НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

Топчій Наталія Миколаївна

УДК 577.24: 575.16: 577.113.4

Фрагментація і метилування ДНК листків цукрового буряка

(Beta vulgaris L.) при запрограмованій загибелі клітин

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі загальної та молекулярної генетики Київського національного університету ім. Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Демідов Сергій Вікторович

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,

завідувач кафедрою загальної та молекулярної генетики

біологічного факультету

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Матишевська Ольга Павлівна

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії біологічного факультету

кандидат біологічних наук

Сорочинський Борис Володимирович

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України,

завідувач лабораторією клітинної радіобіології

Провідна установа: Національний аграрний університет Кабінету Міністрів

України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “12” вересня 2002 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 01143, м. Київ 143, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Автореферат розісланий “12” серпня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Науменко В.Д.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Останнім часом значний науковий інтерес привертає дослідження запрограмованої загибелі клітин (ЗЗК) рослин, яка відбувається у різні періоди їх розвитку, а також у відповідь на біотичні та абіотичні стимули (Greenberg, 1994; Grbic et all., 1995; Danon et all., 2000;). Запрограмована загибель клітин є активним процесом, який має різні форми прояву і механізми протікання.

ЗЗК рослин має місце під час старіння, термінальної диференціації, відповіді на патогенний вплив (Jones, 2001). Старіння листка – завершальний етап його розвитку, під час якого здійснюється мобілізація поживних речовин до репродуктивних, запасаючих органів, котрий закінчується в кінцевому результаті його загибеллю (Полевой и др., 1991; Buchan-Wollaston, 1994). За сучасними уявленнями даний процес є генетично-детермінованим і може прискорюватись під дією факторів оточуючого середовища (Jones, 2001; Nam, 1997), але його молекулярно-генетичні особливості вивчені недостатньо і фрагментарно. Майже не визначені причинно-наслідкові зв’язки, а також компоненти регуляторних шляхів ЗЗК.

Ферментативне метилування цитозинових залишків у складі ДНК, яке впливає на молекулярно-генетичні процеси, зокрема, на експресію генів еукаріот, розглядається, як один з можливих механізмів старіння тваринних клітин (Doerfler, 1983; Храпунов и др., 1987; Мазин, 1993; Martinssen et all., 1995). Однак роль цієї модифікації ДНК у процесах запрограмованої загибелі рослинних клітин невідома. В зв’язку з цим, набуває актуальності питання щодо змін рівня метилування цитозину в специфічних послідовностях як окремих генів, так і геному взагалі. Аналіз характеру та природи диференційно метильованих послідовностей ДНК сприяє розумінню ролі цієї ферментативної модифікації в процесах генетичної регуляції. Тому актуальним є вивчення процесу метилування цитозину ДНК цукрового буряка (Beta vulgaris L.), для якого досліджений характер диференціальної експресії генів під час старіння листків (Тищенко и др., 1991).

До недавнього часу залишалось не з'ясованим, чи відбувається у рослин природна запрограмована загибель клітин у формі апоптозу, який є найбільш вивченим різновидом програмованої загибелі клітин тварин і відбувається послідовно через серію морфологічних та біохімічних змін. Надійним критерієм даного процесу є специфічна деградація ДНК, яка виявляється за допомогою електрофорезу ДНК в агарозному гелі або за допомогою TUNEL-процедури (O’Brien et all., 1998; Studzinski, 1999).

Однак, запрограмована загибель клітин не завжди пов’язана з апоптозом: в ядрах клітин листків тютюну та алейронового шару насіння ячменю (Fath et all., 1999; Mittler, 1995) не виявлено характерної для апоптозу міжнуклеосомної фрагментації ДНК.

Цукровий буряк (Beta vulgaris L.) є важливою сільськогосподарською культурою України. Його продуктивність значною мірою визначається рівнем функціональної активності листків та синтезом в них сахарози (Кружилин и др., 1966; Сакало и др., 2001). Дослідження механізмів старіння листків надасть можливості зрозуміти ті генетичні та метаболічні процеси, які впливають на продуктивність цієї культури. В зв’язку з цим, в даній роботі досліджували молекулярно-генетичні особливості процесу старіння листків цукрового буряка.

Зв’язок роботи з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри загальної та молекулярної генетики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Вона виконана у рамках тем № 97086 “Особливості структурної організації хроматину еукаріот, які визначають ефективність дії на ДНК фізичних та хімічних факторів” (№ Держреєстрації 0197U003138) і № 01БФ036-06 “Вплив біологічно-активних речовин та еластичних напружень ДНК на будову хроматину в ядрах клітин” (№ Держреєстрації 0101U002169) комплексної наукової програми “Здоров’я людини”.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було вивчення закономірностей деградації і метилування ДНК клітин мезофілу листків цукрового буряка (Beta vulgaris L.) при запрограмованій загибелі клітин.

Об’єкт дослідження – молекулярні механізми природної запрограмованої загибелі клітин рослин.

