УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НІКІТСЬКИЙ БОТАНІЧНИЙ САД – НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

ЗІЛЬБЕРВАРГ Ірина Русланівна

УДК 633.81:582.929.4:631.528.2:57.086.83

БІОТЕХНОЛОГІЧНІ ОСНОВИ ОДЕРЖАННЯ ПОЛІПЛОЇДНИХ РОСЛИН М’ЯТИ КОТЯЧОЇ (NEPETA SP.) ІЗ ЗАСТОСУВАННЯМ

АНТИМІКРОТРУБОЧКОВИХ СПОЛУК ДЛЯ ЦІЛЕЙ СЕЛЕКЦІЇ

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Ялта – 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Нікітському ботанічному саду – Національному науковому

центрі Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: доктор біологічних наук МИТРОФАНОВА Ольга Володимирівна,

Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр, завідувач

відділу біотехнології і вірусології рослин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Бугара Олександр Михайлович, Інститут ефіроолійних і лікарських

рослин УААН, завідувач лабораторії клітинної біології

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Ігнатова Світлана Олександрівна, Південний біотехнологічний центр УААН, завідувач лабораторії культури тканин

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ, відділ генетики клітинних популяцій

Захист відбудеться “16 ” травня 2002 р. о 1030 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 при Нікітському ботанічному саду – Національному науковому центрі за адресою: 98648, Україна, Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр.

Факс: (0654) 33-53-86

E-mail: nbs1812@ukr.net

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Нікітського ботанічного саду – Національного наукового центру: 98648, Україна, Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр.

Автореферат розіслано “ 12 ” квітня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, к.б.н. Садогурський С.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Деякі види м’яти котячої (Nepeta sp. L.) є перспективними лікарськими, пряно-ароматичними і ефіроолійними культурами для півдня України. Ефірна олія даних представників родини Губоцвітих має високу антимікробну активність, застосовується як фунгіцид для боротьби з цвілевими грибами. Вона використовується в багатьох країнах світу в медицині і парфюмерно-косметичній промисловості. Великий інтерес становляють складні міжвидові гібриди м’яти котячоїм’яти котячої , отримані у відділі нових технічних і лікарських рослин НБС – ННЦ. Однак відомо, що більшість високопродуктивних міжвидових гібридів бувають у тій чи іншій мірі стерильними і таким чином виключається можливість їхнього розмноження насінням. Основним рішенням проблеми подолання безплідності у складних міжвидових гібридів роду Nepeta є перевід отриманих і батьківських форм на більш високий рівень плоїдності. У деяких випадках доцільно спочатку одержувати тетраплоїди у намічених для гібридизації видів, а потім проводити їхнє схрещування.

Відкриття поліплоїдизуючої дії колхіцину стимулювало активні дослідження з експериментальної поліплоїдії, в результаті чого було розроблено численні способи впливу колхіцином на різні органи рослини, стосовно різних видів. Згодом було доведено, що спорідненість колхіцину до рослинного тубуліну дуже низька. Поряд з колхіцином до групи речовин, які деполімеризують мікротрубочки, також відносяться фосфоротіоамідні і динітроанілінові гербіциди. Ці речовини викликають с-мітози, як і колхіцин, але мають більш високу спорідненість до рослинного тубуліну.

Великі можливості для селекції ефіроолійних і лікарських рослин відкривають методи біотехнології в сполученні з експериментальною поліплоїдією. Одержання поліплоїдних форм м’яти котячої в умовах in vitro з використанням антимікротрубочкових сполук дає можливість прискорити і полегшити селекційний процес, а також підвищити вихід рослинної біомаси.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконані згідно з розділом тематичного плану НБС - ННЦ № держреєстрації 0197U004324 - "Розробити теоретичні основи біотехнології одержання нових селекційних форм рослин з підвищеною продуктивністю й адаптивністю до стресових факторів середовища, створення калюсної біомаси і мікророзмноження субтропічних і кісточкових плодових, лікарських і декоративних культур". Робота виконувалася в рамках проекту № 02.12/07734 "Синтезувати поліплоїди лікарських рослин Hyssopus officinalis L. і Nepeta cataria var. сitriodora Beck із застосуванням антимікротрубочкових сполук в умовах in vitro" державної науково-технічної програми 02.12 "Перспективні біотехнології" з пріоритетних напрямків розвитку науки і техніки "Здоров'я людини", а також відповідно до плану аспірантської підготовки.

Мета і завдання дослідження. Ціль цього дослідження - вивчити особливості культивування тканин і органів м’яти котячої та одержати нові поліплоїдні форми в умовах in vitro із застосуванням колхіцину, динітроанілінових і фосфоротіоамідних гербіцидів для використання в селекції. У процесі роботи необхідно було вирішити такі завдання:

- одержати стерильну культуру експлантів досліджуваних видів м’яти котячої;

- визначити оптимальні умови культивування органів і тканин (склад живильного середовища, інтенсивність освітлення, температура, відносна вологість повітря);

- розробити способи обробки органів і тканин м’яти котячої in vitro антимікротрубочковими речовинами (колхіцин, оризалін, еталфлюралін, пендіметалін, бенефін, трифлюралін і аміпрофосметил);

- показати вплив різних способів застосування антимікротрубочкових речовин на регенерацію рослин;

- вивчити плоїдність отриманих форм м’яти котячої в результаті обробки антимікротрубочковими сполуками;

-

Об'єкт дослідження – процес одержання поліплоїдів із застосуванням антимікротрубочкових сполук in vitro.

Предмет дослідження – біотехнологічні основи експериментальної поліплоїдії роду Nepeta sp.

