НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

ЗАРИЦЬКА МАРИНА ВІКТОРІВНА

УДК 611.018.52-086.3+615.032-081.79

+616.155.25-091-076.4

БІОХІМІЧНІ ТА СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ ОСОБЛИВОСТІ КЛІТИН ЕРИТРОНУ ТА ТРОМБОЦИТІВ ПРИ ІНСУЛІНЗАЛЕЖНОМУ ЦУКРОВОМУ ДІАБЕТІ

03.00.04 – біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Великий Микола Миколайович, кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії, Національний медичний університет імені О.О.Богомольця

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Дмитренко Микола Петрович, завідувач лабораторії біохімії, Інститут екогігієни і токсикології імені Л.І. Медведя МОЗ України доктор біологічних наук, головний науковий співробітник Левицький Євгеній Леонідович, Інститут фармакології і токсикології АМН України

Провідна установа: Інститут ендокринології та обміну речовин імені В.П.Комісаренка АМН України, відділ патофізіології ендокринної системи

Захист відбудеться ” 23 ” вересня 2002 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеках Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна .

Автореферат розіслано 20 серпня 2002 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інсулінзалежний цукровий діабет (ІЗЦД) є поліфакторним метаболічно-аутоімунним захворюванням. Етіологія ІЗЦД зумовлюється генетичною схильністю, впливом b-цитотропних вірусів або b-цитотоксичних хімічних сполук, таких як стрептозотоцин, аллоксан. Аутоімунні процеси, які зумовлюють прогресуючу деструкцію b-клітин підшлункової залози, індукуються цитокінами та посилюються внутрішньоклітинними медіаторами, зокрема оксидом азоту (NO), супероксид-аніоном (O2.-) , перекисом водню (H2O2). Незалежно від природи діючого фактора, механізм пошкодження клітин є спільним. Провідна роль в деструкції клітин належить одноланцюговим розривам ДНК, які викликаються акумуляцією в клітинах активних кисневих радикалів, оксиду азоту або алкілюванням ДНК при дії стрептозотоцину [Okamoto H., 1995, Mendez J.D., 1994].

У патогенезі мікро- та макроангіопатій виключне значення надається тромбоцитам, які ініціюють процес тромбоутворення та розвиток основних форм ускладнень за умов даної хвороби. Функціональна активність тромбоцитів, тобто їх здатність до агрегації, визначається наявністю агрегуючих факторів, мікрооточенням, функціональною активністю рецепторів до агрегуючих агентів, швидкістю утворення внутрішньоклітинних медіаторів, таких як NO, O2.-, пероксинітрит (ONOO-).

NO є унікальною сигнальною молекулою, яка синтезується з L-аргініну за участю NO-синтази, виступає в якості внутрішньоклітинного та позаклітинного месенджера, нейротрансміттера та регулятора внутрішньоклітинної секреції. Тромбоцити містять два типи NO-синтаз: есNOS ІІІ (Са2+/ кальмодулінзалежна – ендотеліальна конститутивна) та іNOS ІІ (індуцибельна)[Chen LY., 1996].

У нормальних фізіологічних умовах конститутивна NO-синтаза проявляє постійну та відносно низьку активність, а при дії серотоніну, тромбіну, ADP та інших факторів, які стимулюють вхід Са2+ в клітину, її активність зростає. При цьому синтезується невелика кількість (пмоль) та виділяється на короткий період (декілька хвилин) оксид азоту, який виконує через cGMP в клітинах-мішенях регуляторну (сигнальну) функцію. Невелика кількість ONOO-, яка утворюється в результаті взаємодії NO і O2.-, зв'язуються внутрішньотромбоцитарним глутатіоном (GSH). В нормі тромбоцитарна iNOS II синтезується у невеликих кількостях[Mazzanti L., 1997].

При цукровому діабеті в тромбоцитах знижується активність ендотеліальної ecNOS та посилюється експресія іNOS ІІ, якій властива висока активність. NO взаємодіє з O2.-, який в значних кількостях утворюється при діабеті внаслідок ініціювання вільно-радикальних процесів. Продуктом такої взаємодії є пероксинітрит. Нагромадження цитотоксичних продуктів – NO, O2.-та ONOO- викликає порушення клітинних функцій та підвищену агрегацію тромбоцитів. Нез'ясованими залишаються механізми участі NO в активації агрегаційної функції тромбоцитів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського національного університету ім.. Івана Франка згідно з планом науково-дослідної роботи кафедри по темах: „Біохімічні дослідження патології цукрового діабету та розробка засобів попередження тканинної гіпоксії” (номер державної реєстрації 0194V022438) та Бх-14Б „Регуляторна дія НАД та гістидинвмісних дипептидів в корекції метаболічних порушень при гіпоксії різної етіології” (номер державної реєстрації 0100V001443).

Мета і задачі роботи. Метою даної роботи було охарактеризувати систему еритрону та дослідити механізми участі оксиду азоту в процесах агрегації тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті.

Згідно з метою були поставлені наступні завдання:

1. Виявити особливості протікання процесу агрегації тромбоцитів щурів при цукровому діабеті.

2. Використовуючи субстрат та специфічні інгібітори NO-синтази дослідити вплив оксиду азоту на процес агрегації тромбоцитів.

3. Дослідити роль білків цитоскелету та ультраструктурних елементів тромбоцитів в процесі агрегації.

4. Провести імуноцитохімічну детекцію індуцибельної NO-синтази в тромбоцитах людей, хворих на ІЗЦД.

5. Дослідити інтенсивність еритропоезу у щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

Об'єкт дослідження – периферична кров та кістковий мозок інтактних щурів та щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом, периферична кров здорових донорів та людей, хворих на ІЗЦД.

