національна АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ мікробіологіЇ і вірусології ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

зубкова наталія леонідівна

УДК 351.774:616-097:578.835.15.

ПОСТВАКЦИНАЛЬНІ ВІРУСНЕЙТРАЛІЗУЮЧІ АНТИТІЛА

ДО ПОЛІОВІРУСІВ ТРЬОХ ТИПІВ ТА ЧИННИКИ, ЩО ВПЛИВАЮТЬ НА ЇХ РІВНІ

03.00.06 – вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В. Громашевського АМН України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Задорожна Вікторія Іванівна,

Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В. Громашевського АМН України,

завідувач лабораторії поліомієліту та інших

ентеровірусних інфекцій

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент

НАН України

Дяченко Наталія Сергіївна,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН

України, завідувач відділу молекулярної біології вірусів

доктор медичних наук, професор

Дзюблик Ірина Володимирівна,

Київська медична академія післядипломної освіти

ім. П.Л.Шупика МОЗ України, завідувач лабораторії

вірусології

Провідна організація: Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечнікова

АМН України, м. Харків

Захист відбудеться " 16 " жовтня 2002р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.233.01 при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології

ім.Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий " 12 " вересня 2002р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Л.М.Пуріш

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Віруснейтралізуючі антитіла до поліовірусів трьох типів – основний показник специфічного гуморального імунітету проти поліомієліту. Визначення їх рівнів дозволяє оцінювати стан специфічного імунітету різних груп населення, визначати ступінь індивідуальної захищеності організму, виявляти групи ризику щодо поліовірусної інфекції, розробляти схеми імунізації Календаря щеплень, адаптовані до певної популяції населення. У сучасних умовах оральна поліомієлітна вакцина (ОПВ) є основним фактором, який впливає на виробку імунітету проти поліомієліту. Завдяки її застосуванню в розвинутих країнах з 50-х років ХХ сторіччя було ліквідовано епідемію поліомієліту і зведено захворюваність до поодиноких випадків.

Однак, незважаючи на очевидні досягнення у вирішенні проблеми поліовірусної інфекції, до теперішнього часу залишається цілий ряд нез'ясованих питань.

Вакцинні віруси здатні тривалий строк зберігатися поза організмом людини та розповсюджуватися через об’єкти довкілля. Зазначене повинно обумовлювати підвищення рівнів специфічного популяційного імунітету і витіснення з циркуляції неполіомієлітних ентеровірусів. Крім того, вакцинні віруси забезпечують виробку не тільки гуморального, але й локального імунітету, викликаючи стан резистентності клітин кишечнику, і тим самим обмежують розповсюдження “диких” поліовірусів. З іншого боку, наявність секреторних антитіл заважає в подальшому приживленню вакцинних поліовірусів, що відбивається на ефективності ревакцинацій ОПВ.

Незважаючи на досить високий відсоток охоплення щепленнями ОПВ дитячого населення (понад 90%) у багатьох країнах, стан специфічного імунітету залишається незадовільним, особливо до поліовірусу типу 3. Негативний вплив природних і соціальних факторів, відчутний у сучасний період в Україні, обумовлює збільшення кількості осіб із хронічною патологією та порушеннями адаптивних можливостей організму, що є однією з причин неспроможності до формування повноцінної імунної відповіді на щеплення ОПВ. Зміни у мікробіоценозі кишечнику, що супроводжуються дисбіозом різного ступеня, при багатьох як інфекційних, так і неінфекційних захворюваннях, та внаслідок безконтрольного прийому антибактеріальних і хіміотерапевтичних препаратів, стає все більш розповсюдженою патологією. У таких осіб за рахунок імунізації не завжди можливо досягти повноцінної протективної відповіді. Виникає необхідність оцінки можливості сумісного використання вакцинних препаратів та імунотропних лікарських засобів.

До кінця нез’ясованим залишається питання низької імуногенності вакцинних поліовірусів типів 1 та 3 у порівнянні з типом 2. В останні роки все більше уваги приділяється феномену мімікрії між пептидами бактерій, вірусів та іншими біологічними структурами. Показана можливість вуглеводовміщуючого біополімеру – нейрамініну, отриманого з мікроорганізмів, впливати як на репродукцію вірусів грипу, так і проявляти адьювантні властивості при імунізації грипозними вакцинами. Вплив нейрамінінів на репродукцію поліовірусів та на процес антитілоутворення при імунізації ОПВ не вивчався.

Таким чином, незважаючи на успіхи в боротьбі з поліомієлітом, існує широке коло невирішених питань, які стосуються підвищення ефективності його імунопрофілактики. Прагнення заповнити існуючі прогалини у цій проблемі стало за основу для проведення даних досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідних робіт лабораторії поліомієліту та іших ентеровірусних інфекцій Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України:

-

-

Мета роботи - вивчити в експерименті вплив деяких чинників на утворення віруснейтралізуючих антитіл до вакцинних поліовірусів та визначити методи корекції їх рівнів.

Для реалізації вказаної мети були поставлені такі задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

Об'єкт дослідження: поствакцинальна імунна відповідь до поліовірусів трьох типів.

Предмет дослідження: віруснейтралізуючі антитіла до поліовірусів трьох типів, поліовіруси, ентеровіруси, продукт "Лактовіт білковий", що містить живі мікроорганізми, імуномодулятори, вуглеводовміщуючий біополімер.

