КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УЛИНЕЦЬ Віктор Золтанович

УДК 578.85/.86

ВПЛИВ ВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ НА СПЕКТРАЛЬНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ФОТОСИНТЕТИЧНОГО АПАРАТУ РОСЛИН РОДИНИ SOLANACEAE

03.00.06 – вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ-2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі вірусології Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, доцент

Поліщук Валерій Петрович

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри вірусології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук

Карпов Олександр Вікторович,

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, м. Київ, провідний науковий співробітник відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів

доктор біологічних наук, професор

Войціцький Володимир Михайлович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії

Провідна установа: Нікітський ботанічний сад – національний науковий центр УААН, м. Ялта

Захист відбудеться „17”12.2002р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, проспект Глушкова, 2.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 62.

Автореферат розісланий “06” 11 2002р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Молчанець О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В сучасних умовах сильного антропогенного впливу на зовнішнє середовище виникає загроза швидкого розповсюдження вірусних інфекцій та виникнення епідемій як серед людей, так і серед тварин і рослин.

Вірусні інфекції завдають дедалі більшої шкоди сільськогосподарським угіддям, що, в свою чергу, призводить до значних втрат врожаю цінних господарських культур (Бойко, 1990). Тому в наш час актуальним є питання екологічного моніторингу стану посівів. Головним завданням моніторингу має бути прогнозування змін характеристик окремих ніш екологічної системи і на основі цього прогнозування подальшої долі екосистеми в часі (Кочубей, 1988).

На сьогоднішній день вже існує багато способів діагностики фітовірусних інфекцій. Це перш за все, біологічний метод доказу інфекційності на тест-об’єктах, метод електронної мікроскопії, різні модифікації імуноферментного аналізу, реакції імунодифузії, інші серологічні тести, метод електрофорезу в гелі, тощо. Але всі вони потребують великих фінансових витрат, руйнування цілісності організму і, що найбільш суттєво, не дають змоги за нетривалий час дослідити значні посівні площі.

Отже, велике значення має отримання експрес-інформації стану рослин, що підлягають дії різних зовнішніх впливів, зокрема, впливу вірусної інфекції (Wolf & Millatiner, 2000). Мається на увазі інформація, яка б дозволила уже на ранніх етапах діагностувати зміни клітинного метаболізму під впливом вірусної інфекції. Таку інформацію важливо отримати до того, як результат зовнішніх дій на організм проявиться візуально. Наслідком таких дій може бути зміна форми і затримка росту клітин, поява некрозів, зменшення загальної біомаси (Мэтьюз, 1992).

Сучасні методи оцінки стану агроценозу базуються переважно на вимірюванні спектрів відбиття зеленої рослинності (Алёхина, 1996). По значенню спектральних коефіцієнтів можна, наприклад, судити про кількість поглинутої рослинним ценозом променевої енергії (Андреева, 1982), вміст пігментів і азоту (Кэтти, 1991), а також оцінювати загальний фізіологічний стан рослин (Алёхина, 1996) і їх біомасу на різних фазах вегетації. З іншого боку, останнім часом багато уваги приділяється вивченню оптичних властивостей рослин, як одного із критеріїв їхнього фізіологічного стану (Антоненко, 1989).

Ймовірно, що чутливість спектральних методів, які ґрунтуються на зміні концентрації хлорофілу, буде залежати від того, на якій стадії розвитку вірусної інфекції можливе його тестування. Також можливо, що чутливість спектральних методів буде залежати як від швидкості та величини зміни пігментації листків рослин, так і від чутливості до зміни вмісту хлорофілу вимірювального спектрального параметру (Атабеков, 1981). Таким чином, виникає потреба у створенні принципово нового методу діагностики вірусних інфекцій великих посівних площ важливих сільськогосподарських культур. При цьому інформація має бути отримана на ранньому етапі розвитку вірусних інфекцій, за невеликий проміжок часу, економічно доцільною і завдавати якнайменшої руйнівної дії досліджуваним культурам.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно з науковою темою кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (реєстраційний номер №01БФ036-01) “Моніторинг збудників вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих технологій вирощування сільськогосподарських культур”, та відповідно проекту “Розробка комплексної еколого-економічної оцінки території України та системи оптимізації сільськогосподарського виробництва з урахуванням природно-ресурсного потенціалу та еколого-токсикологічної ситуації” (№ держ. реєстрації 0196U012978), керівник – доктор біологічних наук, професор, академік УААН, завідувач кафедри Бойко А.Л.

Мета і завдання досліджень. Вивчити вплив вірусної інфекції на фотосинтетичний апарат рослини-господаря за допомогою спектральних характеристик. Удосконалити існуючі і розробити нові методи ідентифікації вірусних захворювань рослин. Виявити можливість застосування спектрів відбиття від листків для дистанційної експрес-діагностики хвороб вірусної етіології.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Дослідити як вірусна інфекція впливає на фотосинтетичні показники досліджуваних рослин.

2. Оцінити інформативність люмінесценції в синьо-зеленій ділянці спектру на прикладі рослин тютюну і прослідити їх реакцію на інфікування ВТМ.

3. Провести аналіз сумісної дії вірусної інфекції (ВТМ) та нестачі азотного живлення на досліджувані рослини.

4. Виявити параметр, який можна було б використати в подальшому для діагностики вірусних інфекцій.