Предмет дослідження – функціональний стан системи еритрону та тромбоцитів, ферментативні системи утворення оксиду азоту (ендотеліальна конститутивна та індуцибельнa NO-синтази), процеси глікозилювання гемоглобіну, біохімічні механізми агрегації, ультраструктура тромбоцитів та її зміни в процесі агрегації тромбоцитів в нормі та при експериментальному стрептозотоциновому діабеті у щурів і у людей, хворих на інсулінзалежний цукровий діабет.

Методи дослідження – функціональний стан системи еритрону досліджували за змінами швидкості дозрівання та добової продукції ретикулоцитів, вмісту фетального (лужностійкого) гемоглобіну. Агрегаційну здатність тромбоцитів характеризували за змінами середнього радіусу агрегатів клітин, ступеня та часу агрегації. Продукцію оксиду азоту визначали за кількістю утворенних кінцевих продуктів метаболізму NO – нітритів та нітратів. Експресію індуцибельної NO–синтази оцінювали імуноцитохімічно з використанням моноклональних антитіл (іNOS IgG fraction of antiserum, Sigma 7782).

Наукова новизна одержаних результатів. Застосування сучасного методу дослідження агрегації тромбоцитів за декількома параметрами дозволило встановити, що тромбоцити в периферичній крові при ІЗЦД знаходяться в активованому стані та виявляють підвищену чутливість до дії агрегуючого агента - ADP.

Продемонстровано регуляторну роль оксиду азоту, що продукується ендотеліальною конститутивною NO-синтазою, в агрегації тромбоцитів. Введення контрольним тваринам субстрату NO-синтази - L-аргініну зумовило підвищення продукції оксиду азоту, рівень якого оцінювали за вмістом кінцевих продуктів його обміну - нітритів та нітратів в плазмі крові та зниженням ступеня агрегації тромбоцитів. Введення специфічних інгібіторів (L-NAME - Nw-nitro-L-arginine methyl ester та L-NMMA - Nw-nitro-monomethyl-L-arginine) ендотеліальної конститутивної NO-синтази значно зменшує продукцію оксиду азоту в тромбоцитах контрольних щурів та підвищує їх агрегаційну здатність.

У щурів із стрептозотоциновим діабетом вихідний рівень нітритів і нітратів був значно вищим, ніж у контрольних тварин. Введення L-аргініну не супроводжувалось подальшим зростанням продукції NO. Разом з тим, ступінь агрегації тромбоцитів був значно вищим, ніж в контролі, оскільки тромбоцити при ІЗЦД перебувають в активованому стані. Інгібітори есNOS зменшували продукцію оксиду азоту, але не змінювали ступінь агрегації кров'яних пластинок.

Отримані результати свідчать, що есNOS не є домінуючою в регуляції агрегаційної активності тромбоцитів при експериментальному стрептозотоциновому діабеті. Вперше показано, що високий рівень продукції оксиду азоту в тромбоцитах при стрептозотоциновому діабеті забезпечується активацією індуцибельної NO-синтази, значна експресія якої була продемонстрована імуноцитохімічно з використанням моноклональних антитіл до індуцибельної NO-синтази (іNOS IgG fraction of antiserum, Sigma 7782). іNOS збільшує продукцію вільних радикалів, зокрема супероксид-аніону О2.-, який взаємодіє з оксидом азоту з подальшим утворенням високореактивної, цитотоксичної сполуки - пероксинітриту.

Вперше показано, що в основі активації тромбоцитів лежать зміни їхньої ультраструктурної організації та кількісний перерозподіл фракцій білків цитоскелету. Процес активації тромбоцитів супроводжується зміною форми, появою числених псевдоподій, зменшенням електронної густини та загальної кількісті a-гранул. За умов інсулінзалежного цукрового діабету зміна функціонального стану тромбоцитів узалежнена перерозподілом вмісту білків цитоскелету кров'яних пластинок. Відмічено зміни у білкових спектрах в областях молекулярної маси 200 кДа (зона тяжких ланцюгів міозину); 55 кДа (зона тубулінових білків); 45 кДа (зона актину). Полоса, яка за маркерними білками нами була визначена зоною міозинових ланцюгів, краще виражена у лізатах кров'яних пластинок людей, хворих на діабет. Зворотня картина спостерігалася при аналізі фракцій з молекулярними масами 55 кДа та 45 кДа. Абсолютний вміст білка цих фракцій був вищий у здорових донорів.

Встановлено, що зміни в системі еритрону при цукровому діабеті виявляються в посиленні еритропоезу (зростає швидкість дозрівання та виходу ретикулоцитів з кісткового мозку в русло крові) та підвищенні вмісту фетального гемоглобіну, що є компенсаторною реакцією організму на розвиток тканинної гіпоксії за даної патології.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, отримані в процесі порівняльного аналізу дії субстрату та інгібіторів конститутивної ізоформи NO-синтази на агрегаційну функцію тромбоцитів контрольних щурів і щурів із стрептозотоциновим діабетом, дозволили суттєво розширити уявлення про механізми агрегації тромбоцитів та участь в цьому процесі оксиду азоту. Виявлені в роботі зміни вмісту глікозильованого та фетального гемоглобіну в еритроцитах щурів із стрептозотоциновим діабетом та у пацієнтів, хворих на ІЗЦД, є практично важливими для ранньої діагностики та клінічної оцінки компенсації діабету, відображення динаміки та прогнозу розвитку ускладнень цукрового діабету, зокрема, діабетичних ангіопатій.

