НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ВІНАРСЬКА НАТАЛІЯ ВІКТОРІВНА

УДК 579.841.11.22

ЗАЛЕЖНІСТЬ БІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ

ЛІПОПОЛІСАХАРИДІВ RALSTONIA SOLANACEARUM (Smith, 1896) ВІД

ЇХ СКЛАДУ ТА СТРУКТУРНИХ ОСОБЛИВОСТЕЙ

03.00.07 –мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів

доктор медичних наук, Шапіро Анатолій Вініамінович, Київський НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МОЗ України, провідний науковий співробітник

Провідна установа: Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова

Захист відбудеться “19” червня 2002 р. о 1000 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д .233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано "17" травня 2002 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

Актуальність проблеми. Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum, Smith 1896) – фітопатогенний мікроорганізм, що викликає бактеріальний вілт широкого кола рослин (більше 55 родин), серед яких ряд економічно важливих сільськогосподарських культур: пасльонові, бобові, складноцвіті, тощо. Цей мікроорганізм є гетерогенним за біологічними властивостями, в систематиці якого багато невирішених проблем. Довгий час представників R. відносили до роду Pseudomonas. Однак з 1992 р. японські дослідники (Yabuuchi et al.) двічі перекласифікували його: спочатку перенесли до роду Burkholderia, а пізніше (в 1995 р.) – до нового роду Ralstonia. Але, разом з тим, було зазначено що гетерогенність штамів R. потребує подальших досліджень для з'ясування таксономічного положення представників цього виду.

Визнаним хемотаксономічним критерієм, що використовуються в систематиці грамнегативних бактерій, є склад і будова ліпополісахаридів (ЛПС) – структурних компонентів зовнішньої мембрани клітинної оболонки грамнегативних бактерій, що включають три високоспецифічні складові ділянки з різною біологічною активністю: О-специфічний полісахаридний ланцюг (О-ПС), олігосахарид кору (ОГ-кор) та ліпід А. Великий інтерес, який продовжує привертати увагу дослідників, це надзвичайно широкий спектр біологічної дії ЛПС, що обумовлюється їх структурними особливостями. Відомо, що тонкі варіації в структурі О- ланцюгів ЛПС визначають серологічну специфічність грамнегативних бактерій та використовуються як молекулярна основа серологічних класифікаційних схем. На відміну від багатьох грамнегативних бактерій (Klebsiella, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, тощо) для R. solanacearum досі відсутня внутрішньовидова класифікаційна схема, що заснована на О-антигенності їх ЛПС. Ліпід А є ендотоксичним центром молекули ЛПС, який відповідає за більшість фізіологічних і патофізіологічних реакцій: летальну токсичність, пірогенність, ендотоксинову толерантність, лейкопенію, ад'ювантність, мітогенну стимуляцію, активацію комплементу, індукцію неспецифічної резистентності до інфекцій, захист організму від радіації, тощо. Крім того, особливості складу жирних кислот ліпіду А, зокрема 3-оксикислот, можуть бути використані як додатковий хемотаксономічний критерій в систематиці мікроорганізмів.

Висока імуномодулююча активність ЛПС дозволяє використовувати їх при створенні нових лікарських засобів. Однак, складність впровадження до терапевтичної практики ЛПС в значній мірі обумовлена їх високою токсичністю та пірогенністю, а також недостатністю або непостійністю їх стимулюючого ефекту. Цей факт спонукає дослідників, поряд з постійним пошуком нових, менш токсичних глікополімерів, розробляти підходи до отримання модифікованих ЛПС, що втрачали би токсичну дію, але зберігали імуномодулюючі властивості.

З огляду на це, отримані дані про зв'язок між біологічною (антигенною, пірогенною і токсичною) активністю ЛПС R. solanacearum та особливостями їх складу та структури можуть бути використані для уточнення таксономічного статусу представників цього виду, а також при подальших розробках його внутрішньовидової класифікаційної схеми та серодіагностиці. Виявлення ЛПС, які не володіють токсичною та пірогенною дією, може бути використано при створенні нових терапевтичних препаратів з імуномодулюючими властивостями.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота включає дослідження, виконані згідно науково-дослідних робіт інституту за темами: “Вивчення залежності біологічної активності глікополімерів мікробної клітини від їх фізико-хімічних та структурних особливостей. Розробка нових стратегій використання глікополімерів” (1998 – 2002 рр., № держ. реєстр. 0198V008078, шифр теми за планом інституту 07.20); “Дослідження антигенних та ендотоксичних властивостей бактеріальних глікополімерів” (2002 – 2007 рр., програма “Молекулярні основи функціонування геному”, № теми за планом інституту 07.71); “Вплив фізичних та хімічних факторів на структурні особливості і біологічну активність ліпополісахаридів (ендотоксинів)” (2001 – 2002 рр., № проекту Держ. фонду фунд. Досліджень 05.07/00012).

Мета і задачі дослідження. Виділити, хімічно охарактеризувати ЛПС Ralstonia solanacearum, встановити залежність між їх біологічною (антигенною, пірогенною, токсичною) активністю та особливостями складу й структури.

Відповідно до поставленої мети було сформульовано такі задачі:

1. Одержати ЛПС із 8 штамів R. solanacearum, які характеризуються різним типом структури О-ПС.

2. Вивчити хімічний склад ЛПС.

3. Вивчити антигенну активність ЛПС R. solanacearum в гомологічних та гетерологічних системах.

4. Дослідити пірогенну та токсичну дію ЛПС.

5. Встановити внесок окремих структурних компонентів молекули ЛПС на прояв біологічних властивостей:

а) отримати модифіковані ЛПС при застосуванні фізичних (УФ-опромінення) та хімічних (О-деацилювання, N-,О-деацилювання і дефосфорилювання) методів;

б) провести порівняльне вивчення серологічної, пірогенної та токсичної активності нативного та модифікованих ЛПС.