Методи дослідження: вірусологічні, серологічні, мікробіологічні, епідеміологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше доведено залежність між станом мікробіоценозу кишечнику щеплених та формуванням гуморальної імунної відповіді до поліовірусів. Надано оцінку стану поствакцинального імунітету проти поліомієліту дітей з дисбіозом. Отримані в роботі дані щодо впливу нейрамініну можуть бути використані для подальшого розкриття механізмів інфекційного процесу при поліомієліті, що обумовлюють поліморфізм клінічних проявів цієї інфекції. Оцінено вплив інтерферуючої активності ентеровірусів на імунну відповідь до поліовірусів трьох типів. Вивчено доцільність використання імуномодуляторів та препаратів, що містять живі мікроорганізми, з метою корекції поствакцинального імунітету проти поліомієліту.

Практичне значення одержаних результатів. Доведено необхідність урахування сезонної активації циркуляції ентеровірусів при плануванні заходів масової імунізації ОПВ. Установлено низьку ефективність імунізації ОПВ щодо поліовірусу типів 1 і 3 у дітей з дисбіозом та недоцільність проведення щеплень оральними вакцинами на фоні застосування препаратів, що містять живі мікроорганізми. Визначено позитивний вплив на поствакцинальну імунну відповідь до поліовірусів трьох типів імуномодулюючих засобів (метилурацилу та дибазолу). Показана можливість застосування нейрамініну для підвищення ефективності виділення поліовірусів та отримання гіперімунних специфічних сироваток, що можна застосовувати як при діагностиці поліовірусної інфекції, так і при моніторингу циркуляції поліовірусів.

Отримані дані увійшли до наказів МОЗ України № 196 від 14.07.98 р. "Про посилення заходів щодо попередження захворювань на поліомієліт", "Плану основних заходів, направлених на ліквідацію поліомієліту на території України до 2000р." (від 15.04.1998 р.); "Оперативного плану дій щодо ліквідації поліомієліту та удосконалення нагляду за ГВП на 1998-1999рр.” (від 11.06.98р.), "Оперативного плану заходів при завізних випадках поліомієліту, виділенні "диких" поліовірусів від людей та з об’єктів довкілля" (2000р.).

Результати роботи було використано при підготовці матеріалів до Субрегіональної наради по епіднагляду за ГВП/поліомієлітом і питанням організації лабораторної мережі (Санкт-Петербург, Російська Федерація, 28-30 липня 1999р.), Апаратної наради "Про сертифікацію України як території вільної від поліомієліту" (жовтень, 2000).

Особистий внесок автора. Основні експериментальні дані щодо вивчення впливу циркуляції неполіомієлітних ентеровірусів на поствакцинальну імунну відповідь, поствакцинальної імунної відповіді при дисбіозі, доцільності застосування імуномодуляторів та препарату, що містить живі мікроорганізми, з метою корекції імунної відповіді, впливу вуглеводовміщуючих біополімерів на інфекційний титр поліовірусів трьох типів та утворення віруснейтралізуючих антитіл до них автором одержано особисто. Крім того, узагальнено первинну документацію та здійснено аналіз рівнів віруснейтралізуючих антитіл до поліовірусів трьох типів дітей та підлітків Київської області, аналіз циркуляції ентеровірусів в об’єктах довкілля у Київській області та в цілому по Україні.

Самостійно здійснено узагальнення матеріалу, статистичну обробку отри-маних даних, інтерпретацію результатів, сформульовано висновки. Здобувач брав безпосередню участь у підготовці наказів МОЗ України та інших нормативних актів. Особистий внесок автора при підготовці матеріалів до опублікування становить значну частину.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи було висвітлено на І Міжнародній науково-практичній конференції "Проблеми гігієни та епідеміології на залізничному транспорті" (Львів, 1998), ІІ міжнародній конференції "Біоресурси та віруси" (Київ, 1998), II Міжнародній конференції "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (Санкт-Петербург, 1998), науковій конференції, присвяченій 90-літтю від дня народження М.П.Чумакова "Актуальные проблемы медицинской вирусологии" (Москва, 1999), Х з'їзді педіатрів України (Київ, 1999), на пленумі УНМТ МЕП ім. Д.К.Заболотного: Наукові та практичні аспекти боротьби з інфекціями в Україні на межі сторіч (Київ, 2000), ІІ (ІХ) Установчому з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000), науково-практичній конференції "Проблемні питання лікування дітей" (Київ, 2001), нараді-семінарі з актуальних питань роботи епідеміологічних відділів і вірусологічних лабораторій установ державної санепідслужби МОЗ України (Дніпропетровськ, 2002).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 9 наукових праць, з них 3 – у фахових виданнях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, 6 розділів власних досліджень, узагальнення отриманих результатів, висновків та списку використаних джерел, викладена на 149 сторінках, ілюстрована 12 рисунками і 21 таблицею. Список використаної літератури включає 278 джерел (127 вітчизняних та країн СНД та 151 зарубіжних).

Автор засвідчує глибоку повагу та щиру вдячність д.мед.н. С.Л.Рибалко та співробітникам лабораторії поліомієліту та інших ентеровірусних інфекцій Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України за підтримку та сприяння у виконанні роботи.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об’єкти та методи досліджень. Віруси. При дослідженнях використано вакцинні поліовіруси типів 1 (LSc 2ab), 2 (P712 CH 2ab), 3 (Leon 12a1b) – еталонні штами, отримані з Референс-центру з діагностики поліомієліту (Росія, Москва). ЕСНО-30 – штам №1089, виділений із фекалій хворого на серозний менінгіт. Вірус отримано з Київської міської СЕС. Вірус Коксакі В-5 – штам №26, виділений із фекалій здорової дитини (Київська область).