5. Створити на основі спектрометричних досліджень швидкий і ефективний метод діагностики стресів вірусної етіології.

Об'єкт дослідження – ВТМ, рослини Nicotiana tabacum L. cv. Trapeson та Capsicum annuum L.

Предмет дослідження – фізіологічні зміни фотосинтетичного апарату під дією вірусної інфекції та можливість їх діагностики за допомогою спектральних методів.

Методи дослідження включали колориметричний метод кількісного визначення хлорофілу, аналіз пігмент-білкового складу, визначення фотохімічної активності фотосистеми І та фотосистеми ІІ, вимірювання параметрів вуглекислотного газообміну, вимірювання спектрів люмінесценції, імуноферментний аналіз, електронну мікроскопію, лабораторні та дистанційні вимірювання спектрів відбиття, а також виміри концентрації вірусу в інфікованих рослинах.

Наукова новизна отриманих результатів. Показано відмінності у спектрах відбиття контрольних та інфікованих вірусом рослин, для яких характерний системний розвиток інфекції. Ці зміни з’являються ще до появи перших візуальних симптомів інфекції, що дозволяє застосовувати спектрометричні методи досліджень для діагностики вірусних інфекцій та для диференціювання їх від інших біотичних та абіотичних стресів.

Показана можливість адаптації методів діагностики вірусних інфекцій, розроблених на основі спектрометрії з високим спектральним розділенням, до їх дистанційної реалізації.

Віднайдено чутливі до дії вірусу тютюнової мозаїки та вміст хлорофілу оригінальні відносні спектральні параметри відбиття та люмінесценції рослин тютюну, ефективні для дистанційного визначення.

Отримана залежність між спектральним параметром І2/І1 та вмістом хлорофілу (CHL=2,482 Ч I2/I1 – 0,599 з коефіцієнтом кореляції 0,9840,089) для рослин перцю дозволяє оцінювати вплив вірусної інфекції за даними дистанційного зондування.

Практичне значення отриманих результатів. Запропонований спектральний метод з високим спектральним розділенням може бути використаний в сільському господарстві для дистанційної експрес-діагностики фітовірусних інфекцій та подальшого прогнозування урожаю на значних площах економічно важливих культур. Цінність такого роду інформації полягає в тому, що вона отримується за невеликий проміжок часу і потребує мінімального впливу на досліджувану культуру та навколишнє середовище.

Особистий внесок здобувача. Інформаційний пошук, опрацювання літературних даних, розробка схем експериментів, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретацію автором дисертації зроблено особисто. Планування та розробка методичних підходів виконання комплексу лабораторних досліджень проведені разом з науковим керівником д.б.н. Поліщуком В.П. Визначення пігмент-білкового складу тилакоїдів хлоропластів, вимірювання вуглекислотного газообміну рослин та дослідження люмінесцентних характеристик досліджуваних рослин проводилися на базі Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за участю д.б.н. Т.М. Шадчиної.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи були представлені на: 2 Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” Київ, вересень 1998 рік; 12-му Конгресі Європейського товариства фізіологів рослин, Будапешт, Угорщина, 2000 рік; ІІІ Міжнародній конференції „Біоресурси та віруси”, Київ, Україна, 2001 рік; міжнародній науковій і практичній школі для молодих вчених і спеціалістів „Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу”, Ужгород, Україна, 2001 рік; 12th International Congress of Virology “The World of Microbes”, 27th July – 1st August 2002, Paris; 6th Conference of European Foundation for Plant Pathology “Disease Resistance in Plant Pathology”, 9-14 September 2002, Prague.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, з яких 5 – статті в наукових журналах та 6 – матеріали конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 132 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 35 рисунками та 9 таблицями, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих даних, висновку та списку використаних джерел, який містить 227 літературних джерел (із них 63 вітчизняних та 164 іноземних).

ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. На підставі робіт вітчизняних та зарубіжних авторів висвітлені сучасні відомості про вплив вірусної інфекції на фотосинтетичний апарат рослини-господаря. Приведені дані про вплив вірусної інфекції та азотного голодування на спектральні властивості рослин. Показана необхідність розробки швидкого і ефективного методу діагностики фітовірусних інфекцій.

Матеріали та методи досліджень. Об'єктом досліджень були рослини Nicotiana tabacum L. cv. Trapeson та рослини Capsicum annuum L. сорту Вогні Молдавії, які виявляли, відповідно, системну та локальну реакції у відповідь на інфікування вірусом тютюнової мозаїки. Визначення концентрації хлорофілу у інфікованих рослин проводили калориметричним методом за загальноприйнятою методикою (Брайон, 1995, Arnon, 1949).

Електрофорез хлорофіл-білкових комплексів хлоропластів проводили у поліакриламідному гелі (ПААГ) за методом (Anderson, 1980), на пристрої GE-2/4 фірми “Pharmacia” (Швеція). Швидкість електронного транспорту в хлоропластах на рівні окремих фотосистем оцінювалась полярографічним методом із застосуванням універсального полярографа ОН-105 (Radelicis, Угорщина) за кількістю виділеного (для визначення активності ФС ІІ) або поглиненого О2 (для оцінки фотохімічної активності ФС І), при освітленні хлоропластів білим світлом насичуючої інтенсивності.