Особистий внесок здобувача. В процесі виконання дисертації автор особисто відібрав і критично проаналізував весь обсяг вітчизняної та зарубіжної наукової літератури по темі проведених досліджень. Дисертантом розроблено програму вирішення поставлених завдань, схеми проведення експериментів, інтерпретовано отримані результати, підготовано до друку публікації. Здобувач особисто виконував експериментальну частину роботи. Електронно-мікроскопічні дослідження виконано в Міжфакультетській лабораторії електронної мікроскопії Львівського національного університету імені Івана Франка під керівництвом завідувача лабораторії, ст.н.сп., к.б.н. Кулачковського О.Р. Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником професором, д.б.н. Великим М.М. та доцентом кафедри біохімії к.б.н. Сибірною Н.О.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були представлені на ІІ курсах з молекулярної та клітинної ендокринології для аспірантів та молодих вчених (Турку, Фінляндія, 7-11 червня 1998 р.), на V Міжнародній конференції „Биоантиоксидант” (Москва, Росія, 18-20 листопада 1998 р.), на ІІІ курсах з молекулярної та клітинної ендокринології для аспірантів та молодих вчених (Мюнстер, Німеччина, 7-10 липня 1999 р.), на Міжнародній конференції “Свободно-радикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты” (Санкт-Петербург, Росія, 8-10 вересня 1999 р.), на науково-практичній конференції „Диабет-проблема общечеловеческая” (Дніпропетровськ, Україна, 1999р.), на ІV Міжнародному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, Україна, 11-13 травня 2000 р.), на ІV курсах з молекулярної та клітинної ендокринології для аспірантів та молодих вчених (Комо, Італія, 24-27 травня 2000 р.), на VІІІ Конгресі Світової Федерації Українських Лікарських Товариств (Трускавець-Львів, Україна, 13-17 серпня, 2000 р.), на ІІІ Парнасівській конференції (3rd Parnas Conference “Mechanisms of cellular signal transduction and communication”, Львів, 14-18 жовтня 2000 р.), на VI Всеукраїнському з'їзді ендокринологів (24-27 травня, Київ, 2001 р.), на V Європейському конгресі з ендокринології (5th European Congress of endocrinology, Турин, Італія, 9-13 червня 2001 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 статей та 8 тез доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 102 сторінках машинопису. Складається з вступу, огляду літератури, розділу, що характеризує матеріали і методи досліджень, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів та висновків. Список викорстаних джерел містить 167 джерел (92 вітчизняних і російськомовних та 75 англомовних). Дисертація ілюстрована 8 таблицями, 8 рисунками та 12 електронними фотографіями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для дослідження використовували кров здорових донорів та людей, хворих на інсулінзалежний цукровий діабет, ускладнений судинними ангіопатіями. Для дослідження корегуючого впливу оксиду азоту на агрегацію тромбоцитів у людей, хворих на інсулінзалежний цукровий діабет (ІЗЦД), дослідні зразки були поділені на дві групи. Перша група - це зразки, які безпосередньо використовувались для досліду, друга група - зразки, які попередньо інкубувалися з L-аргініном (кінцева концентрація 10 мкМ) 10 хвилин при 37 °С.

Паралельно проводили дослідження на щурах–самцях лінії Вістар масою 120-135 г. Експериментальний цукровий діабет викликали шляхом введення стрептозотоцину („Serva”) парентерально в дозі – 7 мг/100 г ваги тварин. Тварини були поділені на наступні групи: 1 – контрольна група тварин (К); 2 – контрольна група тварин, яким вводився L-аргінін per os у концентрації 1,25 г/л питної води (К + L- арг); 3 – контрольна група тварин, яким вводився L-NAME per os у концентрації 70 мг/л питної води ( К + L-NAME); 4 – контрольна група тварин, яким вводився L-NMMA per os у концентрації 70 мг/л питної води ( К + L-NMMA); 5 – тварини з стрептозотоциновим діабетом ( Д ); 6 - тварини з стрептозотоциновим діабетом, яким вводився L-аргінін per os у концентрації 1,25 г/л питної води (Д + L-арг); 7 – тварини з стрептозотоциновим діабетом, яким вводився L-NAME per os у концентрації 70 мг/л питної води (Д + L-NAME); 8 - тварини з стрептозотоциновим діабетом, яким вводився L-NMMA per os у концентрації 70 мг/л питної води (Д + L-NMMA). Тварини утримувались при кімнатній температурі та при 12-тигодинному режимі світла протягом двох тижнів. Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в крові, яку визначали глюкозооксидазним методом. Матеріалом для дослідження була периферична кров, яку одержували шляхом декапітації тварин, а також кістковий мозок із стегнових кісток піддослідних тварин.

Динамічний стан системи еритрона оцінювали за наступними показниками: кількість еритроцитів та ретикулоцитів, вміст загального гемоглобіну периферичної крові, а також його лужностійкої фракції, добова продукція та швидкість дозрівання ретикулоцитів. Визначення кількості ретикулоцитів та фетального гемоглобіну проводили за модифікованими нами методиками Гельмейєра та Зінгера, визначення швидкості дозрівання та добової продукції ретикулоцитів - за методикою Шустова.

Агрегацію тромбоцитів досліджували на лазерному аналізаторі “Біола” (НПФ, Росія), у якості індуктора агрегації використовували ADP (кінцева концентрація 5 мкМ).

Дослідження ультратонкої структури тромбоцитів проводились методом трансмісійної електронної мікроскопії на зрізах за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-100. Виділення, відмивання та фіксацію тромбоцитів проводили за методикою Васільєвої та Баркагана, стереологічний аналіз a-гранул та щільних тілець – за методикою Петрова. Для імуноцитохімічної детекції ізоформи іNOS II застосовували методику Слота у модифікації Кулачковського. Результати імуноцитохімічної детекції були оброблені морфометрично.

Дослідження впливу інгібіторів на активність NO-синтази тромбоцитів здорових донорів та людей, хворих на ІЗЦД, проводили за допомогою 10-хвилинної інкубації при 37°С з L-аргініном як з субстратом досліджуваного ферменту та з L-NAME (10mМ) i L-NMMA (10mМ), які є специфічними інгібіторами по відношенню до конститутивної ендотеліальної NO-синтази.

Індукцію синтезу іNOS II та зростання активності цього ферменту ми виявляли методами імуноцитохімії на електронному мікроскопі ПЕМ-100. Для дослідження змін ультратонкої структури кров'яних пластинок при ІЗЦД та виявлення залежності цих змін від активності різних ізоформ NO-синтази використовували кров здорових донорів та хворих на ІЗЦД.

