АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ НЕЙРОХІРУРГІЇ

імені академіка А.П.Ромоданова

ТРОЯН ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ

УДК 616.831.-001-036.17-092.4:616-089.843-031:611.018.8.013:577.352.38

ВПЛИВ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ ФЕТАЛЬНОЇ НЕРВОВОЇ ТКАНИНИ НА ДИНАМІКУ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ, АНТИОКСИДАНТНИЙ СТАТУС, ОКИСНЕ ФОСФОРИЛЮВАННЯ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ

ТЯЖКІЙ ЧЕРЕПНО-МОЗКОВІЙ ТРАВМІ

14.01.05 — нейрохірургія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ — 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті нейрохірургії імені академіка А.П.Ромоданова АМН України та на кафедрі нейрохірургії Національного медичного університету імені О.О.Богомольця МОЗ України

Науковий керівник — доктор медичних наук, член-кореспондент АМН України, професор Цимбалюк Віталій Іванович, Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України, завідувач кафедри нейрохірургії; Інститут нейрохірургії імені академіка А.П.Ромоданова АМН України, заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти доктор медичних наук, професор Орлов Юрій Олександрович, Інститут нейрохірургії імені академіка А.П.Ромоданова АМН України, завідувач відділу нейрохірургії дитячого віку, Головний дитячий нейрохірург МОЗ України

доктор медичних наук, професор Потапов Олександр Іванович, Івано-Франківська державна медична академія МОЗ України, завідувач курсом нейрохірургії на кафедрі психіатрії та нейрохірургії

Провідна установа Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра факультетської хірургії з курсом нейрохірургії, м.Одеса

Захист відбудеться 14 січня 2003 р. о 12 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.557.01 при Інституті нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України (04050, м.Київ, вул. Мануїльського, 32).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України (04050, м. Київ, вул. Мануїльського,32).

Автореферат розісланий 10.12.2002 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук Л.Л.Чеботарьова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У сучасному суспільстві, завдяки урбанізації і росту скупчення населення, збільшенню кількості транспортних засобів і інтенсивності перевезень, спостерігається зростання частоти травматизму (Macciocchi S.N., Barth S.T.,Littlejield C.M., 1998; Поліщук М.Є. та співавт., 2001; Зозуля Ю.П. та співавт., 2002).

У загальній структурі травматизму, ушкодження черепа і головного мозку складають більше третини від всіх травм і займають провідне місце серед причин смертності та інвалідизації у потерпілих (Ромоданов А.П., 1993; Коновалов А.Н., 1998; Педаченко Є.Г. та співавт., 1999). У різних регіонах України частота черепно-мозкової травми (ЧМТ) коливається від 2 до 4 на 1000 населення щорічно (Полищук Н.Е. та співавт., 2000). Потерпілі з ЧМТ складають більшість серед хворих, яких обстежують і лікують в нейрохірургічних закладах України (Морозов А.Н., 1999; Зозуля Ю.П. та співавт., 2002). Дану патологію вважають не тільки медичною, а і соціальною проблемою, так як вона потребує значних економічних затрат як на лікування, так і на соціальну реабілітацію (Лихтерман Л.Б. та співавт., 1993; Teasdale G.M., 1996; Коновалов А.Н., 1998; Педаченко Е.Г. та співавт., 2001).

Тривала і стійка втрата працездатності, а також висока летальність при ЧМТ вказують на недостатнє вирішення проблем, пов’язаних із діагностикою та лікуванням цієї патології (Бабчин А.И., Кондаков Е.Н., Зотов Ю.В., 1995). Тому пошук нових, ефективних та удосконалення існуючих методів лікування ЧМТ та її наслідків залишається однією з актуальних проблем сучасної медицини.

Концепція травматичної хвороби вимагає розглядати ЧМТ як патогенетично єдиний процес, в основі якого лежать післятравматичні порушення центральних механізмів регуляції метаболізму та гомеостазу всього організму, а постраждалі з ЧМТ на сьогодні оцінюються як потерпілі із наростаючими метаболічними порушеннями (Лихтерман Л.Б., 1994; Педаченко Е.Г., 1996; Коновалов А.Н., 1998).

Одним із найбільш небезпечних ускладнень післятравматичного періоду є активація процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), які є ключовими в механізмах пошкодження біологічних мембран клітин мозку та усього організму (Новиков В.Е. та співавт., 1995; Nishio S. та співавт., 1997).

За умов фізіологічної активності процеси ПОЛ відносять до нормальних метаболічних процесів, що протікають у нервовій тканині та усьому організмі загалом (Никушкин Е.В., 1989; Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997). У разі надмірної активації процеси ПОЛ та накопичення продуктів вільнорадикального ліпідного переокислення призводять до зменшення еластичності та порушення анатомічної цілісності мембран нейронів, сприяють розвитку гіпоксії, набряку та набухання головного мозку, виникненню та прогресуванню неврологічних дисфункцій (Hall E.D., 1993).

Лише деякі з численних природних і синтетичних антиоксидантів (АО) та інгібіторів ПОЛ, з огляду на особливості структурно-функціональної організації мозку і гематоенцефалічний бар’єр, використовуються при патології центральної нервової системи (ЦНС) (Новиков В.Е. та співавт., 1995; Jldan F. та співавт., 1995; Зозуля Ю.П., Поліщук М.Є., 1997; Томас Пентеленьи, 1997; Jnci S., Ozcan O., Kilinc K., 1998). Тому проблема пошуку високоефективних методів і засобів корекції прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу і процесів ПОЛ в ЦНС на сьогодні залишається актуальною.