Інтенсивність фотосинтезу та транспірації вимірювали за контрольованих умов на установці, змонтованій на базі інфрачервоного оптико-акустичного газоаналізатора ГИАМ-5М. Розрахунки газообміну виконували за загальноприйнятою методикою (Гуляев, 1983). Дані обробляли статистично.

Виділення вірусного матеріалу проводили шляхом гомогенізації свіжозаморожених інфікованих рослин в 0,1М калій-фосфатному буфері (К2НР04 - КН2РО4), рН 7,4 з додаванням 0,01М Na2SO3, освітленням хлороформом вірусного екстракту у співвідношенні 1:7 та подальшим низькошвидкісним центрифугуванням протягом 20 хв. при 4 тис. об/хв на центрифузі РС-6. Концентрацію вірусу визначали спектрофотометрично.

Наявність вірусу в зразках визначали за допомогою непрямого імуноферментного аналізу (das-ELISA для визначення антигену) згідно (Кэтти, 1991). Для досліду брали не менш як три проби на кожний варіант. Аналіз проводили в 96-лункових планшетах (“Labsystems”, Фінляндія).

Функціональний стан фотосинтетичного апарату тестували за даними вимірювання параметрів індукції люмінесценції на стаціонарній автоматизованій спектрофлуориметричній установці. Були виміряні такі параметри, як Fo , Fm та Fi, згідно номенклатури (Van Koten, 1990). Розраховані на їх основі відношення Fv /Fm та FpL-Fo/Fm- Fo були використані для оцінки ступеню фотоінгібування та зміни відносної кількості QВ-невідновлювальних центрів ФС ІІ при дії стресових чинників вірусної етіології.

Для лабораторних досліджень відбиття світла рослинами використовували оснащений інтегруючою сферою двопроменевий реєструючий спектрофотометр СФ-18. Для розрахунків брали значення, отримані з листків одного ярусу. Швидкість розгортки складала 90нм/хв. Відтворюваність запису одного й того самого зразку по абсцисі (довжина хвилі) складала 1нм, по ординаті (коефіцієнт відбиття) – 0,3%. Результати паралельно у цифровому вигляді передавалися на ЕОМ, сполучену із спектрофотометром СФ-18. За допомогою ЕОМ проводили математичну обробку результатів кожного виміру окремо та у порівнянні між собою (Кочубей, 1990).

Дистанційні вимірювання спектрального розподілу інтенсивності світлового потоку, відбитого від посіву, здійснювали з висоти 3-х метрів за допомогою макету бортового спектрометру з високим спектральним розділенням МС-04, виготовленим на Вінницькому оптико-механічному заводі і настроєним в Інституті прикладних фізичних проблем при Білоруському державному університеті. Оскільки розроблений метод тестування вмісту хлорофілу та азоту в рослинах не потребує вимірювання абсолютних значень яскравості, а тільки спектрального розподілення їх відносних значень, макет бортового спектрометра при проведенні даних досліджень використовувався як індикаторний прилад.

Статистична обробка результатів проводилася за допомогою комп'ютерних програм з вирахуванням стандартного відхилення (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Спектри люмінесценції в діапазоні довжин хвиль 400-700нм. Досліджено спектри люмінесценції рослин тютюну в діапазоні хвиль видимого світла (400-700нм). Порівнюючи уражені ВТМ та контрольні рослини встановлено, що з віком рослини синьо-зелений максимум (420-500нм) спектру інтенсивності люмінесценції збільшувався. Поряд з цим зменшувався червоний максимум цього спектру (690-730нм). Для рослин, уражених ВТМ, ці зміни були більш виразними (Рис. 1 та 2).

Зміни першого максимуму (420-500нм) зумовлені, головним чином, накопиченням рослиною фенольних сполук. Як стверджує (Lichtenthaler, 1992), фенольні сполуки виділяються рослиною у відповідь на стресову ситуацію, таку, наприклад, як дія фітовірусної інфекції.

, нм, нм

Це такі сполуки, як корична, хлорогенова, ферулінова кислоти та кумарини.

Також у інфікованих рослин збільшується відношення синьо-зеленого та червоного максимумів спектру. Ми пояснюємо це підвищенням концентрації фенольних сполук та зниженням вмісту хлорофілу в листках на одиницю площі під дією вірусу.

Динаміка змін вмісту хлорофілу. В ході експериментів проводився аналіз вмісту хлорофілу через один, сім, чотирнадцять та двадцять один день після зараження. Через сім днів після інокуляції вміст хлорофілу (мг/дм2) в дослідних рослинах був дещо більшим ніж в контролі. Такий розподіл пігментів зумовлений вірусстимулюючою дією на фотосинтетичний апарат рослини-господаря на перших етапах інфекції. При подальшому аналізі вмісту хлорофілу цей показник зростав з віком рослини, але цей ріст був більш інтенсивним вже в контрольних рослинах, що зумовлено деструктивною дією ВТМ на хлоропласти.