Нейрамініни Staphilococcus aureus №392 та Acholeplasma laidlawii, люб'язно надані д.мед.н. С.Л.Рибалко.

Культури мікроорганізмів. Добові культури Lactobacillus acidophilus (штами №№ 3105 і 3107), Streptococcus salivarius ssp. thermophilus (штам №2137), Bifidobacterium longum (штам №4201), люб'язно надані к.б.н. Н.Ф.Кігель з колекції лабораторії біотехнології Технологічного інституту молока і м'яса УААН.

Рівні нейтралізуючих антитіл до поліовірусів досліджували в реакції віруснейтралізації (РВН) згідно з методикою (Ворошилова М.К. и соавт., 1964) та в реакції мікронейтралізації (Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита, ВОЗ, 1998) з використанням культури клітин НЕр-2 та вакцинних штамів поліовірусів. Титри антитіл 1:4-1:8 вважали низькими, 1:16-1:32 – середніми, 1:64 і вище – високими. Дітей з низькими титрами антитіл оцінювали як недостатньо захищених від поліомієліту.

Типоспецифічність вірусу підтверджували в реакції віруснейтралізації за допомогою діагностичних кролячих поліомієлітних сироваток для реакції нейтралізації виробництва ДУПВБВП Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів РАМН (Росія).

Обсяг виконаних досліджень представлено у таблиці 1.

Таблиця 1

Обсяг виконаної роботи

Об’єкт дослідження | Кількість досліджень

власні | проаналізовано

Сироватки крові дітей, досліджених на наявність віруснейтралізуючих антитіл до поліовірусів | 201 | 260

Проби фекалій на ентеровіруси | 293

Дослідні тварини – кролі | 71

Сироватки крові кролів, досліджених на наявність віруснейтралізуючих антитіл до поліовірусів | 174

Проби з об’єктів довкілля | 275

Робота виконана із застосуванням вірусологічних, серологічних, мікробіологічних, епідеміологічних та статистичних методів дослідження. Достовірність результатів досліджень доведено математичною обробкою з використанням статистичних розрахунків та комп'ютерних програм.

Результати дослідження та їх обговорення

Характеристика стану імунітету проти поліомієліту у дітей та підлітків.

Проаналізовано рівні віруснейтралізуючих антитіл до поліовірусів трьох типів у дітей віком від 3 до 14 років та підлітків 15-17 років Київської області.

Встановлено, що серед осіб віком 3-14 років відсоток дітей, що не мали антитіл до поліовірусів типів 1 та 2, був незначним і складав 1,9%, тоді як серонегативних по відношенню до типу 3 виявилося 9,4% дітей. Серед осіб цієї групи, незважаючи на те, що вони періодично підлягають ревакцинації, спостерігали значну кількість недостатньо захищених від поліомієліту (28,3%, 18,9% та 47,2% відповідно до поліовірусів типів 1, 2 та 3).

Високі титри антитіл визначалися до поліовірусів трьох типів відповідно у 11,3%, 11,3 % та 15,1% обстежених дітей. Середні геометричні титри (CГТ) антитіл до поліовірусу типу 1 становили 1:16,0, до поліовірусу типу 2 – 1:19,7. Найнижчим цей показник виявився до поліовірусу типу 3 (1:9,2).

При аналізі результатів обстеження підлітків віком 15-17 років спостерігається тенденція до зростання числа осіб, які не мають антитіл проти поліомієліту. Серонегативними виявилося 12,6%, 2,9% та 10,7% обстежених відповідно до поліовірусів типів 1, 2 та 3. Число недостатньо захищених осіб у цій віковій гру-пі зросло у порівнянні з попередньою і становило 44,4% до поліовірусу типу 1, 27,5% – до типу 2 та до типу 3 – 62,3%. Високі титри антитіл визначалися тільки до поліовірусів типів 1 і 2 у 2,4% та 3,9% обстежених відповідно. Осіб з високими титрами до поліовірусу типу 3 у цій віковій групі не виявлено. CГТ антитіл до поліовірусу типу 1 становили 1:7,5, до типу 2 – 1:14,9. Найнижчим, як і в попередній групі, цей показник був до поліовірусу типу 3 (1:6,5).

Оцінюючи в цілому стан імунітету проти поліомієліту, слід зазначити, що найвищі його показники спостерігаються по відношенню до поліовірусу типу 2, найнижчі – до типу 3, що збігається з тенденцією, яка існує повсюдно.

Вплив циркуляції неполіомієлітних ентеровірусів на поствакцинальну відповідь проти поліомієліту. Оскільки імунізація ОПВ передбачає заселення кишечнику вакцинними поліовірусами, при попередньому інфікуванні дитини неполіомієлітними ентеровірусами останні будуть вступати в інтерферентні взаємодії з вакцинними, що може відбитися на ефективності специфічної профілактики поліомієліту.

Для ентеровірусів превалює фекально-оральний механізм передачі, вони здатні до тривалого зберігання у довкіллі, тому деякі об'єкти навколишнього середовища є факторами їх передачі. Від ступеня контамінації довкілля ентеровірусами в значній мірі залежить інтенсивність їх циркуляції серед населення.