Об'єктом дослідження були ліпополісахариди представників фітопатогенного виду R. – гетерогенного за біологічними властивостями мікроорганізму, в систематиці якого на сьогодні багато невирішених проблем.

Предметом дослідження були склад та деякі аспекти біологічної (антигенної, пірогенної та токсичної) активності ЛПС різних штамів R. solanacearum, які характеризувались тонкими варіаціями в структурі їх О-ПС.

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували мікробіологічні, біохімічні та імунологічні методи, а також методи біологічного контролю визначення пірогенності та токсичності ЛПС.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше було показано, що за складом жирних кислот ліпідів А штами R. solanacearum були розподілені на дві групи. Для першої групи характерною була наявність жирних оксикислот з ланцюгом від 12 до 18 атомів вуглецю (ІСМР 5712, 7945, 7955 і 8110). Друга група штамів містила жирні оксикислоти з меншим числом вуглецевих атомів від С10 до С14 (ІСМР 767, 7944, 8089 і 4157).

Вперше на основі О-антигенності ЛПС, досліджувані штами R. solanacearum були розділені на п'ять серогруп.

Вперше для виду R. solanacearum встановлено, що ЛПС досліджуваних штамів мають типовий для ЛПС S-форми бімодальний електрофоретичний розподіл і включають два основних типи молекул (високомолекулярний S-ЛПС і низькомолекулярний R-ЛПС). ЛПС представників однієї серогрупи характеризуються подібним електрофоретичним розподілом і відрізняються за цим показником від ЛПС представників інших серогруп.

Вперше для ЛПС представників R. solanacearum як в гомологічних, так і в гетерологічних системах виявлено серологічно активні зони, які містяться в S-, SR- та R-ЛПС.

Вперше було показано, що ЛПС досліджуваних штамів характеризуються різним ступенем прояву пірогенності та токсичності.

Вперше встановлено, що модифікація ЛПС R. solanacearum внаслідок О-, N-, O-деацилювання та дефосфорилювання призводить до втрати пірогенної та токсичної активності.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи мають особливу цінність для таксономії бактерій виду R. solanacearum, а також можуть бути використані при подальших розробках внутришньовидової класифікаційної схеми виду R. solanacearum та серодіагностиці. Виявлення ЛПС, які не проявляють токсичної та пірогенної дії, в майбутньому може бути використано при створенні нових терапевтичних препаратів з імуномодулюючими властивостями.

Особистий внесок здобувача. Основні експериментальні дані були одержані здобувачем особисто: напрацьована бактеріальна маса 8 досліджуваних штамів R., з яких виділені ЛПС, вивчений хімічний склад ЛПС: вміст вуглеводів, нуклеїнових кислот, білку. Проведений аналіз моносахаридного, амінокислотного та жирнокислотного складу виділених препаратів ЛПС.

Отримані поліклональні О-антисироватки до 8 досліджуваних штамів R.. При вивченні антигенної активності проведені серологічні дослідження ЛПС штамів R. solanacearum методами кільцепреципітації, аглютинації, імуноелектрофорезу, подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні, ракетного імуноелектрофорезу, ELISA, ELISA-інгібування, ДСН-ПААГ електрофорезу та імуноблотингу. Проведено вивчення пірогенної та токсичної активності ЛПС.

Одержання модифікованих ліпідів А досліджуваних ЛПС здійснено спільно з к.б.н. Васильєвим В.М. (Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ).

Вплив УФ-опромінення на серологічну активність ЛПС здійснено спільно з к.ф.-м.н. Кислюком В.В. та д.ф.-м.н. Лозовським В.З. (Інститут фізики напівпровідників НАН України, Київ).

Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків проведено спільно з науковим керівником. Друковані роботи підготовлено при безпосередній участі автора спільно з науковим керівником.

Автор висловлює щиру подяку інж. Житкевич Н.В. за допомогу у підтримці мікробіологічно чистої культури досліджуваних штамів, а також к.б.н. Нестеровій Н.В., к.б.н. Діденко Л.Ф., к.б.н. Яковлевій Л.М. та інж. Броварській О.С. (Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ) за надання консультацій при проведенні імунохімічного аналізу досліджуваних препаратів ЛПС.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації доповідались та обговорювались на засіданні ІІ (ІХ) з'їзду Мікробіологічного товариства України (Чернігів, 2000); 6th Conference of the International Endotoxin Society (Paris, 2000); на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2000); на Міжнародній конференції науково-практичної школи для молодих учених і спеціалістів “Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (Ужгород, 2001); the European Materials Research Society (E-MRS 2001) Spring Meeting (Strasbourg, 2001); XVI International Symposium on Glycoconjugates “GLYCO XVI” (Hague, 2001); 11th European Carbohydrate Symposium “Eurocarb-11” (Lisboa, 2001); на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ, присвяченому 135-й річниці з дня народження Д.К. Заболотного (Київ, 2001); в матеріалах спільного засідання відділень молекулярної біології, біохімії, експериментальної та клінічної фізіології і загальної біології НАН України та Вченої ради біологічного факультету КНУ ім. Тараса Шевченка (Київ, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових робіт в провідних вітчизняних та закордонних виданнях: 4 статті у наукових журналах, з яких 3 – у фахових виданнях, 4 – матеріали конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 154 сторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали та методи досліджень”, “Результати досліджень”, “Обговорення”, “Висновки”, “Список використаних джерел”, який містить 219 посилань (з яких 194 іноземних авторів). Робота містить 17 таблиць та 20 рисунків.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури представлений двома підрозділами, які містять сучасні уявлення щодо гетерогенності та таксономічного положення представників фітопатогенного виду R., який уражує понад 600 видів рослин і на сьогодні став актуальною проблемою епіфітотії бактеріального вілту, а також викладена інформація останніх років щодо ліпополісахаридів грамнегативних бактерій, їх структури, функції та біологічної активності.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єктами досліджень були 8 штамів R. solanacearum. Всі культури були люб'язно надані куратором ІСМР доктором Дж. Янгом (Нова Зеландія), за що ми висловлюємо йому щиру подяку. Штами були виділені в різних географічних зонах світу з різних рослин і за своїми властивостями віднесені до різних біоварів (табл.1).