Предмет дослідження –процеси деградації сумарної та ядерної ДНК; сайт-специфічне метилування ДНК; цукровий буряк; листки.

Відповідно до цього, були поставлені такі задачі:

-

-

-

-

-

Методи дослідження. Для дослідження динаміки деградації ДНК використовували методи виділення ядер, сумарної і ядерної ДНК, електрофорез ДНК в агарозних гелях, спектрофотометричні вимірювання та хроматографію сумарної ДНК на оксіапатиті. Для вивчення сайт-специфічного метилування ДНК застосовували метод гідролізу ДНК чутливими до метилування ферментами рестрикції, електрофорезу ДНК в агарозних гелях та денситометрії. Обробка результатів досліджень проводилась за допомогою прикладних комп’ютерних програм.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті проведених досліджень показано, що під час природної запрограмованої загибелі клітин мезофілу листків цукрового буряка спостерігається фрагментація ДНК, яка відрізняється від міжнуклеосомної фрагментації ДНК, характерної для апоптозу. Вперше показано, що відмінною рисою даного процесу є конформаційні зміни сумарної ДНК, які пов’язані з дестабілізацією її подвійної спіралі.

Вперше показано, що в вегетативних органах цукрового буряка відбувається диференційне метилування сайт-специфічних послідовностей ДНК. Передбачається участь даної модифікації ДНК в генетичній регуляції процесу морфогенезу вегетативних органів B. vulgaris.

Вперше встановлено, що під час запрограмованої загибелі клітин рослин змінюється характер метилування цитозинових залишків у сайт-специфічних послідовностях ДНК. Показано, що протягом ЗЗК здійснюється гіпо- чи гіперметилування, або підтримка незмінного рівня метилування залишків цитозину в сайт-специфічних паліндромних послідовностях ДНК.

Практичне значення роботи. Модифіковані нами методи виділення ДНК і ядер з клітин мезофілу листків цукрового буряка можуть бути застосованими у науково-дослідній практиці під час вивчення запрограмованої загибелі клітин інших рослин.

Конформаційні зміни ДНК, які пов’язані з дестабілізацією її подвійної спіралі, можна використовувати як критерій природної запрограмованої загибелі рослинних клітин. Виявлена варіабельність метилування специфічних паліндромних ділянок ДНК може бути корисною для подальшого вивчення генетичної регуляції процесів ЗЗК та морфогенезу рослин.

Викладені в дисертації дані можуть бути використані під час проведення навчальних курсів з генетики, біохімії та молекулярної біології для студентів вищих навчальних закладів.

Особистий внесок здобувача. Постановка досліджень та інтерпретація отриманих результатів було проведено спільно з науковим керівником д.б.н. Демідовим С.В. Всі результати даної дисертації отримано дисертантом особисто або за його безпосередньою участю у співробітництві з к.б.н., в.о. зав. відділу генетичної інженерії Інституту фізіології рослин і генетики НАНУ Тищенко О.М. Дисертантом особисто здійснені підбір та обробка літературних даних, статистична обробка результатів досліджень за темою дисертації.

Апробація роботи. Основні результати дисертації були представлені на Міжнародній науковій конференції “Регуляция роста, развития и продуктивности растений” (Мінськ, 1999); конференції студентів та молодих науковців, присвяченій 100-річчю генетики “Conference on Genetics and Molecular Biology” (Львів, 2000); міжгалузевій Конференції молодих вчених-2000 (Київ, 2000); ХІІ конгресі федерації Європейської спільноти фізіологів рослин “Plant Physiology and Biochemistry” (Будапешт, Угорщина, 2000).

Публікації. Результати роботи представлені у 6 статтях і 4 тезах, які опубліковані у профільних вітчизняних журналах та вітчизняних і зарубіжних збірниках матеріалів конференцій та конгресу.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 140 сторінках друкованого тексту. Робота складається зі вступу, огляду літератури, характеристики методів, результатів досліджень та їх обговорення, підсумку, висновків, списку використаних джерел з 304 найменувань, 30 рисунків, 8 таблиць.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктом дослідження була ДНК, виділена з 7- 8 -х листків цукрового буряка сорту Білоцерківський однонасінний-45 на різних стадіях їх старіння: С1, С2, С3, С4, С5 – умовно визначених нами, як стадії, на яких відбувається пожовтіння 0-5 %, 5-25 %, 25-50 %, 50-75 % і 75-100 % площі поверхні листка цукрового буряка відповідно. С0 – зелений листок молодої рослини, яка вегетує. Досліджувалась також ДНК 6-ти денних етіольованих паростків: гіпокотилю разом з сім’ядолями (стебельця) і кореня. Рослини цукрового буряка вирощували в умовах вегетаційних дослідів у 16-ти кг посудинах з темно-сірим опідзоленим грунтом при природному освітленні. Для одержання етіольованих паростків насіння цукрового буряка стерилізували у 30 %-ному перекису водню і пророщували в рулонах фільтрувального паперу, змочуваного дистильованою водою, у термостаті при 25 ?С у темряві протягом 6-ти діб.