Методи дослідження: При одержанні поліплоїдних рослин м’яти котячої із застосуванням антимікротрубочкових сполук використовували класичні біотехнологічні методи (Р.Г.Бутенко, Ф.Л.Калінін та ін., О.В.Митрофанова).

Аналіз отриманих форм рослин проводили за допомогою морфологічних (Л.П.Бреславець) і цитоморфологічних методів (З.П.Паушева, В.А.Піддубна-Арнольді).

Наукова новизна. Уперше створено поліплоїдні форми м’яти котячої в умовах in vitro з використанням антимікротрубочкових сполук, визначено умови культивування вихідних і експериментально отриманих рослин. Уперше виявлено фактори, що впливають на поліплоїдизацію меристематичних тканин мікроживців досліджуваних форм Nepeta sp. L. Розроблено оригінальну методику обробки експлантів м’яти котячої антимікротрубочковими речовинами в умовах in vitro, що може бути запропоновано для застосування на інших цінних сільськогосподарських культурах. Уперше встановлено, що при тривалому культивуванні мікроживців м’яти котячої на агаризованих живильних середовищах, які містять низькі концентрації антимікротрубочкових агентів, знижується число химерних форм від загальної кількості поліплоїдів у порівнянні з попередньою обробкою їх у рідких живильних середовищах, які містять високі концентрації даних речовин.

Практична цінність роботи. Розроблено методику одержання поліплоїдних форм рослин роду Nepeta в умовах in vitro з використанням фосфоротіоамідних і динітроанілінових гербіцидів, яка дає можливість у кілька разів прискорити селекційний процес. Отримано вихідні поліплоїдні форми м’яти котячої для подальшої селекції і гібридизації. Даний метод може бути рекомендований для одержання нових селекційних і гібридних форм інших цінних культур.

Результати досліджень включено до курсу лекцій з сільськогосподарської біотехнології для студентів агрономічного факультету і факультету плодоовочівництва і виноградарства, що читаються на кафедрі біотехнології, ефіроолійних і лікарських рослин КДАУ (довідка про упровадження від 12 грудня 2001 року), а також до курсу лекцій з біотехнології для студентів, що спеціалізуються на кафедрі фізіології рослин і біотехнології ТНУ (довідка про упровадження від 8 січня 2002 року).

Особистий внесок здобувача полягає в постановці експериментів, мікроскопічному аналізі синтезованих форм рослин м’яти котячої, обробці отриманих даних, критичному аналізі літератури й оформленні дисертації. Разом з науковим керівником зроблено вибір актуальної теми наукової роботи, освоєння деяких методик, розробку структури роботи і підготовку наукових статей.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на 7-ми міжнародних конференціях: “Пути решения проблем и перспективы развития биотехнологии в декоративном садоводстве и плодоводстве” (Ялта, 1997); “The Plant Cytosceleton: Molecular Keys for Biotechnology” (Yalta, Crimea, Ukraine, 1998); “II International Symposium on Plant Biotechnology” (Kyiv, Ukraine, 1998); “International Meeting of Young Scientists in Horticulture” (Lednice, Czech Republic, 1999); 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology (Budapest, Hungary, 2000); “Актуальные вопросы современного естествознания” (Симферополь, 2001); Конференції молодих вчених-ботаніків України “Актуальні проблеми ботаніки та екології” (Ніжин, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 10 наукових робіт, з них 4 статті у виданнях, затверджених ВАК як спеціалізовані за біологічним напрямком.

Структура й обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 134 сторінках машинописного тексту, яка складається з вступу, огляду літератури, розділу “Об'єкти і методи дослідження”, двох розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів дослідження, практичних рекомендацій, висновків, списку використаної літератури, додатка (довідки про впровадження) і включає 8 таблиць, 38 рисунків. У списку літератури 195 найменувань, в тому числі 103 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Зроблено огляд літератури з поліплоїдії, її значення і принципів використання в селекції рослин, з основних методів і біотехнологічних основ одержання поліплоїдів. Вивчено друковані роботи з застосування антимікротрубочкових сполук (колхіцину, фосфоротіоамідних і динітроанілінових гербіцидів), що викликають с-мітози, в експериментальній поліплоїдії рослин. На основі літературного огляду розроблено програму досліджень за темою дисертації і деякі методичні підходи для одержання поліплоїдних форм досліджуваних генотипів м’яти котячої (Nepeta cataria L., N. grandiflora M.B., N. transcaucasica Grossh, (N. cataria x N. grandiflora) x N. transcaucasica).

Об'єкти і методи досліджень. Дослідження проводилися на трьох видах Nepeta cataria L., N. grandiflora M.B., N. transcaucasica Grossh і одному гібриді м’яти котячої (N. cataria x N. grandiflora) x N. transcaucasica. Як первинні експланти використовували сегменти пагонів м’яти котячої з апікальними і пазушними бруньками. Рослини культивували на живильному середовищі Murashige і Skoog (1962) у наших модифікаціях, при цьому використовували класичні біотехнологічні методи (Бутенко Р.Г., 1964, Калінін Ф.Л. та ін., 1980, Митрофанова О.В. та ін., 1980, 1997).

У дослідженнях з експериментальної поліплоїдії in vitro використовували антимікротрубочкові агенти, які відносяться до групи хімічних сполук, що викликають с-мітози (тобто деполімеризацію мікротрубочок): колхіцин; фосфоротіоамідний гербіцид - аміпрофосметил (АПМ); динітроанілінові гербіциди (оризалін, трифлюралін, пендіметалін, бенефін і еталфлюралін).