При такому погляді на проблему ПОЛ пошук принципово нових підходів до лікування травматичної хвороби мозку набуває особливої актуальності, зокрема, у зв’язку з впровадженням у клінічну практику протягом останніх років нового біологічного методу корекції нейрохірургічної патології, яким є трансплантація фетальної (ембріональної) нервової тканини в певні ділянки головного мозку (Цимбалюк В.І., Пічкур Л.Д., 1996; Угрюмов В.М. та співавт., 1996; Антоненко В.Г. та співавт., 1998; Цымбалюк В.И. та співавт., 1998; Пятикоп В.А., 1998; Щерба І.М., 1999; Бондарь Л.В., 2000).

В літературі відсутні інформація про вплив трансплантації фетальної нервової тканини (ТФНТ) на активність процесів ПОЛ та АО-статус в мозку та крові травмованих осіб та у тварин в експериментальних дослідженнях, повідомлення про вплив ТФНТ на енергетичний обмін (процеси дихання й окисного фосфорилювання) в ушкодженому мозку.

Дослідження впливу нейротрансплантації на перебіг вищезгаданих метаболічних процесів буде сприяти поліпшенню допоміжної діагностики ЧМТ різного ступеня тяжкості і розробці патогенетично обгрунтованих методів лікування цієї патології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в межах планової науково-дослідної теми Інституту нейрохірургії імені академіка А.П.Ромоданова АМН України: “Розробка фундаментальних та прикладних аспектів трансплантації ембріональної нервової тканини в нейрохірургії”, 1995–1997 рр., за № держреєстрації 0195U010355.

Метою роботи є визначення впливу ТФНТ на динаміку процесів ПОЛ, АО-статус, окисне фосфорилювання в мозку, показники прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу крові після експериментальної тяжкої черепно-мозкової травми (ТЧМТ).

Для досягнення мети роботи поставлено наступні завдання:

1.Провести комплексне довгострокове дослідження впливу ТЧМТ на основні показники перекисно-окисного гомеостазу в мозку та крові травмованих тварин.

2.Дослідити вплив ТЧМТ на активність процесів окисного фосфорилювання в мозку в динаміці післятравматичного періоду.

3.Встановити вплив ТФНТ на динаміку процесів ПОЛ в мозку тварин за показником індукованої хемілюмінесценції (ІХЛ), рівнем ТБК-активних продуктів, ендогенних перекисів (ЕП), шифових основ після експериментальної ТЧМТ.

4.Встановити вплив ТФНТ на активність антиоксидантної системи в мозку за рівнем антиперекисних ферментів (супероксиддисмутази (СОД) та каталази) після експериментальної ТЧМТ.

5.Встановити вплив ТФНТ на динаміку процесів ПОЛ в крові за показником ІХЛ та рівнем ТБК-активних продуктів.

6.Встановити вплив ТФНТ на антиоксидантний статус в крові за показником перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ), рівнем антиперекисних ферментів (СОД та каталази) після експериментальної ТЧМТ.

7.Встановити вплив ТФНТ на енергетичний обмін (процеси дихання і окисного фосфорилювання) в мозку після експериментальної ТЧМТ.

Об’єкт дослідження — трансплантація фетальної нервової тканини в ділянку травматичного ураження мозку після експериментальної тяжкої черепно-мозкової травми.

Предмет дослідження — вплив трансплантації фетальної нервової тканини на динаміку перекисного окислення ліпідів, антиоксидантний статус, окисне фосфорилювання в мозку, показники прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу крові тварин після експериментальної ТЧМТ.

Методи дослідження. В роботі застосовані біохімічні та біофізичні методи дослідження динаміки ПОЛ в мозку та крові за показником ІХЛ, рівнем малонового діальдегіду (за ТБК-активними продуктами), ендогенних перекисів та шифових основ.

Антиоксидантний статус оцінювали за активністю антиперекисних ферментів (СОД та каталази) та стійкістю еритроцитів до перекисів водню.

Окисне фосфорилювання в мітохондріях мозку досліджували за полярографічними показниками: швидкістю поглинання кисню гомогенатом мозку в присутності субстратів окислення (сукцинату та глутамату) (V2); швидкістю поглинання кисню гомогенатом у процесі фосфорилювання екзогенного аденозиндифосфату (АДФ) (V3); швидкістю утилізації кисню гомогенатом мозку після перетворення АДФ в аденозинтрифосфат (АТФ) (V4); за дихальним коефіцієнтом Чанса (ДКЧ); швидкістю утилізації кисню у роз’єднаному стані (VДНФ) та за показником енергопродуктивності мітохондрій (АДФ:0). Результати експериментальних досліджень опрацьовані статистичними методами, у тому числі із використанням таблиць Excel.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на експериментальній моделі ТЧМТ досліджено вплив ТФНТ на динаміку процесів перекисного окислення ліпідів, антиоксидантний статус, окисне фосфорилювання в мозку, показники прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу крові у післятравматичний період.

Встановлено, що ТЧМТ обумовлює потужну тривалу активацію ПОЛ в мозку і крові при одночасному зниженні активності АО-системи.

Показано, що ТЧМТ супроводжується порушенням енергетичного обміну (процесів дихання і окисного фосфорилювання) в травмованому мозку як в гострий (1–3 доба), так і у віддалений (30–60 доба) післятравматичний період.

Вперше встановлено, що ТФНТ в ділянку травматичного ушкодження мозку призводить до зниження підвищеної активності ПОЛ в мозку на 7 та 14 добу після ТЧМТ, активації ПОЛ на 10 та 21 добу, нормалізації вільнорадикальних процесів, відновлення окисного гомеостазу та стабілізації ПОЛ на 35, 45 та 60 добу після травми.

