УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НІКІТСЬКИЙ БОТАНІЧНИЙ САД – НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

ВОЛКОВА

Людмила Львівна

УДК 577.114:633:57.086.83

РІСТРЕГУЛЮЮЧИЙ ТА ЕЛІСІТОРНИЙ ВПЛИВ ФУКОЗОВМІСНИХ ОЛІГОСАХАРИНІВ НА РОСЛИННІ ОБ'ЄКТИ В УМОВАХ IN VITRO

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Ялта – 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у лабораторії біотехнології Херсонського державного педагогічного університету Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, старший науковий співробітник,

Горбатенко Ігор Юрійович,

Херсонський державний педагогічний університет,

завідувач міжвідомчої лабораторії біотехнології

Офіційні опоненти – доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Митрофанова Ольга Володимирівна,

Нікітський ботанічний сад - Національний

науковий центр УААН,

завідувач відділу біотехнології і вірусології рослин

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Кравець Володимир Степанович,

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

завідувач відділу фізіології стійкості рослин,

заступник директора

Провідна установа –

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

відділ молекулярної генетики

Захист відбудеться “ 16 ” __травня_______2002 р. о “ 13 ” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 у Нікітському ботанічному саду - Національному науковому центрі УААН за адресою: 98648, Автономна Республіка Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр УААН, Україна.

Факс: (0654) 33-53-86,

E-mail:nbs1812@ukr.net

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці НБС-ННЦ за адресою: 98648, Автономна Республіка Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр, Україна.

Автореферат розіслано “ 11 ”__квітня______ 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Садогурський С.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Сучасна біотехнологія сформувалась на базі молекулярної біології, клітинної і генетичної інженерії та при широкому використанні методів біоорганічної хімії, фізіології та інших наук (Герасименко, 1989). Одним з головних завдань біотехнології рослин є одержання та клональне мікророзмноження нових високопродуктивних сортів рослин. Головним методом вирішення цієї проблеми є культура тканин і клітин in vitro. Для інтенсифікації клонального мікророзмноження можна використовувати речовини, які прискорюють і регулюють окремі етапи онтогенезу і підвищують стійкість рослинних об'єктів до біотичних та абіотичних факторів. До таких сполук можна віднести олігосахарини – речовини ендогенного походження, що мають досить високу біологічну активність при дуже низьких концентраціях і не акумулюються рослинами (Ayers et al.,1976; Albersheim et al., 1983; 1992).

Олігосахарини (біологічно активні олігосахариди) – це клас специфічних вуглеводних молекул, які здатні змінювати метаболізм рослинних клітин і організму в цілому, що допомагає йому адаптуватися до змін навколишнього середовища (Леонтьева и др., 1993). У рослинах олігосахарини виконують роль сигнальних молекул у процесах міжклітинних комунікацій (Mohnen, Hahn, 1993; Vargas-Rechia et al., 1998; та інші), стимулюють їхній ріст та розвиток (Aldington, Fry, 1993; Creelman, Mullet, 1997; та інші), індукують велику кількість захисних реакцій проти фітопатогенів (Barber et al., 1989; Felix et al., 1993; Stratmann et al., 2000; та інші). Більшість олігосахаринів мають антиауксинову дію (York et al., 1984; Augur et al., 1992; Павлова, 1995; та інші). Проте механізми їх дії практично не досліджені.

Для з’ясування шляхів взаємодії молекул олігосахаринів з рецепторами плазмалеми необхідно встановити вплив їхнього моносахаридного складу і просторової будови на біологічну активність. Для вирішення цієї проблеми велике значення має вивчення природних олігосахаринів різного походження. Олігосахарини рослинного і грибного походження останні двадцять років дуже активно досліджуються вченими усього світу (Albersheim et al., 1983; 1992; Schweizer et al., 1996; Umemoto et al., 1997; та інші). Недослідженими залишаються олігосахарини з жіночого молока, у якому їх міститься декілька десятків. Їх розділяють на дві групи: фукозовмісні та олігосахарини, що мають у своєму складі сиалову кислоту (Химия биологически активных природных соединений, 1976). Застосування методів біотехнології дає змогу досліджувати сигнальну активність олігосахаринів на тканинному та клітинному рівнях в умовах in vitro.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано на базі лабораторії біотехнології Херсонського державного педагогічного університету в період з 1997 р. по 2001 р. Тема дисертації тісно пов'язана з державною науковою темою "Застосування природних біологічно активних речовин з елісіторною та рістрегулюючою дією для стимулювання росту рослин і підвищення їхнього імунітету", реєстраційний номер 0199U002722.

Мета і завдання роботи. Метою дослідження є вивчення рістрегулюючого та елісіторного впливу фукозовмісних олігосахаринів на рослинні об'єкти в умовах in vitro.