Сумарну ДНК клітин мезофілу листків, а також 6-ти денних етіольованих паростків цукрового буряка виділяли за розробленою нами методикою, в основі якої лежить метод Делапорта (1983).

Листові пластинки (без черешків і центральних прожилок), подрібнювали в рідкому азоті, додаючи для зв’язування поліфенолів 5-6 % Polyclar AT і буфер, який містив 0,1 М трис-HCl (рН 8,2), 0,1 М NaCl, 0,1 M аскорбінову кислоту, 1% -меркаптоетанол, 5% парааміносаліцилову кислоту, 1% діетилдитіокарбамат, 2-3% Ds-Na, 0,05 або 0,1 М ЕДТА. Нуклеїнові кислоти осаджували 2,5 об’ємами етанолу або 0,5 – 1 об’ємом ізопропілового спирту протягом ночі при температурі –12 С, після чого їх розчиняли у ТЕ-буфері (Маниатис и др., 1984) (10 мM трис-HCl (рН 7,4), 1 мM EДТА), вносили NaCl і РНКазу А до кінцевих концентрацій 0,5 М і 100 мкг/мл відповідно та інкубували при 37 С 1 годину. ДНК осаджували 0,5-1 об’ємом ізопропанолу при температурі –12 –18 0С, осад ДНК промивали тричі 70%-ним етанолом і розчиняли у ТЕ-буфері.

Спектральні характеристики концентрації і якості препаратів ДНК визначали на спектрофотометрі “М-40” (“Сarl Zeiss”, Jena).

Для дослідження особливостей вікових змін ДНК використовувався модифікований нами сечовино-фосфатний метод (Britten et al., 1968). Рослинний матеріал гомогенізували у буфері, який містив 1 М NaCl, 0,1 M ЕДТА, 0,03 М або 0,05 М ФБ (ФБ – буфер, який містить еквімолярні розчини NaH2PO4 і Na2HPO4), 0,001 М ЕГТА, 0,1 мM PMSF, 1%-ний Ds-Na. Лізат інкубували при 55-60 ?С 5 хв, центрифугували, додавали РНКазу А та вносили сечовину, NaCl, ФБ, Ds-Na до кінцевих концентрацій, які відповідно дорівнювали 8 М, 1М, 0,03М і 1% при 25 ?С та нашаровували на оксіапатит. Оксіапатит промивали спочатку 20 об’ємами (відносно об’єму оксіапатиту) 8М сечовиною, яка містила 0,03М ФБ+1М NaCl, потім послідовно 0,03М ФБ і 0,12М ФБ. Нативну ДНК елюювали 0,4М ФБ при 25 0С і 0,12 М ФБ при 98 0С. Вміст одноланцюгової ДНК визначали як частку від загальної кількості внесеної ДНК, враховуючи різницю в коефіцієнтах екстинкції одно- та дволанцюгової ДНК (Britten et al., 1968):

Термічну денатурацію сумарної ДНК проводили на спектрофотометрі СФ-16 (“ЛОМО”, Росія) згідно рекомендацій М. Манделя і Дж. Мармуру (1970). Визначення вмісту гуаніну та цитозину в ДНК здійснювали за допомогою кривих плавлення в 0,1М SSC (стандартному сольовому цитратному буфер: 0,15 М NaCl + 0,015 цитраті натрію, рН 7,0).

Ядра одержували за частково модифікованим нами методом (Іскакова, Айтхожина, 1988). Для цього рослинні тканини витримували 1 хв в діетиловому ефірі, потім промивали охолодженою бідистильованою водою і гомогенізували у буфері А, якій містив 0,025 М KCl, 0,0025 M ацетат магнію, 0,005 М -меркаптоетанол, 0,02 М триетаноламін з рН 7,6, 0,25 М цукрозу, 0,001 М PMSF, 0,002 M EГТА (5 мл буфера на 1 г тканини). Гомогенат фільтрували крізь капрон і Miracloth (“Calbiochem”, США), нашаровували на ступінчатий градієнт концентрації гліцерину. Всі маніпуляції виконували при 4 С. Якість препаратів контролювали мікроскопічно. Кількість ядер визначали у камері Горяєва за допомогою мікроскопу “NU-2” (“Carl Zeiss”, Jena).

Ядерну ДНК (яДНК) виділяли за частково модифікованим нами методом Паула і Ферла (1988). Суспензію ядер центрифугували 3 хв при 10 000 об/хв, осад ядер ресуспендиювали в буфері, який містив 0,2 М ацетат натрію, 5 мM CaCl2, 0,1 мM PМSF, 50 % гліцерин, знову центрифугували 3 хв при 13 000 об/хв. і ресуспендиювали в буфері, якій містив 0,1 М трис-НСl, рН 8,0, 0,05М ЕДТА, 0,5 М NaCl, 0,01 M ?-ME), протеіназу К з кінцевою концентрацією 100 мкг/мкл, 2 % Ds-Na та інкубували 1 год при 37 0С. Додавали ацетат калію (рН 4,5) до кінцевої концентрації 1,2 М, інкубували на льоду 30 хв. і центрифугували при 13 000 об/хв. ДНК осаджували ізопропанолом.