Порівняльне дослідження білкових спектрів лізатів тромбоцитів здорових донорів та людей, хворих на інсулінзалежний цукровий діабет, проводили за допомогою електрофорезу білків лізатів тромбоцитів в поліакриламідному гелі (ПААГ) в блоках з градієнтом 5-18 % в буферній системі Леммлі.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив цукрового діабету на динамічний стан системи еритрону.

У серії дослідів по вивченню впливу цукрового діабету на червоний кров'яний росток експериментальний цукровий діабет викликали введенням стрептозотоцину, який є N-нітрозопохідним глюкозаміну і вибірково пошкоджує b-клітини острівців Лангерганса. У тварин з експериментальним цукровим діабетом кількість ретикулоцитів у периферичній крові збільшується у 1,6 раза, вміст фетального гемоглобіну зростає у 2,2 раза, швидкість дозрівання ретикулоцитів - майже в 2 рази, добова продукція збільшується у 1,2 рази. Підвищення вмісту ретикулоцитів у периферичній крові щурів при експериментальному діабеті порівняно з нормою свідчить про те, що зростає напруженість еритропоезу. Дослідження вмісту фетального гемоглобіну в еритроцитах контрольних та діабетичних щурів показали, що розвиток стрептозотоцинового діабету веде до підвищення вмісту лужностійкого гемоглобіну F. Такі зміни є компенсаторною реакцією системи еритрону на генералізовану тканинну гіпоксію, яка виникає внаслідок цукрового діабету.

Збільшення на 49 % вмісту в еритроцитах глікозильованого гемоглобіну (HbA1C), якому властива підвищена спорідненість до кисню, також є пристосувальною реакцією організму для створення своєрідного депо кисню.

Як видно з таблиці 3.1, рівень вмісту загального гемоглобіну при експериментальному діабеті неістотно відрізняється від норми. Це може свідчити про здатність клітин еритроїдного ряду синтезувати достатню кількість гемоглобіну навіть за умови дефіциту інсуліну. В процесі еволюції системи крові сформувалися механізми множинної регуляції еритропоезу, що забезпечують високу надійність функціонування системи еритрона.

Таблиця 3.1

Гематологічні показники периферичної крові щурів в нормі та при експериментальному цукровому діабеті ( М±m, n = 11 )

Показники Контроль ІЗЦД

Ретикулоцити,% 23.5±1.8 ­ 30.3±1.9*

Фетальний гемоглобін,% 13.3±0.9 ­ 21.4±0.9*

Загальний гемоглобін, г% 8.9±0.2 9.3±0.2

Швидкість дозрівання ретикулоцитів,% 10.7±1.2 ­ 15.3±0.5*

Добова продукція ретикулоцитів, тис. 131680±7000 ­ 145255±6000*

Кількість еритроцитів, млн/л 5.2±0.1 ­ 7.5±0.2*

Концентрація глікозильованого гемоглобіну HbA1c, % 4.86±0.1 ­ 7.24±0.2*

* - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05

Для підтвердження виявлених динамічних змін системи еритрону на клітинному рівні проводилися цитологічні дослідження препаратів кісткового мозку щурів у нормі та при експериментальному цукровому діабеті.

Аналізуючи показники таблиці 3.2, можна відмітити зниження процентного вмісту поліхроматофільних та оксифільних нормоцитів в кістковому мозку при стрептозотоциновому діабеті. Виявлені зміни в складі нормоцитів можна пояснити сповільненим дозріванням цих еритрокаріоцитів та швидкими темпами елімінації ретикулоцитів у русло крові. Отримані дані узгоджуються з підвищенням вмісту ретикулоцитів у периферичній крові щурів при експериментальному діабеті.

Таблиця 3.2

Морфологічний склад препаратів кісткового мозку щурів в нормі та при експериментальному стрептозотоциновому діабеті, (в %, М±m, n=11)

Показники контроль стрептозотоциновий діабет

Еритробласти 4,1±0,01 ­8,0±0,2

Пронормобласти 10,3±0,1 11,8±0,1

Нормоцити 1) базофільні 18,6±0,3 ­ 30,5±0,2

2) поліхроматофільні 51,6±0,5 Ї 38,6±0,2

3) оксифільні 16,1±0,04 Ї 9,3± 0,4

*- різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05

Продукція оксиду азоту і агрегація тромбоцитів.

Зміни агрегаційної здатності тромбоцитів при цукровому діабеті.

При цукровому діабеті змінюється функціональний стан тромбоцитів, що реєструвалося нами за підвищеною здатністю до агрегації (табл.3.3). З отрманих результатів бачимо, що тромбоцити хворих людей мають підвищену чутливість до дії агрегуючих агентів (ADP) порівняно з контрольною вибіркою. При ІЗЦД ступінь агрегації зростає майже в 2 рази та зменшується час агрегації – в 4 рази порівняно з такими показниками у здорових донорів. Це свідчить про підвищену агрегаційну здатність тромбоцитів за цих умов, що можна пояснити як посиленням чутливості рецепторів до агоністів, так і збільшеною концентрацією власне агоністів у плазмі крові. Зростання рівня зв'язування фібриногену з тромбоцитами при цукровому діабеті викликає зміну їх фізико-хімічних властивостей та сприяє посиленню адгезії кров'яних пластинок до ендотелію. Виявлені зміни спричиняють розвиток хронічних ускладнень, зокрема діабетичних ангіопатій.

Таблиця 3. 3

Агрегаційна здатність тромбоцитів в нормі та при ІЗЦД ( М±m, n=11)

Показники

Умови Ступінь агрегації тромбоцитів, у.о. Час агрегації, сек Кількість б-гранул Щільні тільця

Контроль 23.9±2.5* 220±20* 5.30±0.51* 2.10± 0.19*

Інсулінзалеж-ний цукровий діабет ­ 45.8±2.5* Ї 54±5* 2.30±0.36* 1.48± 0.08*

*- різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05

Дослідження впливу змін продукції оксиду азоту на агрегацію тромбоцитів.