Для досягнення мети поставлено такі завдання:

– визначити вплив олігосахаринів на ріст і розвиток проростків, процеси калюсоутворення й органогенезу в експлантів мікропагонів, гіпокотилів і сім'ядолей томата in vitro;

– виявити вплив передобробки насіння томата та озимої пшениці розчинами олігосахаринів на його проростання, ріст та розвиток проростків;

– дослідити антистресові властивості олігосахаринів. Виявити їхній вплив на стійкість проростків томата до засолення і стресу, викликаного йонами Купруму;

– виявити активність олігосахаринів при спільній дії із ауксинами, цитокінінами і їхній вплив на амілолітичну активність алейронового шару ендосперму ячменю;

– установити елісіторні властивості фукозовмісних олігосахаринів;

– дати порівняльну оцінку біологічної активності олігосахаринів тваринного, рослинного та грибного походження.

Об'єкт досліджень – фукозовмісні олігосахарини і їхня біологічна активність у рослинах.

Предмет досліджень – рістрегулюючий і елісіторний вплив фукозовмісних олігосахаринів на рослинні об'єкти в умовах in vitro.

Методи досліджень. Використовували загальноприйняті в біотехнології методи культури тканин, вирощування асептичних проростків в умовах in vitro і стерилізації рослинного матеріалу (Бутенко, 1964; Калинин и др., 1980; Митрофанова и др., 1997; та інші), біотести (Павлова, 1995; Hahn, 1981; 1992; та інші).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначено біологічну активність фукозовмісних олігосахаринів та їхній вплив на рослинні об'єкти в умовах in vitro. Установлено, що вони стимулюють проростання насіння, розвиток проростків однодольних і дводольних рослин, процеси регенерації, калюсоутворення і ризогенезу в експлантів томата. З’ясовано їхню регуляторну та сигнальну дію на амілолітичну активність алейронового шару ендосперму ячменю, а також ефект синергізму в біотестах з ауксинами. Вперше показано антистресову активність олігосахаринів в умовах сольового стресу та стресу, викликаного йонами Купруму. Встановлено, що фукозовмісні олігосахарини виявляють елісіторні властивості в рослинних організмах. Проведено паралелі між хімічною будовою і біологічною активністю олігосахаринів тваринного, рослинного і грибного походження.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження дають змогу розширити знання про вплив моносахаридного складу і будови олігосахаринів на їхню біологічну активність, що сприятиме вивченню механізму їхньої дії в рослинних організмах, процесу передачі сигналу при міжклітинній взаємодії і при взаємозв’язку рослин із навколишнім середовищем. Одержані результати дозволяють рекомендувати використання олігосахаринів як регуляторів росту в біотехнологічних, генетичних, біохімічних і фізіологічних дослідженнях, а також як речовини, які мають фітогормональну активність, при складанні живильних середовищ для клонального мікророзмноження. Крім цього, олігосахарини можна використовувати для підвищення імунітету цінних рослинних об'єктів.

Результати дисертаційного дослідження включено в лекційні і практичні курси "Основи сучасного хімічного виробництва і біотехнології", "Біохімія" і "Оргбіохімія" для студентів психолого-природничого факультету Херсонського державного педагогічного університету.

Особистий внесок здобувача. Вивчення рістрегулюючого та елісіторного впливу фукозовмісних олігосахаринів на рослинні об'єкти в умовах in vitro проведено автором самостійно. Дисертант оволодів методиками культивування рослинних об'єктів in vitro та проведення біотестів. Проведено аналіз 206 літературних джерел, з них 162 англійською мовою. Встановлено біологічну активність одинадцяти олігосахаринів у різних біологічних процесах. Зроблено математичну обробку одержаних результатів. Проаналізовано вплив моносахаридного складу та просторової будови фукозовмісних олігосахаринів на їхню біологічну активність. Дано порівняльну оцінку біологічної активності олігосахаринів тваринного, рослинного та грибного походження. Результати досліджень відображено в публікаціях та дисертації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на: науково-методичних семінарах кафедри хімії Херсонського державного педагогічного університету (Херсон, 1998-2001); Міжнародному регіональному семінарі ”Environment protection: Modern Studies in Ecology and Microbiology” (Ужгород, 1997); 11-ому Конгресі Федерації Європейського товариства Фізіологів рослин (Варна, 1998); Конференції молодих вчених ”Актуальні питання ботаніки та екології” (Херсон, 1998); Міжнародній конференції ”Проблеми екологічної стабільності Східних Карпат” (Синевір, 1999); Міжнародній конференції ”Фальцфейнівські читання” (Херсон, 2001); Всеукраїнській конференції молодих вчених ”Актуальные вопросы современного естествознания” (Сімферополь, 2001); Міжнародному симпозіумі ”Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems” (Київ, 2001); Міжнародній конференції молодих вчених з молекулярної біології та генетики (Київ, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових робіт: 7 статей (3 з них у виданнях, затверджених ВАК України як спеціалізовані за біологічним напрямком) та 5 тез.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, шести розділів, висновків, списку використаних джерел, практичних рекомендацій та додатків. Загальний обсяг дисертаційної роботи становить 171 сторінку машинописного тексту, з них 119 сторінок основного тексту. Робота містить 22 рисунка, 44 таблиці, 3 додатки (27 сторінок). Бібліографія роботи налічує 206 літературних джерел, з них 162 – іноземною мовою.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

ЛІТЕРАТУРНИЙ ОГЛЯД

Ряд вчених (Creelman and Mullet, 1997; Рудишин, 1998) відносять олігосахарини до одного з нетрадиційних класів фітогормонів. Проте, механізми впливу цих речовин на рослинні організми практично не досліджені. Рослинні олігосахарини стимулюють калюсо- та ризогенез (Павлова, 1995), впливають на ріст та розвиток рослин (Mohnen, Hahn, 1993), взаємодіють з іншими фітогормонами (York et al., 1984; 1993; Augur et al., 1992; 1995; та інші) і здатні індукувати процеси регенерації у рослин (Eberhard et al., 1989; Павлова, 1995; та інші).