В подальших дослідах було підтверджено таку тенденцію. Проте в рослин, що вирощувалися в умовах дефіциту азоту, значення вмісту хлорофілу було меншим, ніж навіть в уражених ВТМ рослинах. Дефіцитні по азоту рослини відрізнялися від решти рослин відставанням у осьовому рості та рості листового індексу. Також для таких рослин з віком не спостерігалось росту вмісту хлорофілу. Оскільки відомо, що саме хлорофіл в основному визначає спектральні властивості рослин, можна, враховуючи зміни в динаміці вмісту хлорофілу, застосувати різноманітні спектральні методи для діагностики стану рослин та для того щоб відрізнити вплив фітовірусної інфекції від впливу інших стресових факторів.

При польовому дослідженні на рослинах перцю можна бачити, що за термін дослідів (3 тижні) в контрольних рослинах концентрація хлорофілу, визначена за методом Арнона, в листках одного ярусу монотонно зростала (Рис. 3). У вірус-інфікованих рослин вона спочатку зростала, так що на сьомий день після інокуляції дещо перевищувала контрольний рівень, а надалі знижувалась.

Рис.3. Концентрація хлорофілу (a+b) в контрольних та інфікованих ВТМ рослинах перцю за лабораторними даними для листків одного ярусу

На кінець третього тижня вміст хлорофілу в листках інфікованих вірусом рослин, виражений як на одиницю сирої маси, так і на одиницю площі листової поверхні, був достовірно нижчий у порівнянні із відповідними даними для листків контрольних рослин.

Хлорофільний індекс, що відповідає загальній кількості хлорофілу накопиченого в листках, у контрольних рослин монотонно зростав.

В таблиці 1 представлено результати визначення фітометричних та біохімічних параметрів контрольних та уражених вірусом тютюнової мозаїки рослин солодкого перцю в залежності від тривалості часу після зараження.

Таблиця 1.

Біохімічні та фітометричні характеристики листків перцю в динаміці розвитку вірусної інфекції в порівнянні з контролем

Визначення співвідношення хлорофілів a/b в хлоропластах тютюну. Аналіз співвідношення хлорофілів a/b в хлоропластах листків тютюну показав, що як вірусна інфекція так і дефіцит азотного живлення, обумовлюють зниження його величини (табл. 2).

Таблиця 2.

Зміна величини співвідношення хлорофілів а/b в хлоропластах листків тютюну, інфікованого ВТМ або вирощеного за нестачі азоту

В літературі дані щодо змін даного показника є досить розрізненими і суперечливими. Результати наших досліджень підтверджують висновки більшості авторів про те, що вірусна інфекція викликає зниження співвідношення хлорофілів а/b в фотосинтетичних мембранах.

Порівняльний аналіз пігмент-білкового складу досліджуваних рослин. Результати порівняльного аналізу пігмент-білкового складу досліджуваних варіантів представлені в таблиці 3.

Найбільш помітні зміни, що виявились під час електрофоретичного розділення пігмент-білкових комплексів хлоропластів досліджуваних рослин, стосуються комплексів LHCP2 та CРa. Відносна частка LHCP2 майже не змінилася у вірусінфікованих рослин і різко зменшилася у рослин, вирощених при азотній нестачі.

У випадку найближчої антени ФС ІІ (CPа) мало місце значне зменшення його відносної кількості під впливом кожного із несприятливих чинників.

Таблиця 3.

Відносний розподіл пігмент-білкових комплексів при електрофоретичному розділенні мембран тилакоїдів

К - контрольні рослини, V – вірусінфіковані, -N - азотна нестача

Пігмент-білкові комплекси |

К | V | -N

Інтенсивність. відн.од. | % | Інтенсивність. відн.од. | % | Інтенсивність. відн.од. | %

CP1a+CP1 | 168,5 | 30,6 | 165,0 | 30,5 | 164,7 | 31,5

LHCP1 | 129,3 | 23.5 | 132,0 | 24,4 | 132,8 | 25,4

LHCP2 | 29,7 | 5,4 | 32,5 | 6,0 | 15,7 | 3,0

Cpa | 30,3 | 5,5 | 19,6 | 3,6 | 15,8 | 3,0

LHCP3 | 94,6 | 17,2 | 96,8 | 17,9 | 96,7 | 18,5

FP | 93,5 | 17,0 | 95,0 | 17,6 | 97,3 | 18,6

Це може обумовлювати зміни у переносі світлової енергії від світлозбиральних пігментів до реакційних центрів ФС ІІ і, таким чином, бути одним з факторів її інактивації.

Зміни електрон-транспортного ланцюгу хлоропластів. Поряд із змінами співвідношення хлорофілів а/b в тилакоїдах хлоропластів та співвідношення окремих пігмент-білкових комплексів, що спостерігаються при дефіциті азотного живлення або зараження рослин ВТМ, нами виявлені також зміни у роботі електрон-транспортоного ланцюга хлоропластів. При визначенні швидкості електронного транспорту в тилакоїдах хлоропластів в реакції Н2О - ДХБХ (в присутності К3(Fе(СN)6) виявилось, що ФС ІІ - залежне виділення О2 складало 53% від контролю при нестачі азоту та дещо менше - 49% - при вірусній інфекції (табл. 4). Таким чином в умовах нашого експерименту обидва несприятливі чинники викликали однонаправлені зміни (зниження) фотохімічної активності ФС ІІ, проте інтенсивність цих змін була дещо різною: інактивація ФС ІІ була більш глибокою при зараженні рослин ВТМ.

Таблиця 4.