Обробку проводили двома способами:

1. Попередня обробка рослинного матеріалу в рідких живильних середовищах, що містять 30, 60, 120, 240 і 480 мкМ антимікротрубочкових агентів. Рослинний матеріал попоредьо обробляли 48 годин при 10-12-годинному фотоперіоді, інтенсивності освітлення 2-4 клк, температурі 20-220С, відносній вологості повітря 80 %. Після попередньої обробки мікроживці поміщали на живильне середовище, яке не містило гербіцидів. Через 30-40 діб мікропагони, що утворилися з пазушних бруньок пасирували на свіжоприготоване живильне середовище.

2. Заливання мікроживців агаризованими живильними середовищами, які містять антимікротрубочкові сполуки. Було використано такі варіанти живильних середовищ : а) що містять АПМ, оризалін, пендіметалін, еталфлюралін, бенефін, трифлюралін у концентраціях 5, 10, 20 мкМ; б) що містять колхіцин – 20, 100, 500, 1000, 1500 мкМ. Через 20-30 діб мікропагони, які утворилися з пазушних бруньок, поміщали на свіже середовище для субкультивування.

Попереднє виділення поліплоїдних форм проводилося за змінами габітусу рослин, форми листя і пагонів, а також розмірів замикаючих клітин устячок, числа хлоропластів у них і кількості устячок на одиницю площі (Бреславець Л.П., 1962). Визначення плоїдності отриманих у результаті експерименту форм здійснювали шляхом підрахунку хромосом на тимчасових препаратах апікальної меристеми кореня і молодих листочків (Паушева З.П., 1970).

Біотехнологічні основи культивування м’яти котячої (Nepeta sp.) з метою експериментальної поліплоїдії. Апікальні і латеральні бруньки різних форм м’яти котячої вводили до умов in vitro із квітня по серпень. Починаючи з третьої декади травня інтенсивність пагоноутворення склала: у N. cataria – 52 %, N. grandiflora – 46 %, N. transcaucasica – 38 %, (N. cataria х N. grandiflora) х N. transcaucasica – 40 %. Високу регенераційну здатність в умовах in vitro мали мікропагони N. cataria у період з кінця травня до початку червня (52-64 %), N. grandiflora – у червні (68-75 %). В результаті фенологічних спостережень було встановлено, що інтенсивність пагоноутворення в умовах in vitro залежала від фенофази рослин і була найвищою на початку бутонізації. У період цвітіння регенераційна здатність знижувалася.

Ефективним способом одержання асептичної культури виявилася ступенева стерилізація етиловим спиртом і розчинами Thimerosal (1 %) і AgNO3 (0,08 %). При цьому нам удалося досягти низького рівня контамінації (5-26 %) і досить високої регенерації мікропагонів (66-95 %) у залежності від генотипу.

В процесі культивування було встановлено, що МС1, розроблене у відділі біотехнології і вірусології рослин НБС – ННЦ, із половинним набором макро- і мікросолей, яке містить зеатин і ІМК, є одним з оптимальних середовищ для уведення експлантів котовника до умов in vitro. Живильне середовище МС2, що містить подвійну дозу N, P і K, найбільше підходить для тривалого культивування. Найефективнішим для субкультивування мікропагонів виявилося середовище МС4, що містить ІУК і кінетин. Активніше регенерація рослин проходила на живильних середовищах, які містили зеатин (0,91-3,19 мкМ) і ІМК (5,71 мкМ). Подальший ріст і розвиток пагонів м’яти котячої в умовах in vitro у меншій мірі залежали від гормонального складу живильного середовища, а істотним фактором для цього був збалансований вміст основних макроелементів.

При культивуванні in vitro різних генотипів м’яти котячої сприятливими умовами для рослин N. transcaucasica є температура 22-240С, інтенсивність освітлення 4 клк, N. cataria і N. grandiflora – 20-220С, 3 клк, (N. cataria x N. grandiflora) x N. transcaucasica – 20-250C, 4 клк і відносна вологість повітря 70-80 %. Для всіх досліджуваних генотипів м’яти котячої оптимальна рН живильного середовища була в межах 5,6-5,8.

Експериментальна поліплоїдія м’яти котячої (Nepeta sp.) з використанням антимікротрубочкових сполук в умовах in vitro. Хімічний мутагенез і експериментальна поліплоїдія in vitro – новий перспективний напрямок у селекції рослин. В процесі досліджень з експериментальної поліплоїдії м’яти котячої в умовах in vitro нами проведено порівняльне вивчення впливу колхіцину й антимікротрубочкових сполук нового покоління, що відносяться до фосфоротіоамідних і динітроанілінових гербіцидів.

Вплив колхіцину на поліплоїдизацію, регенерацію і розвиток рослин N. transcaucasica в умовах in vitro. В результаті культивування мікроживців N. transcaucasica на живильному середовищі з колхіцином різко знижувалася регенерація мікропагонів з пазушних бруньок. При концентрації колхіцину в середовищі 500 мкМ регенерація пагонів склала 40,0±4,7 %, однак поліплоїдних форм отримано не було. При концентрації даного алкалоїду в середовищі 1000 мкМ близько 30 % мікроживців утворили адвентивні мікропагони. У цьому випадку з рослин, що регенерували, тільки 22,2±4,7 % були поліплоїдними, в основному химерними. Після культивування експлантів на середовищі з 1500 мкМ колхіцину регенерувало 16,7±3,3 % мікропагонів, поряд з цим поліплоїдизувалось до 40,0±8,5 % з числа отриманих після обробки рослин. Слон і Кемпер на калюсній культурі моркви установили, що високі концентрації колхіцину можуть інгібувати різні фізіологічні процеси, прямо не зв'язані з функціонуванням мікротрубочок, включаючи дихання, синтез ДНК і етилену (Sloan M.E., Camper N.D., 1981). Очевидно, це також є однією з причин низької регенерації рослин N. transcaucasica, оброблених колхіцином.

