електронномікроскопічних дослідженнях за стандарт розміру приймали довжину відростка бактеріофага Т4D - 113 нм (Ackermann, Krisch 1997).

Вивчення поліпептидного складу високоочищених фагових хвостових відростків і цілісних віріонів проводили за (Laemli, Favre, 1973).

Для виділення фагової ДНК послідовно змішували: 600 мкл очищеної фагової суспензії, 50 мкл 20%-ного розчину ДСН, 50 мкл пронази В (3 мг/мл) і 50 мкл 250 мМ Na2EDTA. Суміш інкубували 10 хв при 60 оС, додавали 200 мкл 5 М NaCl і здійснювали депротеїнізацію фенолом. ДНК осаджували 80%-ним етанолом. Суміш для рестрикції ДНК включала 5 мкл зразку, 2 мкл відповідного 10-ти кратного буферу для рестрикції, 1 - 2 мкл ендонуклеази (від 1 до 4 одиниць активності) й 11 - 12 мкл Н2О. Рестрикційні фрагменти розділяли в 0,5 - 1%-них гелях агарози. Для визначення відносної молекулярної маси використовували HindIII -фрагменти ДНК фага л (лCI857S7).

Виділення плазмідих ДНК E.carotovora проводили за методом Kado, Liu (1981). Суспензію бактеріальних клітин об'ємом 1,5 мл осаджували в мікроцентрифузі. Осад ресуспендували в 100 мкл буфера Е (40 мМ Тріс-ацетат, рН 7,9, 2 мМ Na2ЕДТА), а потім змішували з двома об'ємами лізисного розчину (50 мМ Трис-НCl, pH 12,6, 3% ДСН). Препарати прогрівали протягом 30 - 60 хв у водяному ультратермостаті при температурі 55оС і обробляли сумішшю кислого фенолу та хлороформу (1:1 за об'ємом). Після центрифугування лізатів водну фазу обережно відбирали пластмасовою піпеткою з розширеним кінцем. Для електрофорезу плазмідної ДНК використовували 0,7 - 1,0%-ні агарозні гелі. Розмір ДНК визначали за сумою рестрикційних фрагментів або з застосуванням референсних плазмід: pTi-C58(119 мД), F(63 мД), RP4(36 мД), RSF1010(5,7 мД) і pUC18 (1,75 мД).

Штами E.coli і S.typhimurium з плазмідами трьох груп несумісності (N, J і P) використовували як донори в транскон'югаційних дослідах. Для їх контрселекції застосовували тверде середовище АП з відповідним антибіотиком. Інкубаційні суміші містили рівні пропорції донора і реципієнта (штами E. carotovora). Після контакту (4 год, при 25оС) суміш висівали на селективні чашки. Фаг Т7 і MCTV використовували для додаткової ідентифікації донорних і реципієнтних штамів.

Мутанти E.carotovora, стійкі до налідіксової кислоти (Nalr), були отримані за (Милером, 1976). Для спонтанних мутантів ЕСА 62А, стійких до MCTV (тип RC), визначали здатність підтримувати розвиток фагів F44, Т7 і ZF40, а також чутливість до різних бактеріоцинів. Ауксотрофи His- одержували мутагенезом E.horticola 450 2-амінопурин нітратом та гідроксиламіном. Для тестування супресорних мутантів використовували дикий штам E.horticola 450 (su-- фенотип), E. coli gA120 (su-), HB 101 (supF44/su2+) та дикий тип фагу F44 з його amber-мутантами.

Популяційна дисоціація була досліджена у штамів ЕСА і ЕАТ, які зберігалися 16 років без пересівів. Ці штами E. carotovora розсівали до окремих колоній на LB-агарі, на лактозних агарах МС і ЕМВ.

Лізогенні варіанти чутливих штамів для фагів 49, 59, ZF40 і F44 одержували із вторинного росту культур в негативних фагових колоніях. Лізогени перевіряли на чутливість до гомологічного фага і на його спонтанний вихід. Clear-мутанти фага 49 одержували мутагенезом 1М гідроксиламіном (Девис с соавт., 1984).