Відомо, що утворення оксиду азоту відбувається в організмі при участі NO-синтази. Для дослідження впливу оксиду азоту на агрегаційну здатність тромбоцитів дослідним тваринам вводили L-аргінін, який є основним субстратом для ферменту NO-синтази.

Введення L-аргініну контрольним тваринам підвищує вміст кінцевих метаболітів оксиду азоту – нітритів (NO2 ) та нітратів (NO3)- у плазмі крові у 1,2 раза порівняно з контролем. Це є доказом активації конститутивної ендотеліальної NO – синтази і, як наслідок, збільшення продукції оксиду азоту. У результаті підвищеної продукції NO спостерігалося зниження агрегації тромбоцитів також у 1,2 рази (табл.3.4), збільщувався час агрегації у порівнянні з таким в контрольної групи тварин.

Метою введення структурних аналогів L-аргініну - L-NAME - Nw-nitro-L-arginine methyl ester та L-NMMA - Nw-nitro-monomethyl-L-arginine, які є специфічними інгібіторами ендотеліальної конститутивної NO-синтази, було блокування дії цього ферменту. Підтвердженням дії інгібіторів в контрольній групі тварин є достовірне зниження продукції оксиду азоту у порівнянні з контролем: для L-NAME – у 1,2 раза, для L-NMMA – 1,6 раза. Зниження вмісту оксиду азоту, який є дезагрегуючим агентом, призводило до зростання агрегації тромбоцитів в два рази у випадку застосування обох інгібіторів, скрочувався також і час агрегації.

Таблиця 3.4.

Зміни досліджуваних показників при введенні L –аргініну, L-NMMA та L-NAME in vivo в нормі ( М±m, n=11)

Показники

Умови NO2- + NO3- мM/л Ступінь агрегації, у.од. Час агрегації, сек. Рівень глюкози в крові, ммоль/л

Контроль 23.25±0.45 24.8±0.42 192.5±5 5.6±0.5

Контроль + аргінін ­27.42±0.5* 21.16±0.3* ­206.75±9* 5.8±0.6

Контроль + L-NAME Ї19.65±0.44* ­50.46±0.7* Ї51.2±4* ­9.96±0.7*

Контроль + L-NMMA Ї14.53±0.62* ­48.7±0.23* Ї48±3* 5.8±0.44

* - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05

При введенні L-аргініну тваринам із стрептозотоциновим діабетом вміст нітритів та нітратів зростає в 1,5 раза порівняно до такого у контрольних тварин і майже не змінювався у тварин без введення L-аргініну на фоні стрептозотоцинового діабету, незначно зменшувалась агрегація, час агрегації зростав в 1,4 раза (по відношенню до тварин із стрептозотоциновим діабетом без введення L-аргініну), зростав також рівень глюкози – в 1,6 раза (табл.3.5). Це, на нашу думку, свідчить не тільки про зменшення продукції регуляторного NO, а про зміну шляху його утилізації, а також про перерозподіл вкладу різних форм NO-синтази при стрептозотоциновому цукровому діабеті.

Як видно з табл.3.5, при застосуванні L-NAME та L-NMMA рівень кінцевих метаболітів оксиду азоту знижувався у порівнянні з таким при діабеті (відповідно в 2,5 та в 3 рази). Показник ступеня агрегації тромбоцитів залишається досить високим в усіх досліджуваних групах. Оксид азоту, який продукується за даних умов, не виконує регуляторну функцію.

За умов стрептозотоцинового діабету продукція оксиду азоту збільшується, але ступінь агрегації при цьому зростає порівняно з контролем.

Таблиця 3.5.

Зміни досліджуваних показників при введенні L –аргініну, L-NMMA та L-NAME in vivo при стрептозотоциновому діабеті ( М±m, n=11)

Показники

Умови NO2- + NO3- (мM/л) Ступінь агрегації, у.од. Час агрегації, сек. Рівень глюкози в крові, ммоль/л

Контроль 23.25±0.45 24.8±0.42 192.5±5 5.6±0.5

STZ ­32.6±0.6* ­61.7±1.5 Ї62.3±3.2 9.48±0.5

STZ + аргінін 29.3±0.44* 55.4±1.2 89.5±4.1 14.16±1.1

STZ + L-NAME 23.5±0.7* 58.2±0.9 49.8±2.2 12.2±0.4

STZ + L-NММА 20.7±0.6 59.5±1.1 43±2.1 11.9±.5

* - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05

Імуноцитохімічна детекція індуцибельної NO - синтази.

В результаті імуноцитохімічних досліджень, проведених на ультратонких зрізах за допомогою електронної мікроскопії, та після морфометричного аналізу ми можемо стверджувати, що при цукровому діабеті достовірно підвищується експресія високоактивної індуцибельної ізоформи NOS. Імуноцитохімічна детекція іNOS показала наявність чітко вираженої позитивної реакції в тромбоцитах на фоні цукрового діабету (темні зерна в цитоплазмі). В контрольних тромбоцитах позитивна реакція присутня в незначній мірі, що підтверджує наявність іNOS в тромбоцитах в нормі в дуже невеликій кількості.

Дослідження білкових спектрів лізатів тромбоцитів здорових донорів та людей хворих на інсулінзалежний цукровий діабет.

Після обробки електрофореграм було відмічено зміни у білкових спектрах в областях молекулярної маси 200 кДа (зона тяжких ланцюгів міозину); 55 кДа (зона тубулінових білків); 45 кДа (зона актину). Полоса, яка за маркерними білками нами була визначена зоною міозинових ланцюгів, краще виражена у лізатах кров'яних пластинок людей, хворих на діабет. Зворотня картина спостерігалася при аналізі фракцій з молекулярними масами 55 кДа та 45 кДа. Абсолютний вміст білку цих фракцій був вищий у здорових донорів. У таблиці 3.6 наведено дані статистичної обробки змін білкових спектрів лізатів досліджуваних клітин по окремих фракціях. Отже, в результаті проведених досліджень нами вперше було показано, що за умов інсулінзалежного цукрового діабету зміна функціонального стану тромбоцитів узалежнена перерозподілом вмісту фракцій білків цитоскелету кров'яних пластинок.