В результаті колхіцинування нами отримані, в основному, химерні форми N. transcaucasica, більшість з них міксоплоїдного типу, що підтверджується і літературними даними на інших видах рослин (Utrilla L. та ін., 1989). Крім того, серед отриманих форм основна частина з них із переважанням комплексів диплоїдних клітин, що під час впливу знаходилися в стадії інтерфази, або в які колхіцин не проникнув унаслідок недостатньої дифузії. В процесі культивування in vitro велика частина отриманих високополіплоїдних химер гинула. Відомо, що у багатьох видів рослин мозаїка химерності міксоплоїдних форм змінюється у бік зменшення плоїдності, тому що в міру збільшення плоїдності клітин, швидкість їхнього поділу зменшується (Чувашина Н.П., 1980). У химерних рослин м’яти котячої частка диплоїдних клітин в процесі культивування зростала, що приводило до часткової або повної “розполіплоїдизації”. Безпосередньо після культивування на середовищі з колхіцином плоїдність клітин рослин N. transcaucasica становила 2х, 4х, 8х, 16х і т.д.

Вплив оризаліну й АПМ на поліплоїдизацію, регенерацію і розвиток рослин м’яти котячої в умовах in vitro. Дослідження впливу АПМ і оризаліну на меристематичні тканини різних форм м’яти котячої в умовах in vitro показало можливість використання цих речовин для одержання поліплоїдів і поліплоїдних гібридів.

Складний трьохвидовий гібрид (N. cataria x N. grandiflora) x N. transcaucasica відрізнявся більш високою стійкістю до гербіцидів, ніж вихідні види N. grandiflora і N. transcaucasica, що цілком закономірно і узгоджується з існуючими в літературі даними (Раджабли Е.П., Рудь В.Д., 1972). Бреславець (1962), вивчаючи поліплоїдизацію під впливом різних факторів (колхіцин, різні види випромінювання і т.д.) і узагальнюючи дослідження інших вчених у цій галузі установила, що форми з меншим числом хромосом легше піддаються поліплоїдизації, а складні гібридні і поліплоїдні форми менш чутливі до поліплоїдизуючих факторів. Нами відзначено, що при будь-яких способах обробки, як АПМ так і оризаліном, найбільш низька поліплоїдизація була у гібридної форми, а висока - у N. transcaucasica.

В дослідах з використанням попередньої обробки високими концентраціями гербіцидів (240, 480 мкМ) спостерігали сильне пригнічення в розвитку мікропагонів і різке зниження регенерації рослин, що не перевищувала 20 %. В процесі субкультивування рослини розвивалися повільно, найчастіше мікропагони, що регенерували, відрізнялися сильно укороченими міжвузлями, потворністю листових пластинок і зміною їхнього кольору. Протягом 1-2 місяців частина з них гинула. Поряд з цим, концентрація гербіцидів у рідкому живильному середовищі для попередньої обробки мікроживців м’яти котячої 60-120 мкМ була досить ефективною. При концентрації АПМ і оризаліну в середовищі для попередньої обробки 120 мкМ було отримано 67,0±7,0 % і 60,0±10,8 % поліплоїдних мікропагонів N. transcaucasica відповідно (табл.1). Дані концентрації зменшували вихід високополіплоїдних і химерних форм.

З огляду на підвищення токсичності використовуваних агентів поліплоїдизації при збільшенні їхніх концентрацій для ефективної, але короткочасної обробки експлантів м’яти котячої, нами було використано альтернативний підхід застосування цих речовин, що полягав у тривалому культивуванні рослинного матеріалу на середовищах, які містять АПМ і оризалін, але в більш низьких концентраціях – 5, 10, 20 мкМ. Аналогічний підхід було використанио для одержання дигаплоїдних рослин кукурудзи (Wan Y. і ін. 1991), ефективної поліплоїдизації як представників однодольних (Trypsacum dactyloides (Salon P.R., Earle E.D., 1998)), так і дводольних (картопля (Sree Ramulu K. і ін.,1991), ківі (Chalak L., Legave J.M., 1996)) рослин. Даний спосіб обробки має особливе значення в тих випадках, коли для поліплоїдизації використовують цінний рослинний матеріал в обмеженій кількості.

В процесі досліджень, з використанням методу культивування мікроживців на агаризованих живильних середовищах, що містять гербіциди, отримано життєздатні регенеранти, які нормально розвивалися, при цьому кількість поліплоїдних форм була досить високою. Під впливом 5 мкМ розчину АПМ у живильному середовищі регенерувало і розвивалося близько 60 % мікропагонів N. transcaucasica, 66,5±7,5 % - N. grandiflora і 86,0±5,0 % - (N. cataria x N. grandiflora) x N. transcaucasica, з яких поліплоїдні - 16,0±3,5 %, 9,8±3,3 % і 8,0±4,0 % відповідно. Крім того, низькі концентрації оризаліну виявляли невеликий фітотоксичний ефект на рослини м’яти котячої. При концентрації оризаліну в живильному середовищі 5 мкМ було отримано 14,0±4,0 % поліплоїдних форм N. transcaucasica і 7,6±3,3 % - N. grandiflora. Відсоток поліплоїдних рослин м’яти котячої від числа регенерантів при порівняно низькій концентрації АПМ у середовищі 5 мкМ був досить високим і досягав майже 100 % у N. transcaucasica при концентрації АПМ 20 мкМ (табл.2). На відміну від культивування на середовищі з АПМ, при 48-годинній попередній обробці 30 мкМ розчином гербіциду було отримано тільки 27,5±3,8 % поліплоїдних рослин N. transcaucasica, тоді як 100 %-кову поліплоїдизацію було досягнуто при попередній обробці 240 мкМ розчином АПМ (див. табл.1).