Виділення ліпополісахарида (ЛПС) із клітинної стінки E.horticola 450 проводили після одержання L-мембран, які обробляли проназою В (200 мкг/мл) при 60 °С протягом 10 хв і депротеїнізували фенолом рН 8,1 (DePamphilis, Adler, 1971). Очищені препарати ЛПС були отримані методом ізопікнічного центрифугування в градієнті хлористого цезію. Для виділення ЛПС із клітин E.carotovora застосовували класичний фенольний метод (Westphal, Jann, 1965), або використовували обробку клітин Na2ЕDТА. В останньому випадку препарати ЛПС обробляли ДНК-азою І та РНК-азою. Далі їх очищали градієнтним центрифугуванням у CsCl. Стадія кінцевої очистки препаратів ЛПС з допомогою обробки фенолом була альтернативою градієнтному центрифугуванню. Чистоту одержаних препаратів ЛПС оцінювали методом спектрофотометрії в області 180-300 нм. Препарати ЛПС зберігали при 4оС. Для визначення моносахаридного сладу, проводили гідроліз ЛПС 2н трифтороцтовою кислотою протягом 5 год при 100оС, гідролізати ацетилювали (Захарова, Косенко, 1982), ацетати поліолів розділяли методом газорідинної хроматографії.

РОЗДІЛ 3.

БАКТЕРІОЦИНОГЕННІСТЬ E.CAROTOVORA

SOS-індуковані фактори E. carotovorа - бактеріоцини та бактеріофаги - були одержані під дією традиційних індукторів - мітоміцину С і налідіксової кислоти. Максимальний рівень індукції виявлено в логифмічній клітин стадії росту клітин при кінцевих концентраціях МС і НК - 1 та 20 мкг/мл, відповідно. В лізатах клітин виявлено два види бактеріоцинів. Термостійкі, коліциноподібні каротоворіцини (CCTV) утворювали на бактеріальних газонах широкі зони просвітлення. Чутливі штами для CCTV виявлено серед A.tumefaciens, E.herbicola, E.chrysanthemi, Klebsiella spp. i E.carotovora. Другий вид бактеріоцинів E.carotovora, макромолекулярні каротоворіцини (MCTV), ідентифіковано за здатністю осаджуватися при ультрацентрифугуванні. Індукція тільки одного штаму із 52 досліджених (Erwinia sp. ZM-1) призвела до виходу життєздатного помірного бактеріофага ZF40.

За формою і розміром зон лізису MCTV розділено на два типи, а за лізисною активністю (процент лізованих штамів) - на шість груп. Найбільш активні із них (група I) лізують від 62 до 73% штамів E. carotovora, тоді як бактеріоцини із групи VI здатні вбивати лише окремі штами або взагалі не проявляють автивності. До гетероімунних груп ІІІ і IV входять каротоворіцини, які не відрізняються за характером лізисної активності і вбивають до 29% чутливих штамів. В групу V включено дисперсний набір бактеріоцинів.

Фітопатогенні бактерії родів Pseudomonas, Xanthomonas і Agrobacterium, а також епіфітні бактерії E. herbicola нечутливі до лізисної дії макромолекулярних каротоворіцинів. Високоактивні MCTV із групи І і ІІ ефективно вражають штами E.coli K12 і В. Отже, MCTV не виступають факторами конкурентної взаємодії в межах бактеріальної асоціації, яка заселяє вражену рослину. Чутливість деяких ентеробактерій до MCTV вказує на їх тісну спорідненість з E.carotovora.

Бактеріоциногенність E.carotovora було проаналізовано за двома кількісними показниками: чутливістю штаму до MCTV (S) і лізисною активністю власного бактеріоцина (L). Це дозволило розділити досліджувані штами на два головні бактеріоцинотипи (БТ). Бактеріоцинотип з низькою чутливістю (S=0 – 27%) включає 28 штамів, а БТ з чутливістю в межах 40-67% налічує 24 штами. Серед 52 штамів E. carotovora не зустрічається жодного, бактеріоциночутливість якого знаходилась би в межах 27-40%. Кореляційний зв'язок між бактеріоциночутливістю і лізисною активністю каротоворіцинів виражається співвідношенням: S = 78 - L. Тобто, із збільшенням лізисної активності MCTV зменшується бактеріоциночутливість батьківського штаму, що дає підставу розглядати макромолекулярні бактеріоцини як множинні фактори E. carotovora. Ця гіпотеза отримала підтвердження при дослідженні чутливості бактеріальних мутантів, стійких до лізисної дії 14 різних каротоворіцинів. Було, зокрема, встановлено, що високоактивний препарат MCTV Еса35А гетерогенний і складається із різних за активністю каротоворіцинів. Виявлено бактеріальні R-мутанти, які остаточно не втрачають чутливості до даного бактеріоцина.