У рослинах олігосахарини виконують роль молекул-посередників у процесах міжклітинних комунікацій, стимулюють ріст та розвиток (Albersheim et al., 1983; 1992; Павлова, 1995; та інші), захисну реакцію рослин, тобто виявляють елісіторну дію, включаючи накопичення фітоалексинів (Yamaguchi et al., 2000; та інші) та інгібіторів протеїназ (Thain et al., 1990; та інші), індукцію глюканаз та хітиназ, відкладення лігнінів (Barber et al., 1989), підвищення рН живильного середовища (Felix et al., 1993; та інші) і біосинтезу етилену, крім того, вони сприяють утворенню Н2О2, а також викликають некрози та реакцію гіперчутливості (Slovacova et al., 1994; та інші).

Олігосахарини класифікують на декілька груп, залежно від джерела походження: ?-глюканові, пектинові, ксилоглюканові, хітозани, ліпополісахариди, глікопротеїни, олігосахарини з жіночого молока та штучно синтезовані. Молоко ссавців містить у своєму складі кілька десятків олігосахаринів. Деякі з них відносяться до антигенів системи крові Lewis (Химия биологически активных природных соединений, 1976). На поверхні рослинних клітин у багатьох видів рослин знайдено N-глікани, до складу яких входить Lewis-а антиген (він міститься в жіночому молоці), що може бути пов'язано з міжклітинною взаємодією (Fitchette-Laine et al., 1997; Wilson et al., 2001). Це дає змогу припустити, що інші олігосахарини з жіночого молока також будуть мати біологічну активність у рослинних організмах.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Фукозовмісні олігосахарини з жіночого молока отримано в Інституті елемент-органічних сполук РАН.

Формули фукозовмісних сполук:

FG – фукозилгалактоза б-Fuc-(1>2)-в-Gal;

FGN – N-ацетилфукозилглюкозамін б-Fuc-(1>6)-в-GlcNAc;

DFL – дифукозиллактоза б-Fuc-(1>2)-в-Gal-(1>4)-в-Glc-(3>1)-б-Fuc;

FGGn-ol – фукогалактозилгалакто-N-ол б-Fuc-(1>2)-в-Gal-(1>3)-GalNAc-ol;

LNFP 1 – лакто-N-фукопентаоза 1

б-Fuc-(1>2)-в-Gal-(1>3)-в-GlcNAc-(1>3)-в-Gal-(1>4)Glc;

LNFP 2 – лакто-N-фукопентаоза-2 – Lewis-а пентасахарид

в-Gal-(1>3)[б-Fuc-(1>4)]в-GlcNAc-(1>3)-в-Gal-(1>4)Glc;

LNFP 3 – лакто-N-фукопентаоза-3 – Lewis-х пентасахарид

в-Gal-(1>3)-в-GlcNAc-(1>3)[б-Fuc-(1>3)]в-Gal-(1>4)Glc ;

LNDFH 1 – лакто-N-дифукозилгексаоза 1 – Lewis-b гексасахарид

б-Fuc(1>2)Gal-в(1>3)[Fuc-б(1>4)]GlcNAc-в(1>3)-Gal-в(1>4)Glc;

DFLNH(b) – дифукозиллакто-N-гексаоза (b)

в-Gal-(1>4)[б-Fuc-(1>3)]в-GlcNAc-(1>6)[Glc(4>1)]в-Gal-(3>1)[б-Fuc-(1>4)]в-GlcNAc-(3>1)-в-Gal;

TFLNH – трифукозиллакто-N-гексаоза

в-Gal-(1>4)[б-Fuc-(1>3)]в-GlcNAc-(1>6)[Glc(4>1)]в-Gal-(3>1)[б-Fuc-(1>4)]в-GlcNAc-(3>1)[б-Fuc-(1>4)]в-Gal;

LNT – лакто-N-тетраоза

в-Gal-(1>3)-в-GlcNAc-(1>3)-в-Gal-(1>4)-Glc.

Єдиний відновлений олігосахарин FGGn-ol, виділений із крові свиней, використовувався нами для вивчення розбіжності у біологічній активності відновлених та невідновлених олігосахаринів. LNT, яка не містить фукозильного залишку, досліджувалася для з'ясування залежності біологічної активності від наявності фукози. Схему дослідження зображено на рисунку . Як об'єкти дослідження використовували проростки, експланти мікропагонів, гіпокотилів та сім'ядолей томата (Lycopersicon esculentum Mill., с. Новичок), проростки озимої пшениці (Triticum aestivum L., с. Херсонська 86), сім'ядолі та сегменти гіпокотилів (Cucumis sativus L., с. Парад), ендосперм ячменю (Hordeum sativum Lessen., с. Южний), сім'ядолі сої (Glycine max (L.) Merr., Юг 30).