Вперше показано, що ТФНТ поліпшує прооксидантний статус крові на 7, 10, 14 та 21 добу після ТЧМТ, нормалізує ПОЛ та стабілізує протікання вільнорадикальних реакцій у віддалений післятравматичний період.

Вперше виявлено, що нейротрансплантація сприяє посиленню антирадикального захисту та антиоксидантного потенціалу в мозку і крові як в гострий, так і у віддалений період ТЧМТ.

Вперше досліджено вплив ТФНТ на активність процесів окисного фосфорилювання в мітохондріях мозку, дана кількісна характеристика енергетичного обміну в ушкодженому мозку після нейротрансплантації за полярографічними показниками. Показано, що ТФНТ призводить до нормалізації енергетичного обміну (процесів дихання і окисного фосфорилювання) в мозку на 30–60 добу після ТЧМТ.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження впливу ТФНТ на активність процесів перекисного окислення ліпідів, АО-статус, окисне фосфорилювання в мозку, а також впливу нейротрансплантації на прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз крові можуть бути використані для діагностики ступеня тяжкості травми, перебігу травматичної хвороби мозку та ефективності патогенетичного лікування ЧМТ за допомогою нейротрансплантації.

Одержані позитивні результати впливу ТФНТ на метаболічні процеси сприяють розробці концепції впливу нейротрансплантації на перебіг травматичної хвороби мозку і дозволяють обґрунтувати застосування цього методу в клінічну практику для корекції прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу та енергетичного обміну в мозку після ЧМТ.

Результати дисертаційного дослідження використовуються при викладанні курсу нейрохірургії на кафедрах нейрохірургії Національного медичного університету імені О.О.Богомольця та Київської медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України. Показники активності процесів ПОЛ та АО-статусу можуть бути використані в нейрохірургічній практиці.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням. Автор особисто провів аналіз наукової літератури за темою дисертації, сформулював мету і основні напрямки дослідження, провів патентно-інформаційний пошук, в тому числі й за електронними базами даних, розробив методологію проведення експерименту згідно поставлених задач, методики нанесення ЧМТ.

Здобувачем особисто виконані хірургічні втручання з трансплантацією фетальної нервової тканини, забір матеріалу для досліджень. Біохімічні та біофізичні дослідження автор провів спільно із співробітниками лабораторії біохімії енергетичного обміну Інституту нейрохірургії імені академіка А.П.Ромоданова АМН України під керівництвом к.біол.н. Д.А.Суткового.

Автором особисто проведена статистична обробка результатів дослідження, самостійно написані усі розділи дисертації. Результати дослідження та висновки обговорені з науковим керівником доктором медичних наук, членом-кореспондентом АМН України, професором В.І.Цимбалюком.

Апробація результатів дисертації. Результати дослідження оприлюднені на: 3-й науково-практичній конференції “Актуальні проблеми експериментальної медицини” (Київ, 1999 р.); 54-й науковій медичній конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету імені О.О.Богомольця (Київ, 1999 р.); VII Конгресі Світової Федерації Українських лікарських товариств (Ужгород, 1998 р.); VI з’їзді Всеукраїнського лікарського товариства (Чернівці, 2001 р.).

Апробація дисертації відбулася на спільному засіданні Вченої ради Інституту нейрохірургії імені академіка А.П.Ромоданова АМН України з кафедрами нейрохірургії Національного медичного університету імені О.О.Богомольця та Київської медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика, членами Української Асоціації Нейрохірургів (28.12.2001 р., протокол №22).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 друкованих праць, у тому числі 4 статті в наукових фахових журналах (одна — без співавторів) та 4 тез доповідей на конгресах, зїздах та конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, 5 розділів основних досліджень, підсумку, висновків, списку літератури. Робота ілюстрована 18 рисунками та 14 таблицями. Повний обсяг дисертації становить 161 сторінку, ілюстрації займають 11 сторінок, таблиці — 3 сторінки. Список використаних джерел містить 294 найменування, з них 130 кирилицею, 164 латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи дослідження.

Робота проведена на 368 білих щурах-самцях із середньою масою 180–200 г, які залишилися живими після моделювання їм ТЧМТ та проведення ТФНТ.

Згідно до поставлених задач піддослідних тварин було розділено на групи:

·

·

·

·

При дослідженні впливу ТЧМТ на активність процесів ПОЛ контрольними були показники інтактної групи тварин (по 56 тварин в групах), а при дослідженні впливу ТФНТ на активність ПОЛ та АО-статус контрольними були показники груп тварин з ТЧМТ та хірургічною обробкою (ХО) вогнища забиття (по 63 тварини в групах). При дослідженні впливу ТЧМТ та ТФНТ на активність біоенергетичних процесів в мозку (процесів дихання й окисного фосфорилювання), окрім інтактної, додатково було сформовано 2 групи тварин (тварини з ТЧМТ+ХО вогнища забиття та тварини з ТЧМТ+ХО+ТФНТ). Кількість тварин в цих групах також була однаковою і становила по 60 щурів.

Черепно-мозкову травму тваринам наносили в стандартних умовах по лівій тімяно-скроневій ділянці нефіксованої голови за допомогою пружинного пристрою. Після нанесення травми тварини непритомніли, у них спостерігалися виражені тоніко-клонічні судоми, порушення дихання у вигляді брадіпноє або апноє, а в подальшому — тахіпноє. Виявлялися порушення серцевої діяльності, дисфункція сфінктерів. Неврологічний дефіцит проявлявся гемі- або монопарезом у післятравматичний період. Макроскопічно травма характеризувалася формуванням підапоневротичної гематоми в ділянці травми, вдавленим переломом кісток склепіння черепа, формуванням великого післятравматичного дефекту з просяканням кров’ю і локальним розміжченням речовини мозку.