Для виявлення каротоворіцинів у роботі вперше застосовано бактеріальні індикатори, стійкі до дії налідіксової кислоти. Інформація, отримана за допомогою цього методичного прийому, значно розширила уявлення про бактеріоциногенність E. carotovora. Застосування десяти різних мутантів, стійких до НК (мутанти RN-типу), дало можливість встановити широке розповсюдження MCTV у пектолітичних ервіній. Серед 104 перевірених штамів E.carotovora 88% (91штам) містять біологічно активні MCTV. На бактеріоциногенність ервіній не впливає місце знаходження (країна і географічний регіон), рослина-господар і вік штаму. Це вказує на сталість (консервативність) генетичних детермінант MCTV. Отже, наявність макромолекулярних каротоворіцинів можна розглядати як видову ознаку E. carotovora. Вивчення каротоворіцинів з допомогою різних індикаторів Nalr показало певну автономність (“егоїстичність”) генетичних детермінант макромолекулярних каротоворіцинів. Допускається, що вони могли набуватися різними штамами в процесі горизонтальної передачі генів. Не виключено також, що генетичні детермінанти MCTV залишаються сталими при зміні окремих характеристик штамів при адаптації Е.carotovora до умов оточуючого середовища.

Для вивчення ліпополісахариду (ЛПС) зовнішньої клітинної оболонки, як рецептора для макромолекулярних каротоворіцинів, використовували штам ЕСА 48П та два бактеріоцини – Еса13А і Еса42А. Встановлено, що MCTV здатні адсорбуватися на молекулах ЛПС, одержаних екстракцією клітин E.carotovora Na2ЕДТА з наступною ферментною та фенольною обробкою. В конкурентних дослідах було показано, що летальна доза LD37% при наявності ЛПС складає 14 од., тоді як без ЛПС її значення дорівнює 33 од. Отже, молекули ЛПС конкурують з нативними рецепторними структурами бактеріальної клітини і дійсно є рецептором для MCTV. Додаткове підтвердження цього одержано на підставі порівняння швидкостей адсорбції каротоворіцинів на нативних клітинах і ЛПС. Адсорбція на нативних клітинах - швидкоплинний процес. За перші 2 хв адсорбується більшість часток MCTV. Наступна інкубації (від 2 до 60 хв) характеризується повільним насиченням адсорбції. Швидкість адсорбції каротоворіцину Еса13А на клітинах ЕСА 48П перевищує таку на ЛПС більше, ніж в 200 разів. Отже, очищені молекули виступають як малоефективні рецептори макромолекулярних каротоворіцинів, порівняно з молекулами ЛПС в складі клітинної оболонки. Висловлено припущення, що в складі зовнішньої клітинної мембрани молекули ЛПС знаходяться в особливій структурній конформації, яка залежить від найближчого оточення іншими компонентами. Оцінка кореляційного зв'язку між вмістом цукрів у коровій частині і в О-ланцюгу ЛПС штамів з їх бактеріоциночутливістю підтвердила, що рецептором для MCTV виступає О-ланцюг ЛПС E.carotovora. Визначено, що до складу рецепторних сайтів можуть входити такі моносахариди: фукоза, ксилоза, ліпофільні моносахариди Х1 й Х2 і, ймовірно, маноза. Враховуючи те, що ЛПС E.carotovora subsp. carotovora відіграє важливу роль в патогенності цих бактерій (Pirhonen and Palva 1988; Perombelon, 1992), MCTV можуть бути використані для одержання стійких мутантів зі зміненою вірулентністю.