Стерилізацію рослинного матеріалу проводили за загальноприйнятими у біотехнології методами (Бутенко, 1962; Калинин и др., 1980; Митрофанова и др., 1997; та інші). Для визначення біологічної активності фукозовмісних олігосахаринів, їх додавали у живильні середовища для вирощування експлантів та проростків L. esculentum в умовах in vitro. Передобробку насіння L. esculentum та T. aestivum розчинами олігосахаринів здійснювали способом замочування протягом 4 годин. Біотести на спільну дію з фітогормонами, активність -амілази і біосинтез фітоалексинів проводили за методиками Павлової (1995) та Йорка (1982). У більшості дослідів використовувалися такі концентрації олігосахаринів: 10-15, 10-13, 10-11, 10-9, 10-7, 10-5, а в деяких випадках 10-6 моль/л. Усі дослідження проводили в асептичних умовах. Живильні середовища Мурасіге і Скуга (1962), Кнопа (1865), розчини олігосахаринів стерилізували у автоклаві, далі змішували їх в умовах ламінарного боксу. Математична обробка одержаних результатів включала обчислення середньої арифметичної величини, середньоквадратичного відхилення, коефіцієнта варіації, похибки середньої арифметичної. Достовірність середніх величин і різниці між дослідними та контрольними варіантами оцінювалась за критерієм Стьюдента (Доспехов, 1979).

Об'єкти б

ВПЛИВ ФУКОЗОВМІСНИХ ОЛІГОСАХАРИНІВ НА ЕКСПЛАНТИ ПРОРОСТКІВ L. esculentum in vitro

Ріст та розвиток мікропагонів на середовищі з олігосахаринами in vitro. При додаванні фукозовмісних олігосахаринів у живильне середовище для культивування мікропагонів L. esculentum виявлено, що стимулюючу дію мають лише окремі речовини. При цьому, як показано у таблиці 1, відновлений олігосахарин FGGn-ol з оптимальною концентрацією 10-11 моль/л активізував ріст мікропагонів та процеси ризогенезу, що приводило до збільшення маси регенерантів. Подібною, але менш вираженою дією характеризувалися LNFP 1 і TFLNH. Крім того, деякі вивчені олігосахарини (LNFP 2, LNFP 3, DFLNH (b)) позитивно впливали на ріст кореневої системи. Олігосахарини зі ступенем полімеризації від 5 до 9 більш активні, ніж ди- та тетрасахариди.

Таблиця 1

Ріст і розвиток мікропагонів L. esculentum під дією FGGn-ol

С, моль/л | 0 (Контроль) | 10-15 | 10-13 | 10-11 | 10-9 | 10-7

Показ-ники

М, мг | 318,5±34,0 | 461,0±33,0** | 398,7±39,1 | 534,8±42,0*** | 429,0±31,7* | 493,5±48,3**

ВП, мм | 84,7±3,5 | 97,3±3,6* | 92,1±4,5 | 106,6±4,8*** | 98,8±6,0* | 100,3±5,1*

ДК, мм | 71,9±7,0 | 78,0±6,4 | 62,0±7,9 | 69,0±6,9 | 68,5±6,0 | 63,8±9,2

КК, шт. | 4,34±0,46 | 3,53±0,42 | 4,65±0,59 | 6,65±0,66** | 4,00±0,51 | 4,36±0,54

Тут і далі: примітка: різниця між контрольним і дослідним варіантами достовірна при Р*=0,95; P**=0,99; Р***=0,999.

М – маса рослини; ВП – висота пагону; ДК – довжина кореня; КК – кількість коренів

Дія олігосахаринів на калюс, індукований із гіпокотиля та сім'ядолі проростків L. esculentum. Фукозовмісні олігосахарини впливали на розвиток експлантів сім'ядолей та гіпокотилів томата на живильному середовищі для калюсогенезу. Вони зменшували наростання калюсу. Винятком виявився відновлений олігосахарин FGGn-ol, який стимулював ріст калюсу (49-110 % вище контролю) (рис. 2). LNFP 3 і DFLNH (b) не впливали на масу калюсу.

У той же час деякі олігосахарини (FG, FGN, FGGn-ol, FGGn-ol, LNFP 2, LNFP 3, DFLNHі LNT) стимулювали процеси утворення меристематичних зон, регенераційну здатність та ризогенез у експлантів томата. При цьому кількість калюсних конгломератів, які проліферували пагони та утворили корені, збільшувалась на 30-50%.

Рис. 2. Інтенсивність наростання калюсу, індукованого з гіпокотиля та сім'ядолі L. esculentum, під дією FGGn-ol

ВПЛИВ ФУКОЗОВМІСНИХ ОЛІГОСАХАРИНІВ НА РОЗВИТОК ПРОРОСТКІВ in vitro

Культивування проростків L. esculentum на живильному середовищі з додаванням олігосахаринів. Фукозовмісні олігосахарини стимулювали розвиток проростків томата in vitro у діапазоні концентрацій від 10-13 до 10-7 моль/л. При цьому активнішими за інші виявилися олігосахарини FG, FGN, FGGn-ol і DFLNH (b) (табл. 2). При дії деяких з них (FG, FGN, FGGn-ol, DFL, LNFP 2 і LNFP 3) на 10-45% збільшувалися кількість та довжина коренів. З підвищенням ступеня полімеризації олігосахаринів, їхній вплив на ріст коренів зменшувався. Масу проростка та кількість коренів активніше за інших стимулював олігосахарин DFLNH(b).