Оперативне втручання виконували в стерильних умовах під перитонеальним наркозом сумішшю каліпсолу та реланіуму на 0,9% розчині хлориду натрію. Хірургічна обробка вогнища травми включала розтин м’яких тканин голови по середній лінії над мозковою частиною черепа після попередньої обробки їх антисептиком; скелетизацію кісток склепіння черепа; видалення підапоневротичної гематоми, кісткових уламків, внутрішньочерепних гематом; аспірацію мозкового детриту, гемостаз. Для трансплантації використовували фрагменти сенсомоторної кори (розміром 2–3 мм3) 19–20-добових зародків, отриманих шляхом кесарського розтину вагітної самки. Фрагменти фетальної мозкової тканини трансплантували в ділянку травматичного ураження мозку в сформоване в результаті хірургічних маніпуляцій ложе.

Активність ПОЛ та АО-статусу мозку і крові тварин виявляли, досліджуючи рівень малонового діальдегіду (за ТБК-активними продуктами), шифових основ, вміст супероксиддисмутази та каталази, досліджуючи рівень ЕП та визначаючи ПРЕ, реєструючи ІХЛ в плазмі крові та супернатанті мозку.

У процесі експерименту тварин брали для досліду через 1, 3, 7, 10, 14, 21, 35, 45 та 60 діб після нанесення ТЧМТ та проведення ТФНТ.

Рівень малонового діальдегіду (МДА) у мозку та крові, одного з продуктів ПОЛ, визначали за ТБК-активними продуктами. Принцип методу полягає в тому, що за умов високої температури (90–100) у кислому середовищі в реакції МДА та 2-тіобарбітурової кислоти утворюється забарвлений триметильний комплекс з максимумом поглинання при довжині хвилі 532 нм. Кількість ТБК-активних продуктів відображали у мкМоль/мл плазми крові; у мозку — в мкМоль/г сирої тканини.

Метод визначення перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ) базується на визначенні відсотку еритроцитів, що гемолізуються у стандартних умовах під впливом перекису водню. Ступінь гемолізу залежить від стійкості еритроцитів до перекисів, відбиваючи не стільки активність вільнорадикальних процесів, скільки антиокислювальну стійкість біосистеми щодо ініціації перекисно-окислювальних реакцій. Відображали у % гемолізованих еритроцитів.

Визначали активність супероксиддисмутази (СОД) — ключового ферменту антиоксидантного захисту. Принцип методу полягає у визначенні конкуруючої здатності СОД з нітросинім тетразолієм (НСТ) за супероксидні атоми, що утворюються внаслідок аеробної взаємодії відновленого нікотинаденіндинуклеотидфосфату і феназинметасульфату. Внаслідок реакції нітросиній тетразолій відновлюється (цей процес зворотно-пропорційний активності СОД). Швидкість його відновлення визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 540 нм. За одиницю активності СОД приймали кількість ферменту, необхідного для 50% інгібування відновлення НСТ (ум.од.екстинції/мг білка за 10 хв).

Дослідження активності каталази полягає у визначенні залишкового незруйнованого каталазою перекису водню, з яким солі молібдату амонію утворюють стійкий забарвлений комплекс. Інтенсивність забарвлення вимірювали при довжині хвилі 410 нм. Активність каталази у крові відображали в мкат/л, у тканині мозку — мМоль/хв на 1 мг білку.

Метод визначення рівня ЕП у тканині мозку полягає у тому, що на інтактні еритроцити впливають ендогенними перекисями мозку, які накопичуються в ЦНС пропорційно активності ПОЛ (для отримання екстрактів, що містять ендогенні перекиси, готували 10% гомогенат тканини мозку на фізіологічному розчині, який вміщував 0,1 М ЕДТА). Для отримання аліквоти з ендогенними перекисями гомогенат центрифугували в рефрижераторній центрифузі при 1500 об/хв протягом 15 хв. З метою інгібування ферментативної активності отриманий супернатант піддавали термічній обробці. Усі методичні прийоми в подальшому проводили як при методиці визначення ПРЕ.

Шифові основи — кінцеві продукти ПОЛ — визначали у хлороформ-метанольному екстракті мозку за інтенсивністю їх флюоресценції при довжині хвилі збудження світіння 360–379 нМ, — флюоресценції 420–440 нМ. Кількісний показник відображали в ум.од.флюоресценції.

Метод визначення хемілюмінесценції, індукованої перекисом водню (ІХЛ), заснований на детектуванні ініційованого випромінювання світла, що виникає внаслідок хімічних процесів і, насамперед, за рахунок енергії реагуючих речовин, яка звільняється під час рекомбінації “вільних радикалів”. Для активації хемілюмінесцентного світіння використовували 3% розчин перекису водню, приготовлений на фосфатному буфері рН-7,4. Активність процесу відображали в імп/сек.

При дослідженні впливу ТФНТ на біоенергетичні процеси (процеси дихання й окисного фосфорилювання) в післятравматичний період ТЧМТ тварин брали для досліду на 1, 3, 10, 15, 30, 45 та 60 добу експерименту. Забивали за допомогою декапітації.

Після виділення мозку та звільнення його від оболонок готували 17–20% гомогенат у холодному середовищі: 0,25 М сахарози; 0,01 М трис-HCl; 0,001 ЕДТА; 0,5% БСА; рН-7,4. Після цього гомогенат фільтрували через капроновий фільтр.