Таблиця 3.6.

Перерозподіл вмісту окремих білкових фракцій лізатів тромбоцитів людей за умов інсулінзалежного цукрового діабету.

Показники Умови Вміст білкових фракцій у %

Мол. маса 200 кДа Мол. маса 55 кДа Мол.маса 45 кДа

Контроль 100 100 100

ІЗЦД 124,5±2,3* 66,6±0,7* 80,7±0,3*

* різниця вірогідна у порівнянні з контролем, р<0.05

Ультраструктурні зміни кров'яних пластинок при інсулінзалежному цукровму діабеті.

Нами була досліджена ультраструктура тромбоцитів людей за умов інсулінзалежного цукрового діабету. При порівнянні мікроелектронограм здорових і хворих людей слід відмітити, що тромбоцити, виділені з крові хворих людей, мають характерні ознаки активації та деградації. Процес супроводжується втратою тромбоцитами дискоїдної форми, утворенням чисельних псевдоподій. В самих клітинах відбувається зменшення електронної густини a-гранул. Вони переміщаються до центру клітини, втрачають мембрану та зливаються з вакуолями ПВС (поверхнево-вакуолярна система – система трубочок та мікрофіламентів для виведення вмісту a–гранул у цитозоль та міжклітинний простір), де їхній вміст секретується у міжклітинний простір. Зниження електронної густини a-гранул свідчить про порушення депонування серотоніну, іонів Са2+ та ADP та ін. внаслідок виведення цих сполук назовні. Поряд із зменшенням кількості a-гранул та щільних тілець спостерігається поява чисельних аутофагосом, що свідчить про процеси гідролітичного розщеплення вмісту цитоплазми. Збільшення кількості цих органел говорить про аутофагальне переродження цитоплазми, яке призводить до порушення функціонування тромбоцитів.

Таблиця 3.7.

Ультраструктурні зміни кров'яних пластинок при ІЗЦД

Умови Кількість б-гранул (на 1зріз тромбоцита) Щільні тільця

Контроль 5.30±0.513* 2.10± 0.190*

Інсулінзалежний цукровий діабет 2.30±0.360* 1.48± 0.08*

* - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05

ВИСНОВКИ

1. Експериментальний стрептозотоциновий діабет у щурів та інсулінзалежний цукровий діабет у людей характеризується посиленням еритропоезу та зростанням агрегаційної здатності тромбоцитів. В основі механізму активації тромбоцитів та зростання їх агрегаційної здатності лежить підвищене утворення оксиду азоту, супероксид-аніону та пероксинітриту, які викликають суттєві зміни функціонального стану тромбоцитів. Змінюється білковий склад цитоскелету та ультраструктура кров'яних пластинок. В роботі показано регуляторну роль оксиду азоту, продукованого конститутивною NO-синтазою в регуляції метаболізму тромбоцитів в нормі. При цукровому діабеті активність есNOS III знижується, в той же час експресується високоактивна іNOS II, що викликає порушення функціонування та структури тромбоцитів.

2. Встановлено, що тромбоцити щурів з експериментальним цукровим діабетом характеризуються підвищеною агрегаційною здатністю (скорочується час агрегації та зростає ступінь агрегації).

3. Методом імуноцитохімічної детекції з застосуванням специфічних моноклональниї антитіл вперше виявлено підвищену експресію іNOS в тромбоцитах людей, хворих на інсулінзалежний цукровий діабет.

4. Показано, що активація тромбоцитів при цукровому діабеті супроводжується змінами в ультраструктурній організації тромбоцитів: змінюється форма клітин, з'являються чисельні псевдоподії, зменшується електронна густина a-гранул та їх кількість, а також змінами білкового складу цитоскелету: зростає фракція білків, які відповідають за молекулярною масою міозину і зменшується фракція, що відповідає актиновим та тубуліновим білкам.

5. В модельних експериментах з використанням субстрату та інгібіторів ендотеліальної конститутивної NO-синтази продемонстровано, що у контрольних тварин введення L-аргініну – субстрату есNOS посилює утворення NO (вміст NO2- та NO3- зростає на 18%) і зменшує агрегаційну активність тромбоцитів. Введення інгібіторів ес NOS – L-NAME і L-NMMA викликає зменшення утворення NO (зменшується кількість NO2- та NO3- на 16 та 38 % відповідно) і посилює агрегаційну здатність тромбоцитів.

6. У щурів з стрептозотоциновим діабетом, які мають високий вихідний рівень NO2- та NO3- , введення L-аргініну не підвищує продукцію NO, а введення інгібіторів хоча й зменшує продукцію NO, але не змінює ступінь агрегації тромбоцитів. Вміст нітритів та нітратів, які характеризують продукцію NO, зростає в плазмі крові на 40%.

7. Встановлено, що посилення еритропоезу при інсулінзалежному цукровому діабеті, яке супроводжувалось зростанням кількості, швидкості дозрівання та добової продукції ретикулоцитів, що забезпечується прискоренням елімінації поліхроматофільних нормоцитів із кісткового мозку, а також зростанням вмісту фетального гемоглобіну є компенсаторною реакцією на розвиток тканинної гіпоксії за умов досліджуваної патології.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Махневич Т.Р., Дробот Л.Б., Великий М.М., Урбанович А.М., Токарєва Л.В. (Зарицька М.В.), Сергієнко О.О. Агрегаційна та антиоксидантна активність тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті// Експ. та клін.фіз. і біох., 1998, №3-4(3).- С.85-91.