Для проведення гідролізу ДНК чутливими до метилування рестриктазами виділену ДНК обробляли рестриктазами: MspI, XhoI, PvuII, SalI, SmaI, DraII, Sau3AI, EcoRII , MboI, PstI, HindIII. Проби інкубували у відповідних буферах на протязі 3-5 годин при 37 ?С, крім SmaI, яку інкубували при 25 0С. Препарати очищеної ДНК тестували на присутність інгібіторів ферментів рестрикції шляхом сумісного гідролізу з ДНК бактеріофага ?. Підбирали умови, достатні для повного гідролізу ДНК кожною рестриктазою. В якості стандарту використовували нативну ДНК.

Електрофорез гідролізованої ДНК проводили в агарозних гелях при 3-4 в/см протягом 3-6 годин. В якості джерела струму, використовували прилад “LKB BROMMA” (Швеція). Інтенсивність флуоресценції бромистого етидію визначали на сканері TLC (“CAMAG”, Швейцарія) в області видимого світла (? = 437 нм).

Статистичну обробку даних проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ВИДІЛЕННЯ ДНК З ЛИСТКІВ ЦУКРОВОГО БУРЯКА ТА ЇЇ ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ

Одержання препаратів ДНК – першочергове завдання для дослідження характеру деградації і стану метилування ДНК протягом старіння листків цукрового буряка. Для цього необхідно було одержати максимально очищені від домішок і мінімально деградовані препарати ДНК з урахуванням особливостей рослинних тканин, їх хімічного складу і анатомічної будови.

В даній роботі найбільш ефективними методами виділення сумарної ДНК з листків B. vulgaris виявився метод Деллапорта і сечовино-фосфатний метод, які були нами частково модифіковані. Модифікація методу Деллапорта полягала в змінах умов виділення препаратів ДНК: введення до складу екстракційного буферу Polyclar AT, діетилдитіокарбамату аскорбінової та парааміносаліцилової кислот, зміні концентрацій NaCl та ЕДТА, умов інкубації гомогенату. Це дозволило одержати якісні препарати ДНК з мінімальною кількістю домішок полісахаридів і білків, про що свідчили як їх спектральні характеристики (А260/А230 = 2,1 – 2.3, А260/А280 = 1,8-1,9), так і дані термічної денатурації.

Для вивчення конформаційного стану сумарної ДНК під час старіння листків цукрового буряка використовували сечовино-фосфатний метод виділення ДНК, який дозволяє відділити дволанцюгову ДНК від одноланцюгової ДНК та РНК. Модифікація методу полягала у тому, що, по-перше, в лізуючий буфер додатково вводили сполуки, які пригнічують активність ДНКаз та серинових протеаз, зокрема ЕГТА і PMSF (Хеймс, Хиггинс, 1987). Крім того попередньо здійснювали обробку сумарного препарату нуклеїнових кислот РНКазою А.

В даній роботі в якості іонообмінника використовували оксіапатит, розділ молекул нуклеїнових кислот відбувався за рахунок збільшення іонної сили ФБ. Використання ФБ різних концентрацій пов’язано з тим, що одно- та дволанцюгові молекули ДНК і білки неоднаково міцно зв’язуються з частинками фосфату кальцію і тому елююють при різних концентраціях ФБ. Так, при 0,03 М ФБ відбувається елюція олігонуклеотидів, 0,12 М ФБ – одноланцюгової ДНК, 0,4 М ФБ - дволанцюгової ДНК. Збільшення температури до 98 0С призводить до денатурації міцно зв’язаних фрагментів ДНК і їх елюції з оксіапатиту .

Як відомо, до складу сумарної ДНК рослин, крім ядерної, входять хлоропластна і мітохондріальна ДНК. Більша частина генетичної інформації клітин міститься в яДНК, істотно менша – в ДНК клітинних органел (хлоропластах та мітохондріях). У зв’язку з важливою роллю, яку відіграє яДНК у процесах генетичної регуляції ЗЗК, вивчали особливості її деградації. При виділенні ядерної ДНК використовували частково модифікований нами метод (Paul et al., 1988), основу котрого складає метод очистки нуклеїнових кислот від полісахаридів і білків комплексною сіллю К-DsNa. Модифікація методу полягає у підборі оптимальних умов виділення ДНК (зміна температури інкубації, зміна концентрацій компонентів лізуючого буфера і додавання до його складу крім ЕДТА, таких інгібіторів, як ЕГТА і PMSF) (Хеймс и др., 1987). Це дозволило одержати чисті препарати яДНК, якість яких перевіряли спектрофотометрично, а розмір молекул ДНК визначали методом електрофорезу в агарозному гелі.