Проаналізовано результати вірусологічного дослідження 275 проб води (питна вода, стічна вода, вода відкритих водоймищ), відібраних у Київській області. Ізольовано 30 вірусних агентів, що становило 10,9% від числа досліджених проб. Частота виділення вірусів з проб стічної води дорівнювала 30,2%, з води відкритих водоймищ – 8,6%. З питної води віруси не виділено. Ідентифікація виділених вірусів показала превалювання поліовірусів (типи 1, 2 та 3 виділялися відповідно в 1,8%, 1,5% і 1,1% від числа досліджених проб). Віруси Коксакі В ідентифіковано в 1,5%, віруси ЕСНО – у 1,8%, ентеровірусів інших типів – 1,1%. Значним був відсоток вірусів, що не типувалися діагностичними ентеровірусними сироватками (2,1%).

Отримані дані свідчать про інтенсивне забруднення ентеровірусами, у тому числі поліовірусами, води різного виду водокористування, що, у свою чергу, є опосередкованим показником досить активної циркуляції ентеровірусів серед населення.

З метою встановлення поширеності ентеровірусів серед дітей, які за віком підлягають ревакцинації, досліджено проби фекалій дітей, що були відібрані в день проведення чергової ревакцинації та протягом 2-4 тижнів після неї. Дослідження проведено в той же період часу, що й вивчення циркуляції ентеровірусів у об'єктах довкілля.

Частота виділення ентеровірусів, у тому числі поліовірусів, від дітей до ревакцинації складала 10,0%, після ревакцинації – 9,8% (табл.2).

Таблиця 2

Виділення ентеровірусів від дітей до і після імунізації ОПВ

Групи дітей | Число обстежених дітей | Кількість виділених вірусів |

Типи вірусів

абс. | Мm (%)

До ревакцинації | 150 | 15 | 10,02,5 | 2*Р-2**, 2Р-3, 1Е-1,

3Е-6, 2Е-11, 1В-1, 4В-6

Після ревакцинації | 143 | 14 | 9,82,5 | 3Р-1, 5Р-2, 2Р-3, 1Е-11, 1В-1, 1В-2, 1В-4

Примітки: Р – поліовірус, В – віруси Коксакі В, Е – віруси ЕСНО,

* - кількість виділених штамів, ** - тип вірусу

Як до імунізації, так і після, серопейзаж вірусів, що циркулювали, представлений 7 серотипами, однак ідентичним він був лише за 4 типами. Якщо при першому обстеженні виявлено поліовіруси тільки типів 2 і 3, а їх питома вага серед виділених штамів складала 26,7%, то після ревакцинації спостерігалася циркуляція поліовірусів трьох типів, питома вага яких зросла до 71,4%.

Вивчення частоти виділення ентеровірусів у залежності від кратності ревакцинації показало, що у дітей віком 6 років після 3-ї ревакцинації зазначений показник збільшився незначно (у 1,2 рази). У той же час, частота виділення поліовірусів зросла в 4,3 рази. Після 4-ї ревакцинації (діти віком 15 років), навпаки, загальна частота виділення ентеровірусів зменшилася в 2 рази, а відсоток виявлення поліовірусів не змінився.

Проаналізовано частоту виділення ентеровірусів від імунізованих дітей у залежності від того, в який період року було проведено ревакцинацію. При імунізації дітей у березні місяці, тобто, у період низької циркуляції ентеровірусів (5,0%), відбулося зниження частоти виділення вірусів після ревакцинації (до 2,6%), однак для поліовірусів відбулося зростання зазначеного показника в 3,6 рази. У тому випадку, коли діти ревакцинувались у жовтні, тобто в період високої інтенсивності циркуляції ентеровірусів (25,0%), при повторному їх обстеженні частота виявлення поліовірусів зросла лише в 1,7 рази.

Отже, результати досліджень опосередковано свідчать про вищу ефективність щеплень ОПВ у весняний період і підтверджують доцільність проведення масової імунізації проти поліомієліту на фоні низької циркуляції ентеровірусів, що сприяє більш високому приживленню поліовірусів у кишечнику щеплених.

У цілому одномоментна імунізація в дитячому колективі сприяла зниженню інтенсивності циркуляції неполіомієлітних ентеровірусів. У той же час, випадки виділення ентеровірусів від дітей до і після ревакцинації підтверджують гіпотезу про підвищення в процесі еволюції, на фоні багаторічної вакцинопрофілактики поліомієліту, інтерферуючої активності останніх, що в умовах планової імунізації знижує її ефективність.

Для визначення безпосереднього впливу безсимптомної репродукції ентеровірусів, у тому числі й поліовірусів, у кишечнику щеплених на стан імунітету проти поліомієліту, було вивчено рівні віруснейтралізуючих антитіл у дітей віком 6 років до і через 1 міс. після чергової ревакцинації.

Аналіз напруженості імунітету проти поліомієліту дітей, від яких ентеровіруси не виділено, показав, що ревакцинація позитивно вплинула на стан специфічного імунітету. Якщо до проведення ревакцинації СГТ антитіл до поліовірусу типу 1 становили 1:9,2, до типу 2 – 1:13,0 і до типу 3 – 1:7,5, то через 1 місяць їх показники зросли і дорівнювали відповідно 1:14,9 1:18,4 та 1:11,3, тобто відбулося приживлення поліовірусів, що стимулювало утворення антитіл.

У дітей, від яких виділено ентеровіруси, рівні СГТ антитіл до поліовірусів типів 1, 2 і 3 до ревакцинації становили відповідно 1:4,9, 1:9,2 та 1:4,9, і були достовірно нижчими до поліовірусів типу 1 та 3 (р<0,01), чим у дітей, від яких віруси не виділено. Після ревакцинації відбулося підвищення даного показника до поліовірусів типів 1 і 2 відповідно у 1,7 та 1,8 разів. До поліовірусу типу 3 його значення майже не змінилося (1:6,5 проти 1:4,9).