Культивування бактерій проводили на рідкому синтетичному середовищі, що містило глюкозу та хлористий амоній як джерела вуглецю та азоту, відповідно [Vidaver, 1967].

Таблиця 1

Характеристика досліджених штамів R. solanacearum

Штам ІСМР Географічна зона Біовар Рослина-хазяїн

5712 – типовий (NCPPB 325, ATCC 11696) CША 1 томати

767 Трінідад 1 банани

4157 Нова Зеландія НВ* картопля

7944 Перу 1 подорожник

7945 Перу 4 картопля

7955 Кенія 3 баклажани

8089 Філіппіни 2 солодкий перець

8110 Шрі Ланка 4 картопля

НВ* - не визначений

Виділення та очищення ЛПС проводили за водно-фенольним методом Вестфаля та Янна. Деградацію ЛПС здійснювали м'яким кислотним гідролізом в 1% оцтовій кислоті. Ультрацентрифугуванням (25000?g, 40 хв.) відділяли гідрофільні та гідрофобні частини деградованого ЛПС. Окремі вуглеводні компоненти молекули ЛПС одержували за допомогою гель-хроматографії на сефадексі G-50 з використанням 0,025М піридин-ацетатного буфера, рН 4,5. Визначення кількості вуглеводів здійснювали за Dubois (1956), нуклеїнових кислот – за Спіріним (1958), білку – за Lowry (1951). Гептози визначали реакцією з цистеїном та сірчаною кислотою [Davies, 1957], 2-кето-3-дезокси-D-маннооктонову кислоту (КДО) – реакцією з тіобарбітуровою кислотою [Droge, 1970]. Нейтральні моносахариди у вигляді ацетатів поліолів ідентифікували на газовому хроматографі “Chrom-5” (Чехія). Визначення вмісту амінокислот та гексозамінів проводили на аналізаторі амінокислот “Hitachi” (Японія). Жирнокислотний склад ліпідів А у вигляді метилових ефірів жирних кислот аналізували на газовому хроматографі Hewlett Packard 5890 серії ІІ (США) в комбінації з мас-спектрометром 5970В (Hewlett Packard, США) та подальшої обробки результатів з використанням персонального комп'ютера.

Імунохімічні властивості ЛПС вивчали, застосовуючи методи кільцепреципітації, аглютинації, імуноелектрофорезу, подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні, ракетного імуноелектрофорезу, ELISA та ELISA-інгібування, де ЛПС, виділені з клітин досліджуваних штамів, були використані як антигени, а поліклональні О-антисироватки кролів, отримані до грітих культур досліджуваних штамів R. solanacearum, як антитіла.

Електрофорез здійснювали в системі ДСН-ПААГ за Laemmli (1970) із застосуванням 5% концентруючого та 12% розділяючого акріламідних гелів при постійній силі струму 30 mA. Гелі фарбували за допомогою азотнокислого срібла [Tsai, 1982].

Імуноелектроблотінг проводили за методикою Pyle (1985) з переносом ЛПС на нітроцелюлозну мембрану (Schleicher-Schuell, розмір пор 0,45 мкм) при режимі 150 mA протягом 4 год. Субстратом та хромогеном були Н2О2 та 3,3?-діамінобензидин.

Пірогенність вивчали на кролях шляхом внутрішньовенного введення мінімальної пірогенної дози, встановленої в серії розведень ЛПС (0,01-0,005 мкг/мл), з подальшою термометрією тварин протягом 3 год. Кожну серію розчинів ЛПС перевіряли на кролях, близьких за вагою (0,5 кг). ЛПС вважали непірогенним, якщо сума підвищення температур у 3-х кролів була меншою або дорівнювала 1,4°С; якщо ця сума перевищувала 2,2°С – ЛПС вважали пірогенним.

Токсичну дію ЛПС (ЛД50) досліджували на мишах, сенсибілізованих галактозамінгідрохлоридом, при внутрішньовенному введенні серії розведень ЛПС (50-300 мкг/мл). Кожну серію розведень ЛПС випробовували на 10 мишах; контрольній групі мишей (10 мишей) вводили разом з галактозамінгідрохлоридом стерильний розчин 0,9% NaCl.

Модифіковані ЛПС отримували шляхом О-деацилювання (гідроліз в 0,2 N NаОН в 99% етанолі, 18 год., 50?С), N-,O-деацилювання (гідроліз в безводному гідразині, 40 год., 100?С) та дефосфорилювання (гідроліз в 40% розчині HF, 24 год., кімнатна темепература). Дослідження прояву біологічної (токсичної та пірогенної) активності модифікованих ЛПС визначали раніше зазначеними методами.

УФ-опромінення ЛПС проводили при використанні імпульсного азотного лазеру (ЛГИ-101, СССР). Спектральний оптичний відгук реєстрували в межах 350-600 нм при використанні монохроматора з лічильником фотонів, який був обладнаний схемою збігу. Опромінення проводили в режимі кроку сканування 2 нм та часу підрахунку 5 сек при заданому часі рахунку сканування 7-10 хв. Серологічну активність опромінених ЛПС досліджували подвійною імунодифузією в агарі за Оухтерлоні.

Результати дослідів статистично обробляли, використовуючи коефіциент Ст'юдента.