Активність ФС ІІ в хлоропластах листків тютюну у зв’язку з зараженням ВТМ або нестачею азоту в поживному середовищі

Варіанти досліду | мкМ виділ. О2 /

мг хл год. | % від

контролю

Контроль (K) | 100,1 4,6 | 100% | -NH4NO3 (-N) | 53,4 3,8 | 53,4 % | + ВТМ (V) | 49,0 1,4 | 49,0 %

Вивчені нами варіанти рослин значно відрізнялися і по активності ФС І в хлоропластах (табл. 5). Поглинання кисню в реакції, коли донором електронів для ФС І є відновлений ДАД, а перенос електронів від ФС ІІ до ФС І заінгібований діуроном (ДХМС), знижувалося в середньому на 27 % у варіанті з дефіцитом азотного живлення та біля 40 % - при зараженні ВТМ. Можна бачити, що ступінь зниження активності ФС І є меншою, ніж ФС ІІ. Ці дані вказують на більшу стійкість фотосистеми І до дії вірусної інфекції та рівня забезпечення рослин азотним живленням.

Таблиця 5.

Активність ФС І в хлоропластах листків тютюну у зв’язку з зараженням ВТМ або нестачею азоту в поживному середовищі

Варіанти досліду |

мкМ погл. О2 /

мг хл за год. | % від

контролю

Контроль (K) | 519,2 22,5 | 100 % | -NH4NO3 (-N) | 376,6 11,0 | 72,5 % | + ВТМ (V) | 314,0 22,2 | 60,4 % | Виявлення впливу вірусної інфекції та нестачі азотного живлення на вуглекислотний газообмін рослин тютюну. Важливою характеристикою фізіологічного стану фотосинтетичного апарату є інтенсивність нетто-фотосинтезу, тобто швидкість поглинання СО2 листком. Цей показник є інтегральним відображенням як активності всього комплексу фото- та біохімічних реакцій, що відбуваються у клітинах мезофілу, так і структурно-функціональних особливостей фотосинтетичного апарату на рівні цілого листка — в першу чергу продихової регуляції надходження СО2 до міжклітинників. Знаючи параметри СО2 та Н2О газообміну листка, можна розрахувати листковий (rl) та мезофільний (rm) опори дифузії СО2, які характеризують внесок продихової та метаболічної складових у регуляцію нетто-фотосинтезу.

Виявилося, що інтенсивність фотосинтезу листків дослідних рослин вдвічі менша за контроль, тоді як різниця між самими варіантами досліду була незначною (табл. 6).

Розрахунки опорів дифузії СО2 показали, що це зменшення відбулося переважно внаслідок збільшення rm, який був практично однаковим у інфікованих вірусом рослин та тих, що росли за нестачі азоту. Підвищення rm свідчить про гальмування швидкості карбоксилювання рибулозобісфосфату та взагалі реакцій циклу Кальвіна. Це зрозуміло, оскільки внаслідок зменшення вмісту хлорофілу порушується робота електрон-транспортного ланцюгу та утворення АТФ і відновних еквівалентів, що необхідні для темнової фази фотосинтезу. Отже, вплив як вірусу, так і нестачі азоту, призвів на клітинному рівні до зовні однакового ефекту зменшення швидкості поглинання СО2 мезофілом листка, проте, очевидно, різними шляхами.

Таблиця 6.

Параметри газообміну листків рослин тютюну, інфікованого ВТМ або вирощеного за нестачі азоту

Навпаки, реакція продихів у дослідних рослин була неоднозначною. Нестача азоту практично не вплинула на продихову регуляцію, свідченням чого є відсутність різниці rl між цим варіантом та контролем (див. табл. 6). Водночас у інфікованих вірусом рослин rl був суттєво вищим. Звідси випливає, що вірус якимось чином пошкоджує продихи, можливо через зміну їх рухомості. Це може позначитися на ступені їх розкриття та швидкості дифузії СО2 до міжклітинників мезофілу листка. Зазначимо, що концентрація СО2 у міжклітинниках (Сі) у інфікованих рослин була такою самою, як і в контролі. Однак у перших її величина визначалася закриттям продихів, а у других — активнішим поглинанням СО2 клітинами мезофілу.

Таким чином, можна дійти висновку, що вірусна інфекція як і нестача азоту негативно впливають на процес фотосинтетичної асиміляції СО2. Обидва чинники однаковою мірою знижують вміст хлорофілу в листках та підвищують опір дифузії СО2 мезофілу, що є непрямим свідченням інгібування карбоксилазної активності. Крім того, виявлено негативний вплив вірусу на функціонування продихового апарату, що супроводжується підвищенням листкового опору та утрудненням дифузії СО2 до міжклітинників листка. Внаслідок цього асиміляція СО2 листками рослин, інфікованих вірусом, була навіть дещо нижчою, ніж у варіанті з дефіцитом азоту. У зв'язку з цим пошкоджувальна дія вірусу на фотосинтетичний апарат уявляється порівняно більш небезпечною для продуктивності рослин, ніж нестача азотного живлення.