Застосований метод виділення ядер клітин мезофілу листків цукрового буряка дозволив одержати чисті неушкоджені ядра без цитоплазматичних домішок. Одержані результати визначення кількості ядер на різних стадіях пожовтіння листків представлені в табл. 1.

Вони свідчили про те, що в зелених листках молодих рослин цукрового буряка кількість ядер становила в середньому (9,1 ± 0,02) х107 на 1 г тканини. По мірі старіння листків їх кількість зменшувалась поступово, і, наприклад, на стадії С4 в середньому становила (5,9±0,01) х107 на 1 г тканини, тобто коли площа поверхні пожовтіння листка складала 50 – 75 %, кількість ядер відносно молодих зелених листків зменшувалась в ~1.5 рази. Це узгоджується з існуючими даними про зменшення кількості клітин під час старіння листків рослин, наприклад, сої (Кармадонова и др.,1989), а також про зменшення кількості сумарної ДНК в процесі онтогенезу листків вищих рослин.

Таблиця 1

Визначення кількості ядер мезофілу листків цукрового буряка

на різних етапах ЗЗК

№ | Стадія ЗЗК | Кількість ядер мезофілу на 1 г тканини, ? 10-7

1. | С0 | 9,1 ± 0,02*

2. | С1 | 8,9 ± 0,03*

3. | С2 | 7,9 ± 0,02*

4. | С3 | 6,7 ± 0,01*

5. | С4 | 5,9 ± 0,01*

Примітка. * - різниця статистично достовірна. .

Для одержання інформації про склад основ та їх розташування вздовж ниток ДНК цукрового буряку застосовували метод термічної денатурації. Крім того, цей підхід дозволяє визначити якість препаратів ДНК стосовно рівня її полімерності, наявності чи відсутність домішок РНК (Лобов и др., 1986).

На рис. 1 представлена крива плавлення препаратів ДНК зелених листків молодих рослин цукрового буряка. Стрілочкою відмічене значення температури плавлення ДНК 68,7 0С, при якому величина поглинання досягає половини максимальної.

Відомо, що температура плавлення ДНК рослин може залежно від виду рослин бути різною (Лобов и др., 1986). Вміст ГЦ-пар основ у ДНК листків цукрового буряка, розрахований з урахуванням значення Тпл, становить 34,1 %. Подвійне стандартне відхилення, що характеризує розподіл основ вздовж ниток ДНК дорівнює 17,1 % ГЦ, що свідчить про гетерогенне розташування ГЦ-пар вздовж ниток ДНК. Виявлений за допомогою зазначеного методу гіперхромний ефект складав приблизно 34-35 %. Термічна денатурація спостерігалась після 60 оС, що вказує на відсутність домішок РНК в препаратах ДНК. За нуклеотидною послідовністю геном цукрового буряка, як і більшість вивчених видів вищих рослин, належить до АТ-типу. Крім того, представлена крива плавлення свідчить про те, що сумарна ДНК листків цукрового буряка відповідає критеріям, необхідним для проведення молекулярно-генетичних досліджень.

ДЕГРАДАЦІЯ ДНК ПРИ ЗАПРОГРАМОВАНІЙ ЗАГИБЕЛІ КЛІТИН

ЛИСТКІВ ЦУКРОВОГО БУРЯКА

Вивчення структурного стану сумарної ДНК дозволило встановити деякі особливості процесу деградації ДНК протягом старіння листків рослин. Результати розподілу у 0,8 %-ному агарозному гелі фрагментів сумарної ДНК листків цукрового буряка на різних стадіях старіння представлені на рис. 2. В даному експерименті ДНК виділяли при однакових умовах. На кожну доріжку внесено приблизно по 6 мкг ДНК.

В проведених експериментах спостерігалося поступове збільшення електрофоретичної рухомості фрагментів ДНК по мірі старіння клітин листків. Так, спостерігається поступове збільшення електрофоретичної рухомості як високомолекулярних, так і низькомолекулярних фрагментів ДНК, виділеної з листків з пожовтінням більше 50 % площі поверхні листка.

Для кількісної оцінки змін електрофоретичної рухомості ДНК був проведений спектроденситометричний аналіз електрофореграми сумарної ДНК.

Результати такого визначення підсумовано на гістограмі (рис.3). Вміст ДНК оцінювали за площею смуг, які відповідають: S1, S2, S3 – фрагментам довжиною більше 23 тисяч п.н., від 23 тисяч п.н. до 6,6 тисяч п.н. і менша 6,6 тисяч п.н., відповідно.

По мірі старіння листків кількість високомолекулярних фрагментів сумарної ДНК зменшується, а низькомолекулярних – зростає. Так, на стадії старіння С1 вміст високомолекулярних фрагментів сумарної ДНК з молекулярною масою більше 23 тисяч п.н. складає 22,3 ± 3,8, на стадіях С2, С3 і С4 – 8,7 ± 1,3, 3,8 ± 0,7 та 0,7 ±0,1, відповідно. В той час вміст фрагментів ДНК довжиною більше 6,6 тисяч п.н. на вказаних стадіях дорівнює 12,2 ± 2,6, 52,2 ± 9,9, 50,8 ± 9,9, 72,1 ± 12,2. Тобто з віком відбувається посилення фрагментації сумарної ДНК.