РОЗДІЛ 3. ВИДІЛЕННЯ ЛПС R. solanacearum,

ВИЗНАЧЕННЯ ЇХ КОМПОНЕНТНОГО СКЛАДУ

ЛПС були екстраговані з висушених ацетоном та ефіром клітин 8 штамів R.. Було встановлено, що штами даного виду відрізняються між собою за відносним вмістом ЛПС: незважаючи на те, що екстракція ЛПС здійснювалась за однакових умов, кінцевий вихід ЛПС по відношенню до сухої бактеріальної маси коливався у різних штамів: 2,7-7,8%. Оскільки високий вміст нуклеїнових кислот є характерним для представників виду R., проводили додаткову очистку ЛПС від них шляхом триразового ультрацентрифугування при 144000?g, 4 год., або осадженням насиченим розчином трихлороцтової кислоти. Очищені ЛПС в залежності від штаму містили: 16,5-47,25% вуглеводів, 1,44-3,6% нуклеїнових кислот, 0,25-3,25% білку.

Аналіз моносахаридного складу показав, що домінуючим моносахаридом ЛПС всіх штамів, крім шт. 4157, є рамноза (26,53-92,8%). Для ЛПС шт. 4157 характерним був високий вміст арабінози (84,6%) порівняно з рамнозою (13,3%). Крім того, ЛПС деяких штамів (7945, 5712 та 767) містили ксилозу, яка також вважається характерною для ЛПС представників виду R. (61,36%, 8,72% та 6,81%, відповідно). ЛПС деяких штамів містили менш характерні для представників даного виду вуглеводні залишки: фукозу, арабінозу, рибозу, манозу. З гексозамінів у складі отриманих ЛПС були присутні глюкозамін (1,4-16,8%) та галактозамін (0,66-8,48%). В ЛПС виявлені також гептоза (0,25-2,08%) та КДО (0,03-0,4%).

ЛПС характеризувались незначними кількостями амінокислот. За якісним складом картина їх розподілу була досить різноманітна: представлені майже всі амінокислоти (за винятком лейцину та тирозину), однак найбільш характерними виявились аланін (0,2-6,0%) та гістидин (0,11-0,8%).

Внаслідок деградації ЛПС шт. 5712 одержані ліпід А та вуглеводні компоненти. Профіль елюції вуглеводної частини деградованого ЛПС [О-ПС (фракція І) і ОГ-кор (фракції ІІ і ІІІ)] свідчить, що в дослідженому ЛПС переважною є S-форма ЛПС.

Аналіз жирних кислот показав, що за їх вмістом ЛПС досліджуваних штамів суттєво відрізнялись (табл. 2).

Відомо, що своєрідність жирнокислотного складу ліпіду А – найбільш консервативної частини молекули ЛПС – може бути використано як додатковий критерій при диференціації окремих видів мікроорганізмів з невизначеним систематичним положенням, до яких належить і R. solanacearum. Характерними для типового штаму R. solanacearum були 3-окситетрадеканова (33,53%), тетрадеканова (19,22%), 2-оксигексадеканова (21,55%), 2-оксиоктадеканова (3,12%) та октадеценова (2,66%) жирні кислоти. Більш схожими до типового виявились шт. , 7955 та 8110, в ЛПС яких також були присутні зазначені жирні кислоти. Однак, разом з тим, були виявлені деякі відмінності щодо кількісного та якісного вмісту жирних кислот цих штамів. Так, ЛПС шт. 7945, 7955 і 8110 відрізнялись за вмістом С16:0 (12,56%, 6,09% і 7,29%, відповідно); для ЛПС шт.7945 була характерною наявність ізомерної 2-ОН-С16:0 (2,67%); ЛПС шт. 7945, 7955 і 8110 містили 3-ОН-С15:0 (1,38, 1,35 і 2,66%, відповідно); в ЛПС шт. 7945 і 8110 була наявною ціс-9-С18:0. Крім того, тільки для ЛПС типового штаму була виявлена присутність 2-ОН-С18:1 (8,3%).

Цікаво зазначити той факт, що присутність 3-ОН-С14:0 є характерною для представників Burkholderia cepacia [Солдаткина, 1989] – типового виду роду Burkholderia, до якого нещодавно відносили і R. solanacearum. Ознакою іншого фітопатогенного виду Erwinia carotovora, а також більшості представників роду Enterobacteriaceae [Жеребило, Вишталюк, 1991; Мороз, 2002; Branderburg et al., 1993] є переважність вмісту в ЛПС 3-ОН-С14:0, С16:0 та С14:0 жирних кислот, які містяться в складі типового штаму R. solanacearum та близьких до нього штамів.

Таблиця 2

Жирнокислотний склад ліпідів А ЛПС R. solanacearum

(в % до загальної суми площин піків)