Таким чином, імунізація ОПВ на фоні інфікування організму неполіомієлітними ентеровірусами не є досить ефективною.

Вивчення інтерферуючої активності поліовірусів трьох типів та вірусу Коксакі В-5 у культурі клітин НЕр-2 показало виражену пригнічуючу дію останнього на інфекційний титр вакцинних штамів поліовірусів (табл.3).

Таблиця 3

Інфекційна активність поліовірусів та вірусу Коксакі В-5 при сумісному і

окремому культивуванні у культурі клітин НЕр-2 (у lg ТЦД50/1,0 мл)

Склад суміші | Інфекційна активність вірусів при окремому культивуванні | Інфекційна активність суміші вірусів |

Інфекційна активність вірусу в суміші

Поліовірус типу 1 +

Коксакі В-5 | 7,50,2 | 7,750,2 | 4,50,2

7,50,2 | 7,750,21

Поліовірус типу 2 +

Коксакі В-5 | 8,00,23 | 8,50,2 | 4,50,21

7,50,2 | 5,750,2

Поліовірус типу 3 +

Коксакі В-5 | 7,50,21 | 7,50,2 | 4,00,23

7,50,2 | 7,750,2

Титри поліовірусів типів 1 та 3 знизилися відповідно на 3,0 lg ТЦД50./1,0 мл та 3,5 lg ТЦД50./1,0 мл (p<0,001), а титр вірусу Коксакі В-5 суттєво не змінився. Сумісне культивування поліовірусу типу 2 та Коксакі В-5 призвело до взаємного пригнічення інфекційних титрів цих вірусів у культурі клітин. Інфекційна активність вакцинного поліовірусу типу 2 знизилась на 3,5 lg ТЦД50./1,0 мл (p<0,01), а вірусу Коксакі В-5 лише на 1,75 lg ТЦД50./1,0 мл.

Дослідження інтерферуючої активності поліовірусів трьох типів та вірусу ЕСНО-30 показало, що при сумісному культивуванні вірусів даних типів відбувається взаємне пригнічення титрів інфекційної активності у порівнянні з їх значеннями при окремому культивуванні. При культивуванні поліовірусів типів 1, 2 і 3 з вірусом ЕСНО-30 їх інфекційний титр знизився на 1,5-2,0 lg ТЦД50/1,0 мл (p<0,001), а вірусу ЕСНО-30 – на 1,0-1,5 lg ТЦД50/1,0 мл (p<0,01) (табл.4).

Таблиця 4

Інфекційна активність поліовірусів та вірусу ЕСНО-30 при сумісному і

окремому культивуванні у культурі клітин НЕр-2 (у lg ТЦД50/1,0мл)

Склад суміші | Інфекційна активність вірусів при окремому культивуванні | Інфекційна активність суміші вірусів |

Інфекційна активність вірусу в суміші

Поліовірус типу 1+

ЕСНО-30 | 7,50,2 | 5,750,2 | 5,750,2

5,50,2 | 4,00,2

Поліовірус типу 2 + ЕСНО-30 | 8,00,23 | 6,50,2 | 6,50,2

5,50,2 | 4,00,23

Поліовірус типу 3 +

ЕСНО-30 | 7,50,21 | 6,00,23 | 5,50,21

5,50,2 | 4,50,2

Таким чином, при дослідженні інтерферуючої активності епідеміологічно актуальних штамів ентеровірусів та вакцинних поліовірусів визначено, що для поліовірусів цей показник є нижчим або майже однаковим у порівнянні з досліджуваними ентеровірусами. Феномен вірусної інтерференції необхідно брати до уваги при плануванні кампаній масової імунізації, так як широка циркуляція неполіомієлітних ентеровірусів не призведе до приживлення вакцинних поліовірусів.

Імунна відповідь на введення оральної поліомієлітної вакцини при дисбактеріозі та можливість її корекції препаратами, що містять живі мікроорганізми. Порушення біоценозу кишечнику, що супроводжуються дисбактеріозом різного ступеня, при багатьох інфекційних і неінфекційних захворюваннях стають все більш розповсюдженою патологією. Оскільки кишкові мікроорганізми і поліовіруси заселяють один і той же біотоп людського організму, можна припустити, що зміни в мікробіоценозі кишечнику дитини можуть впливати під час імунізації її ОПВ на приживлення вірусу і, як наслідок, призводити до виробки секреторних і гуморальних специфічних імуноглобулінів у недостатніх титрах.

У тварин з експериментальним дисбактеріозом (дослідна група), викликаним застосуванням антибіотиків (гентаміцин вводили з розрахунку 5 мг на 1 кг маси тіла кроля 2 рази на добу протягом 10 днів), яких імунізовали ОПВ, на 15-ту добу після введення вакцини значення СГТ антитіл до поліовірусів типів 1, 2 та 3 складали відповідно 3,6 log2, 2,4 log2 і 1,8 log2 (табл.5). На 30-ту добу відмічено значне зниження рівнів антитіл до всіх типів вірусів.