При дослідженні показників окисного фосфорилювання застосовували полярограф LP-60 й закритий платиновий електрод типу електроду Кларка. В полярографічну кювету об’ємом 1 мл, в якій знаходилось середовище інкубації, вносили 266 нмолей АДФ і 2,4-дінітрофенолу в концентрації 80 мкМ. Середовище інкубації вміщало 0,150 М сахарози; 0,01 М КН2РО4; 0,04 М KCl; 0,005 М сукцинату чи глутамату; 0,05 М трис-HCl і 0,0002 М ЕДТА; рН-7,4. Температура середовища становила 26. Полярографічно визначали такі показники:

V2 — швидкість поглинання кисню (швидкість дихання) гомогенатом мозку в присутності субстратів окислення (сукцинату та глутамату);

V3 — швидкість поглинання кисню гомогенатом у процесі фосфорилювання екзогенного АДФ;

V4 — швидкість поглинання кисню після перетворення АДФ в АТФ;

ДКЧ — дихальний коефіцієнт Чанса (ДКЧ= V3: V4);

АДФ:О — показник енергопродуктивності мітохондрій, який вказує на кількість молекул АТФ, що синтезуються на один поглинутий атом кисню;

VДНФ — швидкість поглинання кисню у роз’єднаному стані після внесення у кювету 2,4-дінітрофенолу.

Статистична обробка отриманих результатів проводилась по стандартній програмі за допомогою персонального компютера і включала розрахунок середньої (М) і стандартної (m) похибки. Достовірність розбіжностей визначали за допомогою t-критерія Ст’юдента.

Результати власних досліджень та їх обговорення.

Вплив ТЧМТ та ТФНТ на показники ПОЛ та АО-статусу в мозку та крові експериментальних тварин. В результаті дослідження було встановлено, що ТЧМТ призводить до вираженої тривалої активації ПОЛ як у самому травмованому мозку, так і в усьому організмі загалом. Максимум активації цього процесу було зареєстровано на 1, 7, 14 та 120 добу після ТЧМТ. Так, через 1 добу після ТЧМТ рівень ключового показника ПОЛ — малонового діальдегіду (за ТБК-активними продуктами) в мозковій тканині зростав практично вдвічі (на 191%), а через 7 діб — у 4 рази (на 388%) (рис. 1).

Рис.1. Динаміка зміни рівня ТБК-активних продуктів та шифових основ в мозку після ТЧМТ(у % відносно контролю), всі дані статистично достовірні відносно контролю.

Тенденція до нормалізації рівня ТБК-продуктів наприкінці першого місяця після ТЧМТ змінилась повторною активацією ПОЛ, зростанням рівня ТБК-продуктів практично вдвічі (на 94%) через 4 міс (з 2,720,14 мкМоль/г тканини в контрольній групі до 5,270,5 мкМоль/г тканини). Достовірно підвищений вміст ТБК-продуктів (на 75%) і через 6 міс після ТЧМТ (4,610,17 мкМоль/г тканини порівняно з 2,630,35 мкМоль/г тканини в групі контролю). Мобілізація ендогенних захисно-пристосувальних механізмів та антиоксидантних резервів організму не забезпечила відновлення прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу та не ліквідувала зумовлених травмою метаболічних порушень навіть через 4–6 міс після ТЧМТ, що спричинило повторну активацію ПОЛ у віддалені терміни як прояв витрати АО-резервів організму і показник переходу травматичного стресу у фазу виснаження.

Результати дослідження крові підтверджують ці припущення. Вміст ТБК-активних продуктів у крові через 3, 24 год, на 3, 7, 14, 120 та 180 добу після ТЧМТ відповідно підвищений на 28, 18, 46, 103, 56, 16 і 22% (рис. 2). Як і в мозку, вміст ТБК-продуктів особливо високий на 7 та 14 добу післятравматичного періоду: на 7 добу цей показник становив 2,190,09 мкМоль/мл плазми, а на 14 добу вміст ТБК-активних продуктів складав 2,330,11 мкМоль/мл плазми порівняно з 1,490,02 мкМоль/мл плазми контрольної групи. На 30 добу в крові, як і в мозку, реєструвалася нормалізація рівня МДА за ТБК-активними продуктами, але через 4 та 6 міс після травми рівень МДА в плазмі крові знову перевищував контрольну величину відповідно на 16 та 22%.

В результаті ТЧМТ у тварин значно посилювався розпад еритроцитів крові під впливом стандартного розчину перекису водню (рис. 2). Відсоток еритроцитів, зруйнованих внаслідок впливу перекису водню, був особливо високим через 3 год після ТЧМТ і становив 288% (20,91,8% зруйнованих еритроцитів порівняно з 7,251,3% в контролі). Високий ступінь гемолізу еритроцитів утримувався через 3, 7, 14 діб, через 4 та 6 міс після травми. В ці терміни перекисна резистентність еритроцитів була знижена, а відсоток зруйнованих еритроцитів становив відповідно 183, 112, 177, 137 та 143%.

Рис.2. Динаміка зміни рівня ТБК-активних продуктів і перекисного гемолізу еритроцитів в крові після ТЧМТ(у % відносно контролю), всі дані статистично достовірні відносно контролю.

Дослідження рівня шифових основ (кінцевих продуктів ПОЛ) виявило виражені зміни перекисно-окисних реакцій за цими сполуками на ранніх етапах післятравматичного періоду (рис. 1). Через 3 год рівень шифових основ майже у 3 рази перевищував контрольну величину і становив 37,44,7 ум.од. флуоресценції порівняно з 12,62,7 ум.од. флуоресценції в контролі. Через 1, 3, 7 діб після ЧМТ вміст шифових основ був достовірно вищим за показники контрольних груп відповідно на 62, 39 та 61%.