Жирні кислоти Штами ІСМР

5712 7945 7955 8110 767 7944 8089 4157

3-ОН-С10:0 - - - - - - 18,23 3,45

С12:0 0,81 0,07 0,53 0,93 1,07 19,76 16,21 -

2-ОН-С11:0 - - - - - - - 6,61

3-ОН-С11:0 - - - - - 3,0 1,14 1,15

2-ОН-С12:0 - - - - - - 23,6 4,34

3-ОН-С12:0 0,74 0,44 0,28 0,36 0,85 25,64 18,12 24,47

С14:0 19,22 16,63 20,64 16,21 4,19 3,17 1,85 3,38

2-ОН-С13:0 - - - - - - - 14,1

3-ОН-С13:0 0,16 - 1,71 0,15 - - - 6,15

і-С15:0 0,11 - - - 18,1 1,47 0,62 6,65

аі-С15:0 - - - - 27,04 - 1,22 9,52

2-ОН-С14:0 - - 2,17 1,7 - - - -

3-ОН-С14:0 33,53 24,41 27,61 23,68 1,04 16,9 0,39 1,66

С16:1 - - 1,16 2,71 - - - -

С16:0 8,72 12,56 6,09 7,29 18,0 22,74 13,71 3,17

3-ОН-С15:0 - 1,38 1,35 2,66 - - - -

аі-С17:0 - - - - 7,92 1,45 0,48 1,88

isomeric-2-ОНС16:0 - 2,67 - - - - - -

2-ОН-С16:0 21,55 10,43 5,27 10,51 - - - -

3-ОН-С16:0 1,09 0,82 0,63 1,43 3,44 1,63 - -

cis-9-C18:0 - 10,65 - 6,86 - - - -

trans-9-C18:1 - - 5,07 - - - - -

C18:1 2,66 2,37 8,7 6,61 17,45 4,24 4,43 13,47

2-ОН-С18:1 8,3 - - - - - - -

2-ОН-С18:0 3,12 17,56 17,32 14,32 - - - -

3-ОН-С18:0 - - 1,48 3,92 - - - -

Склад жирних кислот ЛПС штамів 767, 7944, 8089 і 4157 принципово відрізнявся від типового штаму та подібних до нього шт. 7945, 7955 і 8110. Для них виявилась характерною присутність оксикислот з більш короткою довжиною вуглецевого ланцюга: 2-ОН-С11:0 (шт. ,61%), 3-ОН-С10:0 (шт. 8089 і 4157 – 18,23 і 3,45%, відповідно), 3-ОН-С11:0 (7944, 8089 і 4157 – 3,0%, 1,14% і 1,15%, відповідно), 2-ОН-С12:0 (8089 і 4157 – 23,6 і 4,34%, відповідно), 3-ОН-С12:0 (7944, 8089 і 4157 – 25,64%, 18,12% і 24,47%, відповідно), 2-ОН-С13:0 і 3-ОН-С13:0 (шт. – 14,1% і 6,15%, відповідно), 3-ОН-С14:0 і С12:0 (7944, 8089 4157). Наявність 3-ОН-С10:0, 3-ОН-С12:0 і 2-ОН-С12:0 наближує ці штами до фітопатогенних видів P. та P. [Веремейченко, Здоровенко, 2000].

Раніше Варбанець та співавт. (1993) при аналізі 25 штамів R. встановили 8 типів структур О-ПС (табл. 3).

Структурні відміни були наступні: 1) повторювальний ланцюг О-ПС деяких штамів містив ?-(1>2)-, б-(1>3)- ?бо ?-(1>3)-зв'язаний N-ацетилглюкозамін; 2) в О-ПС деяких штамів була присутня тільки тетрасахаридна лінійна структура, в інших – пентасахаридна розгалужена, де L-ксилоза або L-рамноза виступали як термінальні замісники; 3) в О-ПС деяких штамів був присутній тільки один тип структури, в той час як інші характеризувались гетерогенною організацією і були представлені більш, ніж одним, типом структури О-ПС; 4) крім того в дослідженнях були присутні два штами 8089 та 4157, які принципово відрізнялись від інших штамів, їх О-ПС були представлені трисахаридними ланцюгами з лінійною та розгалуженою структурою, відповідно.

Таблиця 3

Розподілення типів структур О-ПС ланцюга,

що повторюється, в ЛПС досліджуваних штамів R. solanacearum

ICMP штам О-ПС структура Тип структур, співвідношення структур,%

8110 ®3)-a-D-GlcNAc-(1®2)-a-L-Rha-(1®2)-a-L-Rha-(1®3)®a-L-Rha-(1® A B C D 1 100 %

767 ®3)-b-D-GlcNAс-(1®3)-a-L-Rha-(1®2)-a-L-Rha-(1®3)-a-L-Rha-(1® 2 100 %

5712 ®3)-b-D-GlcNAс-(1®3)-a-L-Rha-(1®2)-a-L-Rha-(1®3)-a-L-Rha-(1® ­4 Ѕ1 b-L-Xyl 3 3:2 70 %:30 %

7955 ®3)-a-D-GlcNAc-(1®3)-a-L-Rha-(1®2)-a-L-Rha-(1®3)-a-L-Rha-(1® 4 4:(3+2) 70 %:30 %

7945 ®3)-a-D-GlcNAc-(1®2)-a-L-Rha-(1®2)-a-L-Rha-(1®3)-a-L-Rha-(1® ­4 Ѕ1 b-L-Xyl 5 5:1:3 40 %:50 %:10 %

7944 ®3)-a-D-GlcNAc-(1®2)-a-L-Rha-(1®2)-a-L-Rha-(1®3)®a-L-Rha-(1® ­3 Ѕ1 a-L-Rha 6 6:1 40 %:60 %

8089 ®3)-a-D-Rha-(1®4)-a-D-GalNAc-(1®3)-a-D-Rha-(1® 7 100 %

4157 ®6)-a-D-GlcNAc-(1®4)-a-D-GalNAc-(1® ­4 Ѕ1 b-D-Araf 8 100 %

РОЗДІЛ 4. СЕРОЛОГІЧНА СПЕЦИФІЧНІСТЬ ЛПС

Відомо, що тонкі варіації в структурі О-ПС ланцюгів визначають серологічну специфічність грамнегативних бактерій та використовуються як молекулярна основа серологічних класифікаційних схем. Для R. solanacearum досі не існує класифікаційної схеми, заснованої на серологічній специфічності їх ЛПС. З огляду на це було проведене дослідження з метою встановлення можливої кореляції між серологічною активністю ЛПС та структурою О-ПС, для чого були обрані штами R. solanacearum, які характеризувались різними типами структури О-ПС (табл. 3).

Визначення імунохімічних властивостей ЛПС проводили за допомогою поліклональних О-антисироваток кролів, отриманих до грітих бактеріальних культур досліджуваних штамів, які використовувались в якості антитіл. В якості антигенів виступали ЛПС, одержані з клітин даних штамів.

Кожний з існуючих в даний час імунохімічних методів поряд з перевагами характеризується також рядом недоліків. З врахуванням цього, вивчення серологічних властивостей та специфічності ЛПС R. solanacearum здійснювали за допомогою ряду методів.