В роботі започатковано вивчення взаємозв'язку між бактеріоциногенністю і патогенністю пектолітичних ервіній. Патогенний процес з участю E.carotovora супроводжується утворенням комплексу екстрацелюлярних ферментів, які причетні до деструкції серединної пластинки рослинної тканини (Barras et al. 1994). Типи ферментів та форми біохімічних реакцій, які вони здійснюють, різноманітні. Зважаючи на це, можлива оцінка патогенності кожного окремого штаму на основі конкретного типу ферментативної реакції. Для оцінки патогенності часто використовується якісний облік пектолітичної активності (Slade, Tiffin, 1984). Її кількісне визначення було розроблено при виконанні цієї роботи. Встановлено, що у більшості штамів ЕСА швидкість утворення зон розрідження поліпектату натрію постійна і визначається реакцією першого порядку. Аналіз розподілу пектолітичної активності 52 штамів пектолітичних ервіній показав природну дискретність цієї ознаки. Це вказує на множинність генетичних детермінант, які визначають пектолітичну активність.

Фаги і бактеріоцини широко застосовуються в типуванні бактерій (Ackermann, Gershman, 1992; Gratia, 1989), але про використання цих простих методів у випадку E.carotovora невідомо. Спроби фаготипування штамів ервініафагами 49, 59 і Е105 виявились невдалими, оскільки ці віруси не репродукуються в клітинах пектолітичних ервіній. Зауваження деяких авторів з приводу неможливості бактеріоцинотипування і використання його як таксономічного критерію для E.carotovora (Slade,Tiffin 1984), на наш погляд, є невиправданим. По-перше, утворення MCTV цими бактеріями є стабільною генетичною ознакою, по-друге, переважна більшість каротоворіцинів суттєво не втрачає активності протягом 1-2-річного зберігання при 4оС. Для бактеріоцинотипування було застосовано набір із тих макромолекулярних каротоворіцинів, значення L у яких складає від 32% - 77%. Було встановлено, що переважну більшість штамів E. carotovora subsp. carotovora можа віднести до 4 типів – І, ІІ, ІІІ і ІV. Бактеріоцинотипи від V до ІХ включають невелику дисперсну групу штамів ЕСА, які мають низьку чутливість до застосованих бактеріоцинів. Між бактеріоцинотипами E. carotovora та вищеописаними природними класами пектолітичної активності будь-якого взаємозв'язку не виявлено. В той же час, у групі штамів із середнім значенням параметру А відмічена позитивна кореляції між лізисною та пектолітичною активностю штамів-носіїв MCTV. Тому бактеріоцини в природних популяцій ервіній можуть відігравати особливу роль. Вони можуть впливати на патогенність цих бактерій опосередковано. Таким чином, на підставі одержаних результатів можна зробити висновок про існування природних класів пектолітичної активності серед Е.carotovora, які в основному співпадають з патотипами даних бактерій. Стабільна ознака бактеріоциногенності забезпечує надійну видову та штамову ідентифікацію в цій групі мікроорганізмів. Між лізисною активністю бактеріоцинів та пектолітичною активністю існує позитивна кореляція, яка відображує важливу роль каротоворіцинів в екології ервіній.

Вивчення бактеріоциногенності E.carotovora дозволило зробити кілька важливих теоретичних висновків. Генетичні детермінанти бактеріоцинів у цих бактерій експресуються при включенні бактеріальної SOS-системи, але в цих умовах помірні життєздатні бактеріофаги не утворюються. Так як каротоворіцини синтезуються у великій кількості при лізогенній індукції, то одержання життєздатних помірних ервініофагів традиційними способами може бути проблематичним. Можливо, з цієї причини нам не вдалося виявити інших бактеріофагів, окрім фага ZF40. Майже 100%-на наявність MCTV вказує на те, що бактеріоциногенність є видовою ознакою фітопатогенних пектолітичних ервіній. Незважаючи на те, що у пектолітичних ервіній одночасно зустрічаються два типи каротоворіцинів, основний прояв кілерної активності відбувається за рахунок MCTV. Коліцинподібні бактеріоцини менш активні щодо штамів E.carotovora.