Відомо, що однією з основних рис апоптозу у тварин (Reed, 2000) та деяких індукованих форм запрограмованої загибелі клітин у рослин (Самуилов и др., 2000) є розщеплення ДНК у міжнуклеосомних ділянках. Однак, одержані нами дані свідчать про те, що сумарна ДНК листків на стадіях старіння С1, С2, С3 і С4 представлена набором фрагментів ДНК, розміри яких перекриваються, але складають не менше тисячі пар нуклеотидів. Присутності продуктів олігонуклесомної фрагментації ДНК не виявлено.

Оскільки до складу сумарної ДНК листків, крім ядерної, входить ДНК хлоропластів і мітохондрій, для з’ясування питання про те, чи відбувається і яким чином деградація яДНК, її виділяли із ядер мезофілу листків на різних стадіях старіння. В зв’язку з цим аналізували динаміку деградації ядерної ДНК протягом програмованої загибелі клітин листків.

Детальну інформацію про розподіл фрагментів ДНК дає метод електрофорезу в 0,6 %-ному та 1,5 – 2 %-них агарозних гелях, в яких ефективно розділяються фрагменти лінійних молекул ДНК розміром 1-20 тисяч п.н. і 0.1 - 4 тисячі п.н., відповідно (Маниатис и др., 1984).

На рис.4 представлена електрофореграма розділеної у 1,7 %-ному агарозному гелі яДНК листків цукрового буряка на стадіях С0 і С2. Одержані результати свідчать про те, що на стадії старіння С2 відбувається фрагментація яДНК.

На рис.5 представлені результати електрофорезу у 1,7 %-ному агарозному гелі ядерної ДНК листків B. vulgaris на стадіях старіння С3 і С4. Наведені дані свідчать про те, що в листках по мірі старіння спостерігається зростання інтенсивності деградації ядерної ДНК. Крім того, розподіл фрагментів ДНК за молекулярними масами носить неперервний характер. Слід підкреслити, що фрагментів яДНК з молекулярною масою приблизно тисячу п.н. нами не виявлено. Внаслідок цього можна зробити висновок про те, що природна загибель клітин цукрового буряку відрізняється від апоптозу, для якого характерна деградація ДНК з утворенням фрагментів, кратних нуклеосомній ДНК (~180 п.н.).

З метою оцінки конформаційного стану сумарної ДНК листків цукрового буряка протягом старіння проводили іонообмінну хроматографію ДНК на оксіапатиті. Результати аналізу проведеної хроматографії представлені на рис.6.

Вони свідчать про те, що на пізніх етапах старіння значна кількість молекул ДНК зазнає конформаційних змін, пов’язаних з руйнуванням її подвійної спіралі. Поряд з дволанцюговими виявлені і одноланцюгові фрагменти ДНК. При цьому одноланцюгових фрагментів виявлено майже вдвічі більше, ніж дволанцюгових.

Слід відмити, що даний метод дозволяє зробити кількісну оцінку деградації ДНК на пізніх стадіях старіння. На ранніх етапах старіння така оцінка є якісною в зв’язку з тим, що основна маса фрагментів є досить високомолекулярними і вони можуть необоротно зв’язуватись з оксіапатитом. Для кількісної оцінки конформаційного стану ДНК на ранніх етапах природної ЗЗК краще використовувати інші методи.

Комп’ютерний аналіз результатів хроматографії сумарної ДНК листків цукрового буряка на різних стадіях старіння узагальнений в таблиці 2.

Отже, одержані дані підтверджують наявність деградації в клітинах старіючих листків цукрового буряка – фрагментацію ДНК на різних стадіях старіння, яка з віком листків посилюється, а також підтверджують гіпотезу про різні шляхи ЗЗК рослин (Fath et al., 1998).

Таблиця 2

Результати елюції сумарної ДНК старіючих листків цукрового буряка

№ | Стадія старіння | О.ДНК (%) | Д.ДНК (%) | О.ДНК (мкг/г) | Д.ДНК (мкг/г)

1. | С3 | 49,7±1,2* | 49,3±1,2* | 9,3±0,6* | 9,2±0,6*

2. | С4 | 67,9±1,5* | 32,1±1,0* | 9,7±0,6* | 4,6±0,4*

3. | С5 | 69,4±1,5* | 30,6±1,0* | 7,2±0,5* | 3,2±0,3*

Примітка: *- різниця статистично достовірна. О.ДНК – фрагменти одноланцюгової ДНК. Д.ДНК - фрагменти дволанцюгової ДНК