Таблиця 5

Рівні СГТ антитіл до поліовірусів трьох типів у кролів після імунізації

в динаміці при експериментальному дисбактеріозі

Доба дослідження | Значення СГТ антитіл до поліовірусів трьох типів (у log2)

дослідна група | контрольна група

тип 1 | тип 2 | Тип 3 | тип 1 | тип 2 | тип 3

15-а | 3,6 | 2,4 | 1,8 | 4,0 | 3,0 | 3,2

30-а | 2,4 | 0,6 | 0,4 | 3,0 | 2,2 | 2,2

У контрольній групі на 15-ту добу після імунізації ОПВ відмічено, більш високі рівні СГТ антитіл. Через місяць після імунізації ці показники дещо знизилися, але були в 1,3, 3,7 та 5,5 разів вище відповідно до поліовірусів типів 1, 2 та 3 у порівнянні з дослідною групою. Таким чином, отримані дані свідчать, що в експерименті на кролях при дисбактеріозі рівні СГТ антитіл до поліовірусів усіх типів є значно нижчими, ніж у здорових.

З метою підтвердження отриманих експериментальних даних було вивчено залежність рівнів віруснейтралізуючих антитіл до поліовірусів типів 1, 2 та 3 від змін у видовому та кількісному складі кишкової мікрофлори клінічно здорових дітей. Обстежені діти були розподілені на групи в залежності від показників облігатної мікрофлори.

Серед дітей дослідної групи (зменшення біфідобактерій (<107), лактобактерій (<106), зменшення (<106) або збільшення кількості (>2х108) кишкової палички в 1г фекалій) серонегативних до поліовірусів типів 1, 2 і 3 було відповідно 16,7%, 6,3% та 18,7%. Низькі титри антитіл до поліовірусу типу 1 мали 39,5% обстежених, до типу 2 - 24,9%, до типу 3 – 50,0%. Серед дітей контрольної групи серонегативних не виявлено, а відсоток осіб з низькими титрами був у 1,7, 1,3 і 1,2 рази меншим відповідно до поліовірусів типів 1, 2 та 3.

Середні та високі титри антитіл у дослідній та контрольній групах до поліовірусу типу 1 відповідно мали 37,5% і 76,2% осіб, до типу 2 – 68,8% і 81,0%, до типу 3 – 31,3% і 57,1% обстежених осіб. СГТ антитіл до поліовірусів типів 1, 2 та 3 у дітей контрольної групи були значно вищі, ніж у дослідній (відповідно 1:18,4 проти 1:9,2; 1:21,1 проти 1:16,0 та 1:14,9 проти 1:7,0), тобто у 2 рази вищі до поліовірусів типів 1 і 3 (р<0,01) та в 1,3 рази - до поліовірусу типу 2 (р>0,05).

Таким чином, у клінічно здорових дітей, які мають порушення кишкової мікрофлори, рівні антитіл до поліовірусів трьох типів є значно нижчими, ніж у дітей контрольної групи. Зміни в біоценозі кишечнику, які, можливо, носять транзиторний характер, при проведенні щеплення ОПВ призвели до недостатнього приживлення поліовірусу у таких дітей.

В останні роки все більшого застосування при дисбіозах набувають пробіотики, що сприяють нормалізації облігатної мікрофлори, відновленню загального імунного статусу тощо. Вивчення впливу таких препаратів на рівень поствакцинального імунітету до поліовірусів трьох типів проводили з використанням продукту "Лактовіт білковий", який розроблений та виготовлений Технологічним інститутом молока та м’яса УААН. Продукт збагачений мікроорганізмами, які є представниками облігатної мікрофлори кишечнику: Bifidobacterium longum, Streptococcus termophilus та Lactobacillus acidophilus. До складу входить також ячмінно-солодовий екстракт та знежирене сухе молоко.

З метою з'ясування взаємодії бактерій та поліовірусів було проведено дослідження щодо визначення адгезивних властивостей мікроорганізмів продукту “Лактовіт білковий” та їх впливу на інфекційний титр поліовірусів in vitro. Для визначення адгезивних властивостей мікроорганізмів розроблено метод з використанням культури клітин НЕр-2. Встановлено, що мікроорганізми фіксуються на поверхні культури клітин. Здатність до адгезії більш виражена у B.longum у порівнянні з іншими мікроорганізмами, що входять до складу продукту (індекс адгезивності 4,57). Індекс адгезивності для L.acidophilus (штам №3105) складав 2,23, для L.acidophilus (штам №3107) – 1,20. S.thermophilus проявив низькі адгезивні властивості (індекс адгезивності 0,54). Таким чином, до складу продукту "Лактовіт білковий" входять мікроорганізми як з високим, так і з низьким індексом адгезивності.

При вивченні впливу культивування мікроорганізмів, що входять до складу продукту "Лактовіт білковий", на інфекційний титр вакцинних поліовірусів у культурі клітин НЕр-2 було встановлено, що попереднє внесення суспензії мікроорганізмів до культури клітин, за умови достатньо високого їх індексу адгезивності, веде до зниження титрів вірусів (табл.6). Якщо цей показник був низьким, інфікування культури клітин бактеріями суттєво не впливало на інфекційний титр вірусів. При зворотній послідовності інфікування титр вірусу був такий же, як і в контрольних дослідженнях.

Таким чином, отримані дані по вивченню адгезивних властивостей бактерії, що входять до складу продукту “Лактовіт білковий”, їх впливу на інфекційний титр поліовірусів у культурі НЕр-2 показали недоцільність проведення імунізації ОПВ на фоні прийому препаратів, що містять живі мікроорганізмів.