РОЗДІЛ 4. ДЕФЕКТНА ЛІЗОГЕНІЯ E.CAROTOVORA

Бактеріальний світ характеризується двома основними типами лізогенії (Campbell, 1994; Прозоров, 1996). При справжній або “істинній” лізогенії профаги помірних бактеріофагів повною мірою реалізують як вегетативний, так і лізогенний шлях розвитоку. За наявності генетичених дефектів, профаги не здатні утворювати повноцінних нащадків. Серед пеповних фагових продуктів бактеріальної клітини часто спостерігають фагові хвостові відростки. Особлива увага до цієї складової частини віріону зумовлена її кілерною активністю. При цьому інколи не приймаються до уваги інші компоненти фагової частки, що не дає змоги скласти повне уявлення про дефектну лізогенію. Наявність дефектної лізогенії у E. carotovora вивчали з використанням 11 штамів різного походження. В спонтанних і індукованих лізатах клітин цих штамів з допомогою електронної мікроскопії постійно виявляли макромолекулярні компоненти фагових часток: хвостові відростки, головки і базальні пластинки. В очищених препаратах було знайдено кілька видів фагоподібних структур: нормальні хвостові відростки (NT), відростки із скороченим футляром (CS), окремі стержні відростка (TT), головки різних розмірів (РН) і окремі базальні пластинки (BP). Відносний вміст цих часток у клітинах E. carotovora наведено в табл. 1. Отримані дані свідчать про те, що утворення зазначених компонентів фагових часток при SOS-індукції відбувається в усіх досліджених штамах. В мітоміцинових лізатах клітин спостерігається більше часток типу фагових хвостових відростків, ніж в НК-лізатах. В останніх переважають компоненти типу базальних пластинок. Вміст фагових головок не залежить від роду індуктора і складає від 1 до 4 % (за виключенням штаму ЕСА 35А – 17%). Частка нормальних (нескорочених) відростків незначна – від 3 до 11%. Майже в усіх лізатах E.carotovora виявляються порожні футляри різної довжини. На відміну від нормальних

Таблиця 1

Процентний вміст компонентів фагових часток в індукованих лізатах E.carotovora.

Компоненти фагових часток Штам/індуктор1

ECA J2 ECA 62A ECA 35A ECA Ec153

НК МС НК МС МС

Фагові хвостові відростки2 10 76 33 59 28

Нормальні відростки 3 7 11 0 4

Скорочені футляри 7 49 21 38 24

Окремі стержні 0 20 1 21 0

Порожні футляри 3 2 0 4 36

Базальні пластинки 85 20 63 20 35

Фагові головки 2 2 4 17 1

Кількість всіх часток3 179 43 237 48 42

Примітка. 1 – НК, МС – налідіксова кислота і мітоміцин С, відповідно. 2 – загальна кількість хвостових відростків в лізаті, отримана як сума нормальних відростків, відростків зі скороченим футляром і окремих стержнів відростків. 3 – кількість часток на окремому електронномікроскопічному полі.

відростків, структури СS-типу мають виражену тенденцію до руйнування. При обчисленнях довжини (L) та ширини (W) скорочених футлярів каротоворіцинів були отримані значні середньоквадратичні відхилення (уn), які у випадку L складали від 4 до 6%, а для W – від 5 до 9%. Ці результати, а також спостереження СS-часток з різним розташуванням структурних субодиниць, вказують на неоднотипність фагових хвостових відростків у клітинах одного і того ж штаму. Статистичний аналіз виявив від одного до трьох модальних об'ємів (Vm) скорочених футлярів в індукованих лізатах ервіній. На основі значень Vm було встановлено розміри скорочених футлярів відповідних типів. Для кожного штаму E.carotovora притаманно не менше двох типів нормальних фагових хвостових відростків (табл.2). Їх довжина знаходиться в межах 128 –192 нм, а ширина складає 15 – 21 нм. Довжина жорстких стержнів відростків, які зустрічаються як окремі ТТ-структури, або в складі скорочених футлярів, співпадає з довжиною нормального відростка. Електронномікроскопічне вивчення адсорбції і кілерної дії нормальних відростків на чутливі клітини підтвердило, що ці частки є макромолекулярними каротоворіцинами типу фагових хвостових відростків (TLCA). Вони вбивають клітини E.carotovora “ззовні”. Частки TLCA можуть мати значну морфолого-структурну різноманітність. Наприклад, для штама ЕСА J2 характерно три типи відростків. До особливостей оного із них (ТLCA 44-1) слід віднести наявність поблизу вершини специфічного утвору (структура ANS – аномальна частина футляра). Структура ANS (19,5 х 18,2 нм) ТLCA 44-1 скорочується першою і, пересуваючись по стержню, може стимулювати його наступне скорочення.

Таблиця 2

Розміри хвостових відростків (нм), виявлених в індукованих лізатах 11 штамів E.carotovora.