В результаті ТФНТ у крові тварин-реципієнтів в післятрансплантаційний період істотно змінювалися практично всі показники системи ПОЛ — АОС. ТФНТ у ділянку травматичного ушкодження мозку призвела до зростання вже на 3 добу активності основних ферментів АО-захисту — СОД і каталази, що інгібують ПОЛ відповідно на стадіях ініціювання та розгалуження ланок вільнорадикальних реакцій. На 7 добу активність СОД та каталази була достовірно підвищена відповідно на 33 та 39 %. Якщо в групі з ТФНТ активність СОД становила 7,870,52 ум.од., то в контрольній групі активність цього ферменту склала лише 5,920,49 ум.од. Активність каталази у піддослідній групі в цей термін становила 13,90,97 мкат/л порівняно з контрольним показником (10,00,81 мкат/л).

На посилення загальної АО-стійкості організму вказує зростання стійкості еритроцитів до перекисів. На 7 добу показник ПРЕ в групі з ТФНТ достовірно (на 62%) перевищив показник контролю, а відсоток гемолізованих еритроцитів склав лише 38% (7,401,65% гемол.еритроцитів порівняно з 19,152,80% гемол.еритроцитів в групі без нейротрансплантації) (рис. 3).

Інтенсивність хемілюмінесценції, індукованої перекисом водню, в плазмі крові на 7 добу в результаті ТФНТ достовірно знижувалась (на 30%). Якщо в групі з ТФНТ інтенсивність ІХЛ становила лише 62756 імп/сек, то в контрольній групі цей показник склав 89461 імп/сек.

Протягом перших 7 діб рівень ТБК-продуктів у крові наближався до норми і практично не відрізнявся від контрольних величин (рис. 4).

Рис.3. Динаміка зміни рівня перекисного гемолізу еритроцитів в крові (у % відносно контролю) після трансплантації ФНТ травмованим тваринам порівняно з цим показником при ТЧМТ

(контроль–інтактні тварини), * — p<0,05.

Рис.4. Динаміка зміни рівня ТБК-активних продуктів в крові (у % відносно контролю) після трансплантації ФНТ травмованим тваринам порівняно з цим показником при ТЧМТ

(контроль–інтактні тварини), * — p<0,05.

Проте на 10, 14 та 21 добу після нейротрансплантації активність ПОЛ за всіма показниками була нижчою порівняно з контрольними тваринами. Так, на 10 добу рівень МДА (за ТБК-продуктами) у тварин з ТФНТ становив 1,460,15 мкМоль/мл плазми, що статистично достовірно було нижче (на 25%) за контрольний показник (1,930,08 мкМоль/мл плазми). Показник хемілюмінесцентного світіння плазми крові складав лише 54% відносно контрольних величин. На 14 та 21 добу рівень ТБК-продуктів також знижений при достовірному зниженні показників ІХЛ (рис. 4, 5).

Активність АО-ферментативної ланки (СОД, каталази) у ці терміни залишалась на рівні контрольних величин, що, з найбільшою вірогідністю, пов’язано із стабілізацією окисних процесів в результаті нейротрансплантації.

У більш віддалені терміни (на 35, 45 та 60 добу) показники активності ліпідної пероксидації у групах з ТФНТ практично не відрізнялись від контрольних показників. В цілому ж, потенціал АО-системи за показником ПРЕ зростав (на 60 добу показник гемолізу еритроцитів становив 66%) (рис. 3).

Рис.5. Інтенсивність індукованої хемілюмінесценції (імп/сек) в крові тварин (у % відносно контролю)

на 10, 14, 21 добу після ТЧМТ та ТФНТ (Mm; n=6–8).

В мозковій тканині нейротрансплантація практично не вплинула на перебіг реакцій ПОЛ протягом 3 діб. На 7 добу зростає рівень ТБК-продуктів (на 34%), проте пул ендогенних перекисів (характеризує стан початкових ланок ПОЛ) та кількість шифових основ (кінцевих продуктів ПОЛ) були значно нижчими у тварин, яким була проведена ТФНТ (на 21 та 65 % відповідно) (рис. 6, 7). Показник ЕП в цей термін склав 10,561,33% гемол.еритроцитів порівняно з 13,402,12 % гемол. еритроцитів в групі контролю. Рівень шифових основ на 7 добу достовірно (на 65%) знижений: інтенсивність флюоресценції цих кінцевих продуктів ПОЛ становила лише 14,42,05 ум.од. порівняно з 40,65,46 ум.од. флюоресценції в групі контролю. ТФНТ спричинила також достовірне зниження індукованої хемілюмінесценції супернатанта тканини мозку — на 36% (20716 імп/сек порівняно з контрольною групою, де показник ІХЛ склав 32428 ум.од.). ТФНТ в ділянку травматичного ушкодження мозку призвела до зростання на 3 добу активності АО-ферментативної ланки — СОД та каталази. На цьому тлі більш переконливим виглядало зростання активності СОД в мозку, рівень якої у 2 рази (201%) перевищував контрольну величину (5,140,50 ум.од. в групі з ТФНТ, в групі контролю — 2,560,36 ум.од.).

Реакції вільнорадикального переокислення в мозку на 10, 14 та 21 добу після нейротрансплантації характеризуються мінливим, нестабільним характером. Активація вільнорадикальних процесів на 10 добу змінюється достовірним інгібуванням реакцій ПОЛ на 14 добу з повторною активацією ліпідної пероксидації на 21 добу (рис. 6).