Динаміка змін спектральних параметрів індукції люмінесценції під впливом ВТМ. Зміни активності у фотосистемі ІІ, виявлені при визначенні фотохімічної активності фотосистем у тилакоїдах хлоропластів, були підтверджені в експериментах по вимірюванню параметрів індукції люмінесценції листків рослин. Згідно отриманих даних (табл. 7), зниження рівня азотного живлення призводить до значного зростання величини Fo та Fm. При цьому параметр Fm-Fo/Fm= Fv /Fm, відомий в літературі, як показник квантового виходу ФС П (Genty, 1989), зменшувався. В середньому це зменшення становило біля 5 %. У листках вірусінфікованих рослин зменшення величини Fv /Fm досягало 9%. Зміни величини Fv /Fm були обумовлені, головним чином, збільшенням інтенсивності початкової флуоресценції Fo. Інтенсивність флуоресценції Fm змінювалась в процесі розвитку інфекції у рослинному організмі по-різному. На 20-й день після інфікування рослинного організму (дані наведені в таблиці) Fm була вищою за контроль, але дещо нижчою за Fm азотдефіцитних рослин. При подальшому розвитку інфекції інтенсивність даного параметру знижувалась.

Таблиці 7.

Параметри індукції люмінесценції адаптованих до темноти листків тютюну за різних умов вирощування

Ріст інтенсивності індукції люмінесценції Fo у вірусінфікованих та азотдефіцитних рослин свідчить, що такі чинники, як вірусна інфекція або нестача азотного живлення рослин, також призводять до змін, що стосуються ФС ІІ.

Крім параметру варіабельної люмінесценції при дії обох видів стресів мають місце також зміни відношення Fpl-Fo/Fm- Fo. Ріст величини параметра Fpl-Fo/Fm- Fo у рослин, дефіцитних по азоту і ще в більшій мірі при дії вірусної інфекції (табл. 7), як показника відносної кількості QВ -невідновлювальних центрів (Корнеев, 2000), що є ще одним свідченням порушень у ФС ІІ при дії вірусної інфекції та азотного голодування.

Динаміка концентрації ВТМ в листках дослідних рослин. При дослідженні залежності загального вмісту хлорофілу від концентрації вірусу, можна відмітити, що на початкових стадіях інфекції спостерігалось падіння рівня концентрації хлорофілу до певного значення на фоні збільшення титру вірусу.

Максимальна кількість вірусів у листковій тканині рослин перцю, за умов локальної реакції рослини на дію ВТМ, виявлялась на 14-й день після інокуляції, після чого їх кількість знижувалась (Рис. 4), тобто характер динаміки концентрації вірусів у листках не відповідав такому для вмісту хлорофілу в них.

Рис. 4. Динаміка концентрації вірусу в листковій тканині

Динаміка змін спектрального параметру відбиття рослин тютюну. Із дослідження спектрів відбиття штучного випромінення листками при дистанційній діагностиці стану рослин виявилось більш інформативним використовувати графічний вираз першої похідної цього спектру в червоній частині. На кривій похідної червоної частини спектру присутні два максимуми, відповідно, короткохвильовий та довгохвильовий (І1 та І2). У випадку зростання концентрації хлорофілу показник І2/І1 буде зростати, і навпаки, при зниженні вмісту хлорофілу – прямує до нуля. Таким чином цей показник може в подальшому бути використаний для експрес-діагностики фітовірусних інфекцій.

Рис.5. Концентрація хлорофілу (a+b) в контрольних та інфікованих ВТМ рослинах перцю за даними дистанційної діагностики

Величини вмісту хлорофілу в листках контрольних та інфікованих ВТМ рослин солодкого перцю, визначені за даними дистанційного зондування з використанням регресійної залежності CHL = 2,482 ? I1/I2 – 0,599 представлені на Рис 5.

Для контрольного варіанту динаміка дистанційно визначеного біохімічного параметра відповідала зміні на цей час концентрації хлорофілу в листках одного ярусу, визначеного хімічно за методом Арнона (Рис. 6).

У листках вірус-інфікованих рослин вміст хлорофілу, обчислений за допомогою дистанційно визначеного спектрального параметра відбиття I1/I2 , починав знижуватись пізніше, ніж це спостерігалось за даними хімічного визначення хлорофілу.

Для вірусінфікованих рослин спостерігалось розходження даних лабораторного та дистанційного визначень хлорофілу (Рис. 5 та 6) в період виявлення відмінностей між контрольними та інфікованими рослинами на 14-й та 21-й дні, коли мало місце зниження вмісту хлорофілу в листках уражених вірусом рослин.

Рис.6. Концентрація хлорофілу (a+b) в рослинах перцю за лабораторними даними для листків одного ярусу.

Ці розходження можна пояснити, якщо брати до уваги той факт, що дана вірусна інфекція, на відміну від дії ВТМ у рослинах тютюну (системні симптоми у вигляді рівномірної дехлорофілізації рослин) викликала нерівномірне ураження по всій площі листової поверхні у вигляді зниження вмісту хлорофілу на певних ділянках листової пластинки з подальшим їх некрозом. А тому навіть при значному розвитку патологічного процесу ділянки листової пластинки з високим вмістом хлорофілу ще вносили суттєвий вплив на формування спектральної кривої відбиття, кількісною характеристикою якох служить обчислюваний нами параметр I2/I1. А тому величини вмісту хлорофілу, одержані за допомогою даного спектрального параметра, в значній мірі відображали вміст хлорофілу на неуражених частинах листової пластинки. Саме цим, очевидно, можна пояснити більш пізнє виявлення зниження хлорофілу в інфікованих рослинах за допомогою спектрального параметра I2/I1 при використанні даних дистанційного зондування ділянок з насадженнями перцю.