В гомологічних системах при проведенні реакцій аглютинації, кільцепреципітації, подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні, а також імуноелектрофорезі було показно, що ЛПС всіх досліджуваних штамів R. виявляли серологічну активність щодо гомологічних О-антисироваток в досить високих титрах (найбільше розведення антигену або сироватки, при яких спостерігались чітко позитивні реакції, становили 1:160000 та 1:3200 в реакціях кільцепреципітації та аглютинації, відповідно) і характеризувались складним антигенним складом (від 1 до 3 антигенних факторів, виражених в преципітаційних лініях в реакціях подвійної імунодифузії та імуноелектрофорезу).

При таксономічних дослідженнях, як один з підходів в класифікації мікроорганізмів, можуть бути використані серологічні перехресні реакції.

На підставі серологічної спорідненості, виявленої в гетерологічних системах ракетного імуноелектрофорезу та подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні досліджувані штами були розділені на п'ять серогруп.

Дані ELISA та ELISA-інгібування, які були отримані в гомологічних та гетерологічних системах, цілком підтверджують результати щодо такого розподілу попередніх дослідженнь.

До першої серогрупи були віднесені 4 штами (5712, 7945, 7955 та 8110), ЛПС яких виявляли серологічну спорідненість не тільки до гомологічної О-антисироватки, а також і до гетерологічних сироваток цих штамів при рівноважному зворотньому реагуванні.

До другої та третьої серогруп були віднесені два штами: 767 та 7944, відповідно, О-антисироватки яких, крім гомологічного ЛПС, впізнавали також ЛПС типового штаму R. 5712, що ввійшов до першої серогрупи, однак зворотнього реагування – О-антисироватка шт. /ЛПС шт. 767 та 7944 – не спостерігалось. Цікаво також відзначити, що О-антисироватка до шт. , представника першої серогрупи, виявляє деяку спорідненість до ЛПС представника третьої серогрупи шт. , О-антисироватка якого серологічно інертна до ЛПС шт. 7945.

ЛПС R. solanacearum штамів 8089 та 4157, структури О-ПС яких принципово відрізнялись як між собою, так і від структур вже описаних штамів, були серологічно інертними з гетерологічними О-антисироватками всіх досліджуваних штамів і навпаки, і тому були віднесені до 4 та 5 серогрупи, відповідно.

Об'єднання в одну серологічну групу передбачає наявність загальної антигенної детермінанти. За даними літератури, роль групових факторів можуть відігравати олігосахаридні фрагменти основного ланцюга. Як вважають дослідники, котрі показали наявність серологічних реакцій між Klebsiella pneumoniae 22535 та Shigella flexneri 6, дисахарид: a-L-Rha-(1®2)-a-L-Rha, який присутній в О-антигенних повторювальних ланках, може відповідати за серологічні перехресні реакції [Ansaruzzman et al., 1996].

На користь цього припущення свідчить той факт, що у О-ПС шт. , представника третьої серогрупи, термінальний замісник, представлений a-L-Rha, екранує передбачувану ланку серологічно активної детермінанти і як результат знімає серологічне навантаження з цієї ділянки. В ЛПС шт. , представника другої серогрупи, в О-ланцюзі присутня передбачувана серологічно активна детермінанта, однак його ЛПС залишається інертним до гетерологічних О-антисироваток досліджуваних штамів. Не виключено, що антигенна детермінанта екранується якими-то замісниками, можливо, невуглеводної природи, які не були виявлені використаними методами встановлення структури О-ПС.

Подальші дослідження були спрямовані на виявлення загальних антигенних детермінант в складі ЛПС, за рахунок яких відбувається перехресне серологічне зв'язування, для чого були використані ДСН-ПААГ- електрофорез з імуноблотингом.

При проведенні ДСН-ПААГ електрофорезу визначено, що ЛПС всіх досліджуваних штамів виявляли типовий для ЛПС S-форми бімодальний розподіл і включали два типи молекул: високомолекулярний S-ЛПС з О-ланцюгами різної довжини та низькомолекулярний R-ЛПС, який не містить О-ланцюгів. Поряд з тим, вдалося виявити також менш виражений SR-ЛПС з малим числом мономерних ланок в О-ланцюзі.

Було показано, що ЛПС штамів, віднесених до однієї серогрупи, характеризувались подібним електрофоретичним розподілом, однак порівняно з іншими серогрупами – електрофоретичний розподіл був індивідуальним.

При проведенні імуноблотингу виявлені загальні закономірності перехресної реактивності антигенів одних штамів та абсолютної серологічної інертності інших щодо досліджуваних поліклональних антисироваток.

При імуноблотингу були виявлені зони серологічної активності ЛПС по відношенню до гомологічних та гетерологічних О-антисироваток. Показано, що передбачуване концентрування загальних антигенних детермінант розташовано в S- та SR-зонах ЛПС, які представлені О-ланцюгами різної довжини, а також в R-зонах ЛПС деяких штамів.

Отримані результати підтвердили розподіл досліджуваних штамів на п'ять серогруп, встановлених в вище описаних серологічних дослідженнях, і свідчили про імунохімічну гетерогенність виду R. solanacearum.

РОЗДІЛ 5. ДОСЛІДЖЕННЯ ТОКСИЧНОСТІ ТА ПІРОГЕННОСТІ ЛПС

Останнім часом дослідники звернули увагу на те, що ряд мікроорганізмів, які раніше вважались патогенними лише для рослин, можуть також впливати і на організм людини, оскільки, потрапляючи до нього з продуктами харчування, можуть викликати порушення імунологічної реактивності організму. Одним з таких мікроорганізмів є R. solanacearum, який уражає томати, картоплю, солодкий перець, соняшник, тощо – рослини, що широко вживаються людиною повсякденно. Раніше Варбанець та співавт. (1989-1991) була встановлена мітогенна, інтерфероногенна, протипухлинна, антилейкозна та антиметастатична дії ЛПС R.. Оскільки поряд з високою імунотропною активністю, ЛПС характеризуються токсичністю й пірогенністю, цікавим було вивчити ці показники у препаратів ЛПС досліджуваних штамів R. solanacearum.