Таблиця 2

Ріст та розвиток коренів у проростків L. esculentum на живильному середовищі, яке містить різні олігосахарини

С, моль/л | 0 (Контроль) | 10-15 | 10-1-3 | 10-11 | 10-9 | 10-7

ОС | Показ-ники

FG | ДК, мм | 52,1±1,2 | 57,3±1,8* | 56,4±2,4 | 58,1±2,5* | 55,7±1,3* | 59,5±2,3*

КК, шт. | 5,11±0,30 | 5,82±0,31 | 6,14±0,38* | 7,48±0,34*** | 5,64±0,49 | 5,68±0,38

FGN | ДК, мм | 55,5±2,5 | 73,6±4,6*** | 66,7±4,1* | 67,5±4,9* | 81,9±5,3*** | 79,3±6,3***

КК, шт. | 5,72±0,56 | 8,01±0,61* | 7,89±0,56* | 7,96±0,65* | 9,12±0,65*** | 9,04±0,56**

FGGn-ol | ДК, мм | 55,5±2,5 | 75,0±4,8*** | 74,3±5,1*** | 70,1±6,0* | 61,6±4,1 | 73,2±4,3***

КК, шт. | 5,72±0,56 | 7,88±0,46* | 6,74±0,47 | 7,43±0,61 | 6,94±0,65 | 9,32±0,65***

DFLNH(b) | ДК, мм | 52,5±2,1 | 52,5±1,5 | 50,8±3,0 | 53,3±1,9 | 58,2±2,1 | 57,1±3,9

КК, шт. | 4,53±0,24 | 6,42±0,26*** | 6,81±0,55*** | 6,91±0,29*** | 6,10±0,25*** | 5,55±0,31*

ДК – довжина кореня; КК – кількість коренів

Вивчення впливу передобробки насіння розчинами олігосахаринів на розвиток проростків L. esculentum. Вперше показано, що при замочуванні насіння, олігосахарини навіть у дуже низьких концентраціях (до 10-15 моль/л), прискорюють ріст проростків і впливають на їхній розвиток. При цьому спостерігалося значне підвищення схожості насіння (20-35 %) у порівнянні з контролем. Маса проростків L. esculentum збільшувалася при використанні FG, FGN, LNFP 2, LNDFH 1, DFLNH (b), TFLNH і LNT у концентрації 10-13 моль/л. Ці речовини підсилювали ріст пагонів при 10-13 і 10-7 моль/л, а довжину кореня збільшували FG, FGN, FGGn-ol, LNFP 1, LNFP 3, LNDFH 1 і TFLNH при 10-7 моль/л. Активніше за інших при передобробці проростків томата діяли дисахариди FG і FGN (табл. 3). Показано, що олігосахарини із середнім ступенем полімеризації 3-5, практично не впливали на ріст та розвиток проростків, тоді як олігосахарини, які містять 7-9 моносахаридних залишків, стимулювали ріст проростків, але не так активно, як дисахариди. Єдиним олігосахарином, що негативно впливав на проростки томата виявився LNT, який не містить фукозильного залишку.

Таблиця 3

Результати передобробки насіння L. esculentum розчинами FG та FGN

С, моль/л | 0 (Контроль) | 10-15 | 10-13 | 10-11 | 10-9 | 10-7 | 10-5

ОС | Показ-ники

FG | М, мг | 210,1±10,1 | 230,6±7,8 | 236,9±6,0* | 213,7±7,6 | 241,4±8,0* | 224,8±10,7 | 239,5±8,9*

ВП, мм | 52,7±1,7 | 61,6±1,7*** | 58,0±1,5* | 55,3±1,3 | 59,7±1,5*** | 61,1±1,7*** | 62,3±2,0***

ДК, мм | 43,5±1,2 | 59,4±1,9*** | 59,9±2,1*** | 59,5±1,8*** | 60,1±2,2*** | 61,6±1,9*** | 64,8±1,8***

FGN | М, мг | 187,6±5,8 | 206,1±11,3 | 212,5±8,6* | 222,3±10,1** | 206,7±7,0* | 232,8±12,8*** | 201,3±8,0

ВП, мм | 45,7±1,1 | 50,9±1,4** | 50,3±1,2** | 53,7±1,3*** | 49,2±1,1* | 54,7±1,4*** | 51,0±1,2**

ДК, мм | 41,1±0,9 | 41,6±1,4 | 41,5±1,1 | 44,1±1,8 | 42,3±1,5 | 48,9±1,4*** | 42,8±1,2

М – маса 5 рослин; ВП – висота пагону; ДК – довжина кореня.