Таблиця 1

Вплив короткочасної попередньої обробки (48 год)

мікроживців м’яти котячої АПМ і оризаліном на регенерацію рослин

і утворення їхніх поліплоїдних форм, % |

АПМ | Оризалін

Генотип | Концентрація гербіцида, мкМ | регенеровані рослини | поліплоїдні рослини | регенеровані рослини | поліплоїдні рослини

N.transcaucasica | контроль | 98,8±2,0 | 0 | 98,8±2,0 | 0

0,8% ДМСО | 96,8±3,2* | 0 | 96,8±3,2* | 0

30 | 60,0±8,6 | 27,5±3,8 | 60,0±5,0 | 28,0±10,0

60 | 36,7±4,2 | 38,0±5,0 | 50,0±3,3 | 40,0±15,0

120 | 20,0±5,0 | 67,0±7,0 | 33,5±4,5 | 60,0±10,8

240 | 10,0±6,4 | 100,0±0,0 | 13,6±6,6 | 100,0±0,0

480 | 0 | 0 | 0 | 0

N.grandiflora | контроль | 89,9±1,1 | 0 | 89,9±1,1 | 0

0,8% ДМСО | 86,8±5,0* | 0 | 86,8±5,0* | 0

30 | 70,0±3,3 | 21,0±4,5 | 74,0±8,9 | 14,8±5,0

60 | 50,0±6,8 | 36,8±8,0 | 47,8±9,0 | 36,0±6,0

120 | 30,0±6,0 | 57,0±12,6 | 30,0±5,0 | 57,8±8,0

240 | 13,2±2,5 | 75,5±8,0 | 20,0±3,3 | 83,0±10,8

480 | 0 | 0 | 14,0±6,0 | 100,0±0,0

(N.cataria x N.grandiflora) x N.transcaucasica | контроль | 96,8±3,3 | 0 | 96,8±3,3 | 0

0,8% ДМСО | 90,0±6,0* | 0 | 90,0±6,0* | 0

30 | 70,0±6,8 | 0 | 80,0±6,2 | 3,0±2,8

60 | 60,0±4,5 | 8,5±5,0 | 60,0±8,0 | 19,0±6,6

120 | 36,8±10,2 | 19,0±4,5 | 40,0±7,0 | 42,0±15,0

240 | 16,5±7,0 | 40,0±10,0 | 30,0±3,5 | 67,5±9,8

480 | 3,0±1,0 | 0 | 20,0±4,0 | 100,0±0,0

* Примітка.

р > 0,05 у порівнянні з відповідним контролем

Таблиця 2

Вплив тривалої обробки (30 діб) мікроживців м’яти котячої АПМ

і оризаліном на регенерацію рослин і утворення їхніх поліплоїдних форм, % |

АПМ | Оризалин

Генотип | Концетрація

гербіцида,

мкМ | регенеровані рослини | поліплоїдні рослини | регенеровані рослини | поліплоїдні рослини

N.transcaucasica | контроль | 97,0±3,3 | 0 | 97,0±3,3 | 0

0,8% ДМСО | 94,0±2,5* | 0 | 94,0±2,5* | 0

5 | 60,0±6,8 | 16,0±3,5 | 80,0±12,6 | 14,0±4,0

10 | 30,0±6,0 | 56,0±8,6 | 46,6±1,0 | 37,2±6,6

20 | 6,9±4,0 | 100,0±0,0 | 13,2±5,3 | 66,8±10,6

N.grandiflora | контроль | 93,7±2,3 | 0 | 93,7±2,3 | 0

0,8% ДМСО | 90,0±6,6* | 0 | 90,0±6,6* | 0

5 | 66,5±7,5 | 9,8±3,3 | 82,8±3,3 | 7,6±3,3

10 | 33,6±7,8 | 34,0±8,6 | 44,0±7,8 | 23,8±8,0

20 | 14,0±5,0 | 75,0±2,6 | 26,8±6,6 | 44,8±6,6

(N.cataria x N.grandiflora) x N.transcaucasica | контроль | 100,0±0,0 | 0 | 100,0±0,0 | 0

0,8% ДМСО | 98,9±1,1* | 0 | 98,9±1,1* | 0

5 | 86,0±5,0 | 8,0±4,0 | 94,6±3,3 | 0

10 | 60,0±11,5 | 16,9±4,5 | 76,8±6,6 | 6,8±5,0

20 | 30,3±5,0 | 32,5±12,0 | 63,5±4,0 | 20,0±4,5

*Примітка.