Випробування пірогенної дії ЛПС 8 досліджуваних штамів проводили згідно біологічного методу якісного контролю щодо присутності бактеріальних ендотоксинів в медичних препаратах.

Для проведення порівняльної оцінки пірогенних характеристик ЛПС досліджуваних штамів в серії розведень була встановлена мінімальна пірогенна доза, яка становила 7,5х10-3 мкг ЛПС мл непірогенного ізотонічного розчину.

Результати термометрії показали, що підвищення температури у експериментальних тварин більш ніж на 0,45?С, що випадає за межі фізіологічної норми здорової тварини, викликали розчини ЛПС штамів R. solanacearum 5712, 7955, 7945 та 8110. Протягом першої години їх введення призводило до різкого підвищення температури у піддослідних тварин. На другу годину спостерігалось деяке зниження температури з тенденцією до її нормалізації. І вже протягом третьої години значення температур досягали вихідних показників.

За проявом пірогенного впливу при внутришньовенному введенні мінімальної пірогенної дози (7,5?10-3 мкг/мл) ці штами виявились подібними до “Пірогеналу” – фармацевтичного препарату, діючим компонентом якого є ЛПС Shigella typhi.

При внутрішньовенному введенні піддослідним тваринам мінімальної пірогенної дози розчинів ЛПС штамів R. 767, 7944, 8089 та 4157 – підвищення температури не спостерігалось, що може свідчити про відсутність пірогенної дії ЛПС цих штамів у досліджуваній концентрації (табл. ).

Для оцінки токсичності ЛПС досліджуваних штамів R. solanacearum (767, 4157, 5712, 7944, 7945, 7955, 8089 та 8110) визначали дозу препарату ЛПС, при внутришньовенному введенні якої спостерігалась би загибель 50% піддослідних тварин (ЛД50) (табл.4). ЛД50 визначали в серії розведень ЛПС.

Досліджувані препарати ЛПС проявляли різний рівень токсичної активності, що відображено в показниках ЛД50. За даними щодо токсичності досліджувані штами можна розділити на дві групи: більш токсичними виявились ЛПС штамів , 7945, 8110 та 5712 (ЛД50 8-12 мкг/мишу), менш токсичними – ЛПС штамів 7944, 767, 4157 та 8089, ЛД50 яких приблизно втричі більше (ЛД50 30-40 мкг/мишу).

Таблиця 4

Біологічна активність ЛПС штамів R. solanacearum

ЛПС штаму ІСМР Мінімальна пірогенна доза ЛПС, яку вводили кролям, мкг/мл Середнє значення відхилення температури (?С) після введення протягом Визначення ЛД50 Серогрупа

1 год 2 год 3 год мкг/мишу г/кг

5712 7,5Ч10-3 +0,79 +0,80 +0,20 12 0,6 1

7945 7,5Ч10-3 +0,95 +0,5 -0,07 10 0,5

7955 7,5Ч10-3 +1,27 +1,21 +0,81 8 0,4

8110 7,5Ч10-3 +0,96 +0,55 +0,26 10 0,5

767 7,5Ч10-3 +0,15 +0,11 +0,01 35 1,75 2

7944 7,5Ч10-3 +0,30 0 -0,31 30 1,5 3

8089 7,5Ч10-3 +0,05 +0,26 -0,08 35 1,75 4

4157 7,5Ч10-3 +0,20 +0,20 0 40 2 5

Як відомо, за прояв патофізіологічних реакцій в організмі ссавців, які виникають під час перебігу інфекційного процесу, викликаного грамнегативними бактеріями, відповідальна ліпід А частина молекули ЛПС. Ліпід А, представлений жирними кислотами, глюкозаміном та залишками фосфорної кислоти, є ендотоксичним центром ЛПС і обумовлює його біологічну активність, в тому числі і пірогенність та токсичність.

Вивчення жирнокислотного складу поки що не дає можливості визначити, наявність яких жирних кислот є необхідним для прояву пірогенних та токсичних властивостей, але можна припустити, що 2-ОН-С16:0 та 2-ОН-С18:0 можуть відігравати в цих процесах певну роль. На користь цього припущення свідчать дані літератури щодо кореляції прояву біологічних властивостей ЛПС і довжиною жирних кислот його ліпіду А. Так, ЛПС Rhodocyclus gelatinosus, у якого обидві глюкозамінові групи несуть більш короткі порівняно з ЛПС E. coli жирні кислоти, виявляють менший за нього ступень пірогенності та токсичності [Brandenburg et al., 1993].

РОЗДІЛ 6. ВИВЧЕННЯ БІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ МОДИФІКОВАНИХ ЛПС

Висока токсичність і пірогенність ЛПС ускладнює їх впровадження в медичну практику як терапевтичних препаратів. Однак їх потужна активність та широкий спектр імуномодулюючої дії спонукає дослідників поряд з постійним пошуком нових, менш токсичних полімерів, розробляти підходи до отримання хімічно модифікованих ЛПС. Крім того, на сьогодні існує ряд запитань щодо відповідальності хімічних угрупувань у складі ЛПС за прояв того чи іншого виду біологічної активності. Тому нами були отримані модифіковані препарати ЛПС типового штаму R. solanacearum 5712 при застосуванні фізичних (УФ-опромінення) і хімічних (О-деацилювання, N-,O-деацилювання та дефосфорилювання) методів та досліджували їх біологічну (антигенну, пірогенну та токсичну) активність.

Опромінення ультрафіолетом ЛПС типового штаму R. solanacearum показало, що серологічна активність корелює з часом експозиції опромінення: вплив УФ-променів на ЛПС до 15 хв. не викликав змін активності, в той час як при 30 хв. експозиції активність значно знижувалась, а після 60 хв. – повністю втрачалась. Втрата серологічної активності УФ-опромінених ЛПС можливо була обумовлена зміною конформації молекули.