Розвиток проростків T. aestivum після передобробки насіння розчинами олігосахаринів. Озима пшениця у порівнянні з томатами сильніше реагує на передобробку розчинами олігосахаринів. Схожість насіння пшениці олігосахарини підвищували на 32-35Замочування насіння озимої пшениці в розчинах олігосахаринів збільшує швидкість проростання приблизно на одну добу. Таким чином, досліджені фукозовмісні олігосахарини після передобробки насіння при всіх концентраціях стимулювали ріст проростків пшениці, підвищуючи висоту пагону, довжину кореня та масу рослини, за винятком олігосахарину LNT, у складі якого відсутній фукозильний залишок.

Зміна стійкості проростків L. esculentum під впливом олігосахаринів до стресу, викликаного йонами Купруму. Нами вперше виявлено здатність різних олігосахаринів збільшувати стійкість рослинних організмів до стресів, що викликані йонами важких металів. Про наявність стресу можна судити з того, що всі біометричні показники в контролі значно більші, ніж у варіанті зі стресором. Особливо сильно стрес позначався на коренях, які буріли та відмирали. Висоту пагону і довжину кореня у проростків томата підвищували усі олігосахарини, крім DFL та LNТ. У присутності олігосахаринів зменшувалися зони некрозів кореня. Масу проростків збільшували олігосахарини FGN, FGGn-ol, LNFP , LNDFH 1, DFLNH (b) і TFLNH. Кращі результати отримано в дослідах з FGGn-ol, LNFP 1, LNDFH 1 і TFLNH (табл. 4). Антистресову активність фукозовмісних олігосахаринів відмічено у діапазоні концентрацій від 10-13 до 10-9 моль/л. У деяких випадках під дією олігосахаринів маса проростка та висота рослини перевищували контроль, у якому був відсутній стресовий фактор.

Таблиця 4

Вплив олігосахаринів на стійкість проростків L. esculentum до стресу, викликаного йонами Купруму

ОС | Варіант | Контроль | CuSO4 (400мг/л) | CuSO4 (400мг/л)+

ОС 10-13 М | CuSO4 (400мг/л)+

ОС 10-11 М | CuSO4 (400мг/л)+

ОС 10-9 М | CuSO4 (400мг/л)+

ОС 10-7М

Показ-ники

FGGn-ol | ВП, мм | 48,3±1,6 | 30,3±1,0*** | 35,1±1,5 | 38,7±1,1* | 40,6±1,6* | 37,0±1,9

ДК, мм | 47,3±3,0 | 31,6±2,4*** | 29,9±2,0 | 37,3±1,9 | 40,1±1,8** | 36,5±2,4

М, мг | 187,6±11,4 | 148,8±8,6** | 158,1±9,9 | 167,4±8,7 | 193,8±9,2* | 197,3±8,9*

LNFP 1 | ВП, мм | 49,1±2,8 | 26,8±1,9*** | 33,4±2,0 | 36,2±1,7** | 43,5±1,7*** | 30,7±1,6

ДК, мм | 49,3±2,7 | 36,1±1,7*** | 38,1±2,0 | 43,6±1,8* | 46,0±2,1** | 38,7±2,1

М, мг | 188,7±12,6 | 150,3±10,2* | 178,5±9,3 | 173,2±13,0 | 180,1±12,4 | 176,7±7,9

LNDFH 1 | ВП, мм | 43,6±1,9 | 26,0±1,3*** | 34,2±2,5 | 37,7±1,8* | 39,9±1,2** | 37,3±1,9*

ДК, мм | 54,1±3,2 | 27,8±2,0*** | 39,1±2,4** | 37,3±1,7* | 35,1±2,6 | 41,5±2,4***

М, мг | 210,6±11,5 | 157,6±13,4* | 199,5±15,8 | 237,0±8,2* | 223,9±18,6 | 241,9±10,5*

TFLNH | ВП, мм | 49,7±2,8 | 28,3±1,5*** | 34,3±2,4 | 35,0±2,6 | 40,5±2,2*** | 37,3±1,8

ДК, мм | 50,6±2,3 | 30,0±1,7*** | 38,2±1,9* | 35,1±1,2 | 35,3±1,6 | 38,7±1,5*

М, мг | 198,4±8,9 | 166,3±6,9* | 196,3±13,8 | 211,8±7,0** | 207,3±6,6** | 223,0±14,4**

М – маса 5 рослин; ВП – висота пагону; ДК – довжина кореня.

Зміна стійкості проростків L. esculentum під впливом олігосахаринів в умовах сольового стресу. Фукозовмісні олігосахарини збільшують стійкість проростків томата до засолення. Про наявність стресу при такій концентрації натрій хлориду свідчить достовірна різниця між значеннями біометричних показників контролю та варіанта зі стресором. Всі олігосахарини, які мають ступінь полімеризації менше 5, практично не впливали на стійкість проростків томата в умовах сольового стресу, за винятком FG, яка пригнічувала ріст. У дослідах із олігосахаринами з більшим ступенем полімеризації стійкість проростків L. esculentum до засолення підвищувалася, особливо в діапазоні концентрацій від 10-11 до 10-7 моль/л. При збільшенні ступеня полімеризації в цих межах зростає вплив на ріст пагону в умовах сольового стресу.