Таблиця 6

Титри поліовірусів типів 1, 2 та 3 (у lg ТЦД50) у культурі клітин НЕр-2

при послідовному внесенні мікроорганізмів і поліовірусів

Вид дослідження | Інфекційна активність

у lg ТЦД50/1,0мл

(Mm) | Достовірність відмінностей у порівнянні з контролем

Т | P

Р1 (контроль) | 7,500,2

L.acidophilus 3105 +Р1 | 5,750,2 | 6,25 | <0,01

L.acidophilus 3107+Р1 | 7,250,25 | 0,78 | >0,05

B.longum +Р1 | 3,250,2 | 15,18 | <0,01

S.thermophilus +P1 | 7,250,2 | 0,89 | >0,05

Р2 (контроль) | 7,750,22

L.acidophilus 3105+Р2 | 6,250,2 | 5,0 | <0,01

L.acidophilus 3107+Р2 | 7,50,21 | 0,83 | >0,05

B.longum +Р2 | 3,750,2 | 13,33 | <0,01

S.thermophilus +P2 | 7,750,22 | 0 | <0,01

Р3 (контроль) | 6,500,21

L.acidophilus 3105+Р3 | 4,750,2 | 6,03 | <0,01

L.acidophilus 3107+Р3 | 5,750,2 | 2,59 | <0,05

B.longum +Р3 | 2,250,24 | 13,28 | <0,01

S.thermophilus +P3 | 6,500,2 | 0 | >0,05

Примітки: Р1 – поліовірус типу 1; Р2 – поліовірус типу 2; Р3 – поліовірус типу 3, показник T розраховували по відношенню до контролю вірусу відповідного типу.

При вивченні впливу прийому пробіотиків на імунну відповідь при вакцинації у кролів 1-ї групи, які перед імунізацією ОПВ отримували протягом 5 днів ”Лактовіт білковий” (з розрахунку 20 мг на добу), мало місце пригнічення процесу антитілоутворення до поліовірусів (табл.7).

Таблиця 7

Рівні СГТ антитіл до поліовірусів трьох типів у кролів після

імунізації ОПВ при використанні продукту “Лактовіт білковий” (у log2)

Група | Значення СГТ антитіл до поліовірусів трьох типів

15-а доба | 30-а доба

тип 1 | тип 2 | тип 3 | тип 1 | тип 2 | тип 3

ОПВ (контроль) | 3,3 | 2,7 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,0

“Лактовіт білковий”+ОПВ

(1-а група) | 2,0 | 2,5 | 1,7 | 1,3 | 1,5 | 0,5

ОПВ+“Лактовіт білковий”

(2-а група) | 5,5 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 2,8 | 2,5

СГТ антитіл на 15-ту добу виявилися значно нижчими до поліовірусів типів 1 і 3 у порівнянні з контрольною групою. Вивчення рівнів антитіл у сироватках крові тварин, імунізованих ОПВ (контрольна група), показало, що на 15-ту добу після одержання дози вакцини значення СГТ антитіл до поліовірусів типів 1, 2 і 3 складали відповідно 3,3 log2, 2,7 log2 і 2,5 log2.

Через місяць після імунізації відбулося зниження значення СГТ антитіл. У тварин 1-ї групи дані показники становили 1,3 log2, 1,5 log2 і 0,5 log2 відповідно до поліовірусів типів 1, 2 та 3, у тварин контрольної - 2,5 log2, 2,5 log2 і 2,0 log2 до відповідних типів поліовірусів.

У тварин 2-ї групи, яким після імунізації ОПВ вводили протягом 5 наступних діб “Лактовіт білковий”, утворення антитіл до поліовірусів відбувалося більш інтенсивно (табл.7). На 15-у добу їх рівні порівняно з контрольною та з 1-ю групами були вищими відповідно у 1,7 і 2,8 рази до поліовірусу типу 1 та в 1,6 і 2,4 рази – до типу 3. До поліовірусу типу 2 в цих групах відмічено близькі значення СГТ антитіл. На 30-ту добу після імунізації в 2-й групі тварин СГТ антитіл були найвищими.

Таким чином, результати експерименту свідчать про більш високий рівень імунної відповіді до поліовірусів трьох типів при застосуванні продукту “Лактовіт білковий” після проведення імунізації. Це дає підстави рекомендувати пробіотики як неспецифічні імуностимулятори після вакцинації ОПВ.

Використання імуномодуляторів з метою підвищення поствакцинального імунітету проти поліомієліту в експерименті. Оскільки проблема низької імунної відповіді на багаторазові щеплення ОПВ у дітей є актуальною, виникає необхідність розробки методів індивідуального підходу для підвищення рівнів їх специфічного захисту. Дибазол і метилурацил є добре вивченими, доступними препаратами, що широко застосовуються у медичній практиці при лікуванні багатьох соматичних захворювань.

Проаналізовано можливість використання дибазолу і метилурацилу вітчизняного виробництва для стимуляції імунної відповіді до поліовірусів трьох типів на введення ОПВ в експерименті на кролях. Дибазол і метилурацил уводили рег os у дозах 0,1 мл (0,001 г) і 0,2 мл (0,05 г) відповідно протягом 5 днів перед імунізацією.

Вивчення рівня антитіл у сироватках крові тварин, імунізованих ОПВ, показало, що на 14-ту добу після одержання дози вакцини значення СГТ антитіл до поліовірусів типів 1 і 2 складали відповідно 0,4 log2 і 0,6 log2, а на 30-ту – 1,6 log2 і 1,2 log2; до поліовірусу типу 3 антитіл не виявлено. На 60-ту добу показники СГТ антитіл до поліовірусів типів 1, 2 і 3 дорівнювали відповідно 1,4 log2, 1,4 log2, 0,8 log2, а на 120-ту – 1,25 log2, 1,5 log2 і 1,0 log2.