2. Токарєва Л.В. (Зарицька М.В.), Сибірна Н.А., Великий М.М., Коробов В.М. Вплив карнозину на проліферативну активність клітин еритрона//Експ. та клін. фізіол. і біох., 1999, №2(6).- С.15-18.

3. Токарєва Л.В. (Зарицька М.В.), Сибірна Н.О., Великий М.М. Вплив L-аргініну на агрегаційну функцію тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті// Наук.вісн. ЛДАВМ ім.Гжицького, 2000, т.2(№2), ч.2.- С.244-248.

4. Великий М.М., Козицький З.Я., Токарєва Л.В. (Зарицька М.В.), та ін. Антисорбітолові препарати в корекції метаболічних порушень при експериментальному стрептозотоциновому діабеті// Наук.вісн. ЛДАВМ ім.Гжицького, 2000, т.2(№2), ч.2.- С.17-20.

5. Токарєва Л.В. (Зарицька М.В.), Сибірна Н.О., Кулачковський О.Р., Великий М.М. Вплив NO на агрегаційну функцію тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті. Морфофункціональні зміни кров'яних пластинок// Вісн.Львів.універ. Серія біологічна. 2000, вип.26.- С.15-20.

6. Токарєва Л.В. (Зарицька М.В.), Сибірна Н.О., Великий М.М., Романишин Я.М. Дослідження системи еритрону за умов гіпоксії різної етіології// Лаб. діагн. 2000, №4.- С.36- 39.

7. Токарєва Л.В. (Зарицька М.В.), Сибірна Н.О., Великий М.М. Участь різних ізоформ NO-синтази в регуляції метаболізму оксиду азоту при стрептозотоциновому діабеті// Лаб. діаг., 2001, №4.- С.22-25.

8. Токарєва Л. (Зарицька М.), Сибірна Н.. Дослідження функціонального стану цитоскелету тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті// Вісн.Львів.універ. Серія біологічна. 2002, №28.- С. 41-46.

9. Токарєва Л.(Зарицька М.В.), Сибірна Н. Зміна активності NO-синтази тромбоцитів людей хворих на інсулінзалежний цукровий діабет// Вісн.Львів.універ. Серія біологічна. 2002, №28.- С.47-50.

10. Зарицька М.В., Сибірна Н.О., Кулачковський О.Р., Великий М.М., Плешанів Є.В. Дослідження ультраструктури тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті// Експ. та клін. фіз. і біохім., 2002, №2.- С.23- 30.

11. Крысько О.М., Сибирная Н.А., Климишин Н.И., Коробов В.Н., Токарева Л.В. (Зарицкая М.В.), Федорович А.Н. Антиокислительная и эритропоэтинстимулирующая роль карнозина в условиях гипоксического стресса// Тези доп. V міжнар. конф. „Биоантиоксидант”, Москва, Росія, 18-20 листопада 1998.- С.142-143.

12. Токарева Л.В. (Зарицкая М.В.), Великий Н.Н., Коробов В.Н. и др. Антигипоксический эффект комплекса карнозина с цинком// Тези доп. та повідомлень міжнар. конф. “Свободно-радикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты”, Санкт-Петербург, Росія, 8-10 вересня 1999. – С.829.

13. Токарєва Л.В. (Зарицька М.В.), Махневич Т.Р., Великий М.М. Агрегаційна та антиоксидантна активність тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті, вплив нікотинаміду// Тези доп. наук.-прак. конф. „Диабет-проблема общечеловеческая”, Дніпропетровськ, Україна, 1999, вип.4.- С.82-84.

14. Токарєва Л.В. (Зарицька М.В.) Динамічний стан системи еритрона при гіпоксіях різної етіології// Тези доп. на ІV Міжнар.конгресі студентів і молодих вчених, Тернопіль, Україна, 11-13 травня 2000.- С.333-334.

15. Токарєва Л.В. (Зарицька М.В.), Сибірна Н.О., Кулачковський О.Р., Великий М.М. Корегуючий вплив NO на агрегаційну функцію тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті// Тези доп. на VІІІ Конгр. СФУЛТ, Трускавець-Львів, Україна, 13-17 серпня, 2000.- С.272.

16. Veliky M., Machnevych T., Tоkareva L. (Zaryts'ka M.) Possible mechanisms of в- cells destruction in IDDM: influence of nicotinamide// Abstract. 3rd Parnas Conference “Mechanisms of cellular signal transduction and communication”, October 14-18, 2000, Lviv.- P.53.

17. Токарєва Л.В. (Зарицька М.В.), Сибірна Н.О., Великий М.М. Роль NO-синтази в регуляції функціонального стану тромбоцитів при стрептозотоциновому цукровому діабеті// Ендокринологія, 2001, т.6 (дод.).- С.300.

18. L.Tokareva (M.Zaryts'ka), N.Sybirna, A.Kulachkovsky. Biosystem: L-arginine/ nitric oxide in platelets of streptozotocin diabetic rats//Abstract, 5th European Congress of endocrinology, 9-13 June 2001, Turin, Italy.- P.328.

АНОТАЦІЯ

Зарицька М.В. Біохімічні та структурно-функціональні особливості клітин еритрону та тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – Біохімія. – Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України. Київ, 2002.

У дисертаційній роботі представлені результати по дослідженню біохімічних процесів, що лежать в основі активації тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті, а саме участі різних ізоформ NO-синтази в утворенні внутрішньоклітинного медіатора – оксиду азоту. Використання субстрату NO-синтази – L-аргініну та специфічних інгібіторів ендотеліальної конститутивної NO-синтази (L-NAME - Nw-nitro-L-arginine methyl ester та L-NMMA - Nw-nitro-monomethyl-L-arginine ) дозволило продемонструвати регуляторну роль оксиду азоту в агрегації тромбоцитів контрольних тварин.