Стійкість томатів до фітофторозу під впливом олігосахаринів. Наші дослідження довели, що олігосахарини тваринного походження стимулюють імунітет рослин. Це виражалось у збільшенні кількості зовні здорових проростків порівняно з контролем. Так, у варіантах із концентрацією олігосахаринів 10-9 моль/л спостерігалось значне збільшення стійкості проростків томата до Phytophtora infestans. Зовні здорові рослини, а також зі слабким ураженням спостерігали внаслідок обробки насіння LNFP 2, LNT та LNDFH 1. З підвищенням концентрації до 10-5 моль/л зросла кількість олігосахаринів, обробка якими викликала зменшення ураження проростків. Можна сказати, що збільшення концентрації підсилювало дію лише двох олігосахаринів: FGN та LNFP 3. Для FG та FGGn-ol, навпаки, більш ефективною була концентрація 10-9 моль/л. Для олігосахаринів з низьким ступенем полімеризації, які містять у своєму складі термінальну групу б-Fuc(1>2)-в-Gal, оптимальною виявилась концентрація 10-9 моль/л. Для тих олігосахаринів, у яких фукоза з'єднана з глюкозою або N-ацетилглюкозаміном, оптимальною була концентрація 10-5 моль/л. Аналогічні результати отримано для олігосахаринів рослинного та грибного походження (Павлова, 1995).

ВИВЧЕННЯ ОЛІГОСАХАРИНІВ У БІОТЕСТАХ

Біотести на вивчення спільної дії олігосахаринів з ауксином і цитокініном. Фукозовмісні олігосахарини діють подібно пектиновим фрагментам і відновленому ксилоглюкановому октасахариду (Vargas-Rechia, 1998; та інші). Як показано на рисунку 3, спостерігався синергізм їхнього впливу з ауксинами на ріст гіпокотилів C. sativus. Відбувалося значне збільшення маси гіпокотилів з оптимальною концентрацією 10-9 моль/л для всіх досліджуваних речовин. Деякі олігосахарини (FGN, LNFP 1, LNFP 3 і LNT) викликали перевищення контролю більш ніж на 100 %, а для LNFP 2 і DFLNH (b) максимум припадав на концентрацію 10-7 моль/л.

Досліджувані нами фукозовмісні олігосахарини, так само, як і ксилоглюканові, не впливали на ростові процеси, індуковані цитокініном. При додаванні їх до розчину кінетину, маса сім'ядолей C. sativus суттєво не змінювалась.

Біотест на вплив олігосахаринів на амілолітичну активність алейронового шару ендосперму H. sativum. Нами показано, що фукозовмісні олігосахарини впливають на амілолітичну активність в інкубаційному середовищі ендоспермів H. sativum. Активність ?-амілази при обробці олігосахаринами була менша, ніж при дії гібереліну, але в 2-6 разів більша ніж при обробці водою. Максимальне зростання амілолітичної активності ендосперму H.sativum спостерігалося при концентрації 10-6 моль/л. При зменшенні вмісту олігосахаринів активність ?-амілази знижувалася.

Рис. 3. Збільшення маси гіпокотилів C. sativus при спільній дії олігосахаринів (10-9 моль/л) з ІОК

Як показано на рисунку 4, сильніше за інших амілолітичну активність стимулювали FG, FGN, FGGn-ol, LNT, LNFP 1 та LNFP 2 (380-435 %). Усі олігосахарини з високим ступенем полімеризації (більше 5) практично не впливали на амілолітичну активність.

Рис. 4. Вплив олігосахаринів (10-6 моль/л) на амілолітичну активність алейронового шару ендосперму H. sativum

Стимуляція біосинтезу фітоалексинів фукозовмісними олігосахаринами. Нами встановлено, що олігосахарини мають елісіторні властивості. Це підтверджується тим, що вони стимулюють біосинтез фітоалексинів у сім'ядолях G. max (рис. 5). У цих дослідах оптимальною була концентрація 10-5 моль/л, проте олігосахарини LNFP 2, LNDFH 1 DFLNHі TFLNH виявили кращі результати при концентрації 10-6 моль/л. Тобто, усі фукозовмісні олігосахарини, які мають у своєму складі дисахаридний фрагмент б-Fuc(1>4)-в-GalNAc, діють при концентраціях на порядок нижче, ніж олігосахарини рослинного і грибного походження (Hahn et al., 1981; 1992; Павлова, 1995).

Рис. 5. Стимуляція біосинтезу фітоалексинів олігосахаринами (10-5 моль/л)

Аналіз та Узагальнення результатів

Проведені дослідження показали, що фукозовмісні олігосахарини чинять на рослинні організми рістрегулюючий й елісіторний вплив (табл. 5). З представлених експериментальних даних можна побачити, що вони мають широкий спектр фізіологічної активності: підвищують активність ауксинів і ?-амілази; стимулюють ріст та розвиток проростків L. esculentum і T. aestivum при додаванні їх в живильне середовище та при передобробці насіння; мають антистресову активність при засоленні й підвищеному вмісті йонів Купруму (вперше показано нами); виконують роль елісіторів, стимулюючи стійкість проростків L. esculentum до фітофторозу та біосинтез фітоалексинів у сім'ядолях G. max. При цьому вони не впливають на активність кінетину, та всі олігосахарини, крім FGGn-ol, не підсилюють процес калюсоутворення.