р > 0,05 у порівнянні з відповідним контролем

Однак високі концентрації антимікротрубочкових агентів при короткочасній обробці, а також тривале культивування на живильному середовищі з гербіцидами досить часто викликали повторні блокади мітозів, що приводило до утворення високополіплоїдних форм. Оскільки клітини діляться не синхронно, то є імовірність утворення химерних рослин, які менш життєздатні і повинні піддаватися розхимерюванню. Короткочасна 48-годинна попередня обробка високими концентраціями гербіцидів викликала утворення 50-75 % химерних рослин. Поряд з цим культивування рослин м’яти котячої на живильних середовищах, які містять гербіциди, зменшувало імовірність утворення химер до 45-50 % і різницю в плоїдності клітин. Багато дослідників, працюючи з колхіцином та іншими поліплоїдизуючими факторами відзначали, що обробки при тривалих експозиціях збільшують вихід високополіплоїдних і химерних рослин (Раджабли Е.П., Рудь В.Д., 1972). Це може бути зв'язано з тим, що колхіцин має дуже низьку спорідненість до рослинного тубуліну на відміну від АПМ і динітроанілінів, а також з особливостями будови, фізичними і хімічними властивостями даних сполук: розчинністю, впливом температури і світла на їхню стійкість у розчинах, принципом дії на рослинний тубулін (Morejohn L.C., Fosket D.E., 1991).

Таким чином, підтверджено високу поліплоїдизуючу активність АПМ і оризаліну при впливі в умовах in vitro на мікроживці різних форм м’яти котячої. Установлено, що найбільш зручний і економічний спосіб обробки даними гербіцидами – це культивування рослин м’яти котячої, протягом 2-3 тижнів, на середовищі, що містить антимікротрубочкові сполуки, а найбільш придатний для поліплоїдизації об'єкт – рослини N. transcaucasica.

Вплив різних представників динітроанілінових гербіцидів на поліплоїдизацію, регенерацію і розвиток рослин N. transcaucasica в умовах in vitro. В процесі досліджень з динітроаніліновими гербіцидами найменший інгібуючий ефект на ріст і розвиток рослин N. transcaucasica виявляв бенефін, а найбільш фітотоксичним був пендіметалін. При концентрації бенефіну в живильному середовищі 20 мкМ регенерувало 20 % рослин, а пендіметаліну – 6,7 %. Однак бенефін, як поліплоїдизуючий агент, був менш ефективним. Кількість поліплоїдних рослин у досліді з пендіметаліном і еталфлюраліном досягала 80 %. На відміну від пендіметаліну еталфлюралін був менш фітотоксичним. Токсичність трифлюраліну й оризаліну була практично однаковою, при цьому поліплоїдизуючий вплив трифлюраліну дещо вищий. У живильному середовищі найбільш ефективною концентрацією для всіх речовин динітроанілінового ряду виявилася 10 мкМ: регенерація мікропагонів коливалася в межах від 30,0 до 56,7 %, а кількість поліплоїдних рослин - від 27,3 до 50,0 %, залежно від гербіциду. Еталфлюралін, при досить низькій токсичності, був одним з найбільш ефективних.

Для визначення оптимальної концентрації динітроанілінових гербіцидів доцільно враховувати як поліплоїдизуючий ефект даних речовин, так і регенерацію рослин під дією різних концентрацій, що можна простежити при накладенні один на одного графіків, які відображають відсоток рослин, що регенерували, і відсоток отриманих поліплоїдних форм (рис. 1).

В результаті обробки динітроаніліновими гербіцидами отримано поліплоїдні форми N.transcaucasica з 2n=4x, 8x, 16x. Кількість химерних рослин була значно меншою, ніж у досліді з колхіцином, де більшість екземплярів були міксоплоїдними (що містять безладно перемішані групи клітин і окремі клітини з різним числом хромосом, тобто 2х, 4х, 8х, 16х, а іноді і вище). Залежно від гербіциду, використовуваного для обробки, число химерних рослин коливалося від 45 до 70 %.

В процесі досліджень вивчено поліплоїдизуючий ефект колхіцину, динітроанілінових гербіцидів і АПМ (фосфоротіоамідний гербіцид). Установлено, що динітроаніліни й АПМ ефективніші колхіцину і викликають поліплоїдизацію в концентраціях на кілька порядків нижче, ніж колхіцин.

Рис. 1. Співвідношення регенерації і виходу поліплоїдних рослин залежно від обробки динітроаніліновими гербіцидами (оптимальна концентрація гербіцидів у точці пересічення кривих).

Морфологічне, цитологічне і цитогенетичне вивчення форм рослин м’яти котячої, отриманих після обробки антимікротрубочковими агентами. В результаті проведених досліджень отримано поліплоїдні форми усіх досліджуваних генотипів м’яти котячої, що значно відрізнялися від контрольних рослин. У поліплоїдних рослин N. grandiflora (клон APM 5/6 (2n=16x=288)) довжина міжвузлів як мінімум у 2 рази перевищувала довжину міжвузлів контрольних, пагони були стовщені з чітко вираженими гранями, листя велике, яйцевидної форми, темно-зелене, а нижнє з яскраво вираженим червоно-коричневим забарвленням. Рослини N. grandiflora (клон ORY 30/1) мали пагони зміненої форми і відрізнялися високою здатністю до коренеутворення, що є важливим для субкультивування й адаптації рослин в in vivo. Листя поліплоїдних рослин стовщене, шкірясте, ламке, часто темно-зеленого кольору або дуже бліде, майже прозоре, увігнуте по центральній жилці. В порівнянні з контролем сильно змінювалося співвідношення довжини і ширини листової пластинки. Рослини N. grandiflora (клон ORY 30/2) відрізнялися формуванням різноякісних мікропагонів. При субкультивуванні дочірні рослини через 2-3 тижні також формували різноякісні пагони. Цитогенетичне вивчення клону показало, що представники його є міксоплоїдами, і містять групи клітин з 2n=4x, 8x і незначну кількість клітин з 16x. Клон ORY 120/5 даного виду відрізнявся від контрольних рослин оберненояйцевидною формою листових пластинок, сильним стовщенням стебел і дуже низькою укоріненістю.