МЕТИЛУВАННЯ ДНК В ОНТОГЕНЕЗІ ЛИСТКІВ ЦУКРОВОГО БУРЯКА

Для тварин ферментативне метилування залишків цитозину у складі ДНК вже давно розглядається в якості одного з можливих механізмів старіння (Мазин, 1993; Rougier et al., 1998; Roemer et al., 1999). Показано, що ця модифікація ДНК має яскраво виражену вікову динаміку. Протягом природного старіння, і старіння культури клітин відбувається втрата 5-метилцитозину (5mC), до того ж тваринний геном може втрачати протягом життя всі залишки цитозину (Мазин, 1993; Rougier et al., 1998). Припускають, що гіпометилування ДНК визначає кількість клітинних поділів у тварин (Мазин, 1993). Можливо така ферментативна модифікація цитозину бере участь в утворені неактивних ділянок хроматину, що призводить до інактивації генів протягом старіння. Для рослин функціональне значення метильованих залишків цитозину ДНК при ЗЗК майже не з’ясоване. Аналіз природи диференційного метилування послідовностей ДНК може довести їх значення в процесах запрограмованої загибелі клітин.

Для дослідження природи диференційного метилування послідовностей ДНК цукрового буряка використовували різні за чутливістю до метилування ферменти рестрикції, беручи до уваги, що поява 5mC у мотивах ДНК, які розпізнаються рестриктазами (ендонуклеазами рестрикції), інгібує її гідроліз (Weaver et al., 1997). З цією метою порівнювали електрофоретичну рухомість в агарозному гелі нативних і гідролізованих фрагментів ДНК. Швидкість переміщення фрагментів в електричному полі залежить від їх довжини: чим коротший фрагмент, тим він швидше рухається в гелі, а пройдена відстань зворотно пропорційна логарифму довжини фрагмента (Виноградова и др, 1983). Співвідношення між розміром досліджуваного фрагмента і пройденою ним відстанню визначають за швидкістю міграції маркерів (Weaver et al., 1997).

На рис. 7 представлені результати порівняльного вивчення продуктів гідролізу ДНК коренів і стебел 6-ти денних етіольованих паростків рестриктазою MspI, яка розщеплює СрСрGpG-послідовності ДНК незалежно від наявності метильної групи у складі залишку внутрішнього цитозина і не робить розривів за цим сайтом, якщо зовнішній цитозин метильований. При порівнянні продуктів гідролізу MspI і EcoRII ДНК коренів видно, що в EcoRII гідролізатах ДНК наявні фрагменти різного розміру, в той самий час як в гідролізатах MspI спостерігається спектр фрагментів широкого діапазону молекулярних мас. Остання обставина означає, що в ДНК цукрового буряка на відміну від CpCpGpG-мотивів зустрічаються регулярно розташовані неметильовані залишки 5-цитозину в CpCp(А/Т)рGG-сайтах ДНК, які розпізнаються EcoRII.

Одержані дані свідчать, що інтенсивність гідролізу MspI ДНК коренів більша, ніж ДНК стебел 6-ти денних етіольованих паростків. Інтенсивність гідролізу ДНК коренів рестриктазою MspI більша, ніж EcoRII. Тобто, варіабельному метилуванню підлягають зовнішні залишки цитозину в СрСрGpG-послідовностях ДНК.

На рис.8 представлені результати гідролізу ДНК листків молодих вегетуючих рослин різними рестриктазами: MspI, XhoI, DraII, SalI, PvuII, PstI, які чутливі до метилування як в симетричних СрG- і СрNрG-сайтах, та і в асиметричних послідовностях ДНК.

Рестриктаза MspI у меншій мірі гідролізує ДНК листків та стебел етіольованих паростків порівняно з ДНК коренів. Крім того, у продуктах гідролізу ДНК листків і стебел рестриктазою MspI відбуваються деякі зміни розміру неметильованих СрС-залишків, які регулярно повторюються. Одержані дані свідчать про варіабельність метилування залишків цитозину СрСрGрG-сайтів ДНК вегетативних органів цукрового буряка.

Рестриктаза DraII, яка гідролізує послідовність А/GрGрGрNpCpCpC/T у відсутності метилування залишку другого внутрішнього цитозину, інтенсивно розщеплює ДНК листка. Крім того, виявлені відмінності в характері метилування мотивів ДНК, які розпізнає рестриктаза XhoI. Серед продуктів гідролізу XhoI у значній кількості присутні фрагменти, розмір яких є меншим 2000 п.н, що свідчить про регулярно розташовані неметильовані залишки цитозину в послідовності СрТрСрGрАрG.

Отримані результати свідчать про те, що диференційне метилування бере участь в процесі морфогенезу вегетативних органів B.vulgaris. Протягом онтогенезу листків цукрового буряка відбувається сайт-специфічне метилування цитозинових залишків в симетричних СрG-динуклеотидах і СрNрG-тринуклеотидах. Поряд з цим наші дані свідчать про можливе метилування ДНК в асиметричних послідовностях, яке характерне і для інших видів вищих рослин. Передбачається, що модифікації в послідовностях сумарної ДНК піддаються саме ті залишки цитозину, за якими іде гуанін. Зміна рівня метилування ДНК спостерігається не тільки в процесі диференціювання клітин, але й в процесах їх старіння, що характерно для сумарної ДНК вищих і трансгенних рослин. До того ж, однією з закономірностей даного процесу є ензиматична модифікація асиметричних послідовностей протягом росту і диференціювання клітин вищих рослин.