Зокрема, на 10 добу експерименту вміст МДА (за ТБК-продуктами) в мозку перевищував контрольний показник майже у 1,5 рази і становив 3,520,41 мкМоль/г тканини (у контролі — 2,410,10 мкМоль/г тканини), а вже на 14 добу достовірно знижався не тільки вміст ТБК-активних продуктів (на 26 %), а і рівень ЕП (на 20%), шифових основ (на 67%) (рис. 7). На 21 добу знову реєструвалося достовірне зростання показників активності ПОЛ (ТБК-активних продуктів — на 28%, ендогенних перекисів — на 75%, ІХЛ — на 26%).

Рис.6. Динаміка зміни рівня ТБК-активних продуктів в мозку (у % відносно контролю) після трансплантації ФНТ травмованим тваринам порівняно з цим показником при ТЧМТ

(контроль–інтактні тварини), * — p<0,05.

Рис.7. Динаміка зміни рівня шифових основ в мозку (у % відносно контролю) після трансплантації ФНТ травмованим тваринам порівняно з цим показником при ТЧМТ

(контроль–інтактні тварини), * — p<0,05.

Лише на 35, 45 та 60 добу після ТФНТ в мозку була відмічена стійка нормалізація процесів ПОЛ, відновлення окисного гомеостазу на тлі поповнення та мобілізації АО-резервів. У ці терміни достовірно знижувався рівень ендогенних перекисів (відповідно на 22, 20 та 25%) (рис. 8), а також рівень ТБК-продуктів (відповідно на 29, 15 та 25%) відносно контрольних показників (рис. 6). Гальмування гіперактивності ПОЛ в мозку після ТФНТ у віддалений період ТЧМТ виявлено і при дослідженні показників ІХЛ та шифових основ. В цілому ж, протягом всього періоду дослідження вміст шифових основ у тварин після ТФНТ був значно нижчим, ніж у тварин контрольної групи (рис. 7).

Рис.8. Рівень ендогенних перекисів (% гемол.еритроцитів) в мозку тварин (у % відносно контролю)

на 35, 45 та 60 добу після ТЧМТ та ТФНТ, (Mm; n=6–8).

Синхронно із активацією ПОЛ змінювалась і функціональна активність АО-системи. Активність СОД, каталази знижувалась саме в ті терміни, коли в супернатанті мозку зростав рівень продуктів ПОЛ, особливо на 21 добу після травми. Зростання активності СОД і каталази на 35 та 45 добу з подальшим зниженням їх активності на 60 добу повязано із відновленням окисного гомеостазу та нормалізацією метаболічних процесів в мозку в результаті нейропротективного впливу ТФНТ.

Вплив ТЧМТ та ТФНТ на показники енергетичного обміну в мозку експериментальних тварин. При дослідженні біоенергетичних процесів в мозку встановлено, що ТЧМТ призводить до порушення процесів дихання й окисного фосфорилювання в травмованому мозку вже в гострий післятравматичний період. На 1 добу після травми знижувалися практично всі показники окисного фосфорилювання в мітохондріях мозку (табл. 1). Порушувалось окислення гомогенатами мозку обох субстратів окислення — як глутамату (85%), так і сукцинату (81,9%) (V2). В цей термін вірогідно знижалися швидкість поглинання кисню гомогенатами у процесі фосфорилювання екзогенного АДФ (V3) та коефіцієнт дихального контролю Чанса (ДКЧ). При субстраті окислення сукцинаті показники V3 та ДКЧ становили 68,2 та 72,7%, при субстраті окислення глутаматі — відповідно 70,2 та 72,6%. Також спостерігалася вірогідна тенденція до зниження енергопродуктивності мітохондрій (за показниками АДФ:0). Такі зміни вказували на роз’єднання процесів окислення й фосфорилювання у мітохондріях мозку, про що свідчило зниження показника VДНФ при окисленні як сукцинату (70,1%), так і глутамату (68,3%). При цьому нейротрансплантація суттєво не вплинула на активність біоенергетичних процесів, так як статистично виважених відмінностей між показниками окисного фосфорилювання у тварин 2 (ТЧМТ+ХО) та 3 (ТЧМТ+ХО+ТФНТ) груп виявлено не було (табл. 1).

Таблиця 1

Показники окисного фосфорилювання в гомогенатах мозку через 1 добу після ТЧМТ та ТФНТ; субстрати окислення — сукцинат та глутамат (Mm; n=810)

Тип впливу | Статис-тичний показник | Субстрат окис-

лення |

V2 |

V3 |

V4 |

ДКЧ |

АДФ:0 |

VДНФ

Інтактні | Mm | сукцинат | 17,70,6 | 63,00,9 | 17,00,6 | 3,710,13 | 2,720,04 | 73,62,8

тварини | глутамат | 13,30,8 | 49,6 2,7 | 13,10,8 | 3,80,20 | 3,760,04 | 61,93,1

Mm | сукцинат | 14,51,0* | 43,04,0* | 15,91,1 | 2,70,15* | 2,560,02 | 51,64,3*

ТЧМТ+ | % | 81,9 | 68,2 | 93,5 | 72,7 | 94,1 | 70,1

ХО | Mm | глутамат | 11,31,0 | 34,82,5* | 12,61,2 | 2,760,21* | 3,540,13 | 42,32,6*

% | 85 | 70,2 | 96,2 | 72,6 | 94,1 | 68,3

Mm | сукцинат | 13,11,2 | 42,00,9 | 14,21,0 | 2,960,18 | 2,530,10 | 53,62,8

ТЧМТ+ | % | 90 | 98 | 89 | 110 | 99 | 104

ХО+ | Mm | глутамат | 10,20,5 | 33,33,1 | 10,91,0 | 3,060,21 | 3,500,09 | 39,43,0

ТФНТ | % | 90,2 | 95,7 | 86,5 | 111 | 98,9 | 93,1

Примітка. * — р<0,05 порівняно з інтактними тваринами.