У експериментально отриманих поліплоїдів усіх досліджуваних форм м’яти котячої довжина замикаючих клітин устячок була в 1,4-1,6 рази більша, ніж у диплоїдів, при цьому ширина їх збільшувалася незначно. У деяких поліплоїдних форм, як довжина, так і ширина замикаючих клітин устячок була в 2-2,5 рази більшою. Кількість хлоропластів устячок, що знаходяться в замикаючих клітинах, у поліплоїдних форм у 1,5-2,5 рази більша, ніж у диплоїдних рослин.

В процесі роботи було отримано форми N. transcaucasica (вихідне 2n = 2х = 18 хромосом), що містять 2n = 4x (36), 8x (72), 16x (144), N. grandiflora – з 2n = 4x (72), 8x (144), 16x (288), а також химерні рослини. Для гібридної форми (N. cataria x N. grandiflora) x N. transcaucasica (вихідне число хромосом 2n = x1 + x2 + x3 = 45) отримані поліплоїдні клони з 2n = 2(x1 + x2 + x3), 4(x1 + x2 + x3). Вони являють собою цінний селекційний матеріал, але потрібна тривала робота, щоб із знов одержаніх поліплоїдів вивести продуктивні сорти сільськогосподарських рослин.

Складено схеми створення селекційного матеріалу котовника з використанням поліплоїдії і міжвидової гібридизації.

Основні етапи одержання поліплоїдних рослин м’яти котячої (Nepeta sp.) з використанням антимікротрубочкових сполук в умовах in vitro. На підставі вивченої літератури і проведених експериментальних досліджень, у ході яких отримані дані, що розкривають синтез поліплоїдних рослин м’яти котячої (Nepeta sp.) з використанням антимікротрубочкових сполук в умовах in vitro, проаналізовано результати і підведено ряд підсумків.

Основні вимоги, що ставляться до форм рослин, які піддаються поліплоїдизації: рослини повинні бути дрібнохромосомними, дрібноклітинними, з малим числом хромосом. Як вихідний матеріал бажано використовувати молоді, слабко диференційовані тканини. Для цієї цілі найбільш придатними є ділянки пагонів з апікальними бруньками і латеральні (пазушні) бруньки.

Основною вимогою для успішного використання методу поліплоїдії в умовах in vitro є вірно підібраний склад живильних середовищ на всіх етапах культивування. Ефективність експериментальної поліплоїдії in vitro залежить від умов вирощування: інтенсивності освітлення, температури повітря і рН середовища.

Застосовувані поліплоїдизуючі агенти повинні володіти ефективною дією, яка чинить слабкий фітотоксичний вплив на експланти. Залежно від поставленого завдання дослідження, повинен бути обраний найбільш прийнятний спосіб обробки антимікротрубочковими сполуками в умовах in vitro.

Попереднє виділення поліплоїдів можливе за морфологічними ознаками, такими як габітус рослин, розміри і морфологічні особливості листя. Поряд з цим можуть бути також використані цитометричні, морфологічні й анатомічні ознаки будови листка. Розміри і будова устячкового апарату є універсальним критерієм. Найбільш точний метод визначення поліплоїдів – підрахунок числа хромосом у клітинах, що поділяються і знаходяться на стадії метафази.

Таким чином на підставі отриманих даних нами розроблено спосіб одержання поліплоїдних рослин м’яти котячої in vitro з використанням антимікротрубочкових сполук (рис.2).

Відбір вихідних видів і форм для поліплоїдії

Стерилізація рослинного матеріалу і уведення в культуру in vitro

Короткочасна попередня обробка (48 год) мікроживців м’яти котячої розчинами антимікротрубочкових речовин у рідких живильних середовищах | Тривала обробка (30 діб) мікроживців м’яти котячої на живильних середовищах, які містять антимікротрубочкові речовини

Культивування мікроживців м’яти котячої на живильному середовищі, яке не містить антимікротрубочкових речовин | Перенесення мікропагонів, одержаних в результаті обробки, на живильне середовище, яке не містить антимікротрубочкових речовин

Перенесення одержаних мікропагонів на живильне середовище для укорінення

Попередній відбір поліплоїдних форм за морфологічними і цитоморфологічними ознаками

Аналіз плоїдності отриманих після обробки клонів шляхом підрахунку хромосом у кінчиках коренів

Перенесення одержаних поліплоїдних форм до умов in vivo і їх адаптація

Рис. 2. Спосіб одержання поліплоїдних форм м’яти котячої з використанням антимікротрубочкових сполук в умовах in vitro

ВИСНОВКИ

1. Уперше вивчено можливі шляхи одержання поліплоїдних форм Nepeta sp. з використанням антимікротрубочкових сполук в умовах in vitro. Підтверджено, що фосфоротіоамідні і динітроанілінові гербіциди, як поліплоїдизуючі агенти, набагато ефективніші колхіцину.

2. Розроблено спосіб регенерації рослин м’яти котячої в умовах in vitro. Активна регенерація рослин відбувалася на живильних середовищах МС, що містять 2,28-3,42 мкМ зеатину і 0,49 мкМ ІМК. Визначено, що для субкультивування достатньо 1,14 мкМ зеатину. Ріст і розвиток мікропагонів м’яти котячої при субкультивуванні в меншій міріі залежали від гормонального складу живильного середовища. Найбільш важливим фактором, що впливає на регенерацію мікропагонів, був збалансований вміст основних макроелементів.