Так, зміна листового індексу контрольних та дослідних рослин перцю впродовж експерименту була неоднаковою (Рис. 7). Видно, що загальна площа листової поверхні інфікованих рослин на третій тиждень була значно меншою за листовий індекс контрольних рослин, що свідчить про одночасне накопичення хлорофілу в інфікованих листках та зупинку росту їхньої площі.

Відсутність росту площі листкової поверхні за умови підвищення вмісту хлорофілу в листках може бути використане для розпізнавання вірусної інфекції на більш ранній стадії розвтку інфекційного процесу.

Рис.7. Динаміка змін площі листової поверхні в контрольних та інфікованих ВТМ рослинах перцю

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що в інфікованих ВТМ рослинах відбувається зміна концентрації хлорофілу як на одиницю площі, так і на одиницю маси, що дозволяє застосовувати спектрометричні методи досліджень для діагностики фітовірусних інфекцій та для диференціювання їх від інших біотичних та абіотичних стресів.

2. Показано, що відмінності у спектрах відбиття контрольних та інфікованих вірусом рослинах, за яких характерний системний розвиток інфекції, з’являються ще до появи перших візуальних симптомів інфекції.

3. Встановлено, що вірусна інфекція, як і нестача азоту негативно впливають на процес фотосинтетичної асиміляції СО2. Виявлено негативний вплив вірусу на функціонування продихового апарату, що супроводжується підвищенням листкового опору та утрудненням дифузії СО2 до міжклітинників листка.

4. Під впливом вірусу ВТМ і нестачі азоту в середовищі ступінь зниження активності ФС І є меншою, ніж ФС ІІ, що вказує на більшу стійкість фотосистеми І до дії вірусної інфекції та рівня забезпечення рослин азотним живленням.

5. Експериментально доведено, що одним з параметрів оцінки стану рослин, за умов системної реакції рослин на розвиток фітовірусної інфекції, може бути співвідношення довгохвильового та короткохвильового максимумів (І2/І1) на кривій першої похідної від спектру відбиття в ділянці червоного краю.

6. Отримано залежність між спектральним параметром І2/І1 та вмістом хлорофілу (CHL=2,482 Ч ?2/І1 – 0,599 з коефіцієнтом кореляції R = 0,984 ± 0,089) для рослин Capsicum annuum L., що дозволяє оцінювати вплив вірусної інфекції за даними дистанційного зондування.

7. Показано, що для підвищення чутливості даного спектрального методу, який використовується для оцінки впливу вірусу на рослину, необхідно використовувати також параметри відбиття, чутливі до зміни величини листового індексу.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Улинець В.З., Поліщук В.П., Шадчина Т.М. Експрес-метод діагностики вірусної інфекції // Науковий вісник Ужгородського національного університету. -2000, №8, с.4-6.

2. Улинець В.З., Поліщук В.П., Шадчина Т.М., Немченко А.М. Успіхи і проблеми в розробці методів дистанційної діагностики фітовірусних інфекцій // Науковий вісник Ужгородського національного університету. -2001, №9, с.73-76.

3. Улинець В.З., Шадчина Т.М, Немченко А.М., Поліщук В.П. Тестування фітовірусних інфекцій перцю за допомогою характеристик відбиття листків в області червоного краю спектру // Вісник Київського національного університету ім. Т.Шевченка. –2001, №35, с. 53-56.

4. В.З. Улинець, Т.М. Шадчина, О.Г. Воловик, С.К. Ситнік. Вплив вірусної інфекції та азотного голодування на фотосинтетичний апарат листків тютюну // Физиология и биохимия культ. растений. -2002, Т. 34, №4, с.360-365.

5. В.З. Улинець, Д.А. Кірізій. Вплив вірусної інфекції та нестачі азотного живлення на вуглекислотний газообмін рослин тютюну // Доповіді Національної академії наук України. -2002, №8, с.166-169.

6. Шадчина Т.М., Бубряк О.А., Улинец В.З., Созинов А.А. Перспективы ранней диагностики фитовирусных инфекций по отражательным характеристикам листьев // ІІ Міжнародна конференція „Біоресурси та віруси”. 7-10 вересня 1998. Київ, Україна. С. 110.

7. V.Ulinets, V.Polishuk, A.Nemchenko. Plant photosynthetic activity affected by viruses, and abilities of fast-diagnostics // 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. 21-25 August 2000, Budapest. S20-45.

8. Улинець В.З., Шадчина Т.М., Немченко А.М. Тестування фітовірусних інфекцій перцю, за допомогою характеристик відбиття листків в області червоного краю // ІІІ Міжнародна конференція „Біоресурси та віруси”. 11-15 вересня 2001. Київ, Україна. С. 103.

9. Улинець В.З., Поліщук В.П., Шадчина Т.М., Немченко А.М. Успіхи і проблеми в розробці методів дистанційної діагностики фітовірусних інфекцій // Міжнародна науково-практична школа для молодих вчених та спеціалістів „Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу”, 4-7 жовтня 2001р., Ужгород. С. 73-76.