Таблиця 5

Біологічна активність модифікованих препаратів ЛПС R.

Препарат Активність

токсична пірогенна

доза, мкг/мл стан тварин Мінімальна пірогенна доза, мкг/мл Середнє значення відхилення температури (С?)після введення протягом

1 год 2 год 3 год

Контроль (нативний ЛПС 5712) 12 50% загинуло 7,5Ч10-3 +0,8 +0,6 +0,5

О-деацильований ЛПС 12 всі живі 7,5Ч10-3 +0,01 -0,29 -0,29

N-,O- деацильований ЛПС 12 всі живі 7,5Ч10-3 +0,28 +0,19 +0,1

Дефосфорильований ЛПС 12 всі живі 7,5Ч10-3 +0,3 +0,1 +0,06

При модифікації О-деацилюванням, N-,O-деацилюванням та дефосфорилюванням ЛПС втрачали пірогенну та токсичну активності. Це може свідчити про те, що за пірогенність та токсичність ЛПС R. solanacearum відповідають як ацильні, так і фосфатні групи.

ВИСНОВКИ

1. Отримано та хімічно охарактеризовано ЛПС восьми штамів R. solanacearum. Домінуючим моносахаридом для 7 штамів R. solanacearum є рамноза. ЛПС R. шт. 4157 характеризувався високим вмістом арабінози. В складі ЛПС деяких штамів (ІСМР 7945, 5712 та 767) була виявлена також ксилоза.

2. Вперше досліджені штами R. за складом жирних оксикислот ліпіду А були розподілені на дві групи: штами, що містили оксикислоти з ланцюгом від 12 до 18 атомів вуглецю (ІСМР 5712, 7945, 7955 та 8110), та штами з меншим числом вуглецевих атомів (С10-С14) в ланцюгах жирних оксикислот (ІСМР 767, 7944, 8089 і 4157).

3. Вперше на основі О-антигенності досліджувані штами R. solanacearum, які характеризувались 8 різними типами структури О-ПС, були віднесені до п'яти серогруп.

4. Встановлено, що ЛПС всіх досліджуваних штамів R. solanacearum мають типове для ЛПС S-форми бімодальне розподілення та включають два основних типа молекул (високомолекулярний S-ЛПС, представлений О-ланцюгами різної довжини, і низькомолекулярний R-ЛПС, що не містить О-ланцюгів).

5. Вперше для R. solanacearum як в гомологічних, так і в деяких гетерологічних (О-антисироватка до шт. 5712/ЛПС першої серогрупи, О-антисироватка до шт. /ЛПС шт. ) системах виявлено переважне концентрування загальних антигенних детермінант в S-, SR- та R-зонах ЛПС.

6. Вперше досліджувані штами R. solanacearum за проявом пірогенної та токсичної дії ЛПС були розподілені на дві групи: більш пірогенні та токсичні (шт. 5712, 7945, 7955 і 8110) та менш пірогенні і токсичні (шт. 767, 7944, 8089 і 4157).

7. Вперше встановлено, що модифікація ЛПС УФ-опроміненням призводить до зниження або повной втрати (30 хв. і 60 хв., відповідно) серологічної активності.

8. Вперше для R. solanacearum показано, що модифікація ліпідів А ЛПС типового штаму шляхом О-деацилювання, N-,O-деацилювання та дефосфорилювання призводить до втрати ЛПС пірогенної та токсичної дії, що свідчить про необхідність присутності жирних кислот і фосфатних груп для прояву цих біологічних активностей.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вінарська Н.В., Варбанець Л.Д. Вплив УФ-опромінення на серологічну активність ліпополісахаридів Ralstonia solanacearum // Науковий вісник Ужгородського університету. – Серія “Біологія”. – №10. – Ужгород, 2001. – С.161-163.

2. Винарская Н.В., Варбанец Л.Д. Химическая характеристика и серологическая активность липополисахаридов Ralstonia solanacearum // Мікробіол. журн. – 2002. – 64, №1. – С.37-47.

3. Варбанец Л.Д., Косенко Л.В., Васильєв В.Н., Винарская Н.В., Затовская Т.В., Кислюк В.В., Лозовский В.З., Пахута Н.В. Использование лазерной спектроскопии для изучения бактериальных гликополимеров // Мікробіол. журн. – 2002. – 64, №2. – С.11-20.

4. Варбанец Л.Д., Винарская Н.В. Структура, функция, биологическая активность эндотоксинов грамотрицательных бактерій // Современные проблемы токсикологии. – 2002. - №1. – С.33-45.

5. Віріч Н.В.*, Варабанець Л.Д., Васильєв В.Н. Серологічна специфічність ліпополісахаридів Ralstonia solanacearum. // Бюллетень інституту сільськогосподарської мікробіології УААН. – Чернігів, 2000. – №7. – С.24.

6. Kislyuk V.V., Varbanets L.D., Kosenko L.V., Vinarskaya N.V., Pachuta I.M. The Laser Spectroscopy of Glycopolymers // The European Material Conference, E.-MRS 2001, Strasbourg (France), 5-8 June, 2001. – Strasbourg, 2001. – P.6.

7. Varbanets L.D., Vinarskaya N.V., Vasiliev V.N., Brovarskaya O.S. Immunochemical investigations of Ralstonia solanacearum lipopolysaccharides // XVI International Symposium on Glycoconjugates: Abstracts (Hague, Netherlands, 19-24 August, 2001). – Hague, 2001. – P.67.

8. Varbanets L.D., Vasiliev V.N., Vinarskaya N.V., Brovarskaya O.S. Characterization of Ralstonia solanacearum ICMP 5712 lipopolysaccharide // 11th European carbohydrate symposium Eurocarb XI – Book of abstracts (Lisboa, Portugal, 2-7 September, 2001).