3. Встановлено оптимальні умови для проведення експерименту з поліплоїдизації м’яти котячої in vitro (інтенсивність освітлення, температура і рН середовища). Найбільш сприятливі для рослин N. transcaucasica – температура 22-240С, інтенсивність освітлення 4 клк, для N. cataria і N. grandiflora – 20-220С, 3 клк, для (N. cataria x N. grandiflora) x N. transcaucasica – 20-250C, 4 клк, відносна вологість повітря 75-85 %, рН живильного середовища 5,6-5,8.

4. Підтверджено високу поліплоїдизуючу активність фосфоротіоамідних і динітроанілінових гербіцидів. Показано, що негативний вплив динітроанілінів на рослини Nepeta sp. трохи нижчий, ніж АПМ. При цьому найбільш зручним і економічним способом обробки є культивування рослин м’яти котячої на середовищі, що містить антимікротрубочкові сполуки, протягом 2-3 тижнів. Тривала обробка мікроживців м’яти котячої низькими концентраціями даних антимікротрубочкових агентів дозволяє зменшити вихід химерних рослин із числа одержаних поліплоїдних форм.

5. Визначено оптимальні концентрації антимікротрубочкових сполук у рідкому живильному середовищі для попередньої обробки 60-120 мкМ, в агаризованому живильному середовищі для обробки в процесі культивування 10 мкМ.

6. Установлено, що при будь-яких способах обробки, як АПМ так і оризаліном, вихід поліплоїдних рослин (N. cataria x N. grandiflora) x N. transcaucasica (2n = x1 + x2 + x3 = 45 хромосом) був нижчим, ніж у інших досліджуваних форм м’яти котячої, при цьому більш високий показник у рослин N. transcaucasica (2n = 2x = 18 хромосом).

7. Показано, що попередній відбір поліплоїдних рослин, що культивуються в умовах in vitro, можливий за морфологічними і анатомічними ознаками (габітус рослин, розміри і морфологічні особливості листка). Розміри і будова устячкового апарату є універсальним критерієм для попереднього визначення поліплоїдів.

8. В процесі досліджень з експериментальної поліплоїдії вперше отримано поліплоїдні форми N. transcaucasica з 2n = 4x, 8x, 16х, N. grandiflora з 2n = 4x, 8х, 16x, (N. cataria x N.grandiflora) x N. transcaucasica, з 2n = 2(x1 + x2 + x3), 4(x1 + x2 + x3), а також безліч химерних рослин міксоплоїдного типу.

9. Вперше розроблено спосіб одержання поліплоїдних форм м’яти котячої в умовах in vitro з використанням антимікротрубочкових сполук для цілей селекції.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1.

2.

3.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Зильберварг И.Р., Митрофанова И.В., Емец А.И., Митрофанова О.В., Работягов В.Д., Блюм Я.Б. Динитроанилиновые гербициды: преимущества использования для полиплоидизации N. transcaucasica Grossh // Доповіді Національної академії наук України. – 2001. – 11. – С. 145-149.

2. Зильберварг И.Р., Митрофанова И.В., Емец А.И., Митрофанова О.В., Блюм Я.Б., Работягов В.Д. Полиплоидизация котовника in vitro // Бюл. Никит. ботан. сада. – 2001. -– Вып. 82. – С. 53-55.

3. Зильберварг И.Р. Использование динитроанилиновых и фосфоротиоамидных гербицидов в целях экспериментальной полиплоидии котовника в условиях in vitro // Ученые записки Таврического Национального университета им В.И.Вернадского. Сер. “Биология”. – 2001. – Т. 14 (53), № 1. – С. 79-83.

4. Зильберварг И.Р., Митрофанова И.В., Емец А.И., Митрофанова О.В., Работягов В.Д., член-корреспондент НАН Украины Блюм Я.Б. Использование оризалина и амипрофосметила для эффективной полиплоидии котовника (Nepeta sp.) // Доповіді Національної академії наук України. – 2001. – 3. – С. 169-174.

5. Zilbervarg I.R., Mitrofanova I.V., Mitrofanova O.V., Rabotygov V.D., Blume Ya.B. Using oryzalin and amiprophos-methyl obtaining issope and nep polyploid forms in vitro // Cell Biology International. – 1997. – 21, N 12. – P. 914-915.

6. Зільберварг І.Р. Експериментальна поліплоїдія котовника в умовах in vitro // Матеріали конференції молодих вчених-ботаніків України “Актуальні проблеми ботаніки та екології”. – Ніжин, 2001. – С. 87.

7. Zilbervarg I.R., Mitrofanova I.V., Yemets A.I., Mitrofanova O.V., Blume Ya.B. High effective producing of Nepeta polyploid forms with amiprophos-methyl and oryzalin // Materials of the 12-th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. Jour. Plant Physiology and Biochemistry. – 2000. – 38. – P. 37.

8. Зильберварг И.Р., Митрофанова И.В. особенности морфогенеза в культуре органов и тканей котовника и иссопа // Materials of the 7-th International Conference “International Meeting of Young Scientists in Horticulture”. – Lednice, Czech republic, 1999. – P. 263-267.

9. Mitrofanova I.V., Zilbervarg I.R., Mitrofanova O.V., Ivanova N.N., Rabotygov V.D., Blume Ya.B. Special features of micropropagation and obtainment of the new nep and issope selection forms in vitro // Materials of the II International Symposium on Plant Biotechnology. – Kyiv, Ukraine, 1998. – P. 158.

10. Митрофанова И.В., Иванова Н.Н., Работягов В.Д., Зильберварг И.Р., Шенфиш Н.Р.