У групі тварин, яким перед імунізацією ОПВ уводили дибазол, на всіх етапах дослідження відзначено вищі рівні антитіл до поліовірусів типів 1 і 2, ніж у групі, що отримала тільки ОПВ. Так, на 14-й день СГТ антитіл до поліовірусів типів 1 і 2 були відповідно в 6,5 разів і 3,7 рази вище, ніж у тварин, що отримали тільки ОПВ; антитіл до поліовірусу типу 3 не виявлено. На 30-ту добу після імунізації СГТ антитіл становили до поліовірусів типів 1, 2 та 3 відповідно 2,75 log2, 2,25 log2 та 1,25 log2. Починаючи з 60-ї доби, значення величин антитілоутворення до поліовірусів типів 2 і 3 не змінювалися (2,25 log2 і 1,25 log2). До поліовірусу типу 1 на 60-ту даний показник становив 3,25 log2, а на 120-ту добу мало місце деяке зниження даного показника, який дорівнював 2,5 log2.

У групі тварин, яким перед імунізацією ОПВ було введено метилурацил, утворення антитіл до поліовірусів відбувалося більш інтенсивно на всіх етапах спостереження, ніж в інших групах. Уже на 14-й день СГТ антитіл у порівнянні з групою, що одержала тільки ОПВ, та з групою, що одержала ОПВ і дибазол, були вищими відповідно у 7 і 5,3 разів до поліовірусу типу 1 та в 1,1 і 1,5 рази – до типу 2. Крім того, до поліовірусу типу 3 одна тварина мала антитіла на 14-ту добу дослідження, чого не спостерігали у тварин інших груп. На 30-ту та 60-ту добу рівні антитіл до поліовірусів типів 1, 2 та 3 у цій групі зростали (відповідно 3,0 log2, 3,0 log2, 0,4 log2, та 3,4 log2, 3,8 log2, 1,6 log2), а на 120-ту добу відмічено їх незначне зниження (відповідно 2,8 log2, 3,2 log2 і 1,2 log2).

Таким чином, результати експерименту свідчать про більш високий рівень імунної відповіді до поліовірусів трьох типів при застосуванні метилурацилу і дибазолу. Більш виражений імуномодулюючий ефект було відмічено при використанні метилурацилу. Зважаючи на те, що зазначений препарат широко застосовується в медичній практиці, можна рекомендувати проведення обмеженого епідеміологічного досліду щодо його використання для корекції імунної відповіді на введення ОПВ.

Вплив вуглеводовміщуючих біополімерів бактерій на інфекційний титр поліовірусів та специфічну імунну відповідь проти поліомієліту. Було вивчено вплив нейрамініну S.aureus та A.laidlawii на інфекційний титр вакцинних штамів поліовірусів трьох типів у перещеплюваній культурі клітин НЕр-2.

Здатність підвищувати інфекційний титр поліовірусів типів 1 і 3 in vitro більш виражена у нейрамініну S.aureus (1,75-2,75 lg ТЦД50) (табл.8). Зазначена властивість є дещо нижчою у нейрамініну A.laidlawii (1,5-1,75 lg ТЦД50).

При попередній обробці культури клітин нейрамініном, з наступним внесенням поліовірусів, виявили протилежну залежність – зменшення інфекційних титрів поліовірусів. Інфекційний титр поліовірусу типу 1 при обробці культури клітин нейрамініном S.aureus зменшився на 1,5 lg ТЦД50/1,0 мл, нейрамініном A.laidlawii – на 1,75 lg ТЦД50/1,0 мл (табл.9).

Для поліовірусу типу 2 при попередній обробці культури клітин нейрамініном S.aureus титр знизився на 1,25 lg ТЦД50/1,0 мл, нейрамініном A.laidlawii – на 0,75 lg ТЦД50/1,0 мл. Нейрамінін S.aureus знижував інфекційний титр поліовірусу типу 3 на 3,0 lg ТЦД50/1,0 мл, нейрамінін A.laidlawii – на 1,25 lg ТЦД50/1,0 мл.

Таблиця 8

Титр поліовірусів типів 1, 2 та 3 (у lg ТЦД50) у культурі клітин НЕр-2

після її обробки нейрамініном на фоні репродукції вірусу

Вид

Дослідження | Інфекційна активність

у lg ТЦД50/1,0мл (Mm) | Статистичні показники

Т | p

Р1* (контроль) | 6,100,0

Р1+НІ S.aureus | 8,850,21 | 13,1 | <0,01

P1+HI A.laidlawii | 7,100,3 | 3,3 | <0,01

Р2** (контроль) | 7,100,0

Р2+НІ S.aureus | 6,600,25 | 2,0 | >0,05

P2+HI A.laidlawii | 7,350,21 | 1,2 | >0,05

Р3*** (контроль) | 6,350,21

Р3+НІ S.aureus | 8,100,0 | 8,3 | <0,01

P3+HI A.laidlawii | 7,850,21 | 5,0 | <0,01

Примітки: Р1* – поліовірус типу 1; Р2** – поліовірус типу 2; Р3*** – поліовірус

типу 3; НІ – нейрамінін; показник T розраховували по відношенню до контролю вірусу відповідного типу.

Таблиця 9

Титр поліовірусів типів 1, 2 та 3 (у lg ТЦД50) у культурі клітин НЕр-2

при її попередній обробці нейрамініном

Вид дослідження | Інфекційна активність

у lg ТЦД50/0,1мл (Mm) | Статистичні показники

Т | p

Р1 (контроль) | 6,100,0

НІ S.aureus+Р1 | 4,600,25