В дисертації вперше показано, що високий рівень продукції оксиду азоту в тромбоцитах при стрептозотоциновому діабеті забезпечується активацією індуцибельної NO-синтази, значна експресія якої була продемонстрована імуноцитохімічно з використанням моноклональних антитіл до індуцибельної NO-синтази (іNOS ІІ IgG fraction of antiserum, Sigma 7782). Експресія іNOS ІІ викликає посилення продукції вільних радикалів, зокрема супероксид-аніону О2.-, який взаємодіє з оксидом азоту з подальшим утворенням пероксинітриту (ОNOO-).

Встановлено, що в основі активації тромбоцитів лежать зміни їхньої ультраструктурної організації та перерозподіл білків цитоскелету. Процес активації тромбоцитів супроводжується зміною форми, появою численних псевдоподій, зменшенням електронної густини та загальної кількості a-гранул. Показано, що при цукровому діабеті зміна функціонального стану тромбоцитів узалежнена перерозподілом вмісту фракцій білків цитоскелету кров'яних пластинок.

Виявлено зміни вмісту глікозильованого та фетального гемоглобіну в еритроцитах щурів із стрептозотоциновим діабетом та у пацієнтів, хворих на ІЗЦД, що є практично важливим для ранньої діагностики та клінічної оцінки компенсації діабету, відображення динаміки та прогнозу розвитку ускладнень при цукровому діабеті, зокрема, діабетичних ангіопатій.

Ключові слова: цукровий діабет, агрегація тромбоцитів, оксид азоту, L-NAME, L-NMMA, ecNOS- ендотеліальна конститутивна NO-синтаза, iNOS- індуцибельна NO-синтаза, ультраструктура тромбоцитів, еритрон, еритропоез, фетальний гемоглобін, глікозильований гемоглобін, ретикулоцити.

АННОТАЦИЯ

Зарицкая М.В. Биохимические и структурно-функциональные особенности клеток эритрона и тромбоцитов при инсулинзависимом сахарном диабете. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – Биохимия. – Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины. Киев, 2002.

В диссертационной работе представлены результаты по исследованию биохимических процесов, лежащих в основе активации тромбоцитов при инсулинзависимом сахарином диабете, а именно участия различных изоформ NO-синтазы в образовании внутриклеточного медиатора – оксида азота. Применение субстрата NO-синтазы – L-аргинина и специфических ингибиторов эндотелиальной конститутивной NO-синтазы (L-NAME - Nw-nitro-L-arginine methyl ester та L-NMMA - Nw-nitro-monomethyl-L-arginine ) позволило продемонстрировать регуляторную роль оксида азота в агрегации тромбоцитов контрольных животных.

В диссертации впервые показано, что высокий уровень продукции оксида азота в тромбоцитах при стрептозотоциновом диабете обеспечивается активацией индуцибельной NO-синтазы, значительная экспрессия которой была выявлена иммуноцитохимически с использованием специфических моноклональных антител к индуцибельной NO-синтазе (іNOS ІІ IgG fraction of antiserum, Sigma 7782). Повышение активности эндотелиальной конститутивной NO-синтазы приводит к синтезу небольших количеств (пмоль) и выделению на короткое время (несколько минут) оксида азота, выполняющего через цГМФ в клетках-мишенях сугубо регуляторные (сигнальные) функции. При сахарном диабете происходит экспрессия гена, ответственного за синтез индуцибельной NO-синтазы, в результате чего на протяжении нескольких часов и в больших количествах продуцируется оксид азота. В результате усиленной генерации NO может проявлять цитотоксические и деструктивные свойства по отношению к клеткам, в которых он синтезируется. Экспрессия іNOS ІІ вызывает повышение продукции свободных радикалов, в частности супероксид-аниона О2.-, который реагирует с оксидом азота с последующим образованием пероксинитрита (ОNOO-). В то же время, в тромбоцитах в условиях исследуемой патологии нарушается синтез GSH, который способен связывать избыточные количества пероксинитрита.

С помощью электронной микроскопии установлено, что в основе активации тромбоцитов лежат изменения их ультраструктурной организации. Процесс активации тромбоцитов сопровождается изменением их формы, образованием псевдоподий, уменьшением электронной плотности и общего количества a-гранул. Показано, что возрастание аггрегационной активности тромбоцитов при сахарном диабете связано с изменением соотношения белков цитоскелета кровяных пластинок.

Показано усиление эритропоэза, которое проявляется в увеличении количества эритроцитов, количества, скорости созревания и суточной продукции ретикулоцитов, а также в уменьшении количества полихроматофильных нормоцитов в костном мозге. При длительном течении заболевания такие изменения приводят к истощению эритрона и, как следствие, к развитию анемии.

Выявлено увеличение уровня гликозилированного и фетального гемоглобина в периферической крови крыс со стрептозотоциновым диабетом и у больных ИЗЦД, что является практически важным для ранней диагностики и клинической оценки компенсации диабета, отражения динамики и прогноза осложнений при сахарном диабете, в частности, диабетических ангиопатий.

Ключевые слова: сахарный диабет, агрегация тромбоцитов, оксид азота, L-NAME, L-NMMA, ecNOS- ендотелиальная конститутивная NO-синтаза, iNOS- индуцибельная NO-синтаза, ультраструктура тромбоцитов, эритрон, эритропоез, фетальный гемоглобин, гликозилированный гемоглобин, ретикулоциты.

SUMMARY

Zaritskaya M.V. The biochemical and structurally functional features of erythron cells and platelets in insulin-dependent diabetes mellitus. - Manuscript.

Dissertation for the scientific degree of “Candidate of Biological Sciences” in speciality 03.00.04 - Biochemistry. – Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences, Ukraine. Kyiv, 2002.

The results of the research of biochemical processes of platelet activation in insulin dependent diabetes mellitus are presented in thesis. The application of a substratum NO synthatase - L-arginine and particular inhibitors of ecNOS III (L-NAME - Nw-nitro-L-arginine methyl ester and L-NMMA - Nw-nitro-monomethyl-L-arginine) has allowed