10. Polischuk V.P., Budzanivska I.G., Ulinets V.Z., Shadchina T.M., Boyko A.L. Detection of plant virus infections using leaf spectral characteristics // 12th International Congress of Virology “The World of Microbes”, 27th July – 1st August 2002, Paris. P. 231.

11. Ulinets V., Polisсhuk V. Changes in photosynthetic apparatus of tobacco leaves in coditions of virus infection and shortage of nitrogen // 6th Conference of European Foundation for Plant Pathology “Disease Resistance in Plant Pathology”, 9-14 September 2002, Prague. P. 78.

АНОТАЦІЯ

Улинець В.З. Вплив вірусної інфекції на спектральні характеристики фотосинтетичного апарату рослин родини Solanaceae. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 – вірусологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка. Київ, 2002.

Показана можливість діагностики фітовірусних інфекцій з застосуванням спектрометричних методів досліджень, які базуються на вимірюванні концентрації хлорофілу.

Головною перевагою даного методу є знаходження відмінностей у спектрах відбиття контрольних і системно інфікованих вірусом тютюнової мозаїки рослинах, які можна спостерігати ще до появи перших симптомів інфекції.

Виявлено негативний вплив вірусної інфекції на структуру і функціональний стан фотосинтетичного апарату з переважним ураженням фотосистеми ІІ.

Показано, що вірусна інфекція та нестача азоту в поживному середовищі, негативно впливають на асиміляцію СО2 листками, зменшуючи інтенсивність нетто-фотосинтезу та підвищуючи мезофільний опір. Разом з тим, виявлено відмінність у дії цих чинників, яка полягає у збільшенні листкового опору при дії вірусної інфекції.

Доведено, що при системній реакції рослин на розвиток вірусної інфекції, для оцінки їх стану може бути використане співвідношення довгохвильового та короткохвильового максимумів (І2/І1) на кривій першої похідної від спектру відбиття в ділянці червоного краю.

Встановлено, що при оцінці впливу вірусу на рослину за допомогою спектрального методу необхідно використовувати також параметри відбиття, чутливі до зміни величини листового індексу.

Ключові слова: вірусна інфекція, вірус тютюнової мозаїки (ВТМ), стрес, ФС І, ФС ІІ, люмінесценція, хлоропласти, хлорофіл, фотосинтез.

Улинец В.З. Влияние вирусной инфекции на спектральные характеристики фотосинтетического аппарата растений семейства Solanaceae. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 – вирусология. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко. Киев, 2002.

Показана возможность диагностики фитовирусных инфекций с использованием спектрометрических методов исследования, которые базируются на измерении концентрации хлорофилла.

Главным преимуществом данного метода есть нахождение отличий в спектрах отражения контрольных и системно инфицированных вирусом табачной мозаики растениях, которые можно наблюдать еще до появления первых симптомов инфекции.

Выявлено негативное влияние вирусной инфекции на структуру и функциональное состояние фотосинтетического аппарата с преимущественным поражением фотосистемы II.

Показано, что вирусная инфекция, как и нехватка азота в питательной среде, отрицательно влияют на ассимиляцию СО2 листьями, уменьшая интенсивность нетто-фотосинтеза и повышая мезофильное сопротивление. Вместе с тем, выявлено различия в действии этих факторов, которые заключаются в увеличении листового сопротивления в результате действия вирусной инфекции.

Доказано, что при системной реакции растений на развитие вирусной инфекции, для оценки их состояния может быть использовано соотношение длинноволнового и коротковолнового максимумов (I2/I1) на кривой первой производной от спектра отражения на участке красного края спектра.

Выявлено, что при оценке влияния вируса на растение с помощью спектрального метода необходимо использовать также параметры отражения, чувствительные к изменению величины листового индекса.

Ключевые слова: вирусная инфекция, вирус табачной мозаики (ВТМ), стресс, ФС I, ФС II, люминесценция, хлоропласты, хлорофилл, фотосинтез.

V.Z. Ulinets. Effects of viral infection on spectral characteristics of photosynthetic apparatus of Solanaceae plants. – Manuscript.

The thesis for obtaining PhD degree in speciality 03.00.06 – virology. Taras Shevchenko’ Kyiv national university. Kyiv, 2002.

Possibility of using of spectrometric research techniques based on measurement of chlorophyll concentration for diagnostics of plant virus infection is demonstrated.

The main advantage of this method is the revealing of differences in reflectance spectrums of control and systemically TMV-infected plants that may be observed even earlier than symptoms’ development.

Negative influence of viral infection on structure and functional state of photosynthetic apparatus with prevailing destruction of photosystem II is shown.

There has been demonstrated that viral infection and shortage of nitrogen in the medium affect assimilation of CO2 by leaves, decreasing therefore intensity of netto-photosynthesis and increasing mesophyll opposition. Moreover, these factors act differently, as viral infection leads to increase of leaves’ opposition.

It was shown that for evaluation of condition of systemically virus-infected plants, ratio of long-wave and short-wave maximums (I2/I1) on the curve of the first derivative from reflectance spectrum in the red edge region may be used.

We also stated that evaluating virus impact on a plant using spectral technique, reflectance parameters sensitive to the value of leaf index should be also used.

Key words: viral infection, tobacco mosaic virus (TMV), stress, PS I, PS II, luminescence, chloroplasts, chlorophyll, photosynthesis.