Аналогічна картина спостерігалася і через 3 та 10 діб після травми та ТФНТ. На 15 добу після ТЧМТ при окисленні сукцинату (флавинаденіндинуклеотидфосфат-залежного субстрату) показники окисного фосфорилювання усіх трьох груп наближалися до показників у інтактних тварин, при чому навіть за умов ТФНТ статистичних відмінностей між показниками окисного фосфорилювання у тварин 2 та 3 груп виявлено не було. Утилізація кисню мітохондріями мозку достовірно знижувалася при окисленні глутамату (V2), особливо після перетворення екзогенного АДФ в АТФ (V4).

Порушення енергетичного метаболізму в мозку було констатовано і через 30 діб після ТЧМТ. При субстраті окислення глутаматі біоенергетичні процеси в мозку практично за всіма показниками окисного фосфорилювання були зниженими (рис.9, 10).

Рис. 9. Динаміка зміни швидкості поглинання кисню гомогенатом мозку (V2) після трансплантації ФНТ порівняно з цим показником при ТЧМТ (контроль–інтактні тварини); субстрат окислення — глутамат (Mm, n=8–10); * — p<0,05.

Рис. 10. Динаміка зміни швидкості поглинання кисню гомогенатом мозку в процесі фосфорилювання екзогенного АДФ (V3) після трансплантації ФНТ порівняно з цим показником при ТЧМТ (контроль–інтактні тварини); субстрат окислення — глутамат (Mm, n=8–10); * — p<0,05.

При субстраті окислення сукцинаті достовірно знижувалися показники V3, коефіцієнт ДКЧ і VДНФ (відповідно на 11,4, 38 та 31,7%) та зростали V2 і V4 порівняно з інтактними тваринами. ТФНТ позитивно вплинула саме на ті ланки енергетичного метаболізму, які в найбільшій мірі постраждали внаслідок ТЧМТ. На цьому тлі достовірно зростав коефіцієнт дихального контролю Чанса (з 62 до 168% у групі з ТФНТ) та показник VДНФ (з 68,3 до 144,5%) ( рис. 11, 12).

Рис. 11. Динаміка зміни коефіцієнту ДКЧ в мозку після трансплантації ФНТ порівняно з цим показником при ТЧМТ (контроль–інтактні тварини); субстрат окислення — сукцинат

(Mm, n=8–10); * — p<0,05.

Рис. 12. Динаміка зміни VДНФ в мозку після трансплантації ФНТ порівняно з цим показником при ТЧМТ (контроль–інтактні тварини); субстрат окислення — сукцинат (Mm, n=8–10); * — p<0,05.

На 45 та 60 добу, як і в гострий післятравматичний період, енергопродукування та енергозабезпечення мозку знижено, причому ці порушення виражені при окисленні як глутамату, так і сукцинату, що в цілому характеризує зниження активності дихального ланцюга мітохондрій й дефектність високопродуктивної ланки енергетичного метаболізму.

В результаті ТФНТ біоенергетичні процеси в травмованому мозку нормалізовувалися, зростали усі показники окисного фосфорилювання в мозку тварин 3 групи порівняно з показниками окисного фосфорилювання контрольної групи (без нейротрансплантації) при окисленні як сукцинату, так і глутамату. Зокрема, на 45 добу після ТФНТ при окисленні сукцинату достовірно зростали: V2 (з 77,4 до119%), V3 (з 68 до129,3%), коефіцієнт ДКЧ (з 73,5 до 127%) та показник VДНФ (з 62,6 до 144%). При окисленні глутамату показники окисного фосфорилювання змінювалися аналогічним чином, при цьому достовірно зростали: V2 (з 80,4 до130%), V3 (з 77,8 до132%), коефіцієнт ДКЧ (з 87,6 до 122,5%) та показник VДНФ (з 64,9 до 147,2%) (табл. 2).

Таблиця 2

Показники окисного фосфорилювання в гомогенатах мозку через 45 діб після ТЧМТ та ТФНТ; субстрати окислення — сукцинат та глутамат (Mm; n=8)

Тип впливу | Статис-тичний показник | Субст-рат окис-

лення |

V2 |

V3 |

V4 |

ДКЧ |

АДФ:0 |

VДНФ

Інтактні | Mm | сукцинат | 17,70,6 | 63,00,9 | 17,00,6 | 3,710,13 | 2,720,04 | 73,62,8

тварини | глутамат | 13,30,8 | 49,6 2,7 | 13,10,8 | 3,80,20 | 3,760,04 | 61,93,1

Mm | сукцинат | 13,70,8* | 42,92,3* | 15,60,5 | 2,750,16* | 2,580,07 | 46,13,0*

ТЧМТ+ | % | 77,4 | 68 | 91,7 | 73,5 | 94,8 | 62,6

ХО | Mm | глутамат | 10,70,4* | 38,62,0* | 11,60,3 | 3,330,16 | 3,690,08 | 40,22,9*

% | 80,4 | 77,8 | 88,5 | 87,6 | 98,1 | 64,9

Mm | сукцинат | 16,30,5** | 55,53,9** | 16,00,5 | 3,50,19** | 2,550,06 | 66,54,9**

ТЧМТ+ | % | 119 | 129,3 | 102,6 | 127 | 99 | 144

ХО+