Антистресова активність олігосахаринів, можливо, викликана тим, що підвищення концентрації йонів важких металів призводить до активації ферментів, які руйнують клітинні стінки у рослин (Moustacas et al., 1991). При цьому утворюються олігосахарини, ймовірно, вони є одним із видів сигнальних молекул, які запускають загальний механізм стресової відповіді у рослин. Надлишок йонів важких металів призводить до утворення фітоалексинів (Бейли, 1985). Як показано в наших дослідженнях, олігосахарини здатні підсилювати синтез фітоалексинів, що також може бути одним з механізмів підвищення стійкості рослин до стресу, викликаного йонами Сu2+. Так як йони важких металів пригнічують ріст розтягуванням, позитивну дію фукозовмісних олігосахаринів в умовах стресу, викликаного йонами Купруму, можна пояснити підсиленням ними дії ауксину саме в цьому процесі.

Підвищена концентрація солей викликає зміну в стані протоплазми рослинних клітин, результатом чого є плазмоліз, що призводить до роз'єднання клітин, порушує між ними фізіологічний взаємозв'язок і узгодження у процесах водообміну та метаболізму (Барабой, Сутковой, 1997). Олігосахарини як молекули-медіатори можуть відтворювати хоча б частково порушений взаємозв'язок між клітинами, викликаний сольовим стресом.

Точний збіг оптимальних концентрацій олігосахаринів тваринного походження із ксилоглюкановими, при протилежному ефекті в спільній дії з ауксинами може значно полегшити з'ясування механізму дії олігосахаринів у рослинних організмах, вивчення впливу кількісного та якісного складу олігосахаринів на їхню активність. Найімовірніше моносахаридом, який обумовлює збільшення або зменшення активності ауксинів, є ксилоза. Активні ксилоглюканові олігосахарини містять ті ж самі моносахаридні залишки, що й досліджувані нами (крім ксилози) та мають ефект протилежний олігосахаринам тваринного походження.

Таблиця 5

Біологічна активність фукозовмісних олігосахаринів

Олігосахарини | FG | FGN | DFL | FGGn-ol | LNFP 1 | LNFP 2 | LNFP 3 | LNDFH 1 | DFLNH (b) | TFLNH | LNT

Процеси, у яких досліджувалися олігосахарини

Розвиток мікропагонів | 0 | 0 | 0 | + | + | 0 | 0 | 0 | 0 | + | 0

Калюсоутворення із сім'ядолей | 0—— | + | 0 | 0 | 0— | 0— | 0

Калюсоутворення з гіпокотилів—— | 0 | +—— | 0 | 0 | 0——

Розвиток проростків томата 1 | + | + | + | + | 0 | +— | 0 | + | + | 0

Розвиток проростків томата 2 | + | + | 0 | 0 | + | + | + | + | + | +—

Розвиток проростків озимої пшениці | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | 0

Стійкість проростків до CuSO4 | + | + | 0 | + | + | + | 0 | + | + | + | +

Стійкість проростків до засолення— | 0 | 0 | + | + | + | + | + | + | + | +

Стійкість проростків до фітофторозу— | + | 0 | + | + | + | + | + | 0 | + | +

Взаємодія з ІОК | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | +

Взаємодія з кінетином | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0

Стимуляція ?-амілази | + | + | + | + | + | + | 0 | 0 | 0 | + | +

Стимуляція біосинтезу фітоалексинів | 0 | + | 0 | + | 0 | + | 0 | + | 0 | + | +

+ - достовірний позитивний вплив; — - достовірний негативний вплив; 0 – відсутність достовірного впливу.

1 – олігосахарини додавали в живильне середовище; 2 – проводили передобробку розчинами олігосахаринів.

Імовірно, що стимулюючий вплив олігосахаринів на амілолітичну активність пов'язаний з їхньою дією на активність ферментів, що беруть участь у деградації полімерів клітинної стінки, тим більше, що є підтвердження активації ксилоглюкановими олігосахаринами ?-1,4-глюканази (Maclachlan et al, 1992) та целюлази (McDougall and Fry, 1990).

Можливо для впливу на активність ?-амілази необхідна наявність фрагменту б-Fuc(1>2)-в-Gal. Такий фрагмент є в ксилоглюканових нона- та пентасахаридах і у багатьох досліджуваних нами речовинах. Проте LNDFH 1 також має цей фрагмент, хоча її вплив на активність ?-амілази приблизно в два рази нижчий, ніж, наприклад, LNT, яка не містить фукози. Можна припустити, що в молекулах олігосахаринів може бути не один, а декілька моносахаридних фрагментів, що впливають на амілолітичну активність. Ці фрагменти можуть також мати різний механізм впливу.

висновки

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ за ТЕМою ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

Волкова Л. Л. "Рістрегулюючий та елісіторний вплив фукозовмісних олігосахаринів на рослинні об’єкти в умовах in vitro". – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Нікітський ботанічний сад-Національний науковий центр УААН, Ялта, 2002.

Дисертаційну роботу присвячено вивченню впливу фукозовмісних олігосахаринів, отриманих з жіночого молока, на рослинні об’єкти в умовах in vitro. Встановлено, що вони стимулювали