Таким чином, ЗЗК листків цукрового буряка супроводжується зміною характеру метилування ДНК, яка виявляється вже на початковому етапі старіння і пов’язана, з вибірковим метилуванням або деметилуванням залишків цитозину в паліндромних ділянках геному. Поряд з варіабельно модифікованими мотивами в ДНК цього виду зустрічаються послідовності, рівень метилування яких залишається без змін. На підставі одержаних результатів можна припустити, що процес модифікації залишків цитозину у складі ДНК може брати участь в регуляції функціонування геному рослин шляхом конформаційних змін ДНК, які переводять хроматин у неактивний стан.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ПО МАТЕРІАЛАМ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

АНОТАЦІЯ

Топчій Н.М. Фрагментація і метилування ДНК листків цукрового буряка (Beta vulgaris L.) при запрограмованій загибелі клітин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 – генетика. – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2002.

До захисту подається дисертація, яка присвячена дослідженню молекулярно-генетичних особливостей фрагментації і метилування ДНК при запрограмованій загибелі клітин (ЗЗК) мезофілу листків вищих рослин

Досліджено закономірності деградації сумарної та ядерної ДНК. Представлені результати вказують на поступову фрагментацію сумарної та ядерної ДНК, характер перебігу якої відрізняється від апоптозу, для якого притаманна деградація за міжнуклеосомними спейсерами ДНК, що є кратними ~180 парам нуклеотидів. Експериментально обґрунтовано, що фрагментація ДНК супроводжується конформаційними змінами структури ДНК, які пов’язані з дестабілізацією її подвійної спіралі. Показано зменшення кількості ядер клітин мезофілу листків B. vulgaris під час старіння.

Виявлено, що в вегетативних органах цукрового буряка відбувається варіабельне метилування в сайт-специфічних послідовностях ДНК. Передбачається, що ця ензиматична модифікація бере участь в генетичній регуляції процесів морфогенезу вегетативних органів Beta vulgaris L.

Встановлено, що протягом запрограмованої загибелі клітин мезофілу листків цукрового буряка змінюється характер метилування цитозину в сайт-специфічних послідовностях ДНК. При цьому здійснюється гіпо-, гіперметилування або підтримка незмінного рівня метилування залишків цитозину в специфічних паліндромних послідовностях ДНК.

Подані результати свідчать на користь гіпотезі про диференційні шляхи запрограмованої загибелі клітин.

Ключові слова: запрограмована загибель клітин, апоптоз, метилування ДНК, ядра клітин, сумарна ДНК, ядерна ДНК, цукровий буряк, фрагментація ДНК.

АННОТАЦИЯ

Топчий Н.Н. Фрагментация и метилирование ДНК листьев сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) при запрограммированной клеточной гибели. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 – генетика. – Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2002.

К защите представлена диссертация, посвящённая исследованию молекулярно-генетических особенностей фрагментации и метилирования ДНК при запрограммированной гибели клеток (ЗГК) мезофилла листьев высших растений.

Анализ экспериментальных данных показал, что при старении листьев сахарной свеклы осуществляется постепенная деградация суммарной и ядерной ДНК с образованием непрерывного спектра фрагментов, размер которых составляет не менее ~ тысячи пар нуклеотидов. При этом олигонуклеосомной фрагментации молекул ДНК, что характерно для апоптоза, эукариот, не выявлено. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фрагментация ДНК сопровождается конформационными изменениями структуры суммарной ДНК, которые связаны с дестабилизацией её двойной спирали. По мере старения повышается доля денатурированной ДНК.

Показано уменьшение количества ядер клеток мезофилла листьев B. vulgaris во время старения.

На основании полученных данных установлено, что в вегетативных органах сахарной свеклы осуществляется вариабельное метилирование в сайт-специфических последовательностях ДНК. Предполагается, что данная энзиматическая модификация принимает участие в генетической регуляции процессов морфогенеза вегетативных органов Beta vulgaris L.

Установлено, что на протяжение запрограммированной клеточной гибели мезофилла листьев сахарной свеклы изменяется характер метилирования цитозина в сайт-специфических последовательностях ДНК. При этом осуществляется гипо-, гиперметилирование или поддерживается неизменным уровень метилирования остатков цитозина в специфических палиндромных последовательностях ДНК.

Представленные результаты свидетельствует в пользу гипотезы о дифференциальных путях запрограммированной гибели клеток.

Ключевые слова: запрограммированная гибель клеток, апоптоз, метилирование ДНК, ядра клеток, суммарная ДНК, ядерная