Штам Назва Нормальний відросток Відросток з скороченим футляром

Футляр Стержень

L W L W L

ECA 35A TLCA 12-1 - - 61,0 21,8 150,0

TLCA 12-2 - - 62,9 23,4 159,0

TLCA 12-3 - - 60,1 25,4 -

ECA J2 TLCA 44-1 128,0 15,1 - 20,0 127,2

TLCA 44-2 128,6 13,4 49,4 17,0 122,0

TLCA 44-3 153,6 15,0 68,4 20,2 134,0

ECA 62A TLCA 5-1 135,5 15,1 - - 134,7

TLCA 5-2 147,5 17,2 58,3 19,0 146,4

TLCA 5-3 - - - - 160,5

ECA Ec153 TLCA 29-1 135,8 15,9 54,4 18,3 134,0

TLCA 29-2 146,2 17,3 57,3 21,0 147,5

ECA 48A TLCA 25-1 161,0 16,4 68,5 21,1 160,0

TLCA 25-2 - - 66,8 26,8 -

EAR 3A TLCA 11-1 187,0 18,8 70,0 26,0 -

TLCA 11-2 192,0 21,6 68,5 28,0 -

ESP ZM-1 TLCA 40-1 184,0 - - - -

TLCA 40-2 - - 52,8 16,4 -

EAR g48 TLCA 2-1 - - 58,3 21,5 -

TLCA 2-2 - - 61,6 25,4 -

ECA 59A TLCA 55-1 - - 55,3 21,8 -

TLCA 55-2 - - 61,4 17,2 -

ECA 4A TLCA 36-1 - - 66,4 24,7 -

TLCA 36-2 - - 68,0 27,3 -

ECA M2-4* TLCA 50-1 - - 42,9 14,3 -

Примітка. “-“ означає, що частки не виявлені в очищених суспензіях, або дослідження не проводились. * - виміряно 10 часток

Три типи структур, схожі на фагові головки, було виявлено в індукованих лізатах ЕСА 35А (табл. 3). Деякі із них мали виражену полярність, яка характеризує портальні вершини капсиду. Переважна кількість головок цього штаму, ймовірно, заповнена нуклеїновою кислотою невідомої природи і походження. В лізатах штаму ЕСА Ес153 було виявлено два типи РН-структур. Один із них представлено незаповненими головками діаметром 66,2 нм, другий – мініголовками з діаметром 18,7 нм, яким властиве приєднання до нормальних відростків TLCA 29-1 і TLCA 29-2. Було виявлено аналогичні мініголовки, які прикріплено тонкими нитками до аномально довгих хвостових відростків (417 нм). Для штаму ЕСА 62А характерні незаповнені головки еліпсоїдної форми (середній діаметр - 92 нм), які інколи асоційовані з нормальними відростками TLCA 5-1. В жодному випадку не спостерігали головок, приєднаних до відростка зі скороченим футляром, а також жодної нормальної фагової частки.

Таблиця 3

Головки і базальні пластинки дефектних фагів деяких штамів E.carotovora

Штам Діаметр головки (нм) Діаметр базальної пластинки (нм)

Тип 1 Тип 2 Тип 3 Тип 4

ECA 35A - 55,4 75,0 98,2 -

ECA J2 - 59,0 67,0 - 39,7

ECA Ec153 18,7 - 66,2 - 45,6

ECA 62A - - - 92,0 44,5

ECA 48A - - - - 50,0

ECA 4A - - - - 53,0

Примітка. “-“ – означає, що результатів отримати не вдалося.

Діаметр часток типу базальних пластинок складає 39,7 – 53 нм (табл. 3). Базальні пластинки не завжди виявляються в складі структур NT, дистальні кінці яких мають короткі кінцеві нитки. Детально проаналізовано базальні пластинки, знайдені в клітинах ECA J2 (BPJ). Виявлено 4 конформаційних стани BPJ. У вільному стані вони набувають такі форми: “велосипедного колеса”, неупорядкованих “клубків” і симетричних округлих “клубків” з добре вираженою центральною частиною. Дві останні конформації BPJ можуть переходити в структуру, яка має більше, ніж шість попарно розміщених жорстких ниток довжиною 56 – 58 нм. Середній діаметр BPJ всіх конформацій складає 39,8 нм (уdn